Средство для коррекции холинергических нарушений мнестических процессов Российский патент 2018 года по МПК A61K36/714 A61K31/395 A61P25/28 A61P25/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической фармакологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции нарушений функций ЦНС, и заключается в применении дитерпенового алкалоида зонгорина в качестве средства, корригирующего холинергические нарушения.

Ацетилхолин является одним из ведущих медиаторов нервной системы, он осуществляет регуляцию когнитивных функций, двигательных реакций (инициация движений, двигательные стереотипы и т.д.), церебрального сосудистого тонуса (за счет влияния на биосинтез NO), а также взаимодействет с дофамин-, ГАМК-, серотонинергическими и другими системами, участвующими в поддержании психоэмоционального баланса и поведенческих активности [1].

Такие факторы, как возраст, сосудистые заболевания, травмы, стрессы, приводят не только к дефициту ацетилхолина, но и к снижению чувствительности рецепторного аппарата к остаточному количеству этого медиатора. В свою очередь, ацетилхолинергическая недостаточность создает тот фундамент, на котором развиваются, как возрастное снижение когнитивных функций, так и дементные нарушения [2]. Холинергическая недостаточность является пусковым механизмом нейромедиаторного дисбаланса в ЦНС и вторичного вовлечения моноаминергических, глутаматергической и пептидергических систем в патологический процесс при когнитивной дисфункции. Кроме того, дефицит центральных холинергических систем может приводить к отложению в головном мозге патологического белка - бета-амилоида и тем самым способствовать развитию прогрессирующего нейродегенеративного процесса - болезни Альцгеймера [3-6]. Для коррекции холинергических нарушений в клинической практике используются препараты из группы ингибиторов холинэстеразы (ИХЭ) [7]. Установлено, что такие представители ИХЭ как донепизил, ривастигмин, галантамин вызывают статистически достоверное улучшение когнитивных функций при их нарушениях, однако величина этих улучшений относительно мала [8]. Вместе с тем препараты этой группы проявляют серьезные побочные эффекты, такие как гепатотоксичность и др., что существенно ограничивает возможность их применения. Поэтому, поиск лекарственных средств, обеспечивающих направленную регуляцию активности одной из ведущих медиаторных систем - холинергической и при этом отвечающих принципам безопасности и высокой эффективности является актуальной задачей современной фармакологии.

Источником получения таких препаратов могут быть лекарственные растения [9]. Растительные экстракты способны не только ослаблять выраженность когнитивных расстройств у экспериментальных животных и улучшать когнитивные функции у здоровых испытуемых, но и препятствовать отложению амилоида в головном мозгу, предотвращая тем самым развитие болезни Альцгеймера [10].

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала высокоэффективных средств, корригирующих холинергические нарушения. Поставленная задача решается применением дитерпенового алкалоида зонгорина, выделенного из надземной части аконита байкальского в качестве средства, корригирующего холинергические нарушения мнестических процессов.

Дитерпеновые алкалоиды на сегодняшний день являются перспективным классом веществ, для получения новых фармакологических препаратов, благодаря их способности оказывать влияние на жизненно важные функции организма [7]. Установлено, что зонгорин обладает антигипоксическими [11], анксиолитическими [12] свойствами, оказывает влияние на активность некоторых нейротрасмиттеров: серотонина [13], ацетилхолина [14], гистамина [15]. При этом влияние зонгорина на холинергические нарушения, вызванные неселективным блокатором ацетилхолиновых рецепторов - скополамином, не были изучены. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения зонгорина с достижением нового технического результата, заключающегося в коррекции холинергических нарушений, для специалиста не является очевидным. Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области, их описание не содержится в патентной и научно-технической литературе. Предлагаемое изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении. Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: "Новизна", "Изобретательский уровень", "Промышленная применимость".

Предлагаемые нами средства получали следующим образом.

Пример 1. Надземная часть аконита байкальского, собранная в период цветения, измельчалась до размера частиц менее 5 мм, обрабатывалась раствором карбоната натрия и подвергалась непрерывной экстракции хлороформом в течение 5 суток. Хлороформный экстракт упаривали до небольшого объема и тщательно экстрагировали 5% серной кислотой. Кислотную вытяжку подщелачивали карбонатом натрия до рН 9-10 и последовательно экстрагировали сначала эфиром, затем хлороформом. Эфирный экстракт упаривали досуха, растворяли в небольшом количестве эфира и хроматографировали на дезактивированной окиси алюминия в системе гексан-ацетон (90→50%). Эфирорастворимую фракцию подвергли дробной экстракции буферными растворами с увеличивающимися значениями рН. Эфирный раствор, оставшийся после экстракции наиболее щелочным буфером, упаривали досуха и хроматографировали на окиси алюминия в системе гексан-метанол до элюции зоноргина, происходящей после выхода напеллина. Вещество растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации. Зонгорин (C22H33NO3), представляет собой гетероциклическое азотсодержащее органическое соединение растительного происхождения (Фиг. 1). Чаще всего он встречается в растениях рода Аконит.

