Способ уничтожения микроорганизмов в биопленках Российский патент 2023 года по МПК A61K35/66 

Настоящее изобретение относится к способу борьбы с биопленками как на биотических, так и на абиотических поверхностях. Способ предлагается как для медицинского, так и немедицинского применения, в частности для борьбы с инфекциями, вызванными патогенами, формирующими биопленки, или для борьбы с биопленками на неживых поверхностях, например, с целью дезинфекции.

Способ основан на уничтожении микроорганизмов в биопленках путем их обработки антимикробными веществами, к которым чувствительны микроорганизмы, входящие в состав микробных биопленок, и метаболитами непатогенных бактерий, подобранными по их способности повышать уровень продукции аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) у микроорганизмов, входящих в состав микробных биопленок.

Изобретение основано на открытии, заключающемся в том, что метаболиты непатогенных бактерий, повышающие уровень АТФ у микроорганизмов в биопленках, одновременно с этим повышали чувствительность микроорганизмов в биопленках к антимикробным препаратам.

Актуальность разработанного способа определяется тем, что по имеющейся информации (Joo H.S., Otto M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens // Chemistry & biology. - 2012. - T. 19. - №. 12. - C. 1503-1513.), до 65-80% всех инфекций связаны с образованием микроорганизмами биопленок, что свидетельствует об их огромном клиническом значении. Бактерии в биопленках часто являются причиной хронизации инфекций, в отличие от планктонных бактерий, вовлеченных в острые процессы (Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections // Science. - 1999. - T. 284. - №. 5418. - C. 1318-1322; Wolcott R.D. et al. Chronic wounds and the medical biofilm paradigm // Journal of wound care. - 2010. - T. 19. - №. 2. - C. 45-53.). Одной из важнейших характеристик биопленок является их высокая устойчивость к противомикробным агентам (Wimpenny J., Manz W., Szewzyk U. Heterogeneity in biofilms // FEMS microbiology reviews. - 2000. - T. 24. - №. 5. - C. 661-671.). Показано, что для бактерий в биопленках минимальные подавляющие концентрации антибиотиков и дезинфицирующих средств в 100-1000 раз выше, чем для планктонных (Hall С.W., Mah Т.F. Molecular mechanisms of biofilm-based antibiotic resistance and tolerance in pathogenic bacteria // FEMS microbiology reviews. - 2017. - T. 41. - №. 3. - C. 276-301.). Такая высокая устойчивость к антимикробным веществам бактерий в биопленках позволяет им сохранять жизнеспособность даже на фоне адекватной антимикробной терапии и сохранного иммунного ответа хозяина, что является причиной возникновения хронических инфекций, обусловленных персистенцией этиологического агента.

Из существующего уровня техники известны способы борьбы с биопленками путем применения смеси ферментов (заявка РФ №2009106069, опубл. 27.08.2010; патент РФ №2495098 С2, опубл. 10.10.2013), разрушающих матрикс биопленок. Недостатком этих способов является то, что действие ферментов в основном направлено на разрушение биополимеров матрикса, при этом бактерии остаются жизнеспособными и могут образовать биопленку заново и, следовательно, сформировать новый очаг инфекции.

Известны способы борьбы с биопленками путем применения бактериофагов (патент РФ №2565824, опубл. 20.10.2015; патент РФ №2646102, опубл. 01.03.2018). Недостатком этих способов является то, что бактериофаги высоко специфичны, действуют только против одного фаготипа бактерий и не эффективны по отношению к другим.

Известно применение бактерий для борьбы с биопленками, например патент РФ №2576008, опубл. 27.02.2016, описывает использование штамма бактерий Enterococcus faecium, обладающий способностью снижать образование биопленок грибами рода Candida. Одним из недостатков этого и подобных способов является применение бактерий, обладающих антагонистической активностью в отношении узкого круга микроорганизмов, способных образовывать биопленки, другим недостатком является то, что с помощью этих способов замедляется развитие биопленки, но не достигается разрушения уже сформировавшихся биопленок.

