СТАБИЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ PD-1 Российский патент 2024 года по МПК A61K39/395 A61K39/00 A61K47/12 A61K47/22 A61K47/26 A61K9/08 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка истребует преимущества китайской патентной заявки 202010566153.8, поданной 19 июня 2020 г., содержание которой целиком включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области биофармацевтических составов и, в частности, к стабильной композиции рекомбинантного моноклонального антитела против PD-1.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

PD-1, известный как рецептор 1 программируемой гибели клеток, представляет собой член семейства CD28, также известного как CD279. Он функционирует как регулятор запрограммированной клеточной гибели и в основном экспрессируется на поверхности зрелых CD4+ и CD8+ Т-клеток, а также натуральных Т-клеток киллеров, В-клеток, моноцитов и некоторых дендритных клеток. PD-1 участвует в иммунной регуляции Т-клеток.

PD-1 имеет два лиганда: PD-L1 и PD-L2, которые в норме экспрессируются на антигенпрезентирующих клетках и при связывании с PD-1 ингибируют активацию и пролиферацию Т-клеток. В норме иммунная система реагирует на чужеродные антигены, которые накапливаются в лимфатических узлах или селезенке, способствуя антигенспецифической активации и пролиферации Т-клеток. Напротив, связывание PD-1 с PD-L1 производит отрицательные регуляторные сигналы и ингибирует активацию и пролиферацию Т-клеток.

Одним из способов уклонения опухолевых клеток от уничтожения Т-клетками является экспрессия PD-L1 на их клеточной поверхности. Когда PD-L1 связывается с PD-1 на поверхности Т-клеток, специфических к опухолевыми антигенам, он проводит отрицательные регуляторные сигналы, делая такие Т-клетки, специфические к опухолевыми антигенам, неспособными контролировать опухолевые клетки и посылать сигналы атаки опухолевым клеткам, что приводит к уклонению опухолевых клеток от иммунного надзора и уничтожения организмом.

Антитела против PD-1 специфически связывают PD-1, блокируют его взаимодействие с PD-L1 и обезвреживают опосредованную PD-1/PD-L1 Т-клеточную иммуносупрессию, индуцируя тем самым активацию Т-клеток и восстанавливая способность организма контролировать и атаковать опухолевые клетки.

Однако перед введением композиции антител подвергаются процессам хранения и транспортировки, во время которых происходит физическая и химическая деградация антитела, и эти нестабильности могут снижать эффективность и/или повышать иммуногенность антитела, таким образом, стабильная композиция гарантирует, что антитело остается терапевтически активным и безопасным до необходимого момента введения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Техническая задача, решаемая настоящим изобретением, заключается в создании стабильной композиции для рекомбинантного моноклонального антитела против PD-1. Рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1 обладает хорошей стабильностью в этой композиции.

Первый аспект настоящего изобретения относится к стабилизированной композиции, содержащей рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1, буфер, регулятор осмолярности, стабилизатор, и поверхностно-активное вещество.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

концентрация указанного рекомбинантного моноклонального антитела против PD-1 составляет 10-50 мг/мл, предпочтительно концентрация указанного рекомбинантного моноклонального антитела против PD-1 составляет 10-25 мг/мл; и

концентрация указанного буфера составляет 10-50 мМ, предпочтительно концентрация указанного буфера составляет 20-40 мМ;

концентрация указанного регулятора осмолярности составляет 20-200 мМ, предпочтительно 80-160 мМ;

концентрация указанного стабилизатора составляет 10-250 мМ, предпочтительно 20-205 мМ;

концентрация указанного поверхностно-активного вещества составляет 0,005-0,05 вес. %, предпочтительно 0,02-0,04 вес. %;

pH раствора составляет 5,5-6,5, предпочтительно 5,8-6,2.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

указанный буфер выбран из одного или более из цитратного буфера, ацетатного буфера или гистидинового буфера;

указанный регулятор осмолярности выбран из хлорида натрия;

указанный стабилизатор представляет собой одно или более из сахарозы, трегалозы, или аргинин гидрохлорида, предпочтительно 205 мМ сахарозы, или 20 мМ - 80 мМ аргинин гидрохлорида или 200 мМ трегалозы;

указанное поверхностно-активное вещество выбрано из полисорбата 80.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

pH раствора композиции составляет 6,0.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

указанная композиция содержит 25 мг/мл рекомбинантного моноклонального антитела против PD-1; 20 мМ гистидиновый буфер, 120 мМ хлорид натрия, 40 мМ аргинин гидрохлорид, и 0,02 вес. % полисорбата 80.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

указанное рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1 включает вариабельный участок лёгкой цепи и/или вариабельный участок тяжёлой цепи,

при этом указанный вариабельный участок лёгкой цепи включает CDR1 лёгкой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, CDR2 лёгкой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2, и CDR3 лёгкой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 3; и

вариабельный участок тяжёлой цепи включает CDR1 тяжёлой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:4, CDR2 тяжёлой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:5, и CDR3 тяжёлой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:6.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

указанное рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1 включает последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 90%, 92%, 95%, 98%, или 100% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 8 вариабельного участка лёгкой цепи антитела против PD-1, и/или последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 90%, 92%, 95%, 98% или 100% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 7 вариабельного участка тяжёлой цепи антитела против PD-1.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

указанное антитело дополнительно включает константный участок лёгкой цепи и константный участок тяжёлой цепи, предпочтительно указанная последовательность аминокислот указанного константного участка лёгкой цепи имеет по меньшей мере 90%, 92%, 95%, 98% или 100% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 10 константного участка лёгкой цепи каппа, и/или указанная последовательность аминокислот указанного константного участка тяжёлой цепи имеет по меньшей мере 90%, 92%, 95%, 98% или 100% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 9 константного участка тяжёлой цепи IgG4.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

указанное рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1 представляет собой антитело IgG, предпочтительно антитело IgG4.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

указанное рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1 представляет собой моноклональное антитело.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

Среднее значение K_D, аффинности связывания указанного рекомбинантного моноклонального антитела против PD-1 с рекомбинантным белком PD-1 человека, составляет 20-200 пM, предпочтительно 60-70 пM, более предпочтительно 64,8 пM.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

указанная композиция находится в водной форме или лиофилизированной форме.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

указанная композиция может стабильно храниться по меньшей мере 42 месяцев при 2-8°C и по меньшей мере 12 месяцев при 25°C.

