Способ получения протеиназ с фибринолитической и фибриногенолитической активностями Российский патент 2018 года по МПК C12N9/62 C12N1/14 C12R1/66 

Изобретение относится к области биотехнологии, получению протеолитических ферментов фибриногенолитического действия.

Фибриноген - белок плазмы крови, предшественник фибрина, волокна которого составляют основу тромба. Чрезмерное тромбообразование приводит к развитию тромбоэмболических заболеваний с возможным летальным исходом. Удаление тромбов из сосудов возможно хирургически или ферментативно. Протеазы, обладающие фибринолитической активностью, входят в состав противосвертывающих и антигипертензивных препаратов [1, 2] Применяются протеиназы животного, растительного и микробного происхождения с фибринолитической и фибриногенолитической активностью [3]. Преимущество имеют ферментные препараты, обладающие одновременно фибринолитической и фибриногенолитической активностью [4], фибролаза, получаемая из яда змеи Agkistrodon contortrix contortrix [5] или наттокиназа из Bacillus subtilis [6].

Известны способы получения протеиназ с фибринолитическим действием с использованием штаммов микромицетов рода Aspergillus [7-10], к примеру Aspergillus brasiliensis AUMC 9735 [10], A. flavus AUMC 9736 [10], A. japonicum KSS05 [11], A. oryzae KSK-3 [12], A. niger [13]. Недостатком этих способов является отсутствие у протеиназ фибриногенолитической активности.

Ближайшим аналогом является способ получения протеиназ с фибринолитическим действием с использованием штамма микроскопического гриба Aspergillus ustus 1, в котором из известных способов получают протеиназы с наиболее высокой и выраженной активностью в отношении фибрина (соотношение фибринолитической активности и неспецифической протеолитической (казеинолитической) активности - 6,92) [14].

Задачей настоящего изобретения является разработка нового способа получения протеиназ, обладающих одновременно высокой фибринолитической и фибриногенолитической активностями.

Задача решается:

1) с помощью использования штамма Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D - продуцента протеиназ с фибринолитической и фибриногенолитической активностями;

2) культивирования продуцирующего их штамма микроскопического гриба Aspergillus ochraceus на сложной среде, содержащей глюкозу, крахмал, гидролизат рыбной муки, пептон, хлорид натрия, дигидрофосфат калия и сульфат магния, при следующем соотношении компонентов (г/л):

Глюкоза - 35,0

Крахмал - 1,25

Гидролизат рыбной муки - 5,0

Пептон - 5,0

Хлорид натрия NaCl - 2,0

Дигидрофосфат калия KН₂РО₄ - 0,5

Сульфат магния MgSO₄×7H₂O - 0,5

Вода водопроводная до 1 л

рН 5,5.

Штамм при культивировании на жидкой питательной среде, продуцирует внеклеточные ферменты с фибринолитическим и фибриногенолитическим действием, выделение которых из культуральной жидкости проводят известными методами с помощью осаждения белков сульфатом аммония до степени насыщения 80%, растворением в минимальном объеме дистиллированной воды. Сформированные осадки центрифугируют, растворяют в буфере (рН 8,2), удаляют нерастворимую часть осадков, а для удаления солей аммония раствор диализуют при 4°С против того же буфера или проводят гель-фильтрацию на колонках с сефадексом G-25 [7]. Активность фермента определяют рекомендованными методами [14] с фибрином и фибриногеном и получают фибринолитическую активность не менее 18 Е_Тир и фибриногенолитическую 109 Е_Тир.

Раствор хранят в холодильнике при 4°С в течение 3 дней или лиофилизируют для длительного хранения.

Штамм Aspergillus ochraceus депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов под номером ВКМ F-4104D. Штамм Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D был также использован в патенте №2461614 как продуцент протеиназы - активатора протеина С.

Штамм поддерживают на косяках с сусло-агаром 4-5 °Б с начальным рН 6,0-6,2 или стандартной среде Чапек-агар при комнатной температуре с пересевом через 1-3 месяца, а при хранении при 5°С с пересевом через 6-12 месяцев.

Пример 1.

Способ получения протеиназ с фибринолитической и фибриногенолитической активностями с использованием штамма Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D.

