Биоактивный полимерный пористый каркас Российский патент 2018 года по МПК A61F2/02 A61F2/28 C08L67/04 

Изобретение относится к композиционному каркасу (скаффолд, Scaffold), выполненному в форме биорезорбируемой пористой конструкции медицинского назначения с повышенной остеокондуктивностью на основе термопластичного полимера с добавлением биоактивного керамического компонента, сформированному с помощью 3D-печати методом наплавления нитей (Fused Filament Fabrication, FFF), который может быть заселенен мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих для использования в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани.

Известно изобретение (WO 2014144488 А1 «3d biomimetic, bi-phasic key featured scaffold for osteochondral repair»), представляющее собой метод создания биосовместимых каркасов на основе полилактида с высокими механическими свойствами, в котором 3D-печать может быть использована для создания структур, которые способствуют восстановлению и/или производству тканей организма.

Недостатком упомянутого изобретения является то, что биосовместимые каркасы, получаемые по предлагаемому его авторами методу, не содержат биоактивного компонента - кальций-фосфатной керамики, который мог бы обладать способностью поставлять минеральные частицы для костных клеток.

Прототипом является изобретение (US 8071007 B1 «Three-dimensional bioresorbable scaffolds for tissue engineering applications»), представляющее собой трехмерные (3D) биологически рассасывающиеся каркасы из резорбируемых полимеров, таких как поликапролактон (PCL), или из композитов резорбируемых полимеров и керамики, таких как поликапролактон / гидроксиапатит (PCL / НА). Включение саморассасывающийся керамики для получения гибридного / композитного материала обеспечивает желательную кинетику резорбции.

Недостатком упомянутого изобретения является то, что основой трехмерных каркасов, предлагаемых его авторами, является поликапролактон, который характеризуется низкой температурой плавления - около 60°С, что ограничивает диапазон температур эксплуатации до потери эксплуатационных характеристик и ограничивает применимость методов стерилизации, таких как стерилизация в автоклаве.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в создании биоактивного полимерного каркаса, который можно заселять мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих для использования в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани, обладающего следующими свойствами:

- составом и структурным сходством с костной тканью, для увеличенной адгезии наполнителя к полимерной матрице,

- повышенной биоактивностью относительно каркаса из чистого полилактида,

- повышенной адгезией клеток к поверхности относительно каркаса из чистого полилактида,

- наличием открытой пористости со средним диаметром пор 400-800 мкм для обеспечения пролиферации клеток,

- способностью обеспечивать миграцию клеток, формирование сосудов и диффузию питательных веществ и кислорода, обеспечивая остеокондуктивность,

- способностью к осуществлению регенерационного подхода при имплантировании каркаса,

- способностью поставлять минеральные частицы для костных клеток,

- высокими механическими свойствами на сжатие: предел прочности пористого каркаса более 40 МПа,

- модулем Юнга, близким к модулю упругости трабекулярной (или губчатой) кости: более 4 ГПа.

Технический результат достигается следующим образом: формируется биоактивный полимерный пористый каркас на основе биорезорбируемого полилактида и гидроксиапатита путем 3D-печати методом послойного наплавления нити с толщиной слоя 50-250 мкм, диаметром пор 400-800 мкм, открытой пористостью (% об.) от 30 до 60, с сетью каналов. При этом поры по оси X смещены относительно пор по оси Y в декартовой системе координат, образуя пересечение каналов пор и связанную систему пор. При этом размер частиц гидроксиапатита от 100 до 1000 нм. Используется следующее соотношение компонентов (% масс): полилактид - от 85 до 65, гидроксиапатит - от 15 до 35. Также внешняя поверхность порового пространства пересекающихся каналов заселенена мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих. Также каркас выполнен в виде конструкции, обеспечивающей его применение в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани.

В предлагаемом в данной заявке изобретении композиционный каркас имеет в качестве полимерной матрицы биорезорбируемый полилактид (ПЛА, PLA), а в качестве биоактивного наполнителя - дисперсный гидроксиапатит со средним размером частиц от 100 до 1000 нм с увеличенной адгезией к полимерной матрице. Степень наполнения гидроксиапатитом - от 15 до 35 масс. %. Биоактивный полимерный пористый каркас формируется с помощью 3D-печати методом наплавления нитей с толщиной слоя 50-250 мкм и характеризуется наличием открытой пористости более 30% об. и порами в виде каналов со средним диаметром 400-800 мкм. Поры по оси X смещены относительно пор по оси Y в декартовой системе координат, что ведет к пересечению каналов пор и образованию связанной системы пор. Модуль Юнга на сжатие полученного таким способом биоактивного полимерного каркаса составляет более 4 ГПа. Микроразмерные поры обеспечивают миграцию клеток, формирование сосудов и диффузию питательных веществ и кислорода, обеспечивая остеокондуктивность. Каркас имеет большое количество ребер жесткости, что придает большую прочность. Эксплуатация каркаса возможна до температуры 55°С без изменения функциональных характеристик. Биоактивный полимерный каркас может быть заселенен мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих для использования в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани.