Второй аспект настоящего изобретения относится к применению композиций согласно настоящему изобретению в приготовлении лекарственных средств для лечения опухолей или рака, предпочтительно рака толстой кишки.

Третий аспект настоящего изобретения относится к применению указанных композиций согласно настоящему изобретению для лечения опухолей или рака, предпочтительно рака толстой кишки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На Фиг. 1 продемонстрирован тренд чистоты для каждого образца композиции в Примере 1 при 4°C и 37°C для недели 0, недели 3 и недели 5.

На Фиг. 2 продемонстрирован тренд пиков кислотности для каждого образца композиции в Примере 1 при 4°C и 37°C для недели 0, недели 3 и недели 5.

На Фиг. 3 продемонстрирован тренд чистоты для каждого образца композиции в Примере 2 при 4°C и 37°C для недели 0, недели 3 и недели 5.

На Фиг. 4 продемонстрирован тренд пиков кислотности для каждого образца композиции в Примере 2 при 4°C и 37°C для недели 0, недели 3 и недели 5.

На Фиг. 5 продемонстрирован тренд чистоты для каждого образца композиции в Примере 3 при 4°C и 37°C для недели 0, недели 3 и недели 5.

На Фиг. 6 продемонстрирован тренд пиков кислотности для каждого образца композиции в Примере 3 при 4°C и 37°C для недели 0, недели 3 и недели 5.

На Фиг. 7 продемонстрирован тренд чистоты для каждого образца композиции в Примере 4 при 4°C и 37°C для недели 0, недели 3 и недели 5.

На Фиг. 8 продемонстрирован тренд чистоты для каждого образца композиции в Примере 5 при -80°C и 45°C для недели 0, недели 1, недели 2 и недели 4.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение обеспечивает стабильную композицию рекомбинантного моноклонального антитела против PD-1, что решает проблему стабильности антител при хранении и транспортировке. Антитело гарантированно остается активным и безопасным для терапевтических целей перед введением пациентам.

Термин «композиция» относится к композиции, которая эффективно сохраняет биологическую активность активного компонента и не содержит других компонентов, неприемлемо токсичных для субъекта. Такие препараты являются стерильными. Термин «стерильный» относится к отсутствию живых бактерии или отсутствию или существенному отсутствию всех живых микроорганизмов и их спор.

В настоящем тексте «стабильная» композиция относится к композиции, в которой активный компонент сохраняет по существу свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность после хранения. В предпочтительном варианте осуществления указанная композиция в значительной степени сохраняет свою физическую и химическую стабильность, а также свою биологическую активность после хранения.

Термины «пациент» или «субъект» используются взаимозаменяемо и относятся к любому млекопитающему, страдающему от состояния или заболевания в соответствии с настоящим изобретением, в предпочтительном варианте к человеку.

Стабилизированная композиция согласно настоящему изобретению включает рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1, буфер, регулятор осмолярности, стабилизатор и поверхностно-активное вещество.

Термины «включают» и «содержат» означают, что могут быть включены дополнительные компоненты в дополнение к упомянутым.

При использовании в настоящем документе и в прилагаемой формуле формы единственного числа «один», «другой» и «указанный» включают обозначение объекта во множественном числе, если контекст явно не указывает на иное.

В настоящем тексте «буфер» относится к буферному раствору, который противостоит изменениям pH за счет действия сопряженных кислотно-щелочных пар. В вариантах осуществления согласно настоящему изобретению выбирают буферный раствор гистидина, имеющий значение рН между от примерно 5,5 до примерно 6,5, предпочтительно примерно 6.

В настоящем тексте «поверхностно-активное вещество» относится к поверхностно-активному веществу, а в одном из вариантов реализации указанное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20.

Термин «регулятор осмолярности» относится к фармацевтически приемлемому регулятору осмолярности, где подходящие регуляторы осмолярности включают соли, но не ограничиваются ими, в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению представляет собой хлорид натрия (NaCl) при концентрации от примерно 80 мМ до примерно 160 мМ.

Термин «стабилизатор» относится к фармацевтически приемлемому стабилизатору и включает аминокислоты и сахара, такие как аргинин гидрохлорид, сахароза, и трегалоза в вариантах осуществления настоящего изобретения, которые могут использоваться отдельно или в комбинации в концентрациях от примерно 20-80 мМ аргинин гидрохлорида, от примерно 205 мМ сахарозы, и от примерно 200 мМ трегалозы, но не ограничиваются ими.

«Стабильность» белка можно оценить качественно и/или количественно после хранения при выбранных температурах в течение выбранных периодов несколькими различными способами, включая оценку образования агрегатов (например, с помощью эксклюзионной хроматографии, измерения мутности и/или путем визуального осмотра); оценку гетерогенности заряда с помощью катионообменной хроматографии, визуализирующего капиллярного изоэлектрофокусирующего электрофореза (IEF) или капиллярного зонного электрофореза; анализ амино-концевой или карбокси-концевой последовательности; масс-спектрометрии; анализ SDS-ПААГ для сравнения восстановленного и интактного антитела; анализ пептидного картирования (например, трипсин или LYS-C); оценку биологической активности или антигенсвязывающей функции антител; и т.п.

