Способ синтеза (3aR,4S,8S,12R,12aS,12bR)-10-метил-2-фенилоктагидро-1H-4,12a-этено-8,12-метанопирроло[3',4':3,4]пиридо[1,2-a][1,5]диазоцин-1,3,5(4H)-триона с ноотропными, гипогликемическими, антигипоксическими и антиагрегационными свойствами Российский патент 2025 года по МПК C07D471/22 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и касается усовершенствованноого способа синтеза соединения формулы 1 и возможности его применения в качестве ноотропного, гипогликемическего, антигипоксического и антиагрегационного лекарственного средства для терапии комплекса нейродегенеративных заболеваний, вызванных или осложненных сахарным диабетом.

Серьезной медицинской проблемой, характерной для населения старших возрастных групп, являются нарушения когнитивных функций, в том числе, вызванные сахарным диабетом (СД) (https://diabetestalk.net/diabetes/diabetes-and-dementia-in-older-adults; Biessels G.J., Despa F. Cognitive decline and dementia in diabetes mellitus: mechanisms and clinical implications // Nat. Rev. Endocrinol. 2018. Vol. 14. P. 591). Диабетические энцефалопатии (ДЭ), начальные стадии которых проявляются легким или умеренным когнитивным дефицитом и субклиническими аффективными расстройствами, представляют собой наиболее распространенные осложнения, прогрессирование которых сопровождается высокими рисками развития серьезных нейродегенеративных заболеваний (НДЗ) (Toth C. Diabetes and neurodegeneration in the brain // Handb. Clin. Neurol. 2014. Vol. 126. P. 489). Так, при длительном течении СД 2 типа риск возникновения таких НДЗ, как болезнь Альцгеймера, повышается на 65% (Lynn J., Park M., Ogunwale C., Acquaah-Mensah G.K. A Tale of Two Diseases: Exploring Mechanisms Linking Diabetes Mellitus with Alzheimer's Disease // J. Alzheimers Dis. 2022. Vol. 85. P. 485). В настоящее время в клинической практике для лечения СД 2 типа (Moran C., Lacy M.E., Whitmer R.A., Tsai A.L., Quesenberry C.P., Karter A.J., Adams A.S., Gilsanz P. Glycemic Control Over Multiple Decades and Dementia Risk in People With Type 2 Diabetes // JAMA Neurol. 2023. Vol. 80. P. 597) широко применяются следующие гипогликемические средства сульфонилмочевины и меглитиниды - стимулирующие выработку инсулина, бигуаниды - уменьшающие выработку глюкозы печенью, тиазолидиндионы - повышающие чувствительность клеток организма к инсулину и снижающие выработку глюкозы печенью, ингибиторы альфа-глюкозидазы - замедляющие всасывание углеводов, поступающих в организм, ингибиторы фермента дипептидилпептидазы-4, агонисты глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) - имитирующие действие определенных гормонов кишечника (инкретинов), участвующих в контроле уровня сахара в крови, ингибиторы котранспортера глюкозы натрия 2 (SGLT2) - помогающие выводить глюкозу с мочой.

Глимеперид Натеглинид Метформин Пиоглитазон Линаглиптин Канаглифлозин Акарбоза

В то же время, основным компонентом комплексной терапии когнитивных дисфункций, в том числе, протекающих на фоне СД, являются ноотропные препараты, которые влияют на высшие интегративные функции мозга, улучшают память, облегчают процессы обучения, повышают устойчивость мозга к негативным воздействия, улучшают межнейрональные связи (Преображенская И.С. Ноотропные препараты в гериатрической практике // РМЖ. 2004. Vol. 5. P. 256; Kang M.G., Lee D., Kwon S., Lee E., Kim W.J. Effectiveness of Nootropics in Combination with Cholinesterase Inhibitors on Cognitive Function in Mild-to-Moderate Dementia: A Study Using Real-World Data // J. Clin. Med. 2022. P. 11). Ноотропные препараты, наиболее часто применяемые в клинической практике, представлены химическими соединениями разнообразных структурных групп и различаются по механизму своего фармакологического действия (Malik M., Tlustoš P. Nootropics as Cognitive Enhancers: Types, Dosage and Side Effects of Smart Drugs // Nutrients. 2022. P. 14; Машковский М.Д. Лекарственные средства. М, Новая волна. 2007. 1200 c.) - это может быть активация энергетических процессов в нейронах, усиление мозгового кровообращения и микроциркуляции, влияние на метаболизм и функции основных нейромедиаторов, нейропротекция, антигипоксическое, антиагрегационное воздействие.

Пирацетам Центрофеноксин Гаммалон Гопантан Пиритинол Холина альфосцерат Винпоцетин Циннаризин Бромантан

Одну из перспективных групп средств терапии когнитивных расстройств представляют лиганды никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР), что обусловлено связью между состоянием никотиновых ацетилхолиновых рецепторов и развитием большинства нейродегенеративных заболеваний (O'Neill M.J., Murray T.K., Lakics V., Visanji N.P., Duty S. The role of neuronal nicotinic acetylcholine receptors in acute and chronic neurodegeneration // Curr. Drug Targets CNS Neuro.l Disord. 2002. Vol. 1. P. 399; Utkin Y.N. Aging Affects Nicotinic Acetylcholine Receptors in Brain // Cent. Nerv. Syst. Agents Med. Chem. 2019. Vol. 19. P. 119). Так, на основе хинолизидинового алкалоида цитизина, являющегося лигандом α4β2 подтипа нАХр, синтезировано большое число производных (продуктов алкилирования и ацилирования вторичного атома азота и/или функционализации его 2-пиридонового ядра), которые обладают выраженной способностью позитивно влиять на деятельность центральной нервной системы ЦНС (Boido C.C., Tasso B., Boido V., Sparatore F. Cytisine derivates as ligands for neuronal nicotine receptors and with various pharmacological activities // Farmaco. 2003. Vol. 58. P. 265-277; Tasso B., Boido C.C., Terranova E., Gotti C., Riganti L., Clementi F., Artali R., Bombieri G., Meneghetti F., Sparatore F. Synthesis, Binding, and Modeling Studies of New Cytisine Derivatives, as Ligands for Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptor Subtypes // J. Med. Chem. 2009. V. 52. P. 4345; Cui D., Chen Y., Ye B., Guo W., Wang D., He J. Natural products for the treatment of neurodegenerative diseases // Phytomedicine. 2023. Vol. 121. P. 155101). В то же время показано, что комбинация Тролокса С и собственно цитизина 2 способна снижать уровень глюкозы в крови лабораторных животных (Jin L., Tu J., Jia J., An W., Tan H., Cui Q., Li Z. Drug-repurposing identified the combination of Trolox C and Cytisine for the treatment of type 2 diabetes // J. Transl. Med. 2014 Vol. 12. P. 153). Также трифторбензильное производное цитизина 3 и замещенный бензамид 4 проявляют потенциальную антидиабетическую активность in vitro, экспрессируя транспорт глюкозы Glut4 и активируя AMPK согласно данным (Huang X., Xu H. Advances on the Bioactivities, Total Synthesis, Structural Modification, and Structure-Activity Relationships of Cytisine Derivatives // Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 2020. Vol. 20. P. 369).

