Способ получения препарата для регуляции численности комара обыкновенного (Culex pipiens) Российский патент 2018 года по МПК A01N63/00 A01P7/04 

Изобретение относится к области борьбы с кровососущими насекомыми, а именно с комаром обыкновенным (Culex pipiens).

Много исследований направлено на улучшение существующих инсектицидов с целью объединения наилучших характеристик современных препаратов. В случае с химическими инсектицидами улучшения направлены на снижение вреда для нецелевых организмов, а в случае с биологическими препаратами - на уменьшение затрат при их производстве, а также на повышение скорости действия.

На сегодняшний день препараты для контроля численности насекомых на основе коротких антисмысловых олигонуклеотидов не используются. Обладая высокой избирательностью и отсутствием заметного негативного влияния на окружающую среду, они имеют большой потенциал стать основным средством в борьбе с комарами. Препараты на основе антисмысловых фрагментов ДНК (ДНК-инсектициды) могут объединить наилучшие качества современных инсектицидов и быть доступными, эффективными и безопасными одновременно.

Известен способ борьбы с комарами [Method for controlling mosquito reproduction, US 20050081428 A1, https://www.google.ch/patents/US20050081428], в котором основным действующим веществом является инсектицид из класса пиретроидов, с помощью которого достигается необходимый эффект.

Основное действие пиретроидов направлено на комаров, однако они оказывают негативное влияние, например, на рыб, птиц, млекопитающих, нецелевых насекомых. Таким образом, обрабатывая личинок комаров пиретроидами, мы негативно влияем и на другие организмы. Период полураспада пиретроидов сравнительно большой и в большинстве случаев составляет от нескольких дней до 20 месяцев (в зависимости от типа пиретроида и условий среды), что продлевает отравляющий эффект данного класса инсектицидов.

Недостатком этого метода является низкая избирательность в действии, а также сравнительно продолжительная токсическая нагрузка на окружающую среду.

Техническим результатом изобретения является повышение избирательности и эффективности воздействия на комара обыкновенного, в результате которого снижается количество особей, переходящих на стадию имаго, а также снижение токсической нагрузки на окружающую среду.

Способ получения препарата для регуляции численности комара обыкновенного (Culex pipiens) включает использование средств, избирательно действующих на организмы определенного вида, и заключается в том, что в емкость с личинками комара обыкновенного (Culex pipiens), находящихся в растворе солей хлористого натрия, хлористого калия и хлористого кальция в количестве NaCl - 7,4 г/л; KCl - 0,34 г/л; CaCl₂ - 0,22 г/л, добавляют водный раствор короткого 18-нуклеотидного консервативного антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-1 комара обыкновенного с последовательностью 5'-CACAACGTGGCCАСАCGG-3', смешанного с «Липосамом», чтобы при этом концентрация ДНК-фрагментов в растворе составила 2 фемтомоль/мкл.

Автором заявляемого технического решения впервые выявлено, что обработка личинок комара антисмысловым фрагментом антиапоптозного гена комара IAP-1 во взаимодействии с «Липосамом» достоверно снижает выход имаго по сравнению с контролем. И поскольку влияние этого фрагмента на личинок комара выявлено впервые, это доказывает существенность отличий.

Причинно-следственная связь между отличительными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом заключается в том, что антисмысловой фрагмент антиапоптозного гена комара смещает биохимические реакции клеток насекомого (в наших экспериментах - комара обыкновенного) в сторону апоптоза, однако детали механизма смещения этих реакций в науке на данный момент окончательно не выяснены. Предполагается, что он работает по общему механизму действия антисмысловых олигонуклеотидов, снижая экспрессию целевого антиапоптозного белка. Это вызывает апоптотические процессы в клетках и гибель насекомого.

Пример конкретного осуществления способа.