В предлагаемом композиционном каркасе повышение указанных характеристик достигается за счет введения в полимерную матрицу ультрадисперсного порошка гидроксиапатита, обеспечивающего остеоинтегративные характеристики, и применения послойной 3D-печати, позволяющей формировать сложную сеть пор-каналов с дополнительной шероховатостью за счет послойной печати для увеличения остеокондуктивных свойств.

Возможность промышленной применимости предлагаемого каркаса и его использования в медицине подтверждается следующим примером реализации.

Изобретение поясняется чертежом, где на фиг. 1 показана 3D-модель (А), срез (В) и внешний вид напечатанного биоактивного полимерного каркаса с открытой пористостью 35% об. (С). На фиг. 2 показаны варианты расположения пересекающихся каналов. На фиг. 3 показаны примеры микрофотографий биоактивного полимерного каркаса, полученного путем 3D-печати методом послойного наплавления нити с толщиной слоя 50 (А), 150 (В), 250 мкм (С). По микрофотографии можно судить о пористой структуре каркасов. На фиг. 4 показаны примеры микрофотографий вид напечатанного биоактивного полимерного каркаса со средним диаметром 400 (А) и 800 мкм (В). На фиг. 5 показан пример диаграммы деформации биоактивного полимерного каркаса при сжатии с содержанием гидроксиапатита 15 (А) и 30 (В) % масс. Предел прочности пористого каркаса более 40 МПа. На фиг. 6 показан пример кривых ДСК для биоактивного полимерного каркаса с содержанием гидроксиапатита 15% масс. (1 нагрев, охлаждение, 2 нагрев). Первое фазовое превращение происходит при температуре стеклования материала - 61.4°С, т.е эксплуатация каркаса без изменения функциональных характеристик гарантировано возможна до 55°С. На фиг. 7 показан пример заселения внешней поверхности порового пространства мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками мышей: оптическая микроскопия (А), флюоресцентная микроскопия (Б) с окраской антителами к CD 105, коньюгированными с FITC, (В) и (Г) оптическая микроскопия с окраской гематоксилин-эозином. На фиг. 8 показан пример топографии и текстуры поверхности полимерного каркаса с толщиной слоя 250 мкм, заселенный ММСК. На фиг. 9 показан пример замещения дефекта соединительной ткани мыши полимерным каркасом ПЛА/ГАП.

Пример 1.

В качестве исходных материалов использовался полилактид (ПЛА) марки Ingeo 4032D (производства Natureworks LLC, USA), порошок гидроксиапатита ГАП 85-Д (производства НПО «Полистом») со средним размером частиц 1000 нм. Сформирован биоактивный полимерный каркас в количестве 10 штук с содержанием гидроксиапатита 35% масс со средним диаметром пор 400 мкм и толщиной слоя 50 мкм. Объемная пористость - 30% об. Температура стеклования - 62°С, предел прочности на сжатие - 52 МПа, модуль Юнга при сжатии - 4.5 ГПа. Полимерные каркасы ПЛА/ГАП были выполнены в виде прямоугольных пластин размером 4×4 мм.

Для оценки биоактивных свойств полимерных каркасов ПЛА/ГАП 5 образцов в асептических условиях инкубировали с ММСК в течение 7 суток in vitro при 37°С и 5% СО₂. Использовали монокультуру клеток 2-го пассажа, генерированной их CD34-CD45- клеток костного мозга мышей линии СВА. В ходе эксперимента стерильный образец каркаса промывали средой RPMI-1640, помещали на дно лунки планшета Nung и перфузировали клеточной взвесью (5×10⁵ клеток/мл) в объеме 100 мкл. Через 5 минут экспозиции в лунку добавляли 2 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки эмбриона коровы (HyClon, USA), 25 mM HEPES, 24 mM бикарбонат натрия, L-гутамин, 100 mg/стрептомицина и 100 U/mL пенициллина. По окончании инкубации образцы были фиксированы, окрашены гематоксилин-эозином и проанализированы с использованием световой микроскопии. Вся поверхность образцов полимерных каркасов ПЛА/ГАП была колонизирована полигональными крупными (50-150 мкм) плотно адгезированными клетками с четко очерченным овальным ядром, длинными отростками, экспрессирующими на мембране CD 105 маркеры, что позволило их идентифицировать как ММСК (Фиг. 7). Плотность колонизации соответствовала 40-70 клеток в поле зрения при увеличении ×200. Выбор ММСК в качестве биологического субъекта обоснован их способностью к пролиферации в условиях in vitro и плюрипотеностью, что определяет их способность к направленной дифференцировке в волокна соединительной ткани, клетки сосудов, жировой, хрящевой и костной тканей. Поскольку ММСК являются предшественниками остеобластов, их можно рассматривать в качестве адекватной биологической модели оценки остеокондуктивности заявляемых полимерных каркасов.