Ранее было показано, что продукт реакции (4+2)-циклоприсоединения N-фенилмлаеинимида к метилцитизину 5 - (3aR,4S,8S,12R,12aS,12bR)-10-метил-2-фенилоктагидро-1H-4,12a-этено-8,12-метанопирроло(3',4':3,4)пиридо(1,2-a)(1,5)диазоцин-1,3,5(4H)-трион - соединение формулы 1, проявляет мнестический эффект in vivo (здоровые лабораторные животные - крысы линии Vistar) в тесте условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) в эффективной дозе ЕД₅₀ равной 15 мг/кг, превосходящий мнестический эффект препарата сравнения Пирацетам (78.5% и 71.7%, соответственно). Являясь веществом III класса опасности с ЛД₅₀ 1900 мг/кг, соединение формулы 1 по широте терапевтического действия превосходит препарат сравнения Пирацетам в 4.8 раза (терапевтический индекс пирацетама равен 26.5, терапевтический индекс соединения формулы 1 - 126.6) (Makara N.S., Sapozhnikova T.A., Khisamutdinova R.Yu., Tsypysheva I.P., Borisevich S.S., Koval’skaya A.V., Petrova P.R., Khursan S.L., Zarudii F.S. Nootropic Activity of Novel (-)-Cytisine Derivative (3aR, 4S, 8S, 12R, 12bR)-10-Methyl-2-Phenyloctahydro-1H-4,12a-Etheno-8,12-Methanopyrido(3’,4’:3,4)Pyrido(1,2-a)(1,5)Diazocine-1,3,5(4H)-Trione // Bull. Exp. Biol. Med. 2018. Vol. 164. P. 434).

Первый способ синтеза соединения формулы 1 (МЕТОД I), описанный в (Tsypysheva I.P., Lobov A.N., Koval’skaya A.V., Vinogradova V.I., Suponitsky K.Yu., Khursan S.L., Yunusov M.S. Synthesis of Diels-Alder adducts of quinolizidine alkaloids N-methylcytisine, (-)-leontidine, and (-)-thermopsine with N-phenylmaleimide // Tetrahedron: Asymmetry. 2013. Vol. 24. P. 1318), предполагает длительное нагревание исходных компонентов - метилцитизина 5 и N-фенилмалеинимида в мольном соотношении 1:5 в толуоле с обратным холодильником при атмосферном давлении и температуре 110°С с контролем окончания реакции методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). В результате данной реакции образуется пара диастереомеров (соединение формулы 6 и соединение формулы 1) с «α-эндо» и «β-эндо» расположением сукцинимидного фрагмента, соответственно.

Выход целевого соединения формулы 1, полученного по МЕТОДУ 1, после выделения колоночной хроматографии на SiO₂ (элюент этилацетат) составляет 22%.

Второй способ синтеза соединения формулы 1 (МЕТОД II) в условиях статического высокого давления (СВД) (Tsypysheva I.P., Borisevich S.S., Lobov A.N., Kovalskaya A.V., Shamukaev V.V., Safiullin R.L., Khursan S.L. The Inversion of Diastereoselectivity under High Pressure Conditions: Diels-Alder Reaction of 12-N-substituted Derivatives of (-)-Cytisine with N-Phenylmaleimide // Tetrahedron: Asymmetry. 2015. V. 26. P. 732) предполагает проведение реакции исходных метилцитизина 5 и N-фенилмалеинимида в баростате высокого давления (БВД), который имеет следующие технические характеристики: предельное давление пресса - 30 т при давлении масла в цилиндре пресса 400 атм., предельный ход поршня - 30 мм, давление расчетное в блоке высокого давления диаметром 14 мм - 15000 атмосфер, максимальная температура блока 220^о. Условия проведения реакции : тефлоновый реактор (V = 1.5 мл), мольное соотношение реагентов 1:1.4, растворитель хлористый метилен, давление 0.6 ГПа (5 922 атмосфер), температура 80^оС, время проведения реакции 72 часа.

Выход соединения формулы 1, полученного по МЕТОДУ II, после очистки колоночной хроматографией на SiO₂ (элюент бензол : изопропанол = 7:3) составляет 66% (Tsypysheva I.P., Borisevich S.S., Lobov A.N., Kovalskaya A.V., Shamukaev V.V., Safiullin R.L., Khursan S.L. The Inversion of Diastereoselectivity under High Pressure Conditions: Diels-Alder Reaction of 12-N-substituted Derivatives of (-)-Cytisine with N-Phenylmaleimide // Tetrahedron: Asymmetry. 2015. V. 26. P. 732).

К недостаткам описанных методов относятся: в первом случае - низкий выход целевого соединения формулы 1 (22%) и необходимость использования большого избытка N-фенилмалеинимида (пятикратный мольный избыток); во втором (несмотря на более высокий выход 66%) использование специальной аппаратуры (БВД) и высокого давления (5 922 атмосфер), а также невозможность масштабирования процесса (объем реактора 1.5 мл); общим недостатком МЕТОДОВ I и II является необходимость использования колоночной хроматографии на SiO₂ для выделения и очистки соединения формулы 1.