В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению, чистоту образца после хранения в течение выбранного периода времени определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии молекулярного исключения: разделение и количественный анализ по различным молекулярным размерам, таким образом, получают информацию о количестве мономеров, агрегатов и фрагментов образца; изомеры с разным зарядом выявляют катионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографией (CEX-ВЭЖХ): разделение и количественный анализ белков с разным зарядом, таким образом получают информацию о гетерогенности образца по заряду; или изомеры с разным зарядом выявляют визуализирующим капиллярным изоэлектрофокусирующим электрофорезом (IEF): разделение и количественный анализ на основе различных изоэлектрических точек белков, таким образом получают информацию о количестве кислых и основных белков в образце; определение «биологической активности» образца с помощью анализа с использованием репортерного гена, который основан на принципе, что связывание экспрессирующих PD-L1 клеток-мишеней с эффекторными клетками, экспрессирующими PD-1 и люциферазу, ингибирует экспрессию люциферазы, и добавление антитела против PD-1 блокирует связывание PD-1 с PD-L1, поэтому биологическая активность антитела против PD-1 может быть определена путем анализа степени экспрессии люциферазы.

Термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина и относится к любой форме антитела, которая проявляет желаемую биологическую активность. К ним относятся моноклональное антитело (включая полноразмерное моноклональное антитело), поликлональное антитело и полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело), и даже фрагменты антител, но не ограничиваются ими. Как правило, антитело с полноразмерной структурой содержит четыре полипептидные цепи, две тяжёлые (Н) цепи и две лёгкие (L) цепи, обычно соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжёлая цепь содержит вариабельный участок тяжёлой цепи и константный участок тяжелой цепи. Каждая лёгкая цепь содержит вариабельный участок лёгкой цепи и константный участок лёгкой цепи. В дополнение к этой типичной полноразмерной структуре антитела, эта структура также включает другие производные формы.

Термин «вариабельный участок» относится к домену в тяжёлой или лёгкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные участки тяжёлой и лёгкой цепи природного антитела (V_H и V_L, соответственно) в целом имеют сходную структуру и могут дополнительно подразделяться на участки с высокой степенью вариабельности (называемые участками, определяющими комплементарность (CDR)) с вкраплениями более консервативных областей (называемых каркасными участками (FR)).

Термин «участок, определяющий комплементарность» (CDR, например, CDR1, CDR2, и CDR3) относится к таким остаткам аминокислот указанного вариабельного участка антитела, наличие которых необходимо для связывания с антигеном. Каждый вариабельный участок обычно содержит три участка CDR, называемые CDR1, CDR2, и CDR3. Каждый участок, определяющий комплементарность, может содержать остатки аминокислот из «участка, определяющего комплементарность» как определено Kabat (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) и/или остатки из «высоковариабельной петли» (Chothia и Lesk; J Mol Biol 196: 901- 917 (1987)).

Каждый вариабельный участок тяжёлой цепи и вариабельный участок лёгкой цепи обычно содержит 3 CDR и до 4 FR, указанные CDR и FR расположены от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке, например, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Участок, определяющий комплементарность, (CDR) и каркасный участок (FR) определённого антитела могут быть идентифицированы с использованием системы Kabat (Kabat и др.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, U.S. Department of Health и Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991).

Термин «константный участок» относится к таким последовательностям аминокислот в лёгких и тяжёлых цепях антитела, которые не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как вызываемая антителом цитотоксичность.

«Антиген-связывающий фрагмент антитела» включает часть интактной молекулы антитела, которая сохраняет в меньшей степени некоторую специфичность связывания исходного антитела и обычно включает по меньшей мере часть антиген-связывающего участка или вариабельного участка (например, один или более CDR) родительского антитела. Примеры антиген-связывающих фрагментов включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, фрагменты Fd, фрагменты Fd', молекулы одноцепочечных антител (например, scFv, ди-scFv или три-scFv, двудольные антитела или scFab) и однодоменные антитела, но не ограничиваются ими.

«Фрагмент антитела» представляет собой неинтактную молекулу антитела, которая сохраняет по меньшей мере некоторые биологические свойства родительского антитела, в том числе фрагмент Fc, в дополнение к описанным выше «антиген-связывающим фрагментам», но не ограничиваются ими.

Термин «химическое антитело» относится к антителу, в котором часть тяжёлой и/или лёгкой цепи происходит от определённого источника или вида, а остальная часть происходит от другого источника или вида. «Гуманизированные антитела» являются подмножеством «химерных антител».

Термин «гуманизированное антитело» или «гуманизированный антиген-связывающий фрагмент» в настоящем документе означает следующие антитела или фрагменты антител: (i) антитела, полученные из источника, отличного от человека (например, трансгенная мышь, несущая гетерологичную иммунную систему) и основанные на последовательности зародышевой линии человека; или (ii) химерные антитела, в которых указанный вариабельный участок имеет происхождение, отличное от человека, а константный участок имеет человеческое происхождение; или (iii) трансплантаты CDR, в которых CDR в указанном вариабельном участке имеет происхождение, отличное от человека, а один или более участков каркаса в указанном вариабельном участке имеет человеческое происхождение, при этом константный участок, если таковой имеется, имеет человеческое происхождение. Целью «гуманизации» является устранение иммуногенности антитела происхождения, отличного от человека, у человека при сохранении максимально возможной аффинности. Выгодно выбрать последовательность каркасного участка человека, которая наиболее похожа на последовательность каркасного участка антитело происхождения, отличного от человека, в качестве матрицы для гуманизации. В некоторых случаях может быть необходимо заменить одну или более аминокислот в последовательности каркасного участка человека соответствующими остатками в нечеловеческом каркасном участке, чтобы избежать потери аффинности.

Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из практически однородной популяции антител, т.е., каждое отдельное антитело, включенное в популяцию, идентично, за исключением возможных мутаций (например, естественных мутаций), которые могут присутствовать в очень небольших количествах. Соответственно, термин «моноклональное» указывает на природу указанного антитела, т.е., не на смесь неродственных антител. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела против разных антигенных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклонального антитела направлено против конкретной антигенной детерминанты. В дополнение к их специфичности, препараты моноклонального антитела имеют то преимущество, что они обычно не контаминированы другими антителами. Термин «моноклональное» не следует толковать как требующий какого-либо конкретного метода получения указанного антитела. Термин «моноклональное антитело» конкретно включает химическое антитело, гуманизированное антитело и человеческий антитела.