В качестве посевного материала используют двухсуточную культуру, полученную на среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон. Штамм Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D выращивают в условиях глубинного культивирования в 100 мл питательной среды в качалочных колбах объемом 750 мл на круговых качалках (200 об/мин) при 28°С. Дальнейшее культивирование штамма проводят при тех же условиях на среде, содержащей глюкозу, крахмал, пептон, гидролизат рыбной муки, хлорид натрия, дигидрофосфат калия, гидратированный сульфат магния, при следующем соотношении компонентов, г/л (в пересчете на кристаллогидратные формы солей):

Глюкоза - 35,0

Крахмал - 1,25

Гидролизат рыбной муки - 5,0

Пептон - 5,0

Хлорид натрия NaCl - 2,0

Дигидрофосфат калия KН₂РО₄ - 0,5

Сульфат магния MgSO₄×7H₂O - 0,5

Вода водопроводная до 1 л

рН 5,5.

Мицелий после 2 суток культивирования отделяют от среды (фильтрованием через бумажный фильтр или центрифугированием) и получают культуральную жидкость.

Белки культуральной жидкости осаждают сернокислым аммонием при 80%-ном насыщении на холоду. После формирования осадков их отделяют центрифугированием при 15 тыс.об/мин. Осадок белков растворяют в 0,005 М Трис-HCl буфере (рН 8,2), удаляют нерастворимую часть осадка, раствор освобождают от ионов аммония диализом, при 4°С против того же буфера. Полученный раствор хранят в холодильнике при 4°С.Для длительного хранения раствор лиофилизируют.

Фибринолитическую и фибриногенолитическую активности определяют путем инкубации протеиназ культульной жидкости штамма Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D с суспензией бычьего фибрина или фибриногена [14] и с использованием фибриновых пластин [9].

К 200 мкл фильтрата культуральной жидкости микромицета добавляют 400 мкл 1%-ной суспензии фибрина или 1%-ной суспензии бычьего фибриногена, приготовленной на 0.1 М Трис-HCl буфере (рН 8.2), и после инкубации в течение 60 мин при 37°С реакцию останавливают добавлением 600 мкл 10%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Далее, пробы центрифугируют при 12400 g и в супернатанте, проводят измерение поглощения при 275 нм [14]. За единицу активности (Е_Тир) принимают количество мкмоль тирозина, освобождающегося при гидролизе протеиназой белкового субстрата в 1 мл пробы за 1 мин при 37°С.

Для приготовления фибриновых пластин в чашке Петри смешивают 9 мл 0.76%-ного раствора фибриногена и 0.2 мл 0.4%-ного раствора тромбина, приготовленных на смеси физиологического раствора и 0.05 М Трис-HCl буфера (рН 8.2) в соотношении 9:1. Образовавшийся гель прогревают при 86°С в течение 30 мин. Затем на эту фибриновую пластину в чашке Петри наносят 30 мкл фильтрата культуральной жидкости микромицетаи проводят инкубацию в течение 3 часов при 37°С. Активность выражают в условных единицах (1 усл. ед. соответствует 10 мм² зоны просветления) на 1 мл культуральной жидкости [9].

По предлагаемому способу фибриногенолитическая активность протеиназ в культуральной жидкости, определенная с использованием в качестве субстрата 1%-ной суспензии бычьего фибриногена, составляет 109,4 Е_Тир, а фибринолитическая активность, определенная с использованием в качестве субстрата 1%-ной суспензии бычьего фибрина, составляет 18,1 Е_Тир.

Фибринолитическая активность протеиназ в культуральной жидкости, определенная с помощью фибриновых пластин, по предлагаемому способу составляет 649,3 усл. ед. /мл и фибриногенолитическая активность - 109,4 Е_Тир.

Пример 2.

Сравнение способов получения протеиназ с фибринолитической и фибриногенолитической актвиностями штамма Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D и ближайшего аналога - штамма Aspergillus ustus 1.

Сравнение предлагаемого способа получения протеиназ с применением штамма А. ochraceus ВКМ F-4104D и ближайшего способа - аналога с A. ustus 1 проводят по примеру 1. Фибринолитическая активность протеиназ в культуральной жидкости по предлагаемому способу близка к получаемой по способу - аналогу (см. табл.). Но по предлагаемую способу фибриногенолитическую активность протеиназ в культуральной жидкости в 4 раза более высокая, чем у протеиназ - по способу - ближайшему аналогу.

Литература

1. Matsui Т., Fujimura Y., Titani K. Snake venom proteases affecting hemostasis and thrombosis // Biochim Biophys Acta, 2000, 1477, 1-2, 146-56.

2. Shyh-Horng C., Yen-Shan C. Characterization of two major families of fibrinogenolytic proteases from the venom of Taiwan habu with special reference to their medical applications // Toxin Reviews. 2005, 24, 1, 43-61.