В качестве прототипа использовали хорошо зарекомендовавший в течение последних нескольких десятков лет ноотропный препарат - пирацетам, в механизме действия которого не последнее место отводится корригирующему влиянию на холинергические структуры. Известно, что пирацетам предотвращает снижение концентрации ацетилхолина в коре и гиппокампе после воздействия электрошоком [16] и увеличивает плотность М-холинорецепторов во фронтальной коре пожилых крыс [17]. Большое количество исследований посвящено эффектам пирацетама при скополамин-индуцированной амнезии. Обнаружилось, что введение пирацетама как до исследования, так и после него, в данной модели демонстрирует антиамнестический эффект [18, 19].

Исследование корригирующего влияния зонгорина на холинергические нарушения мнестических процессов выполняли на 49 мышах-самцах линии СВА массой 19-23 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (г. Страсбург, 1986).

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708 н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Москва, 2012). Предлагаемое средство в дозах 5, 25 и 100 мкг/кг и препарат сравнения пирацетам в дозе 100 мг/кг вводили животным курсом ежедневно в течение пяти дней однократно через зонд в желудок в виде раствора или суспензии в воде очищенной за 1 ч до выработки рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Животные в группе контроля получали эквивалентное количество воды очищенной. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента, непараметрического U критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и углового преобразования Фишера (ϕ) с помощью пакета программ Statistica 6,0.

Нарушение процесса запоминания и воспроизведения навыка под воздействием скополамина является одним из наиболее распространенных методических приемов в исследовании механизмов памяти. Алкалоид скополамин - неселективный м-холинолитик, является антихолинергическим средством, вызывает амнезию. Для изучения влияния зонгорина на амнестическое действие холиноблокатора за 20 минут до выработки УРПИ всем мышам, кроме интактного контроля, вводили скополамин подкожно в дозе 2,5 мг/кг. В этой дозе скополамин вызывает нарушение восприятия и препятствует консолидации следа памяти [20, 21]. Проверку рефлекса проводили через 48 ч после выработки, а также на 9-е и 16-е сутки эксперимента.

Выработку УРПИ осуществляли в установке, состоящей из двух отсеков - большого светлого и малого темного [22]. Методика основана на подавлении врожденного безусловного рефлекса предпочтения темного пространства, имеющегося у грызунов [23]. Животное помещали в светлый отсек и через некоторое время, в силу врожденного рефлекса, оно переходило в темный, после чего отверстие, соединяющее оба отсека, перекрывали дверкой и на пол темного отсека, представляющий собой решетку из параллельных чередующихся электродов, подавали электрический ток импульсами продолжительностью 50 Мс, частотой 5 Гц, амплитудой 50 мА. Через 10 с дверку открывали и животное могло выскочить в светлый отсек с обычным полом. В результате описанной процедуры у мышей вырабатывался условный рефлекс избегания темного пространства. При выработке рефлекса регистрировали время захода в темный отсек. Данный показатель характеризует ориентировочную реакцию. При проверке УРПИ фиксировали время первого захода в темный отсек (латентное время захода), суммарное время пребывания в темном отсеке. Рефлекс считался выработанным, если в течение 3-х минут наблюдения животное ни разу не посетило темный отсек. Об эффекте исследуемых веществ судили по количеству животных с выработанным рефлексом. Кроме того, дополнительно оценивали отдельные поведенческие акты, характеризующие условно-рефлекторную деятельность и поведенческий статус животных: горизонтальную и вертикальную активности; количество заходов в темную камеру (ТК); количество подходов, обнюхиваний и заглядываний в ТК; груминг и дефекацию (табл.1).

Примечание. Перед уровнями значимости p стоят номера сравниваемых групп.

Процесс выработки условного рефлекса пассивного избегания показал, что под действием скополамина происходило нарушение когнитивных функций исследуемых животных, выражающееся в значительном удлинении латентного времени захода в темную камеру (см. табл.1). У мышей в скополаминовом контроле этот показатель увеличивался в 2,3 раза относительно интактных животных. Назначение мышам пирацетама не приводило к коррекции латентного времени захода в ТК, а у животных, получавших зонгорин в дозах 5 и 25 мкг/кг, отмечалась отчетливая тенденция к снижению этого показателя. Курсовое превентивное введение мышам зонгорина в дозе 100 мкг/кг обеспечивало статистически значимое снижение латентного времени в 1,5 раза относительно негативного контроля (см. табл. 1), что может свидетельствовать о холиномиметическом действии зонгорина.