Таким образом, задачей изобретения является расширение ассортимента низкотоксичных ноотропных препаратов, обладающих дополнительными гипогликемическими, антигипоксическими, антиагрегационными свойствами.

Задача решается улучшенным способом соединения формулы 1, представляющим собой нагревание раствора метилцитизина 5 и N-фенилмалеинимида (мольное соотношение реагентов 1:1.1) в толуоле при температуре 110°С в замкнутом объеме (стальной автоклав, V = 250, 500 или 1000 мл) с последующей кристаллизацией целевого продукта из этилацетата, позволяющим избежать недостатков получения соединения формулы 1, присущих МЕТОДУ I и МЕТОДУ II, а именно: 1) использования большого избытка реагента - 5 экв. N-фенилмалеинимида, 2) высокого давления - 5 922 атмосфер, 3) выделения целевого продукта методом колоночной хроматографии на SiO₂, приводящим к снижению расхода исходных реагентов (на 1 эквивалент метилцитизина приходится лишь 1.1 эквивалент N-фенилмалеинимида) и повышению выхода целевого соединения формулы 1 с 22 до 47%, а также возможностью применения соединения формулы 1 в качестве лекарственного средства с ноотропными, гипогликемическими, антигипоксическими и антиагрегационными свойствами для терапии комплекса нейродегенеративных заболеваний, вызванных или осложненных сахарным диабетом. Необходимо отметить, что подобный комплекс фармакологических свойств у соединений предшественников (хинолизидиновые алкалоиды (-)-цитизин и метилцитизин) отсутствует.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез (3aR,4S,8S,12R,12aS,12bR)-10-метил-2-фенилоктагидро-1H-4,12a-этено-8,12-метанопирроло(3',4':3,4)пиридо(1,2-a)(1,5)диазоцин-1,3,5(4H)-триона (соединение формулы 1)

Раствор 5.1 г (25 ммоль) метилцитизина 5 и 4.8 г (27.5 ммоль) N-фенилмалеинимида в 100 мл толуола помещали в стальной автоклав (V = 250 мл) и выдерживали при температуре 110°С 12 часов, затем охлаждали до комнатной температуры. Реакционную массу концентрировали при пониженном давлении, густой сиропообразный остаток растворяли в 50 мл горячего этилацетата. Медленной кристаллизацией из раствора получили 4.9 г сырого продукта, повторная кристаллизация которого из 30 мл этилацетата дала 4.6 г соединения формулы 1 (выход 47%) в виде белых кристаллов.

Физико-химические константы соединения формулы 1: Т. пл. 134-135 ^оС (этилацетат). (α)²⁰_D = ̶ 5.2 (с 0.8, CHCl₃). ИК (KBr, см^-1): = 2934, 2785, 1774, 1704, 1660, 1653, 1598, 1497, 1384, 1248, 1192, 1148, 756, 728, 694. HRMS (EI): m/z вычислено для C₂₂H₂₃N₃O₃ (M+) 377.1734, найдено 377.1739.

Спектр ЯМР ¹³C (CDCl₃, δ м.д.): 25.4 (C8); 26.5 (C9); 29.6 (C7); 42.8 (C14); 45.2 (C3); 46.8 (C26); 47.8 (C10); 48.4 (C15); 58.4 (C13); 62.2 (C11); 63.4 (C6); 126.3 (C21(25)); 128.9 (C23); 129.2 (C22(24)); 129.6 (C4); 131.5 (C20); 134.3 (C5); 171.6 (C2); 174.3 (C16); 174.6 (C18). Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ м.д., J, Гц): 1.75 (дтд, 1H, ²J = 13.3, ³J_8анти-7 = 3.6, ³J_8анти-9 = 3.6, ⁴J_{8анти-10эндо} = 1.8, H_анти-8); 1.95 (дтт, 1H, ²J = 13.3, ³J_8син-7 = 3.4, ³J_8син-9 = 3.4, ⁴J_{8син-11эндо} = 1.7, ⁴J_{8син-13эндо} = 1.7, H_син-8); 2.15 (дд, 1H, ²J = 12.1, ³J_13экзо-7 = 2.0, H_экзо-13); 2.16 (м, 1H, H-9); 2.16 (ддд, 1H, ²J = 11.4, ³J_11экзо-9 = 2.4, ⁴J_{11экзо-10экзо} = 1.3, H_экзо-11); 2.17 (с, 3H, H-26); 2.80 (ддт., 1H, ²J = 11.4, ³J_11эндо-9 = 3.5, ⁴J_{11эндо-13эндо} = 1.7, ⁴J_{11эндо-8син} = 1.7, H_эндо-11); 3.16 (ддт, 1H, ²J = 12.1, ³J_13эндо-7 = 3.4, ⁴J_{13эндо-11эндо} = 1.7, ⁴J_{13эндо-8син} = 1.7, H_эндо-13); 3.23 (м, 1H, H-7); 3.36 (дд, 1H, ³J_14-15 = 7.9, ³J_14-3 = 3.2, H-14); 3.37 (ддд, 1H, ²J = 13.4, ³J_10экзо-9 = 6.6, ⁴J_{10экзо-11экзо} = 1.3, H_экзо-10); 3.47 (д, 1H, ³J_15-14 = 8.1, H-15); 3.58 (дд, 1H, ²J = 13.4, ⁴J_{10эндо-8анти} = 1.8, H_эндо-10); 4.00 (ддд, 1H, ³J_3-4 = 5.9, ³J_3-14 = 3.2, ⁴J_3-5 = 1.7, H-3); 6.48 (дд, 1H, ³J_4-5 = 8.0, ³J_4-3 = 5.9, H-4); 6.59 (дд, 1H, ³J_5-4 = 8.0, ⁴J_5-3 = 1.7, H-5); 7.14 (дт, 2H, ³J_{21(25)-22(24)} = 6.7, ³J_21(25)-23 = 1.7, ⁴J_{21(25)-25(21)} = 1.7, H-C21(25)); 7.38 (тт, 1H, ³J_23-22(24) = 7.3, ⁴J_23-21(25) = 1.7 Hz, H-C23); 7.44 (ддд, 2H, ³J_22(24)-23 = 7.3, ³J_{22(24)-21(25)} = 6.7, ⁴J_{22(24)-24(22)} = 1.7, H-22(24)).