Антиген «специфически связывается» с целевым антигеном, таким как опухолеассоциированный пептидный антиген-мишень (в данном документе PD-1), т.е., связывается с указанным антигеном с достаточной аффинностью, чтобы позволить указанному антителу использоваться в качестве терапевтического агента, нацеливаться на клетку или ткань, экспрессирующую указанный антиген, и не давать значительной перекрестной реакции с другими белками или с белками, отличными от гомологов и вариантов (например, мутантных форм, вариантов сплайсинга или протеолитически укороченных форм) антигенных мишеней, упомянутых выше.

Термин «аффинность связывания» относится к силе суммы нековалентных взаимодействий между отдельными сайтами связывания молекулы и её партнерами по связыванию. Если не указано иное, «аффинность связывания» в данном контексте относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающей пары (например, антитело и антиген). «K_D», «константа скорости связывания k_on» и «константа скорости диссоциации k_off» обычно используются для описания сродства между молекулой (например, антителом) и его партнером по связыванию (например, антигеном), т.е., насколько прочно лиганд связывается с конкретным белком. На аффинность связывания влияют нековалентные межмолекулярные взаимодействия, такие как водородная связь, электростатические взаимодействия, а также гидрофобные и ван-дер-ваальсовы силы между двумя молекулами. Дополнительно на аффинность связывания между лигандом и его молекулой-мишенью может влиять присутствие других молекул. Аффинность можно анализировать обычными методами, известными в данной области техники, включая описанный в настоящем документе метод ИФА (ELISA).

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и выделено из клетки, которая естественным образом экспрессирует это антитело. Выделенные антитела включают антитела in situ в рекомбинантных клетках и антитела, которые обычно получают за по меньшей мере одну стадию очистки.

«Идентичность последовательности» между последовательностями двух пептидов или нуклеиновых кислот указывает на количество остатков, идентичных между указанным последовательности, в процентах от общего числа остатков. При вычислении процентной идентичности указанные сравниваемые последовательности сопоставляются таким образом, чтобы получить максимальное совпадение между указанными последовательностями, а пустые позиции в совпадении (если они есть) разрешаются с помощью определенного алгоритма. Предпочтительные компьютерные программные методы для определения идентичности между двумя последовательностями включают программные пакеты GCG, включая GAP, BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul и др. 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410), но не ограничиваются ими. Вышеупомянутые пакеты общедоступны в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и других источниках. Известный алгоритм Смита-Уотермана также может быть использован для определения идентичности.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения используется рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1, задокументированное в патентной заявке PCT/CN2019/126594, поданной 19 декабря 2019 г., и в особенности в предпочтительном варианте осуществления, являющемся антителом PD1-H944. Заявка PCT/CN2019/126594 целиком включена в данное описание и формулу изобретения посредством ссылки.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция содержит 25 мг/мл антитела PD1-H944; 20 мМ гистидинового буфера, 120 мМ хлорида натрия, 40 мМ аргинина гидрохлорида и 0,02 вес. % полисорбата 80. Указанная композиция обладает хорошей стабильностью и стабильна в течение по меньшей мере 42 месяцев при температуре от 2 до 8°C и по меньшей мере 12 месяцев при 25°C.

Указанная композиция согласно настоящему изобретению может быть предоставлена в жидкой форме или может быть предоставлена в лиофилизированной форме. Это можно сделать путем восстановления лиофилизированной композиции перед введением.

Указанная композиция согласно настоящего изобретения может лечить опухоли или рак, предпочтительно рак толстой кишки.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение будет лучше и полнее понято со ссылкой на следующие варианты осуществления. Однако их не следует толковать как ограничивающие объём настоящего изобретения. Вся литература, патенты и патентные заявки включены в настоящий документ посредством ссылки. В следующих вариантах осуществления используемым рекомбинантным моноклональным антителом против PD-1 является PD1-H944, получение, характеристика и идентификация эффективности которого задокументированы в заявке PCT/CN2019/126594, поданной 19 декабря 2019 г.

В следующих вариантах осуществления использовали способ обнаружения, описанный ниже.

(1) Молекулярная эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография (SEC-ВЭЖХ)

Колонка: Колонка для гель-фильтрации TSKgel G3000SWX (7,8×300 мм, 5 мкм) (каталожный номер 0008541), подвижная фаза представляла собой подвижную фазу SEC (200 мМ динатрийгидрофосфат, 100 мМ аргинин, pH 6,50, 1% изопропанол), длина волны УФ-детектирования составляла 280 нм, температура колонки была 25°C, 80 мкг тестируемого образца вводили в жидкостный хроматограф, а чистоту образца определяли в соответствии с методом нормализации площади (Общее правило 0514 Китайской фармакопеи (издание 2015 г., том III)).

2) Катионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография (CEX-ВЭЖХ)

Использовали колонку слабого катионита WCX-10 (4*250 мМ) (Артикул 054993) с фазой А (10 мМ ФБ, рН=7,0) и фазой Б (10 мМ ФБ, 200 мМ NaCl, рН=7,0). в качестве подвижных фаз, длина волны УФ-детекции составляла 280 нм, а температура колонки составляла 35 °С. Градиент элюции SCT-I10A осуществляли согласно следующей таблице.

Время (минуты) B (%) C(%) Давление, бар 1 0,00 100 0 200 2 40,00 50 50 200 3 45,00 0 100 200 4 45,01 100 0 200 5 70,00 100 0 200

80 мкг исследуемого образца вводили в жидкостный хроматограф и чистоту образца оценивали по методу нормализации площади (см. Общее правило 0512 и Общее правило 0513 Фармакопеи Китайской Народной Республики (издание 2015 г., том III)).