В ходе проверки сохранности рефлекса через 48 часов было установлено, что у большинства животных в интактном контроле УРПИ воспроизводился (87,5%), тогда как в негативном (скополаминовом) контроле наблюдалась полное нарушение воспроизведения рефлекса - все животные в этой группе забыли о полученной травме и заходили в ТК. При этом, значительно сокращалось латентное время захода мышей в ТК (в 2 раза), а количество заходов и суммарное время пребывания в ТК повышалось в 6,7 и 14,2 раза соответственно относительно фоновых значений (табл. 2). Наряду с этим, у животных в контрольной группе отмечалось статистически значимое по сравнению с интактными мышами увеличение одного из показателей тревожности - частоты дефекаций и количества подходов, обнюхиваний и заглядываний в ТК (табл. 2). Курсовое введение референтного препарата защищало животных от негативных проявлений скополаминовой травмы, что выражалось в нормализации большинства исследуемых показателей (табл. 2). Под действием пирацетама достоверно улучшалось воспроизведение условного рефлекса - у 62,5% животных УРПИ сохранялся (табл. 2). Отрицательным проявлением курсового применения препарата сравнения на этом этапе являлось статистически значимое увеличение частоты дефекаций, сопоставимое с показателями скополаминового контроля (табл. 2). Превентивное внутрижелудочное введение мышам зонгорина в дозах 5, 25 и 100 мкг/кг обеспечивало улучшение многих тестируемых нами поведенческих актов животных, измененных холинолитиком, а воспроизведение УРПИ оказалось достоверно выше, чем у контроля и составило 62,5, 37,5 и 50% соответственно (табл. 2).

Оценивая сохранность УРПИ в более поздние сроки исследования (9-е сутки эксперимента), мы установили, что в группе интактного контроля воспроизведение рефлекса оставалось на прежнем уровне (87,5%), а у животных, получавших пирацетам - только у 25% мышей (табл. 3). Под действием референтного препарата статистически значимо, относительно фоновых значений, изменялись некоторые интегративные поведенческие реакции в данный период (табл. 3): понижались горизонтальная поисковая (в 2,2 раза) и вертикальная исследовательская активности (в 6,6 раза) мышей. Это говорит о сужении исследовательского поведения в группе животных, получавшей пирацетам. Применение зонгорина во всех исследуемых дозах оказывало положительное влияние на поведенческую активность мышей в этот период и способствовало сохранности рефлекса у 37,5 - 50% животных (табл. 3).

На 16-е сутки тестирования сохранность рефлекса регистрировалась у 75% интактных животных (табл. 4). Назначение мышам препарата сравнения не обеспечивало достоверного воспроизведение рефлекса к этому времени и очень низким, относительно фонового, оставался показатель вертикальной активности животных (табл. 4). Курсовое превентивное введение дитерпенового алкалоида зонгорина в дозах 5 и 25 мкг/кг способствовало статистически значимой относительно негативного контроля сохранности УРПИ у мышей (37,5 и 25% соответственно) даже на столь отдаленных сроках исследования.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что курсовое введение зонгорина во всех исследуемых объемах корригировало нарушения мнестической функции, вызываемые скополамином, что проявлялось в улучшении выработки условного рефлекса пассивного избегания и нормализации поведенческой активности мышей на протяжении всего периода наблюдений. Данный эффект превосходил таковой у животных, получавших препарат сравнения - пирацетам.

ЛИТЕРАТУРА

1. Живолупов С.А., Бардаков С.Н., Самарцев И.Н., Гневышев Е.Н. Роль антихолинэстеразных средств в оптимизации лечения цереброваскулярных заболеваний (теоретические предпосылки и клиническая феноменология) // Журнал неврологии и психиатрии. - 2014. - Т. 8, №2. - С. 57-64.

2. Liu С.The pattern of brain gray matter impairments in patients with subcortical vascular dementia // J Neurol Sci. - 2014. - Vol. 341, N 1-2. - P. 110-118.

3. Яхно Н.Н., Преображенская И.С. Болезнь Альцгеймера: патогенез, клиника, лечение // Русский медицинский журнал. - 2002. - №10. - С. 1143-1146.

4. Колыханов И.В., Рассадина Г.А., Гаврилова С.И. Поведенческие и антипсихотические эффекты холинергической терапии болезни Альцгеймера (сравнительное исследование) // Современная терапия психических расстройств. - 2008. - №3. - С. 34-39.

5. Успенская О., Захаров В. Патогенетические и нейрохимические основы развития болезни Альцгеймера // Врач. - 2010. - №4. - С.72-74.