Пример 2. Изучение ноотропной активности соединения формулы 1 в условиях естественного старения

Эксперимент проводили на 24 белых крысах самцах линии Вистар в возрасте 20 месяцев, массой 350-400 г. Исследуемое соединение формулы 1 вводили перорально, хронически в течение 14 дней в дозе ЕД₅₀ (15 мг/кг) до эксперимента (Makara N.S., Sapozhnikova T.A., Khisamutdinova R.Yu., Tsypysheva I.P., Borisevich S.S., Koval’skaya A.V., Petrova P.R., Khursan S.L., Zarudii F.S. Nootropic Activity of Novel (-)-Cytisine Derivative (3aR, 4S, 8S, 12R, 12bR)-10-Methyl-2-Phenyloctahydro-1H-4,12a-Etheno-8,12-Methanopyrido(3’,4’:3,4)Pyrido(1,2-a)(1,5)Diazocine-1,3,5(4H)-Trione // Bull. Exp. Biol. Med. 2018. Vol. 164. P. 434). В качестве разводящего раствора использовали ДМСО. На 15 день изучали влияние соединения формулы 1 на способность к обучению возрастных крыс на модели выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) с помощью автоматизированной системы LE 870 (Panlab, Испания), состоящей из двух камер - освещенной и затемненной с закрывающейся дверцей между ними и токопроводящим полом в темной камере. Процедура включала в себя два этапа: обучение рефлексу и проверка сохранности рефлекса (Миронов А.Н., Бунятян Н.Д. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Гриф и Ko. Москва. 2012. 944 с.; Mayer G., Nitsch R., Hoyer S. Effects of changes in peripheral and cerebral glucose metabolism on locomotor activity, learning and memory in adult male rats // Brain Res. 1990. Vol. 532. P. 95). В первый день (фаза обучения) животное помещали в середину освещенной камеры хвостом к входу в темную камеру. Регистрировали латентный период входа в темную камеру (время, прошедшее между помещением крысы в середину освещенной камеры и первым входом крысы в темную камеру), при этом общее время наблюдения составляло 5 мин (крысы которые не вошли в темную камеру были исключены из теста). После входа крысы в темную камеру ее подвергали электрораздражению через электрифицированный пол (0.3 мА, 9 с) при закрытой дверце. Второй этап (проверка сохранения памятного следа о болевом рефлексе) выполняли через 24 ч после обучения. Определяли латентный период перед первым заходом в темную камеру, общее время пребывания крысы в темной камере и количество крыс, не вошедших в темную камеру. Мнестическую активность (%), рассчитывали по формуле: М_t = ((t_k-t_оп)/t_k)^.100%, где t_k - среднее время пребывания в темном отсеке животных контрольной группы, t_оп - среднее время пребывания в темном отсеке животных, которым вводили исследуемое вещество (Mayer G., Nitsch R., Hoyer S. Effects of changes in peripheral and cerebral glucose metabolism on locomotor activity, learning and memory in adult male rats // Brain Res. 1990. Vol. 532. P. 95). Статистическую обработку данных проводили методом однофакторного дисперсионного анализа с использованием программы Statistica 10 (Stat soft), данные выражали как средние и их ошибки (M±m). Для сравнений между группами использовали t-критерий Стьюдента, при p<0.05 вероятность различий считали достоверной критерий.

Согласно результатам эксперимента (таблица 1) соединение формулы 1 достоверно увеличивало латентный период захода в темный отсек по сравнению с первым днем и достоверно снижало время нахождения в темном отсеке во второй день эксперимента по сравнению с контролем.

Таблица 1. Влияние соединения формулы 1 на обучаемость старых крыс при выработке условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ), (M±m), (n=8)

Группа Первый этап эксперимента (обучение) Второй этап (через 24 часа) эксперимента (воспроизведение навыка) M_t*, % Латентный период, с Латентный период, с Время в темной камере, с - Контроль 18.5 ± 3.64 4.25 ± 0.45 256.6 ± 26.3 - Пирацетам 9.3±0.16 225.4±14.4 54.0±5.21^** 71.7^** 1 9.63 ± 3.15 247.5 ± 21.1^** 50.3 ± 7.0^** 80.4^**

Мнестическая активность, расчитанная по формуле: М_t = ((t_k-t_оп)/t_k)^.100%, где t_k - среднее время пребывания в темном отсеке животных контрольной группы, t_оп - среднее время пребывания в темном отсеке животных, которым вводили исследуемое вещество.

^**p<0,001 - статистически достоверно по отношению к данным контрольной группы.

В результате, соединение формулы 1 превосходило контроль по мнестическому эффекту на 80%, что обусловлено его выраженным геропротективным действием. Таким образом, было выявлено, что формулы 1 замедляет развитие возраст-зависимого снижения когнитивной функции, улучшая процессы обучения и памяти при выработке УРПИ.

Пример 3. Изучение сахароснижающей и ноотропной активности соединения формулы 1 на модели сахарного диабета, вызванного аллоксаном

Эксперимент проводили на 20 белых крысах линии Вистар обоего пола, массой 200-250 г. Животные были лишены пищи за 16 часов до эксперимента. Сахарный диабет вызывали внутрибрюшинным введением 5% раствора аллоксана моногидрата (ООО Кемифилд, Россия) в физиологическом растворе в дозе 170 мг/кг. Через 72 часа после индукции СД, у животных определяли уровень глюкозы биосенсорным глюкозо-оксидазным методом с помощью системы ONETOUCH Ultra. В эксперимент отбирали животных с показателем глюкозы выше 11 ммоль/л.