3) Визуализация капиллярного изоэлектрофокусирующего электрофореза (IEF)

Анализ iCE3 осуществляли с использованием прибора для капиллярного изоэлектрофокусирующего электрофореза с визуализацией. Соответствующие параметры для iCIEF: раствор образца для анализа готовили путем смешивания тестируемого образца с Pharmalyte 3-10 для IEF, 1% метилцеллюлозой (1% MC), маркером pI с pI 5,12 и 9,33 и воды. Конечная концентрация белка составляла 0,25 мг/мл, конечная концентрация амфотерного электролита составляла 4%, конечная концентрация MC в конечном растворе составляла 0,35%. Анализ ICE3 осуществляли при следующих условиях фокусировки: 1500 В в течение 1 минуты; 3000 В в течение 6 минут. После подачи напряжения на капилляр образец сфокусируется в своей точке pI. Длина волны детекции составляет 280 нм, и фотографируется пик УФ-поглощения, после чего может быть получен сфокусированный спектр, а расчетным путем может быть получена информация о количестве кислых и основных белков в пробе (Фармакопея Китайской Народной Республики, издание 2015 г., том IV, общее правило 0542 «Метод капиллярного электрофореза»).

4) Метод репортёрного гена для определения «биологической активности» образца

Клетки CHO-K1-PD-L1-CD3E инокулировали в 96-луночные планшеты в количестве 20К на лунку и инкубировали в течение ночи при 37°C, 5% CO₂, после чего супернатант отбрасывали. Клетки добавляли в серийные разведения рабочих контрольных и опытных проб по 40 мкл на лунку для получения конечных концентраций 40,000, 13,333, 4,444, 1,481, 0,494, 0,165, 0,055, 0,018 и 0,006 мкг/мл. Клетки Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1 добавляли в количестве 75К на лунку (40 мкл на лунку) и инкубировали в течение 6 часов при 37°C в среде с 5% CO₂, клетки лизировали и 20 мкл на лунку клеточного лизата переносили в 96-луночные планшеты с белым дном, помещенные на микропланшетный люминесцентный детектор, и добавляли 60 мкл на лунку системы анализа люциферазы для детекции биолюминесценции. Относительную активность образцов рассчитывали путем построения графика логарифма концентрации образца как горизонтальной координаты и значения биолюминесценции (RLU) как вертикальной координаты и подгонки четырехпараметрического уравнения, в результате чего получали значения EC₅₀ образцов и рабочих контрольных образцов. Относительная активность (%) = EC₅₀ рабочего контрольного образца / EC₅₀ образца × 100% (Lan Wang, Chuanfei Yu, Yalan Yang и др. Разработка надежного анализа репортерного гена для измерения биологической активности терапевтического антитела против PD-1/PD-L1. Journal of Pharmaceytical and Biomedical Analysis, 2017, 145:447-453; Фармакопея Китайской Народной Республики, издание 2015 г., том IV, общее правило 3523 «Метод анализа биологической активности интерферона. II. Метод репортерного гена»).

Пример 1: Скрининг pH раствора композиции

Указанная композиция PD1-H944 для этого варианта осуществления показана в следующей таблице.

Таблица 1. Композиции с различным pH

Серийный номер композиции Моноклональное антитело против PD-1 Гистидиновый буфер Аргинин гидрохлорид Хлорид натрия Полисорбат 80 pH F1 25 мг/мл 40 мМ 40 мМ 120 мМ 0,02 вес. % 5,5 F2 25 мг/мл 40 мМ 40 мМ 120 мМ 0,02 вес. % 5,8 F3 25 мг/мл 40 мМ 40 мМ 120 мМ 0,02 вес. % 6,0 F4 25 мг/мл 40 мМ 40 мМ 120 мМ 0,02 вес. % 6,2 F5 25 мг/мл 40 мМ 40 мМ 120 мМ 0,02 вес. % 6,5

Способ приготовления композиции антитела: антитело переносили в целевой буфер (все компоненты, кроме полисорбата 80 и антитела) ультрафильтрацией, добавляли необходимое количество полисорбата 80, доводили концентрацию антитела до 25 мг/мл, асептически дозировали и помещали в холодильник на 4°C и в термостат на 37°C, соответственно, отбирали после недели 0, недели 3 и недели 5 для анализа и детекции, и анализы включали SEC-ВЭЖХ и IEF.

Способы анализа и детекции:

Детекция чистоты: молекулярная эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография (SEC-ВЭЖХ); принцип обнаружения заключается в разделении и определении количества молекул в соответствии с их разным размером, а затем в получении информации о количестве мономеров, агрегатов и фрагментов в образце.

Изомеры с разным количеством заряда: визуализация капиллярного изоэлектрофокусирующего электрофореза (IEF); принцип детекции заключается в разделении и определении количества белков по их разным изоэлектрическим точкам, а затем в получении информации о количестве кислых и основных белков в образце; для продуктов антител подходят менее кислые пики.

Результаты теста представлены в приложенных Фиг. 1-2.

Результаты испытаний показали, что чистота PD1-H944 в F3 была выше, чем в других композициях, а пик кислотности был ниже, чем в других композициях, что указывает на то, что стабильность F3 была лучше, чем в других композициях.

Пример 2: Скрининг концентраций антитела

Указанная композиция PD1-H944 для этого варианта осуществления показана в следующей таблице.

Таблица 2. Композиции с различными концентрациями антитела

Серийный номер композиции Моноклональное антитело против PD-1 Гистидиновый буфер Хлорид натрия Полисорбат 80 pH F1 25 мг/мл 20 мМ 120 мМ 0,02 вес. % 6,0 F2 10 мг/мл 20 мМ 120 мМ 0,02 вес. % 6,0

Способ приготовления композиции антитела: антитело переносили в целевой буфер (все компоненты, кроме полисорбата 80 и антитела) ультрафильтрацией, добавляли необходимое количество полисорбата 80, а затем концентрацию антитела доводили до 10 мг/мл и 25 мг/мл, соответственно, асептически распределяли и помещали в холодильник с температурой 4°C и термостат с температурой 37°C, и брали образцы для анализа после 0, 3 и 5 недели, соответственно. Методы включали SEC-ВЭЖХ и IEF.

Способы анализа и детекции:

Тест на чистоту: молекулярная эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография.

Изомеры по заряду: капиллярный изоэлектрический фокусирующий электрофорез с визуализацией.

Результаты теста представлены в приложенных Фиг. 3-4.