3. Craik C.S., Page M.J., Madison E.L. Proteases as therapeutics // Biochem J., 2011. 435, 1, 1-16.

4. New Therapeutic Agents in Thrombosis and Thrombolysis / Ed. J.E. Freedman, J. Loscalzo, 2009,"Informa healthcare", NY London, 690p.

5. Ahmed N.K., Gaddis R.R., Tennant K.D., Lacz J.P. Biological and thrombolytic properties of fibrolase-a new fibrinolytic protease from snake venom // Haemostasis, 1990, 20, 6, 334-40.

6. Xiao P., Yao S., Rizwan-ur-rehman, Kang R., Wang Y. A fibrinolytic enzyme produced by Bacillus subtilis using Chickpea (Cicer arietinum L.) as substrate //. Advance Journal of Food Science and Technology, 2014. 6. 12, 1294-1300.

7. Ландау Н.С., Кураков A.B., Туликова О.М., Батомункуева Б.П., Струкова С.М., Егоров Н.С. Экстрацеллюларные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами// Микробиология. 1998, 67, 2, 215-220.

8. Осмоловский А.А., Звонарева Е.С., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. Воздействие внеклеточных протеаз микромицетов рода Aspergillus на белки системы гемостаза // Биоорганическая химия, 2014, 40, 6, 688-694.

9. Шаркова Т.С., Кураков А.В., Осмоловский А.А., Матвеева Э.О., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. Скрининг продуцентов протеиназ с фибринолитической и коллагенолитической активностями среди микромицетов // Микробиология, 2015, 84, 3, 316-322.

10. Kotb Е., Helal G.E.-D.A., Edries F.M. Screening for fibrinolytic filamentous fungi and enzymatic properties of the most potent producer, Aspergillus brasiliensis AUMC 9735 // Biologia. Sect. Cell. Mol. Biol, 2015, 70, 12, 1565-1574.

11. Yadav S., Siddalingeshwara K.G. Screening and biosynthesis of fibrinolytic enzyme from Aspergillus japonicum II J. Drug Deliv. Therap, 2015, 5. 6, 60-62.

12. Schirasaka N., Naitou M., Okamura K., Kusuda M., Fukuta Y., Terashita T. Purification and characterization of a fibrinolytic protease from Aspergillus oryzae KSK-3 // Mycoscience, 2012, 53, 5, 354-364.

13. Aradhye P.K., Chavan M.D. Production and characterization fibrinolytic enzyme from Aspergillus niger II World J. Pharmacy and Pharm. Science, 2015, 3. 9, 843-851.

14. Осмоловский А.А., Попова E.A., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. Фибринолитическая и коллагенолитическая активность внеклеточных протеиназ штаммов микромицетов Aspergillus ochraceus L-1 и Aspergillus ustus 1 // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология, 2016, 1, 71-75.

15. Билай В.И., Коваль Э.З. 1988. Аспергиллы. Определитель. Киев: Наукова Думка, 203 с.

16. Raper K.В., Fermell D.J. The genus Aspergillus. USA, Baltimore, Williams a. Wilkins Co., 1965. 686 p.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения протеиназ с фибринолитической и фибриногенолитической активностями предусматривает культивирование штамма Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D на питательной среде, содержащей глюкозу, крахмал, гидролизат рыбной муки, пептон, NaCl, KH₂PO₄, MgSO₄×7H₂O и водопроводную воду при заданных соотношениях компонентов и при заданной температуре в течение 2 суток. Изобретение позволяет получать протеиназы, обладающие фибринолитической и фибриногенолитической активностями. 1 табл., 2 пр.

Способ получения протеиназ с фибринолитической и фибриногенолитической активностями путем культивирования штамма микроскопического гриба рода Aspergillus, отличающийся тем, что используют штамм Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D и ферментацию ведут на сложной среде, содержащей глюкозу, крахмал, гидролизат рыбной муки, пептон, хлорид натрия, дигидрофосфат калия и сульфат магния при начальном значении рН 5,5 и следующем составе компонентов (г/л):

Глюкоза - 35,0

Крахмал - 1,25

Гидролизат рыбной муки - 5,0

Пептон - 5,0

Хлорид натрия NaCl - 2,0

Дигидрофосфат калия KН₂РО₄ - 0,5

Сульфат магния MgSO₄×7H₂O - 0,5

Вода водопроводная до 1 л.