Крыс распределяли по группам экспериментальной терапии и контроля - группа СД и группа СД+1, которой изучаемое соединение формулы 1 вводили однократно перорально в дозе ЕД₅₀ = 15 мг/кг (Епринцев А.Т., Селиванова Н.В., Моисеенко А.В. Влияние экстракта топинамбура на функционирование малатдегидрогеназы в печени крыс при аллоксановом диабете // Биомедицинская химия. 2021. Т. 67. С. 144; Волчегорский И.А., Рассохина Л.М., Мирошниченко И.Ю. Церебропротекторное действие производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты в остром периоде аллоксанового диабета у крыс // Эксп. Клин. Фарм. 2011. Т. 74. С. 17). Животные контрольной группы СД получали соответствующий объем дистиллированной воды с ДМСО. Через пять часов после однократного введения соединения формулы 1 животных групп СД и СД+1 обучали условному рефлексу пассивного избегания (УРПИ) с помощью автоматизированной системы LE 870 (Panlab, Испания) согласно протоколу, описанному в примере 2. Проверку сохранности рефлекса осуществляли через 24 часа (Mayer G., Nitsch R., Hoyer S. Effects of changes in peripheral and cerebral glucose metabolism on locomotor activity, learning and memory in adult male rats // Brain Res. 1990. Vol. 532. P. 95). Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2. Влияние соединения формулы 1 на обучаемость крыс с аллоксановым диабетом при выработке условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ), (M±m), (n=8)

Группа Первый этап эксперимента (обучение) Второй этап (через 24 часа) эксперимента (воспроизведение навыка) M_t^*, % Латентный период, с Латентный период, с Время в темной камере, с СД (n=6) 5.8±2.8 19.3±1.68 268.0±11.8 - СД+1 (n=7) 8.2±7.14 251.3±54.6^** 48.8±54.6^** 81.8%

Мнестическая активность, расчитанная по формуле: М_t =((t_k-t_оп)/t_k)^.100%, где t_k - среднее время пребывания в темном отсеке животных контрольной группы, t_оп - среднее время пребывания в темном отсеке животных, которым вводили исследуемое вещество.

** различия достоверны в сравнении с контролем при p<0.05; n - количество животных в группе.

Согласно полученным результатам соединение формулы 1 улучшало обучаемость животных в тесте УРПИ на фоне индуцированного аллоксаном СД. Так, через сутки после обучения латентный период первого захода увеличился в группе соединения формулы 1 (СД+1) в 30.6 раза, а в контроле лишь в 3.3 раза. Время, проведенное животными из группы СД+1 в темной камере, уменьшилось в 5.5 раза (p<0.05) по сравнению с группой контроля (группа СД). Таким образом, мнестическая активность соединения формулы 1 составила 82% (таблица 2).

По окончании теста УРПИ определяли уровень глюкозы в крови лабораторных животных (биосенсорным глюкозо-оксидазным методом с помощью системы ONETOUCH Ultra) после чего изучали их ориентировочно-двигательную активность в установке «Открытое поле», которая представляет собой круглое поле, диаметром 95 см, поделенное на 16 внешних и 8 внутренних секторов с отверстиями («норками»), огороженное бортиком, высотой 35 см, снабженное системой видеофиксации («OpenSience», Россия). Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 10 (Start Soft). Данные представлены как средние и их ошибки (M±m). Статистический анализ данных проводили с использованием ДА, оценку статистической значимости различий при межгрупповых и внутригрупповых сравнениях проводили по критерию Тьюки для неравных объемов и критерию Фишера. Данные теста открытое поле оценивали по критерию Манна-Уитни для двух независимых групп. Различия считались статистически значимыми при p<0.05.

Как оказалось, уровень глюкозы в крови (фигура 1, раздел дополнительные графические материалы) у группы животных, леченных соединением формулы 1 (СД+1), был в 2 раза ниже (p<0.01), чем у контроля с аллоксановым диабетом (12.96±4.94 и 30.63±2.8 ммоль/л, соответственно); в группе интактных животных уровень глюкозы составил 6.2±0.23 ммоль/л (p<0.01). что свидеьельствует о выраженной способности соединения формулы 1 снижать уровень глюкозы в крови на фоне острой фазы аллоксанового диабета более, чем в два раза.

Для оценки ориентировочно-двигательной активности в тесте ОП каждое лабораторное животное помещали в центр поля, и в течение 5 мин фиксировали состоящую из горизонтальной составляющей - число пересеченных секторов, вертикальной составляющей - число стоек, а также число чисток (груминг), заглядываний в норки и дефекацию (вегетативный эквивалент тревоги у крыс). Данный тест позволяет получить интегральную характеристику аффективного статуса грызунов, активность которых в «открытом поле» формируется как равнодействующая двух противоположных тенденций - страха незнакомого пространства и мотивации к его исследованию (Mayer G., Nitsch R., Hoyer S. Effects of changes in peripheral and cerebral glucose metabolism on locomotor activity, learning and memory in adult male rats // Brain Res. 1990. Vol. 532. P. 95).

Согласно данным теста ОП в остром периоде аллоксанового диабета у крыс наблюдается дефицит исследовательско-ориентировочной активности, груминга, но увеличивается число дефекаций по сравнению с интактными животными (данные таблицы 3). Применение исследуемого соединения формулы 1 на фоне аллоксанового СД способствовало нормализации исследовательско-ориентировочной активности: по сравнению с группой контроля в группе соединения формулы 1 увеличилось количество заглядываний в отверстия и актов груминга в 1.9 (p<0,05) и в 2.7 раза (p<0.05). Кроме того в 4.3 раза снизилась анксиогенная дефекация у животных. Также в группе соединения формулы 1 наблюдали вертикальную составляющую двигательной активности - стойки, которые полностью отсутствовали у контрольных животных (таблица 3).

Таблица 3. Влияние соединения формулы 1 на поведение в тесте ОП у крыс в остром периоде аллоксанового диабета (M±m)

Группа Количество стоек Кол-во заглядываний в отверстия Груминг Количество актов дефекации СД (n=6) 0 3.5±1.4 0.3±0.28 1.75±0.28 СД+1 (n=7) 0.2±0.21 6.6±1.89^* 0.8±0.21^* 0.41±0.21^** Интактные (n=6) 4.9±0.69 7.0±0.18^** 1.1±0.39^* 0.30±0.11^**

Различия достоверны в сравнении с контролем при ** p<0,01; * p<0,05; n - количество животных в группе.

