ШТАММ ASPERGILLUS OCHRACEUS - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕИНАЗЫ - АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2012 года по МПК C12N1/14 C12N9/62 C12R1/66 

Изобретение относится к области биотехнологии, получению протеолитических ферментов - активаторов протеина С плазмы крови человека.

Активаторы протеина С - протеиназы, осуществляющие образование из витамин К-зависимого профермента протеина С его активной формы - активированного протеина С в крови млекопитающих, включая человека. Активированный протеин С является ключевым ферментом системы гемостаза, который инактивирует факторы свертывания крови Va и VIIIa, предотвращая чрезмерное тромбообразование. При недостатке протеина С в крови снижается активность активированного протеина С, что обусловливает возникновение тромбоэмболических осложнений с возможным летальным исходом [1, 2]. В связи с этим актуальным является диагностика его содержания в крови, которую можно осуществлять с использованием специфических протеиназ - активаторов протеина С [3].

Известно, что активаторы протеина С имеются в яде некоторых видов змей [4]. Активаторы протеина С из яда щитомордника Agkistrodon contortrix используются для производства диагностических препаратов (Protac^® фирмы PENTHAPHARM (Швейцария)) [5, 6]. Недостатками получения активаторов протеина С из яда змей являются крайняя сложность добывания змей и ограниченность этого источника.

Ввиду важности активатора протеина С для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний ведутся поиски альтернативных организмов для его получения, среди которых наиболее доступными и перспективными для масштабного производства могут быть микроорганизмы. Микроскопические грибы представляют одни из таких объектов, так как в их культуральной жидкости обнаружены комплексы внеклеточных протеиназ, обладающих не только фибринолитическими, но и антикоагулянтными свойствами. Известны штаммы Aspergillus ochraceus 1, Penicillium claviforme 2, P.granulatum 7, Alternaria sp. 10 [7] и Aspergillus ochraceus 513 [8], культуральная жидкость которых обладает антикоагулянтными свойствами - действием по типу активатора протеина С. Актикоагулянтная активность по типу активатора протеина С, определенная по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени плазмы крови человека [9], у Aspergillus ochraceus 1 составляет 854%, Penicillium claviforme 1 - 690%, P.granulatum 7 - 500%, Alternaria sp.10 - 500% [7] и у A.ochraceus 513 - 65,7% [8].

Ближайшим аналогом следует принять штамм микроскопического гриба Aspergillus ochraceus 1, который проявляет из известных штаммов наиболее высокую антикоагулянтную активность активатора протеина С - 854% [7].

Недостатками ближайшего аналога Aspergillus ochraceus 1 являются длительный срок культивирования штамма (7 сут) и низкая активность получаемого активатора протеина С.

Задачей настоящего изобретения является изыскание нового штамма микроскопического гриба Aspergillus ochraceus, продуцирующего с высокой активностью протеиназу - активатор протеина С плазмы крови.

Задача решается с помощью вновь выделенного авторами штамма Aspergillus ochraceus, продуцента активатора протеина С плазмы крови, описываемого ниже.

Новый штамм Aspergillus ochraceus, предназначенный для получения протеиназы, выделен Кураковым А.В. на среду Чапек-агар из образцов погребенной почвы, отобранной в Краснодарском крае (п.Сенной, раскоп древнегреческого города Фанагории).

Штамм Aspergillus ochraceus депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов под номером ВКМ F-4104D.

Штамм Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D относится к митоспоровым грибам - анаморфам аскомицетного аффинитета: рода Emericella, семейства Trichocomaceae, порядка Eurotiales, класса Eurotiomycetes, отдела Ascomycota.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D имеет типичные для этого вида культурально-морфологические признаки (Билай, Коваль, 1988; Raper, Fennel, 1949) [10, 11]. Колонии на средах Чапека и сусло-агаре достигают в среднем 3,5 см в диаметре на 10 сут, плоские, бархатистые, ярко-охристого цвета, с мелкими каплями эксудата. Обратная сторона красновато-коричневых тонов. Конидиальные головки шаровидные, при старении распадаются на 2-4 компактные колонки светло-охристо-коричневого цвета. Конидиеносец двуярусный, по всей везикуле плотно расположены метулы (15-20×5-6 мкм) с фиалидами размером (7-13×2-3) мкм. Конидиеносцы диаметром 7-9 мкм, гладкие, неокрашенные до желтоватых тонов, расширение конидиеносца округлое, конидии округлые, гладкие, 3,0-3,5 мкм.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм хорошо растет на стандартных средах: сусло-агаре, среде Чапека, среде Гетчинсона, глюкозо-пептонной среде при температуре 25°С. Спороношение штамм начинает на 4-5 сут, обильноспороносящие колонии формирует к 10 суткам. Штамм термотолерантный, способен расти в интервале температур 8°С-42°С. Споры сохраняют жизнеспособность при прогревании в почве в течение нескольких часов при температуре 60°С. На питательных средах растет в широком диапазоне рН, включая кислую (до рН 2,5-3,0) и слабощелочную область (рН 7-9). Штамм обладает протеолитической (казеинолитической), целлюлозолитической и ксиланазной (гидролизует целлюлозу, гемицеллюлозу) и липолитической активностью.