6. Selkoe DJ. Alzheimer's Disease. In: Rosenberg's Molecular and Genetic Basis of Neurological and Psychiatric Disease (Fifth Edition). Rosenberg RN, Pascual JM, editors. Elsevier. - 2015. - P. 753-768.

7. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М.: ОО "Изд-во Новая Волна", 2008. - 1206 с.

8. Katz S., Peters K.R. Eachancing the mind? Memory medicine, dementia and the aging brain // J. Aging Studies. - 2008. - Vol. 22. - P. 348-355.

9. Самылина И.А., Булаев В.М. Лекарственные растения в лечении когнитивных расстройств // Фармация. - 2012. - №8. - С.47-50.

10. Adams М., F., Hamburger М. Plants traditionally used in age related brain disorders - a survey of ethnobotanical literature // J. Ethnopharmacol. - 2007. - Vol. 113. - P. 363-381.

11. Nesterova Yu.V., Pashinsky V.G., T.N., Pushkarskiy S.V., Popova E.V., Nagornjak Yu.G., Semenov A.A., Andreeva T.I., Zhdanov V.N., Suslov N.I. Antihypoxic activity of vegetative extracts // Traditional medicine: A current situation and perspectives of development (Materials of the III scientific conference. Ulan-Ude, Russia. - August 18-22. – 2008. - P. 78.

12. Nesterova Yu.V. T.N., Suslov N.I., Shults E.E., G.N., Aksinenko S.G., O.G., Krapivin A.V., Kharina T.G. Anxiolytic activity of diterpene alkaloid songorine // Bulletin of Experimental Biology and Medicine - October, 2015. - Volume 158, Issue 5. - P. 1-3.

13. Nesterova Yu.V. T.N., Suslov N.I., Semenov A.A., Pushkarskiy S.V. Antidepressant Activity of Diterpene Alkaloids of Aconitum baicalense Turcz. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine - August, 2011. - Vol. 151, Issue 4. - P. 425-429.

14. Nesterova Yu.V., T.N., Suslov N.I., G.N., Pushkarskiy S.V., Aksinenko S.G., Schulz E.E., Kravtsova S.S. and Krapivin A.V. Analgesic Activity of Diterpene Alkaloids from Aconitum baikalense // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - August, 2014. - Vol. 157. Issue 4. - P. 488-491.

15. Nesterova Yu.V. T.N., Suslov N.I., Shults E.E., G.N., Aksinenko S.G., Pushkarskiy S.V., and Krapivin A.V. Anti-inflammatory Activity of Diterpene Alkaloids from Aconitum baikalense // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - March, 2014. - Vol. 156, Issue 5. - P. 665-668.

16. Malykh Andrei G. and Reza Sadaie M. Piracetam and piracetam-like drugs. From basic science to novel clinical applications to CNS disorders // Drugs. - 2010. - Vol. 70, N 3. - P. 287-312.

17. Pilch H., Muller W.F. Piracetam elevates muscarinic cholinoreceptor density in the frontal cortex of aged but not of young mice // Psychopharmacology. - 1988. - Vol. 94. - P. 74-48.

18. Суслов Н.И., Ратахина Л.В., Першина О.В., Поветьева Т.Н., Литвиненко В.И., Попова Т.П. Влияние сухого экстракта из корней Scutellaria baicalensis georgi на формирование и воспроизведение условно-рефлекторного навыка при действии скополамина у мышей // Растительные ресурсы. - 1994. - №4. - С.66-70.

19. Абдулина О.В. Пирацетам: от механизма действия к лечению когнитивных расстройств // Русский мед. журнал. - Т. 18, №26. - 2010. - С. 1596-1600.

20. Азарашвили А.А. Исследование механизмов памяти с помощью физиологически активных соединений. - M., 1981. - 185 с.

21. Шабанов П.Д., Бородкин Ю.С. Нарушения памяти и их коррекция. - Л., 1989. - 128 с.

22. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. / Под ред. А.Н. Миронова. - M.: Гриф и К, 2012. - 944 с.

23. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. / Под ред. А.С. Бутаева. - M.: Высш. шк., 1991. - 399 с.

Примечание. Перед уровнями значимости p стоят номера сравниваемых групп.

Примечание. Перед уровнями значимости p стоят номера сравниваемых групп.

Примечание. Перед уровнями значимости p стоят номера сравниваемых групп.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству, корригирующему холинергические нарушения мнестических процессов. Применение дитерпенового алкалоида зонгорина в качестве средства, корригирующего холинергические нарушения мнестических процессов. Вышеописанное средство эффективно для коррекции холинергических нарушений мнестических процессов. 1 ил., 4 табл.

Применение дитерпенового алкалоида зонгорина в качестве средства для коррекции холинергического нарушения мнестических процессов.