При оценке общего состояния лабораторных животных в заключающей стадии эксперимента в группе контроля (группа СД) отмечали ухудшение внешнего вида и общего состояния: взъерошенная шерсть, усиление жажды, потеря в весе, снижение двигательной активности, учащение мочеиспускания, наблюдали падеж животных. Животные экспериментальных групп, по сравнению с контролем были более подвижны, незначительно потеряли в весе. Смертность от диабета на конец эксперимента составила в контрольной группе (СД) - 50% (пало 3 из 6 крыс), в группе животных, получавших соединений формулы 1 (СД+1) - 28% (пало 2 из 7 крыс).

Таким образом, установлено, что в условиях острого периода развития сахарного диабета, вызванного аллоксаном, соединение формулы 1 регулирует уровень глюкозы в крови, снижает смертность животных, тормозит развитие когнитивного дефицита, улучшая память, корректирует исследовательско-ориентировочную активность, увеличивая вертикальную двигательную активность и снижает уровень стресса у животных, попавших в незнакомые условия «открытого поля».

Пример 4. Изучение сахароснижающей и ноотропной активности соединения формулы 1 на модели сахарного диабета, вызванного срептозотоцином

Стрептозотоцин вызывает у подопытных животных смешанную форму сахарного диабета (СД 1-2 типа) за счет повреждения β-клеток свободными радикалами и метилированием ДНК, что приводит к нарушению синтеза инсулина (Szkudelski T. The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas // Physiol. Res. 2001. Vol. 50. P. 536). Диабетогенный эффект низких доз стрептозотоцина связан с угнетением β-клеток поджелудочной железы за счет снижения функциональной активности митохондрий в течение длительного времени (Можейко Л.А. Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета часть II. хирургический, стрептозотоциновый и дитизоновый диабет // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. 2013. № 4. С. 5).

Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар, массой 180-200 г. Животные были лишены пищи за сутки до эксперимента со свободным доступом к воде. Диабет воспроизводили внутрибрюшинным введением стрептозотоцина в дозе 40 мг/кг, раствор готовили в цитратном буфере, pH=4,5 (Миронов А.Н., Бунятян Н.Д. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Гриф и Ko, Москва. 2012. 944 с; Harini R., Ezhumalai M., Pugalendi K.V. Antihyperglycemic effect of biochanin A, a soy isoflavone, on streptozotocin-diabetic rats // Eur. J. Pharmacol. 2012. Vol. 676. P. 89 ). Для предотвращения смертности от первичной гипогликемии крыс поили 5% раствором глюкозы.

После внутрибрюшинного введения стрептозотоцина в указанной дозе у крыс в течение 48-96 часов развивалась гипергликемия, которую наблюдали в течение всего эксперимента. На 4 сутки после индукции СД определяли уровень глюкозы в крови помощью системы ONE TOUCH Ultra; в эксперимент отобрали животных с уровнем глюкозы выше 15 ммоль/л. Были сформированы три экспериментальные группы: 1 - стрептозотоциновый диабет (группа СД); 2 - диабет + соединение формулы 1 (СД+1); 3 -интактные животные. Группе (СД+1) соединение формулы 1 вводили в течение 14 дней внутрижелудочно в дозе EД₅₀ (15 мг/кг) (Makara N.S., Sapozhnikova T.A., Khisamutdinova R.Yu., Tsypysheva I.P., Borisevich S.S., Koval’skaya A.V., Petrova P.R., Khursan S.L., Zarudii F.S. Nootropic Activity of Novel (-)-Cytisine Derivative (3aR, 4S, 8S, 12R, 12bR)-10-Methyl-2-Phenyloctahydro-1H-4,12a-Etheno-8,12-Methanopyrido(3’,4’:3,4)Pyrido(1,2-a)(1,5)Diazocine-1,3,5(4H)-Trione // Bull. Exp. Biol. Med. 2018. Vol. 164. P. 434). Животные с диабетом (СД) получали эквивалентное количество разводящего раствора (раствор ДМСО) в течение того же времени.

На 14 день после начала введения соединения формулы 1 изучили его влияние на выработку условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) у лабораторных животных групп (СД), (СД+1) и интактных на установке («PanLab», Spain) согласно протоколу, описанному в примере 2. Ориентировочно-двигательную активность лабораторных животных групп (СД), (СД+1) и интактных исследовали в установке «Открытое поле» («OpenSience», Россия) согласно протоколу, описанному в примере 3.

Согласно результатам эксперимента (таблица 4) в тесте УРПИ в первый день обучения латентный период у животных с диабетом (СД) был длиннее, чем у здоровых и у группы животных, получавших соединение формулы 1 (группа СД+1), но результаты не были достоверными. На второй день (этап воспроизведения навыка) латентный период увеличился во всех группах относительно первого дня, что говорит о том, что животные помнили о полученном болевом раздражении в темной камере.

Таблица 4. Влияние соединения формулы 1 (ЕД₅₀ = 15 мг/кг) на выработку УРПИ у крыс на фоне диабета, вызванного стрептозотоцином

Группа Латентный период, с 1 день (обучение навыку) 2 день (воспроизведение навыка) СД 37.3±4.7 234.0±37.5* СД+1 22.5±4.7 227.0±37.5* Интактные 18.0±5.1 158.0±41.1* **

Количество животных в группах: СД, СД+1 - 6, интактных - 5; Критерий Тьюки (MS=4284,8, cc=37.882) был достоверным при p<0.05; *относительно первого дня, **относительно группы соединения 1 второй день p=0.019476.

В группе контроля с диабетом (СД) и леченных соединением формулы 1 (СД+1) не вошло в отсек по 4 животных, а в группе интактных - вошли все (в этой же группе было отмечено наименьшее время латентного периода в первый день). Увеличение латентного периода в опытных группах с СД можно объяснить снижением двигательной активности животных на фоне плохого физического состояния, по этой причине мнестическую активность в этом эксперименте не рассчитывали (данные таблицы 4).