Для эксперимента были собраны личинки комара обыкновенного (Culex pipiens). В среднем, для каждого варианта группы эксперимента были использованы 10-15 личинок 2-4 возрастов. Все насекомые находились в контейнерах с 20 мл раствора, содержащего NaCl - 7,4 г/л; KCl - 0,34 г/л; CaCl₂ - 0,22 г/л, при среднесуточной температуре 25-27°С. В качестве питания каждый день использовалась навеска из перетертой сухой дафнии (10-20 мг в день/контейнер). В контейнер был добавлен водный раствор фрагментов ДНК (в концентрации 100 пмоль/мкл) объемом 40 мкл, перемешенным с 40 мкл «Липосама». После добавления ДНК-фрагментов в раствор, их концентрация составила 2 фемтомоль/мкл. Последовательность примененного антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-1 была следующей: 5'-CACAACGTGGCCАСАCGG-3'. Емкости с личинками контрольных групп содержали воду и воду с добавлением «Липосама» (40 мкл). В качестве контрольного антисмыслового олигонуклеотида использовался ДНК-фрагмент гена гексокиназы комара обыкновенного с последовательностью 5'-TTGACGATGGCCAGGCGA-3' (GEX). В экспериментальном сосуде использовали «Липосам» и водный раствор олигонуклеотидов со следующей последовательностью: 5'-CACAACGTGGCCАСАCGG-3'. Фрагменты были синтезированы ЗАО "Евроген РУ" (Россия). Был использован χ²-критерий Пирсона с поправкой Йетса для оценивания инсектицидного действия фрагментов ДНК. Использовали препарат «Липосам» (Изготовитель: ЧП «БТУ-Центр», Украина, 24321, Винницкая обл., г. Ладыжин, ул. Строителей, 35). Смесь взбалтывают перед применением.

Эксперимент проводили в четырехкратной повторности.

Антисмысловой фрагмент антиапоптозного гена IAP-1 комара обыкновенного проявил достоверное инсектицидное действие и снизил выход имаго комара. Достоверные различия в выходе имаго были обнаружены между группами контроль vs. IAP-1 + «Липосам» (29,1%; Р<0,01) и группами контроль + «Липосам» vs. IAP-1 + «Липосам» (21,9%; Р<0,01).

Результаты эксперимента представлены в таблицах 1 и 2. Полученные результаты показывают перспективность совместного применения антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-1 с «Липосамом» в реальных условиях с целью борьбы с кровососущими насекомыми, в частности - комарами. По сравнению с прототипом заявленный способ является экологически более безопасным, так как во всех клетках есть пути распада нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к биотехнологии и энтомологии. Предложен способ получения препарата для регуляции численности комара обыкновенного (Culex pipiens). Способ включает внесение в раствор солей в количестве: NaCl - 7,4 г/л; KCl - 0,34 г/л; CaCl₂ - 0,22 г/л и добавление водного раствора короткого 18-нуклеотидного консервативного антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-1 комара с последовательностью 5'-CACAACGTGGCCACACGG-3', смешанного с «Липосамом», в количестве, чтобы концентрация ДНК-фрагментов в растворе составила 2 фемтомоль/мкл. Изобретение обеспечивает повышение избирательности и эффективности воздействия на комара обыкновенного, снижая количество особей, переходящих на стадию имаго. 2 табл., 1 пр.

Способ получения препарата для регуляции численности комара обыкновенного (Culex pipiens), включающий применение средств, обладающих избирательным действием на организмы определенного вида, отличающийся тем, что в емкость с личинками комаров, находящихся в растворе солей хлористого натрия, хлористого калия и хлористого кальция в количестве NaCl - 7,4 г/л; KCl - 0,34 г/л; CaCl₂ - 0,22 г/л, добавляют водный раствор короткого 18-нуклеотидного консервативного антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-1 комара с последовательностью 5'-CACAACGTGGCCACACGG-3', смешанного с «Липосамом», чтобы при этом концентрация ДНК-фрагментов в растворе составила 2 фемтомоль/мкл.