Известно применение комплексов антимикробных пептидов насекомых для борьбы с биопленками (патент РФ №2664708, опубл. 21.08.2018; патент РФ №2699712, опубл. 09.09.2019). Недостатком этих способов является трудность выделения, и очистки антимикробных пептидов из сложной смеси биологически активных веществ, содержащихся в насекомых.

Известно применение ненасыщенных алифатических длинноцепочечных спиртов или альдегидов (патент РФ №2561053 С2, опубл. 20.08.2015), ионов серебра в составе композиций (патент РФ №2553363, опубл. 10.06.2015) для борьбы с биопленками. Недостатком данных способов является низкая специфичность их действия, в результате чего, вещества, используемые в этих способах, могут повреждать ткани и органы хозяина.

Известно применение (патент РФ №2646488 С2, опубл. 05.03.2018) тритерпеноида милиацин в качестве средства для влияния на образование биопленок микроорганизмами. Недостатком данного способа является то, что результатом его применения является снижение образование биопленок, при этом микроорганизмы биопленки полностью не уничтожаются и могут вновь сформировать биопленки. Другим недостатком указанного способа является то, что он позволяет замедлить развитие биопленки, но не разрушить уже сформировавшиеся биопленки.

В качестве прототипа был выбран способ лечения инфекций, в том числе за счет разрушения биопленок, композицией, содержащей антибиотик и диспергатор или антиадгезионный агент (патент РФ №2739249 С2, опубл. 22.12.2020). Действие данного способа основано на разрыхлении биопленки, что позволяет антибиотику легче проникнуть в нее. Недостатком данного способа является невозможность полного уничтожения всех микроорганизмов биопленки в связи с тем, что антибиотик уничтожает только метаболитически активные клетки микроорганизмов, тогда как в составе биопленок значительная часть популяции микроорганизмов находится в покоящемся состоянии, то есть для антибиотика они не уязвимы.

Целью, на достижение которой направлено заявляемое изобретение, является создание высокоэффективного способа уничтожения микроорганизмов в биопленках.

Для достижения этой цели было выполнено исследование, в котором использовали 17 штаммов Staphylococcus aureus, 21 штамм Klebsiella pneumoniae, 19 штаммов Pseudomonas aeruginosa и 13 штаммов грибов рода Candida, образующих выраженные микробные биопленки, и 19 штаммов непатогенных микроорганизмов, относящихся к родам Bifidobacterium и Lactobacillus. Все перечисленные микроорганизмы были идентифицированы на основании морфологических, культуральных и биохимических характеристик.

Дизайн исследования состоял в измерении количества живых микроорганизмов и концентрации АТФ в сформированных биопленках до и после их обработки метаболитами непатогенных микроорганизмов совместно с антимикробными препаратами в разных концентрациях.

Для получения биопленок Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и грибы рода Candida выращивали в стерильных 96 луночных полистироловых планшетах в соответствующих средах и условиях.

Для обработки биопленок метаболитами непатогенных микроорганизмов, культуру штаммов, относящихся к родам Bifidobacterium и Lactobacillus, указанные штаммы выращивали в соответствующей жидкой питательной среде, затем клетки осаждали центрифугированием, а надосадочную жидкость стерилизовали фильтрованием и добавляли к биопленкам.

Минимальную бактерицидную концентрацию антимикробных веществ для микроорганизмов в биопленках определяли методом микроразведений по изменению количества жизнеспособных бактерий по восстановлению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолий бромида в формазан.

Для оценки метаболической активности микробной популяции в биопленках с помощью люциферин-люциферазной системы измеряли концентрацию АТФ. Биолюминесценцию регистрировали на люминометре. Концентрацию АТФ выражали в мкмоль/мг белка.