По данным теста ОП, на фоне диабета (15 день с начала введения соединения формулы 1) у лабораторных животных групп СД и СД+1 была снижена горизонтальная двигательная активность по сравнению с интактными животными (p=0.017623). Также на фоне диабета наблюдали снижение вертикальной двигательной активности (стойки) (p=0.022480) и снижение количества исследованных норок (p=0.026677) по сравнению с интактной группой. Животные с диабетом, которым вводили соединение формулы 1 (группа СД+1), были активнее, по сравнению с контролем по количеству пересеченных квадратов (результаты не достоверны), на остальные показатели влияния соединения формулы 1 отмечено не было. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5. Влияние соединения формулы 1 на ориентировочно-двигательную активность крыс на фоне диабета, вызванного стрептозотоцином

Соединение Кол-во пересеченных квадратов / 3 мин Количество стоек Количество исследованных норок Число актов груминга СД 11.7±6.3 4.0±2.1 1.5±0.9 4.3±1.6 СД+1 19.8±6.3 4.8±2.1 1.7±0.9 3.0±1.6 интактные 50.0±6.9^* 15.0±2.3^* 6.4±1.0^* 4.2±1.8

Количество животных в группах: СД, СД+1 - 6, интактных - 5; Критерий Манна-Уитни * p<0,05 - достоверно относительно группы диабет.

После окончания теста ОП животных усыпляли и декапитировали, осуществляли забор крови и готовили сыворотку для определения уровня глюкозы и α-амилазы (наборы реагентов «Глюкоза-8-Ольвекс» (Россия) и «Альфа-амилаза-Ольвекс» (Россия), соответственно). Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 10 (Start Soft). Данные представлены как средние и их ошибки (M±m). Статистический анализ данных проводили с использованием ДА, оценку статистической значимости различий при межгрупповых и внутригрупповых сравнениях проводили по критерию Тьюки для неравных объемов и критерию Фишера.

Согласно полученным данным, на 15 день хронического введения лабораторным животным соединения формулы 1 (фигура 2, раздел дополнительные графические материалы) в группе животных с СД уровень глюкозы снизился только на 18% (26.1±1.31 и 21.4±1.5 ммоль/л, p=0.052901). В группе животных СД+1 уровень глюкозы понизился на 77.5% (27.5±1.22 и 6.2±1.4 ммоль/л, p=0.000134) относительно исходных данных и на 71% (p=0.000134) относительно группы СД, что практически соответствовало уровню глюкозы у интактных животных (6.4±1.55 и 4.8±1.73 ммоль/л). Кроме того, на 15 сутки после начала ежедневного введения лабораторным животным соединения формулы 1 уровень фермента α-амилазы у животных, леченных соединением формулы 1 (группа СД+1) также снизился на 24.5% (10.25±0.91 ед/л, p=0.055) по сравнению с группой СД (фигура 3, раздел дополнительные графические материалы). Уровень этого фермента в группе СД оставался повышенным (13.57±1.00 ед/л) относительно интактных животных (7.05±1.12 ед/л, p=0.003014).

Таким образом, соединение формулы 1 достоверно снижало уровень глюкозы и α-амилазы в крови лабораторных животных с диабетом, вызванным стрептозотоцином, увеличивало их двигательную активность, но не влияло на процессы запоминания и воспроизведения памятного следа в тесте условного рефлекса пассивного избегания.

Пример 5. Антигипоксические свойства соединения формулы 1 в условиях экзогенных острых гипоксий: нормобарической гипоксии с гиперкапнией, гемической и гистотоксической гипоксии

Гипоксия - это процесс, сопровождающий или провоцирующий большинство заболеваний, включая нейродегенеративные. При недостатке кислорода происходит нарушение функций мембран, что приводит к окислительному стрессу и нарушению работы всех систем организма, при этом в первую очередь страдает ЦНС. Антигипоксанты применяют для улучшения энергетического статуса клетки в условиях гипоксии (Оковитый С.В., Суханов Д.С., Заплутанов В.А., Смагина А.Н. Антигипоксанты в современной клинической практике // Клин. Мед. 2012. № 9. С 63). Эксперименты по изучению антигипоксических свойств соединения формулы 1 были выполнены на 66 беспородных мышах-самцах массой 18-23 г. Исследуемое соединение формулы 1 (15 мг/кг) и препарат сравнения Пирацетам (400 мг/кг) (Озон, Россия) вводили за 1 час до начала экспериментов внутрижелудочно через зонд в виде растворов в смеси вода/ДМСО. В контрольных группах животные получали однократно дистиллированную воду с ДМСО.

Для воспроизведения нормобарической гипоксии с гиперкапнией мышей одинакового веса помещали по одному животному в герметически закрываемые банки объемом 250 см³ (Миронов А.Н., Бунятян Н.Д. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Гриф и Ko. Москва. 2012. 944 с). Острую гемическую гипоксию вызывали подкожным введением метгемоглобинобразователя - нитрита натрия в дозе 240 мг/кг. Острую гистотоксическую (тканевую) гипоксию вызывали внутрибрюшным введением натрия нитропруссида в дозе 25 мг/кг (Макарова Л.М., Погорелый В.Е., Айрапетова А.Ю., Нечипасова Д.И. Изучение противогипоксической активности компонентов деревообразующих базидиомицетов // Известия Самарского научного центра РАН. 2012. Т. 14. №5(3). С. 742; Мустафин Р.Н., Зеленская К.Л., Шилова И.В., Суслов Н.И., Бакибаев А.А. Антигипоксическое и стресспротекторное действие экстракта альфредии поникшей // Химия растительного сырья. 2012. № 1. С. 211). При моделировании гипоксий отсчет времени жизни животных в минутах начинали непосредственно сразу после воспроизведения гипоксии. Фиксировали продолжительность жизни мышей.