Результаты анализа показали, что чистота PD1-H944 в F1 и F2 была выше 99% при хранении при 37°C в течение 0, 3 и 5 недель, а тенденция изменения пика кислотности была в основном одинаковой, что указывает на то, что стабильность PD1-H944 в F1 и F2 была сравнима.

Пример 3: Скрининг концентрации поверхностно-активного вещества

Указанная композиция PD1-H944 этого варианта осуществления показана ниже.

Таблица 3. Композиции с различными концентрациями поверхностно-активного вещества

Серийный номер композиции Моноклональное антитело против PD-1 Гистидиновый буфер Хлорид натрия Полисорбат 80 pH F1 25 мг/мл 20 мМ 120 мМ 0,02 вес. % 6,0 F2 25 мг/мл 20 мМ 120 мМ 0,04 вес. % 6,0

Способ приготовления композиции антитела: антитело переносили в целевой буфер (все компоненты, кроме полисорбата 80 и антитела) ультрафильтрацией, добавляли необходимое количество полисорбата 80, доводили концентрацию антитела до 25 мг/мл, асептически дозировали и помещали в холодильник на 4°C и в термостат на 37°C, соответственно, отбирали после недели 0, недели 3 и недели 5 для анализа и детекции, и анализы включали SEC-ВЭЖХ и IEF.

Способы анализа и детекции:

Тест на чистоту: молекулярная эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография.

Изомеры по заряду: капиллярный изоэлектрический фокусирующий электрофорез с визуализацией.

Результаты теста представлены в приложенных Фиг. 5-6.

Результаты детекции показали, что чистота PD1-H944 в F1 была выше, чем в F2, и тенденция изменения пика кислотности была в основном такой же, что указывает на то, что стабильность F1 была лучше, чем у F2.

Пример 4: Скрининг концентраций регулятора осмолярности

Указанная композиция PD1-H944 этого варианта осуществления показана ниже.

Таблица 4. Композиции с различными концентрациями регулятора осмолярности

Серийный номер композиции Моноклональное антитело против PD-1 Гистидиновый буфер Хлорид натрия Полисорбат 80 pH F1 25 мг/мл 20 мМ 120 мМ 0,02 вес. % 6,0 F2 25 мг/мл 20 мМ 160 мМ 0,02 вес. % 6,0 F3 25 мг/мл 20 мМ 80 мМ 0,02 вес. % 6,0

Способ приготовления композиции антитела: антитело переносили в целевой буфер (все компоненты, кроме полисорбата 80 и антитела) ультрафильтрацией, добавляли необходимое количество полисорбата 80, доводили концентрацию антитела до 25 мг/мл, асептически дозировали и помещали в холодильник на 4°С и в термостат на 37°С, соответственно, и отбирали для анализа и детекции после недели 0, недели 3 и недели 5, соответственно.

Способы анализа и детекции:

Тест на чистоту: молекулярная эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография.

Результаты теста представлены на Фиг. 7.

Результаты анализа показали, что чистота PD1-H944 в F1 была выше, чем у F2 и F3, что свидетельствует о лучшей стабильности F1, чем у F2 и F3.

Пример 5: Скрининг стабилизатора и концентрации стабилизатора

Указанная композиция PD1-H944 этого варианта осуществления показана ниже.

Таблица 5. Композиции с различными стабилизаторами и различными концентрациями стабилизатора *

Серийный номер композиции Моноклональное антитело против PD-1 Гистидиновый буфер Хлорид натрия Сахароза Аргинина гидрохлорид Трегалоза Полисорбат 80 F1 25 мг/мл 20 мМ 120 мМ 40 мМ 0,02 вес. % F2 25 мг/мл 20 мМ 120 мМ 80 мМ 0,02 вес. % F3 25 мг/мл 20 мМ 120 мМ 20 мМ 0,02 вес. % F4 25 мг/мл 20 мМ 205 мМ 0,02 вес. % F5 25 мг/мл 20 мМ 200 мМ 0,02 вес. % F6 25 мг/мл 20 мМ 205 мМ 40 мМ 0,02 вес. % F7 25 мг/мл 20 мМ 40 мМ 200 мМ 0,02 вес. %

* pH 6.0 в каждой композиции

Способ приготовления композиции антитела: антитело перемещали в целевой буфер (все компоненты, кроме полисорбата 80 и антитела) ультрафильтрацией, добавляли необходимое количество полисорбата 80, доводили концентрацию антитела до 25 мг/мл, асептически дозировали и помещали в холодильник -80°C и термостат 45°C, отбирали для анализа и детекции после недели 0, недели 1, недели 2 и недели 4, соответственно.

Способы анализа и детекции:

Тест на чистоту: молекулярная эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография.

Результаты теста представлены на Фиг. 8.

Результаты испытаний показали, что чистота PD1-H944 в F1 была выше, чем в других композициях при 45°C в течение 4 недель, что указывает на то, что стабильность F1 была лучше, чем в других композициях.

Пример 6: Анализ годности композиции

Три серии композиций рекомбинантного моноклонального антитела против PD-1 (состава 25 мг/мл PD1-H944 + 20 мМ гистидиновый буфер + 120 мМ хлорид натрия + 40 мМ аргинина гидрохлорид + 0,02 вес. % полисорбата 80, pH 6,0) проверяли на стабильность при 2-8°C и 25±2°C с использованием SEC-ВЭЖХ, CEX-ВЭЖХ, а также проверяли биологическую активность.

Способы анализа и детекции:

Тест на чистоту: молекулярная эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография.

Изомеры по разряду: Катионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография (CEX-ВЭЖХ); принцип детекции заключается в разделении и определении количества белков в соответствии с их различным зарядом и, таким образом, в получении информации о гетерогенности заряда образца.

Биологическая активность: метод репортерного гена; принцип анализа заключается в том, что связывание экспрессирующих PD-L1 клеток-мишеней с эффекторными клетками, экспрессирующими PD-1 и люциферазу, ингибирует экспрессию люциферазы, а добавление антитела против PD-1 блокирует связывание PD-1 с PD-L1, поэтому биологическая активность антитела против PD-1 может быть определена путем анализа силы экспрессии люциферазы (смотри PCT/CN2019/126594).