В результате проведенного исследования установлено, что если метаболиты непатогенных микроорганизмов повышают уровень продукции АТФ у микроорганизмов биопленки, то в случае совместного применения антимикробных веществ с этими метаболитами уничтожение микроорганизмов биопленки происходит более эффективно.

В результате проведенного исследования установлено, что полное уничтожение микроорганизмов в биопленке было достигнуто только в том случае, когда вместе с антимикробными веществами применяли метаболиты непатогенных микроорганизмов, повышающие уровень продукции АТФ у микроорганизмов биопленки (табл. 1-4). В том случае, если метаболиты непатогенных микроорганизмов не повышали уровень продукции АТФ у микроорганизмов биопленки, то достигнуть полного уничтожения микроорганизмов в биопленках не получалось. Описанная закономерность (табл. 1-4) наблюдалась применительно ко всем видам исследованных микроорганизмов.

Сущность изобретения состоит в том, что для эффективного уничтожения микроорганизмов в биопленках предварительно наряду с определением чувствительности к антимикробным веществам основных микроорганизмов биопленок, оценивают уровень продукции ими АТФ под влиянием метаболитов непатогенных микроорганизмов. Затем биопленку обрабатывают антимикробными веществами с учетом чувствительности микроорганизмов биопленки и метаболитами тех непатогенных бактерий, которые максимально повышают уровень продукции АТФ у микроорганизмов биопленки.

Способ осуществляется следующим образом:

Для эффективного уничтожения микроорганизмов в биопленках предварительно из конкретной биопленки получают материал для выделения микроорганизмов.

У выделенных микроорганизмов определяют чувствительность к антимикробным веществам молекулярно-биологическими или классическими бактериологическими методами. На основе проведенных исследований выбирают антимикробные вещества, к которым чувствительны микроорганизмы, выделенные из биопленки.

Одновременно с этим, у выделенных микроорганизмов оценивают изменение продукции АТФ под воздействием метаболитов непатогенных бактерий. На основе проведенных исследований выбирают штамм непатогенных бактерий, который максимально усиливает продукцию АТФ большинством выделенных из микробной биопленки микроорганизмов.

Затем микробную биопленку обрабатывают антимикробными веществами с учетом чувствительности микроорганизмов биопленки и метаболитами непатогенных микроорганизмов, которые максимально повышают уровень продукции АТФ у микроорганизмов биопленки.

Контроль качества уничтожения микроорганизмов в биопленках осуществляют классическими бактериологическими методами.

Примеры конкретного выполнения

Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример №1.

Необходимо уничтожить биопленку на сложном высокотехнологичном оборудовании, не подлежащем стерилизации. С внутренней поверхности воздуховода получен материал микробной биопленки, из которого выделен штамм Pseudomonas aeruginosa.

У выделенного штамма Pseudomonas aeruginosa определили чувствительность к антимикробным веществам классическим бактериологическим методом. Штамм устойчив к азтрионему, амикацину, имипенему, меропенему, левофлоксацину, чувствителен к полимиксину В. На основе этих данных для уничтожения микробов биопленки был выбран полимиксин В.

Одновременно с этим, у выделенного штамма Pseudomonas aeruginosa оценили изменение продукции АТФ под воздействием метаболитов штаммов непатогенных микроорганизмов, относящихся к родам Bifidobacterium и Lactobacillus. На основе проведенного исследования был выбран штамм L. acidophilus, который повышал продукцию АТФ штаммом Pseudomonas aeruginosa в 3,1 раза.

Затем микробную биопленку обрабатали полимиксином В и метаболитами L. acidophilus.

Через сутки после обработки провели контроль качества уничтожения микроорганизмов в биопленках бактериологическим методом и установили отсутствие Pseudomonas aeruginosa на внутренней поверхности воздуховода.

Пример №2.

Необходимо уничтожить биопленки во влагалище у пациентки с рецидивирующим вагинальным кандидозом, имеющей в анамнезе три курса неуспешной антимикробной терапии. С бокового свода влагалища получен фрагмент микробной биопленки, из которого выделен штамм Candida albicans.