Штамм поддерживают на косяках с сусло-агаром 4-5°Б с начальным рН 6,0-6,2 или стандартной среде Чапек-агар при комнатной температуре с пересевом через 1-3 месяца, а при хранении при 5°C с пересевом через 6-12 месяцев.

Штамм является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении кроликов не проявляет зоопатогенных свойств. При нанесении экстракта культуры штамма на кожу кролика не вызывает токсической реакции.

Штамм при культивировании на жидкой питательной среде продуцирует внеклеточный фермент с активаторным к протеину С действием, выделение которого из культуральной жидкости проводят известными методами с помощью осаждения белков сульфатом аммония до степени насыщения 80%, растворением в минимальном объеме дистиллированной воды. Сформированные осадки центрифугируют, растворяют в буфере (рН 8,2) или дистилированной воде, удаляют нерастворимую часть осадков, а для удаления солей аммония раствор диализуют при 4°С против того же буфера или проводят гель-фильтрацию на колонках с сефадексом G-25 [7]. Полученный раствор хранят в холодильнике при 4°С или лиофилизируют для длительного хранения.

Пример 1

Антикоагулянтная активность активатора протеина С Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D

В качестве посевного материала используют двухсуточную культуру, полученную на среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон. Штамм Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D выращивают в условиях глубинного культивирования в 100 мл питательной среды в качалочных колбах объемом 750 мл на круговых качалках (200 об/мин) при 28°С. Дальнейшее культивирование штамма проводят при тех же условиях на сложной среде, содержащей глюкозу, крахмал, соевую муку, мясной экстракт, пептон, хлорид натрия, дигидрофосфат калия, гидратированный сульфат магния, при следующем соотношении компонентов, г/л (в пересчете на кристаллогидратные формы солей):

Глюкоза - 35,0

Крахмал - 10,0

Соевая мука - 20,0

Мясной экстракт - 5,0

Пептон - 5,0

Хлорид натрия NaCl - 2,0

Дигидрофосфат калия KH₂PO₄ - 0,5

Сульфат магния MgSO₄×7H₂O - 0,5

Вода водопроводная до 1 л

рН 5.5.

Мицелий после 2 суток культивирования отделяют от среды (фильтрованием через бумажный фильтр или центрифугированием) и получают культуральную жидкость.

Белки культуральной жидкости осаждают сернокислым аммонием при 80%-ном насыщении на холоде. После формирования осадков их отделяют центрифугированием при 15 тыс. об/мин. Осадок белков растворяют в 0,005 М Трис-HCl буфере (рН 8,2), удаляют нерастворумую часть осадка, раствор освобождают от ионов аммония диализом.

Антикоагулянтную активность полученного раствора белков (препарата ферментов) из культуральной жидкости определяют по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) плазмы крови человека. Тест используют для оценки активации протеина С в форму, которая инактивирует факторы Va и VIIIa свертывания крови. Удлинение АЧТВ определяют по методу, рекомендованному НИИ гематологии и переливания крови (г.Вятка) в следующей модификации [7, 9]. Готовят смесь из 0,1 мл стандартной плазмы крови, 0,1 мл препарата ферментов гриба в физиологическом растворе, 0,1 мл суспензии каолина. Смесь инкубируют в течение 2 мин на водяной бане при 37°С при постоянном перемешивании, после чего добавляют 0,1 мл водного раствора хлорида кальция (0,277%). Время свертывания измеряют секундомером. В контроле вместо испытуемого раствора используют эквивалентное количество физиологического раствора (0,86%-ный раствор хлорида натрия). Относительное АЧТВ рассчитывают по формуле (А-В)×100%/В, где А - время свертывания плазмы в присутствии испытуемого раствора протеаз гриба (сек), В - время свертывания плазмы в контроле (сек). Повторность - 3-кратная.

Антикоагулянтная активность штамма A. ochraceus BKM F-4104D по АЧТВ составляет 960%.