Результаты эксперимента представлены в Таблицах с 6 по 11.

Таблица 6. Данные стабильности композиции PD1-H944 (Lot1), хранившейся при 4°C

Контролируемые параметры Срок хранения при 4°C, месяцы 0 3 6 9 12 18 24 30 36 42 Чистота (SEC-ВЭЖХ, %) Мономеры 99,5 99,4 99,4 99,0 99,1 99,3 99,2 99,2 99,1 99,4 Агрегаты 0,5 0,6 0,6 1,0 0,9 0,7 0,7 0,8 0,9 0,6 Фрагменты 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Изомеры по разряду (CEX-ВЭЖХ, %) Пики кислотности 12,3 12,0 13,2 13,8 14,5 15,6 15,7 16,9 18,2 18,9 Варианты лизина 87,7 88,1 86,8 86,1 85,5 84,4 84,2 83,2 81,8 81,0 Биологическая активность, % 100 93 92 87 97 86 94 88 87 83

Таблица 7. Данные стабильности композиции PD1-H944 (Lot1), хранившейся при 25°C

Контролируемые параметры Срок хранения при 25°C, месяцы 0 2 4 6 8 10 12 Чистота (SEC-ВЭЖХ, %) Мономеры 99,5 99,3 99,2 99,1 99,0 98,1 96,8 Агрегаты 0,5 0,7 0,7 0,8 0,9 1,8 3,0 Фрагменты 0,0 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 Изомеры по разряду (CEX-ВЭЖХ, %) Пики кислотности 12,3 17,2 20,3 25,3 29,7 33,7 39,4 Варианты лизина 87,7 82,8 79,7 74,8 70,3 66,3 60,6 Биологическая активность, % 100 92 93 90 88 81 90

Таблица 8. Данные стабильности композиции PD1-H944 (Lot2), хранившейся при 4°C

Контролируемые параметры Срок хранения при 4°C, месяцы 0 3 6 9 12 18 24 30 36 42 Чистота (SEC-ВЭЖХ, %) Мономеры 99,6 99,5 99,4 99,1 98,9 99,3 99,2 99,2 99,2 99,4 Агрегаты 0,4 0,5 0,6 0,9 1,1 0,7 0,8 0,8 0,8 0,6 Фрагменты 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Изомеры по разряду (CEX-ВЭЖХ, %) Пики кислотности 13,6 13,4 14,4 15,3 14,7 16,7 16,8 18,0 18,5 19,6 Варианты лизина 86,5 86,6 85,6 84,7 85,3 83,2 83,1 82,0 81,6 80,4 Биологическая активность, % 92 99 93 97 95 104 75 84 78 86

Таблица 9 Данные стабильности композиции PD1-H944 (Lot2), хранившейся при 25°C

Контролируемые параметры Срок хранения при 25°C, месяцы 0 2 4 6 8 10 12 Чистота (SEC-ВЭЖХ, %) Мономеры 99,6 99,4 99,1 98,9 99,0 98,5 98,3 Агрегаты 0,4 0,6 0,8 1,0 1,0 1,4 1,6 Фрагменты 0,0 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Изомеры по разряду (CEX-ВЭЖХ, %) Пики кислотности 13,6 18,0 22,0 27,1 31,5 32,8 38,4 Варианты лизина 86,5 82,0 78,0 72,9 68,6 67,2 61,6 Биологическая активность, % 92 87 92 97 87 74 90

Таблица 10 Данные стабильности композиции PD1-H944 (Lot3), хранившейся при 4°C

Контролируемые параметры Срок хранения при 4°C, месяцы 0 3 6 9 12 18 24 30 36 42 Чистота (SEC-ВЭЖХ, %) Мономеры 99,6 99,5 99,5 99,2 98,9 99,3 99,4 99,3 99,2 99,5 Агрегаты 0,4 0,5 0,5 0,8 1,1 0,7 0,6 0,7 0,8 0,5 Фрагменты 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Изомеры по разряду (CEX-ВЭЖХ ,%) Пики кислотности 13,6 13,6 14,9 15,6 15,7 16,6 17,2 17,7 19,5 19,5 Варианты лизина 86,4 86,4 85,1 84,5 84,3 83,4 82,8 82,3 80,5 80,4 Биологическая активность, % 100 100 100 104 86 100 82 90 96 90

Таблица 11 Данные стабильности композиции PD1-H944 (Lot3), хранившейся при 25°C

Контролируемые параметры Срок хранения при 25°C, месяцы 0 2 4 6 8 10 12 Чистота (SEC-ВЭЖХ, %) Мономеры 99,6 99,4 99,2 99,1 99,0 98,5 98,6 Агрегаты 0,4 0,6 0,7 0,9 0,9 1,4 1,3 Фрагменты 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 Изомеры по разряду (CEX-ВЭЖХ, %) Пики кислотности 13,6 19,1 23,7 27,6 32,2 33,8 38,9 Варианты лизина 86,4 80,9 76,3 72,3 67,8 66,3 61,1 Биологическая активность, % 100 93 92 95 94 82 94

Экспериментальные результаты показывают, что композиция PD1-H944, описанная в настоящем изобретении, обладает хорошей стабильностью и может быть стабильно храниться в течение по меньшей мере 42 месяцев при 2-8°C и по меньшей мере 12 месяцев при 25°C.