У выделенного штамма Candida albicans определили чувствительность к антимикробным веществам классическим бактериологическим методом. Штамм устойчив к флуконазолу, итраконазолу, клотримозолу, сертаконазолу, умеренно чувствителен к нистатину. На основе этих данных для уничтожения Candida albicans биопленки был выбран нистатин.

Одновременно с этим, у выделенного штамма Candida albicans оценили изменение продукции АТФ под воздействием метаболитов непатогенных микроорганизмов, относящихся к роду Lactobacillus. На основе проведенного исследования был выбран штамм L. casei subsp. rhamnosus Lcr35, который повышал продукцию АТФ штаммом Candida albicans в 2,7 раза.

Затем 7 дней пациентка вагинально получала свечи с нистатином и препарат, содержащий живые лиофолизированные L. casei subsp. rhamnosus Lcr35 и их метаболиты. Через неделю после завершения терапии бактериологическое исследование содержимого влагалища выявило отсутствие Candida albicans.

Пример №3.

Необходимо уничтожить биопленки в длительно не заживающей ране стопы у пациента, страдающего сахарным диабетом. С фрагмента микробной биопленки, полученной из раны, были выделены штаммы Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae.

У выделенных штаммов Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae определили чувствительность к антимикробным веществам классическим бактериологическим методом. Штамм Staphylococcus aureus устойчив к цефакситину, нитрафурантаину, ампициллин/клавуланату, клиндамицину, ванкомицину, умеренно чувствителен к левофлоксацину, чувствителен к эритромицину. Штамм Klebsiella pneumoniae устойчив к ампициллин/клавуланату, тикарциллин/клавуланату, пиперациллин/ тазобактаму, всем цефалоспоринам, умеренно чувствителен к гентамицину, чувствителен к канамицину. На основе этих данных для уничтожения Staphylococcus aureus был выбран эритромицин, для Klebsiella pneumoniae - канамицин.

Одновременно с этим, у выделенных штаммов Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae оценили изменение продукции АТФ под воздействием метаболитов непатогенных микроорганизмов. На основе проведенного исследования был выбран штамм Bacillus subtilis 534, который повышал продукцию АТФ штаммом Staphylococcus aureus в 4,7 раза и в 3,2 для Klebsiella pneumoniae.

Затем 10 дней на рану стопы наносили комбинацию антимикробных препаратов: канамицина и эритромицина и метаболиты Bacillus subtilis 534.

Через 10 дней рана очистилась, появились грануляции, площадь поверхности раны сократилась в два раза. При бактериологическом исследовании материала из раны стопы Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae не выявлены.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу борьбы с биопленками как на биотических, так и на абиотических поверхностях. Сущность изобретения: для эффективного уничтожения микроорганизмов в биопленках предварительно определяют чувствительность к антимикробным веществам основных микроорганизмов биопленок, и те непатогенные микроорганизмы или их метаболиты, которые максимально повышают уровень продукции АТФ микроорганизмами биопленок. Затем биопленку обрабатывают антимикробными веществами с учетом чувствительности микроорганизмов биопленки и непатогенными бактериями или их метаболитами, максимально повышающими уровень продукции АТФ микроорганизмами биопленки. Использование заявляемого способа позволяет с высокой эффективностью уничтожать микроорганизмы в биопленках как на биотических, так и на абиотических поверхностях. 4 табл., 2 пр.

Способ уничтожения микроорганизмов в биопленках, включающий выявление микробного состава биопленки, подбор антимикробных веществ с учетом чувствительности к ним выявленных микроорганизмов, входящих в состав микробной биопленки, подбор непатогенных бактерий, продуцирующих метаболиты, повышающие уровень продукции АТФ у микроорганизмов, входящих в состав микробный биопленки, обработку биопленки метаболитами подобранных непатогенных бактерий и подобранными антимикробными веществами.