Для установления того, что антикоагулянтная активность обусловлена действием протеиназы - активатора протеина С, активность активатора протеина C A. ochraceus BKM F-4104D в культуральной жидкости определяют по методике [12] с использованием хромогенного пептидного субстрата pGlu-Pro-Arg-pNA (пироглутамил-пролил-аргинил-пара-нитроанилид) [13, 14]. Активированный протеин С плазмы крови специфично отщепляет п-нитроанилин (pNA) от pGlu-Pro-Arg-pNA. За единицу активности активатора протеина С принимают то количество фермента, которое отщепляет 1·10^-3 мкмоль п-нитроанилина (pNA) от pGlu-Pro-Arg-pNA за 1 мин при рН 8,2 и 37°С. Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D в культуральной жидкости составляет 77,5 ед./мл

Пример 2

Сравнение антикоагулянтной активности активатора протеина С штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D и ближайшего аналога - штамма Aspergillus ochraceus 1

Культивирование штамма A. ochraceus BKM F-4104D проводят по примеру 1. Активность активаторов протеина С по показателю относительной АЧТВ у A. ochraceus BKM F-4104D - 960%, что значительно превосходит таковую у штамма, ближайшего аналога, A. ochraceus 1 (854% (см. таблицу)). Время культивирования предлагаемого штамма для достижения такой активности активатора протеина С уменьшается на 5 суток, с 7 до 2 суток.

Время культивирования в ферментационной среде и активность протеиназы - активатора протеина С Aspergillus ochraceus BKM F-4104D и ближайшего аналога A. ochraceus 1 Вариант Время культивирования, сут АЧТВ**, % Ближайший аналог - A. ochraceus 1* 7 854 A. ochraceus BKM F-4104D 2 960 * - [7]; ** - коэффициент вариации данных не превышает 3%.

Литература

1. Коган А.Е., Струкова С.М. Протеин С: механизм активации и антикоагулянтного действия. Биохимия, 1993. 58, 6, 827-844.

2. Dahlbäck В., Villoutreix B.O. Regulation of blood coagulation by the protein С anticoagulant pathway: novel insights into structure-function relationships and molecular recognition. Arterioscler. Thromb. Vasс. Biol., 2005, 25, 1311-1320.

3. Gempeler-Messina P.M., Volz K., Bühler В., Müller С. Protein С activators from snake venoms and their diagnostic use. Haemostasis, 2001, 31, 266-272.

4. Stocker K., Fisher H., Meier J., Brogli M., Svendsen L. Protein С activators in snake venoms. Behring. Inst. Mitt., 1986, 79, 7-47.

5. Martinoli J.L., Stoker K. Fast functional protein С assay using Protac^®, a novel protein С activator. Thromb. Res., 1986, 43, 253-256.

6. Stoker К., Fisher H., Meier J., Brogli M., Svedsen L. Characterization of the protein С activator Protac^® from the venom of southern copperhead (Agkistrodon contortrix) snake. Toxicon, 1987, 25, 3, 239-252.

7. Ландау Н.С., Кураков А.В., Гуликова О.М., Батомункуева Б.П., Струкова С.М., Егоров Н.С. Экстрацеллюлярные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами. Микробиология, 1998, 67 2 215-220.

8. Батомункуева Б.П., Егоров Н.С. Выделение, очистка и разделение комплексного препарата внеклеточных протеиназ Aspergillus ochraceus 513 с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами. Микробиология 70, 5, 602-606, 2001.

9. Струкова С.М., Коган А.Е., Тара А.А., Аавиксаар А.А. Противотромботический эффект активатора протеина С из змеинового яда. Вопр. Мед. Химии. 35, 5, 115-119. 1989.

10. Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Определитель. Киев: Наукова Думка, 1988, 203 с.

11. Raper K.B., Fennell D.J. The genus Aspergillus. USA, Baltimore, Williams a. Wilkins Co., 1965. 686 р.

12. Kogan А.Е., Makarov A.N., Bobrushkin I.D., Strukova S.M. Comparative study of protein С activators from the Agkistrodon snake venoms. Trombosis research. V.62. P.775-780. 1991.

13. Sakata Т., Hatsuyama H., Kitamura Т., Hekida K., Katayama J., Matsumata T. Study of chromogenic substrate on protein С activity assay - in patients treated with narfarin. Rinsho Byori. V.38, №8, P.937-941. 1990.

14. Dang Q.D., Cera E.D. Chromogenic Substrates selective for activated protein C. Blood, 89, 2220-2221. 1997.

Штамм Aspergillus ochraceus выделен из образцов почвы, отобранной в Краснодарском крае, и депонирован в ВКМ под номером F-4104D. Штамм продуцирует протеиназу, являющуюся активатором протеина С плазмы крови человека, в культуральную жидкость при выращивании на среде, содержащей углеводные и белковые соединения и минеральные соли. Антикоагулянтная активность штамма по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени на 2 сутки культивирования составляет 960%. Активность протеиназы штамма Aspergillus ochraceus в культуральной жидкости, определенная с использованием хромогенного пептидного субстрата pGlu-Pro-Arg-pNA, составляет 77,5 ед./мл. 1 табл., 2 пр.

Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4104D - продуцент протеиназы - активатора протеина С плазмы крови человека.