Перечень последовательностей

Номер послеователь-ности Описание последовательности Последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 Последовательность аминокислот CDR1 лёгкой цепи антитела PD1-M944 мыши / гуманизированного антитела PD1-H944 ESVDSYGNSFMH SEQ ID NO:2 Последовательность аминокислот CDR2 лёгкой цепи антитела PD1-M944 мыши / гуманизированного антитела PD1-H944 AASNQGSGVPA SEQ ID NO:3 Последовательность аминокислот CDR3 лёгкой цепи антитела PD1-M944 мыши / гуманизированного антитела PD1-H944 QQSKEVPWT SEQ ID NO:4 Последовательность аминокислот CDR1 тяжёлой цепи антитела PD1-M944 мыши / гуманизированного антитела PD1-H944 GFTFSSYGMS SEQ ID NO:5 Последовательность аминокислот CDR2 тяжёлой цепи антитела PD1-M944 мыши / гуманизированного антитела PD1-H944 VATISGGGRDTYYSDSVKG SEQ ID NO:6 Последовательность аминокислот CDR3 тяжёлой цепи антитела PD1-M944 мыши / гуманизированного антитела PD1-H944 SRQYGTVWFFN SEQ ID NO:7 Последовательность аминокислот вариабельного участка тяжёлой цепи гуманизированного антитела PD1-H944 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRDTYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMNSLRAЭДТАVYYCSRQYGTVWFFNWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:8 Последовательность аминокислот вариабельного участка лёгкой цепи гуманизированного антитела PD1-H944 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYFCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO:9 Последовательность аминокислот константного участка тяжёлой цепи гуманизированного антитела PD1-H944 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO:10 Последовательность аминокислот константного участка лёгкой цепи гуманизированного антитела PD1-H944 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> СИНОСЕЛЛТЕХ ЛТД

<120> СТАБИЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ PD-1

<130> PCT69930SXB

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 1

Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 2

Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 3

Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 5

Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 6

Ser Arg Gln Tyr Gly Thr Val Trp Phe Phe Asn

1 5 10

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Gln Tyr Gly Thr Val Trp Phe Phe Asn Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 327

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 10

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Представлена стабильная композиция, пригодная для применения при лечении опухоли или рака, ассоциированного с PD-1, содержащая рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1 в количестве 10-25 мг/мл; буфер в концентрации 20-40 мМ; регулятор осмолярности в концентрации 80-160 мМ; стабилизатор в концентрации 20-205 мМ; поверхностно-активное вещество в количестве 0,02-0,04 вес.%, при этом pH раствора составляет 5,5-6,5, а также раскрыто ее применение для получения лекарственного средства для лечения опухоли или рака, ассоциированного с PD-1. Указанная композиция может повысить стабильность указанного антитела и продлевает срок годности указанного антитела в водных композициях. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 8 ил., 11 табл., 6 пр.

1. Стабильная композиция, пригодная для применения при лечении опухоли или рака, ассоциированного с PD-1, содержащая

рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1 в количестве 10-25 мг/мл;

буфер в концентрации 20-40 мМ;

регулятор осмолярности в концентрации 80-160 мМ;

стабилизатор в концентрации 20-205 мМ;

поверхностно-активное вещество в количестве 0,02-0,04 вес.%;

при этом pH раствора составляет 5,5-6,5,

а указанное рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1 содержит вариабельный участок лёгкой цепи и вариабельный участок тяжёлой цепи,

при этом указанный вариабельный участок лёгкой цепи содержит CDR1 лёгкой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, CDR2 лёгкой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2 и CDR3 лёгкой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 3; а

вариабельный участок тяжёлой цепи содержит CDR1 тяжёлой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 4, CDR2 тяжёлой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 5, и CDR3 тяжёлой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 6.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что

указанный буфер выбран из одного или более из следующего: цитратный буфер, ацетатный буфер или гистидиновый буфер;

указанный регулятор осмолярности выбран из хлорида натрия;

указанный стабилизатор представляет собой одно или более из следующего: сахароза, трегалоза или аргинина гидрохлорид;

указанное поверхностно-активное вещество выбрано из полисорбата 80.

3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанный стабилизатор представляет собой 205 мМ сахарозу, или 20-80 мМ аргинина гидрохлорид, или 200 мМ трегалозу.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что раствор композиции имеет pH 6,0.

5. Композиция по любому из пп. 1-4, содержащая 25 мг/мл рекомбинантного моноклонального антитела против PD-1; 20 мМ гистидинового буфера, 120 мМ хлорида натрия, 40 мМ аргинина гидрохлорида и 0,02 вес.% полисорбата 80.

6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанное рекомбинантное моноклональное антитело против PD-1 содержит последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 90%, 92%, 95%, 98% или 100% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 8 вариабельного участка лёгкой цепи антитела против PD-1, и/или последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 90%, 92%, 95%, 98% или 100% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 7 вариабельного участка тяжёлой цепи антитела против PD-1.

7. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанное антитело дополнительно содержит константный участок лёгкой цепи и константный участок тяжёлой цепи, предпочтительно последовательность аминокислот указанного константного участка лёгкой цепи имеет по меньшей мере 90%, 92%, 95%, 98% или 100% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 10 константного участка лёгкой цепи каппа и/или последовательность аминокислот указанного константного участка тяжёлой цепи имеет по меньшей мере 90%, 92%, 95%, 98% или 100% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 9 константного участка тяжёлой цепи IgG4.

8. Композиция по п. 1, в которой указанное антитело представляет собой антитело IgG, предпочтительно антитело IgG4.

9. Композиция по п. 1 или 6, в которой указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.

10. Композиция по любому из пп. 1-9, в которой указанное антитело имеет среднее K_D, которое связывается с рекомбинантным белком PD-1 человека со средней аффинностью K_D в диапазоне 20-200 пM, предпочтительно 60-70 пM, более предпочтительно 64,8 пM.

11. Композиция по любому из пп. 1-10, которая находится в форме водной композиции или в лиофилизированной форме.

12. Композиция по любому из пп. 1-11, которая может стабильно храниться в течение по меньшей мере 42 месяцев при температуре от 2 до 8°C и по меньшей мере 12 месяцев при 25°C.

13. Применение композиции по любому из пп. 1-12 для получения лекарственного средства для лечения опухоли или рака, ассоциированного с PD-1.

14. Применение по п. 13, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой рак толстой кишки.

15. Применение композиции по любому из пп. 1-12 для лечения опухоли или рака, ассоциированного с PD-1.

16. Применение по п. 15, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой рак толстой кишки.