На модели нормобарической гипоксии с гиперкапнией было показано, что соединение формулы 1 увеличивало продолжительность жизни мышей на 20% по сравнению с контролем (таблица 6). На модели острой гемической гипоксии при введении соединения формулы 1, продолжительность жизни мышей увеличивалась на 78.2% (p<0.01) в сравнении с контролем. При острой гистотоксической гипоксии увеличение времени жизни относительно контроля составляет 26.8 % (таблица 7).

Таблица 6. Выживание лабораторных животных в условиях нормобарической гипоксии с гиперкапнией под действием соединения формулы 1 (15 мг/кг)

Соединение Время выживания в условиях гипоксии, мин Увеличение времени жизни относительно контроля, % Контроль 32.8 ± 1,53 - Пирацетам 36.4 ± 0.90 11.0 1 39.4 ± 1.90* 20.1*

Различия достоверны в сравнении с контролем, *p<0.02

Таблица 7. Влияние соединения формулы 1 (15 мг/кг) на продолжительность жизни мышей при тканевой и гемической гипоксии (M±m, n=6)

Группа Продолжительность жизни, мин Увеличение времени жизни относительно контроля, % Острая гемическая гипоксия Гипоксический контроль 17.6 ± 0.58 - 1 31.4 ± 3.12* 78.2* Острая гистотоксическая гипоксия Гипоксический контроль 5.68 ± 0,65 - 1 7.20 ± 0.40 26.8

Различия достоверны в сравнении с контролем *p<0.01

Таким образом, установлено, что соединение формулы 1 увеличивает продолжительность жизни животных при изученных экзогенных гипоксических состояниях, особенно в условиях необратимого нарушения функций гемоглобина (продолжительность жизни увеличивается на 78.2%).

Пример 6. Антиагрегационные свойства соединения формулы 1

Препараты с антиагрегационными свойствами эффективно применяются как для профилактики, так и при терапии нарушений микроцикуляции, предотвращая слипание тромбоцитов и улучшая реологические свойства крови. Так, одним из механизмов действия ноотропного препарата пирацетам является улучшение микроциркуляции в сосудах головного мозга за счет его антиагрегантных свойств. Антиагрегационную активность соединения формулы 1 изучали на 24 крысах-самцах линии Vistar, массой 200-220 г на модели агрегации, вызванной АДФ, в разведении 2×10^-5. Животным внутрижелудочно через зонд вводили соединение формулы 1 (15 мг/кг) и через 45 минут под эфирным наркозом декапитировали для сбора крови. Полученную кровь стабилизировали 3.8% раствором цитрата натрия, в соотношении 4:1. Для получения богатой тромбоцитами плазмы, кровь центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Агрегацию тромбоцитов определяли по методу Born с помощью анализатора агрегации тромбоцитов АТ-02 (Миронов А.Н., Бунятян Н.Д. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Гриф и Ko. Москва. 2012. 944 с). Об антиагрегационной активности соединений судили по уменьшению максимальной амплитуды агрегации, выраженной в процентах, и сравнивали с данными контрольной группы (интактные животные). Результаты эксперимента представлены в таблице 8.

Таблица 8. Антиагрегационная активность соединения формулы 1 (15 мг/кг) у крыс (агрегант АДФ 2×10^-5 М).

Группа Максимальная амплитуда агрегации, % 1 10.3±1.2 АСК (2,14 мг/кг) 7.2±1.1, P<0.01 Контроль 24.89±1.7

Количество животных в группе - 8

P - достоверно по отношению к контролю

Согласно полученным данным соединение формулы 1, эффективно понижало максимальную амплитуду агрегации тромбоцитов в 2.4 раза по сравнению с контролем (таблица 8), что сравнимо с ангиагрегационной активностью ацетилсалициловой кислоты (АСК), которая применяется для улучшения реологических свойств крови и профилактики тромбов в качестве антиагрегационного средства при наличии факторов риска, таких как диабет, гиперлипидимия, сердечно-сосудистые заболевания и др. Таким образом, установлено, что соединение формулы 1 проявляет антиагрегационную активность на уровне АСК.

Заключение

Таким образом, предложен усовершенствованный способ синтеза 8S,12R,12aS,12bR)-10-метил-2-фенилоктагидро-1H-4,12a-этено-8,12-метанопирроло(3',4':3,4)пиридо(1,2-a)(1,5)диазоцин-1,3,5(4H)-триона - соединения формулы 1, заключающийся в нагревании раствора метилцитизина с N-фенилмалеинимидом в толуоле при температуре 110°С в стальном автоклаве с последующей кристаллизацией целевого продукта из этилацетата, что позволяет избежать применения избытка N-фенилмалеинимида, высокого статического давления (0.6 ГПа) и колоночной хроматографии на этапе выделения продукта реакции и повысить выход соединения формулы 1 до 47%. Впервые показана возможность применения соединения формулы 1 в качестве ноотропного, гипогликемическего, антигипоксического и антиагрегационного лекарственного средства для терапии комплекса нейродегенеративных заболеваний, вызванных или осложненных сахарным диабетом.

Изобретение относится к способу синтеза (3aR,4S,8S,12R,12aS,12bR)-10-метил-2-фенилоктагидро-1H-4,12a-этено-8,12-метанопирроло[3',4':3,4]пиридо[1,2-a][1,5]диазоцин-1,3,5(4H)-триона формулы 1, включающему взаимодействие метилцитизина с N-фенилмалеинимидом в органических растворителях при повышенной температуре. Реакция проводится в автоклаве с последующей кристаллизацией целевого продукта из этилацетата. Технический результат – получение соединения формулы 1 с высоким выходом без применения избытка N-фенилмалеинимида, высокого статического давления и колоночной хроматографии на этапе выделения продукта реакции. 3 ил., 8 табл., 6 пр.

Способ синтеза (3aR,4S,8S,12R,12aS,12bR)-10-метил-2-фенилоктагидро-1H-4,12a-этено-8,12-метанопирроло[3',4':3,4]пиридо[1,2-a][1,5]диазоцин-1,3,5(4H)-триона - соединения формулы 1, включающий взаимодействие метилцитизина с N-фенилмалеинимидом в органических растворителях при повышенной температуре, отличающийся тем, что реакция проводится в автоклаве с последующей кристаллизацией целевого продукта из этилацетата.