Поскольку костная ткань является разновидностью соединительной ткани, то для моделирования возможности возмещения дефектов тканей мезенхимального происхождения образцы полимерных каркасов ПЛА/ГАП (n=5) были имплантированы мышам линии СВА (по 1 образцу на мышь) в искусственно сформированный подкожный дефект соединительной ткани дорсальной поверхности тела площадью 25±4 мм² с соблюдением требований асептики и антисептики. В течение всего периода наблюдения (1 месяц) в области имплантации не наблюдали признаков формирования язв, абсцесса и некроза. По результатам патолого-анатомического исследования было установлено, что имплантированные полимерные каркасы ПЛА/ГАП подверглись частичной биорезорбции, были плотно фиксированы в окружающих тканях без признаков формирования демаркационной линии, вала воспаления, скопления гноя или отека окружающих тканей с полным закрытием площади дефекта. В прилегающих к каркасам тканях наблюдали скопление гистиоцитарных соединительно-тканных клеток, а также активный неоваскулогенез, что свидетельствует о биоактивных свойствах полимерных каркасов.

Модуль Юнга полимерного каркаса при сжатии (4.5 ГПа) адекватен модулю Юнга костной ткани (трабекулярная бедренная кость) без экранирования напряжений при замещении дефекта костной ткани.

Пример 2.

В качестве исходных материалов использовался полилактид марки Ingeo 4032D (производства Natureworks LLC, USA), порошок гидроксиапатита ГАП 85-УД (производства НПО «Полистом») со средним размером частиц 100 нм. Сформирован биоактивный полимерный каркас в количестве 10 штук с содержанием гидроксиапатита 15% масс со средним диаметром пор 800 мкм и толщиной слоя 250 мкм. Объемная пористость - 60% об. Температура стеклования - 61°С, предел прочности на сжатие - 55 МПа, модуль Юнга при сжатии - 4.1 ГПа.

Испытания биологических свойств образцов in vitro и in vivo проводили как описано в Примере 1. В опытах in vitro было установлено, что по окончании эксперимента поверхность образцов полимерных каркасов ПЛА/ГАП (n=5) была колонизирована полигональными крупными (50-150 мкм) плотно адгезированными CD 105+ клетками с четко очерченным овальным ядром, длинными отростками, идентифицированными как ММСК. Плотность колонизации соответствовала 50-100 клеток в поле зрения при увеличении ×200 (Фиг. 8). В опытах in vivo не отмечали признаков формирования язв, абсцесса и некроза в области имплантации образцов полимерных каркасов ПЛА/ГАП (n=5). Было установлено, что имплантированные полимерные каркасы ПЛА/ГАП подверглись частичной биорезорбции, были плотно фиксированы в окружающих тканях без признаков формирования демаркационной линии, вала воспаления, скопления гноя или отека окружающих тканей с полным закрытием площади дефекта. В прилегающих к каркасам тканях наблюдали скопление гистиоцитарных соединительно-тканных клеток, а также активный неоваскулогенез (Фиг. 9), что свидетельствует о биоактивных свойствах полимерных каркасов.

Модуль Юнга полимерного каркаса при сжатии (4.1 ГПа) адекватен модулю Юнга костной ткани (трабекулярная берцовая кость) без экранирования напряжений при замещении дефекта костной ткани.

Изобретение относится к области медицины, в частности к созданию биосовместимых каркасов для замещения дефектов костной ткани. Биосовместимый каркас в форме биорезорбируемой пористой конструкции медицинского назначения с повышенной остеокондуктивностью на основе термопластичного полимера с добавлением биоактивного керамического компонента может быть заселен мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих и состоит из полимерной матрицы полилактида и биоактивного наполнителя гидроксиапатита со средним размером частиц от 100 до 1000 нм с увеличенной адгезией к полимерной матрице. Указаный каркас формируется с помощью 3D-печати методом наплавления нитей с толщиной слоя 50-250 мкм и характеризуется наличием открытой пористости от 30 до 60 об.% и порами в виде каналов со средним диаметром 400-800 мкм. Биоактивный полимерный каркас характеризуется тем, что его эксплуатация возможна до температуры 55°C без изменения функциональных характеристик, каркаса, может быть заселен мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих для использования в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани. 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 пр.

1. Биоактивный полимерный каркас для замещения дефектов костной ткани на основе биорезорбируемого полилактида и гидроксиапатита с размером частиц от 100 до 1000 нм, сформированный с помощью 3D-печати методом наплавления нитей с толщиной слоя от 50 до 250 мкм, средним диаметром пор от 400 до 800 мкм, при этом поры по оси X смещены относительно пор по оси Y в декартовой системе координат, образуя пересечение каналов пор и связанную систему пор, открытой пористостью (об.%) от 30 до 60 при следующем соотношении компонентов (мас.%):

полилактид - от 85 до 65,

гидроксиапатит - от 15 до 35.

2. Биоактивный полимерный каркас для замещения дефектов костной ткани по п. 1, у которого внешняя поверхность порового пространства пересекающихся каналов заселена мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих.

3. Биоактивный полимерный каркас для замещения дефектов костной ткани по п. 2, который выполнен в виде конструкции, обеспечивающей его применение в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани.