ПОЛИПЕПТИД, ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЙ СИАЛИЛИРОВАННОЙ САХАРНОЙ ЦЕПЬЮ Российский патент 2018 года по МПК C07K14/565 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полипептиду, гликозилированному сиалилированной сахарной цепью. В частности, настоящее изобретение относится к полипептиду, обладающему активностью интерферона β, гликозилированному высокооднородными сиалилированными сахарными цепями.

Сведения о предшествующем уровне техники

Природный человеческий интерферон β (IFN-β) представляет собой гликопротеин, состоящий из 166 аминокислотных остатков. Интерферон β принадлежит семейству цитокинов и, как известно, вовлечен в иммунорегулирующее действие, антивирусную активность и ингибирующее клеточный рост действие. Кроме того, человеческий интерферон β содержит три Cys в положениях 17, 31 и 141 природной аминокислотной последовательности и один сложный N-связанный олигосахарид при Asn в положении 80. Кроме того, известно, что человеческий интерферон β содержит дисульфидную связь по Cys в положениях 31 и 141.

Интерферон β в качестве фармацевтического средства получают с использованием экспрессионной системы на основе клеток, и классифицируется на IFN-β-1а или IFN-β-1b в зависимости от хозяина для экспрессии. IFN-β-1а получают в экспрессионной системе на основе клеток яичника китайского хомячка (СНО), и он представляет собой гликопротеин, содержащий сахарные цепи, сходные с природным интерфероном β. С другой стороны, IFN-β-1b экспрессируется в Е. Coli и представляет собой белок без сахарных цепей.

Известно, что IFN-β-1а обладает более сильным действием по сравнению с IFN-β-1b в отношении иммуногенности, антивирусной активности и противоопухолевых свойств. Кроме того, структура сахарной цепи, содержащаяся в гликопротеине, как известно, оказывает сильное влияние на фармакокинетику.

Кроме того, известно, что такие эффекты, как улучшение физической стабильности, устойчивости к тепловому воздействию и стабильности в плазме белка, достигаются путем связывания водорастворимого полимера, такого как полиэтиленгликоль (PEG), с белком. Имеются сообщения, касающиеся пегилированного IFN-β с такими предполагаемыми эффектами. Например, имеются сообщения, касающиеся комплекса IFN-β, который пегилирован на N-конце IFN-β-1b (патентная литература 1 и 2). Также, имеются сообщения, касающиеся комплекса IFN-β, который пегилирован на N-конце IFN-β-1а (патентная литература 3). Такие модификации могут действительно способствовать вышеуказанным стабильностям белка, но при этом вызывают проблемы, связанные с тем, что они понижают активность IFN-β в качестве фармацевтического средства. Например, сообщалось, что активность значительно уменьшается в случаях, например, когда молекулярная масса PEG составляет 20000 или выше (непатентная литература 1).

С учетом описанных выше проблем, связанных с пегилированием, имеется также сообщение, касающаяся выбора положения, которое может сохранять активность IFN-β даже в случае присоединения высокомолекулярного PEG для сайт-специфического пегилирования (патентная литература 4). Однако, поскольку PEG представляет собой соединение, которое не существует in vivo, до сих пор не было проведено надлежащего исследования, касающегося накопления, безопасности и эффективности длительного введения пегилированного IFN-β.

Между тем, имеется сообщение, касающееся сайт-специфических гликозилированных комплексов IFN-β (патентная литература 5). В патентной литературе 5 в аминокислотную последовательность природного IFN-β введена аминокислотная мутация, таким образом, что природный IFN-β содержит консенсусную последовательность (Asn-X-Ser/Thr), которая будет являться сайтом узнавания для N-связанной сахарной цепи, и это экспрессируется в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Однако таким способом получают аминокислотные мутации, которые отличаются от подлежащей гликозилированию аминокислоты, для введения консенсусной последовательности. Также, в целом известно, что в случае экспрессии клетками СНО будет возникать неоднородность сахарных цепей.

Перечень ссылок

[Патентная литература 1] Опубликованная заявка на патент США №2009/0214472 [Патентная литература 2] Заявка на патент США №7829659 [Патентная литература 3] Заявка на патент США №7446173 [Патентная литература 4] Международная публикация №2005/019260 [Патентная литература 5] Международная публикация №02/074806 [Непатентная литература 5] J. Control. Rel. Vol. 88, pp. 35-42 (2003)

Краткое описание изобретения

Проблемы, подлежащие решению с помощью изобретения

Например, для модификации полипептида интерферона β используют PEG для улучшения физической стабильности, теплостойкости, стабильности в плазме, и тому подобного, интерферона β, как описано выше. Однако, как описано выше, активность интерферона β в качестве фармацевтического средства может уменьшаться в случае модификации с использованием PEG. Кроме того, так как PEG не представляет собой вещество, которое существует in vivo, то имеется проблема, связанная с неблагоприятными явлениями, индуцированными лекарственным средством вследствие накопления in vivo.

С другой стороны, существует также пример модификации полипептида интерферона β сахарной цепью. Однако, как описано выше, известно, что в случае получения гликозилированного интерферона β путем экспрессии в клетках СНО, возникает неоднородность в добавленном типе сахарной цепи или добавленном положении. В случае, когда сахарные цепи не являются однородными, существует вероятность того, что действие лекарственного препарата как лекарственного средства будет различаться между партиями, и, кроме того, возникает недостаток, связанный с коротким периодом удерживания в крови природного гликозилированного интерферона β.

Способы решения проблем

В результате всестороннего исследования, проведенного авторами настоящего изобретения для решения указанных выше проблем, было обнаружено, что гликозилированный полипептид, имеющий лучшее удерживание в крови и лучшую противоопухолевую активность по сравнению с природным человеческим интерфероном β, может быть получен путем замещения аминокислот в 4-6 положениях гликозилированными аминокислотами, при этом все невосстанавливающие концы сахарной цепи являются сиалилированными в полипептиде интерферона β.

Другими словами, в одном аспекте настоящее изобретение относится к гликозилированному полипептиду, обладающему активностью интерферона β, при этом указанный гликолизированный полипептид представляет собой любой полипептид, выбранный из группы, состоящей из следующих с (1) по (4):

(1) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1;

(2) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, где одна или несколько аминокислот, удаленных, замещены или добавлены,

(3) полипептид, который является аналогом интерферона β; и

(4) полипептид, имеющий 80% или более гомологии с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1,

в котором аминокислоты в четырех-шести положениях являются замещенными гликозилированными аминокислотами, и в котором все невосстанавливающие концы указанной сахарной цепи являются сиалилированными.

В одном аспекте настоящего изобретения указанная соответствующая гликозилированная аминокислота, каждая, может независимо представлять гликозилированный Cys или гликозилированный Asa.

В одном аспекте настоящего изобретения сахарные цепи в указанной соответствующей гликозилированной аминокислоте все могут быть независимо выбраны из группы, состоящей из дисиало-сахарной цепи, трисиало-сахарной цепи и тетрасиало-сахарной цепи.

В одном аспекте настоящего изобретения сахарные цепи в указанной соответствующей гликозилированной аминокислоте все могут быть независимо выбраны из группы, состоящей из следующей формулы (1), формулы (2), формулы (3) и формулы (4).

Химическая формула 1

Химическая формула 2

Химическая формула 3

Химическая формула 4

В одном аспекте настоящего изобретения сахарные цепи в указанной соответствующей гликозилированной аминокислоте все могут быть идентичными.

В одном аспекте настоящего изобретения, по меньшей мере, одна из указанных соответствующих гликозилированных аминокислот может присутствовать в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения все из указанных соответствующих гликозилированных аминокислот могут представлять собой такие аминокислоты, которые не присутствуют в положении, соответствующем положениям 2, 5, 6, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 23, 27, 33, 37, 39, 40, 43, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 73, 78, 83, 86, 87, 90, 93, 94, 100, 124, 125, 128, 131, 132, 138, 141, 142, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 159,160 или 163 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения, по меньшей мере, одна из указанных соответствующих гликозилированных аминокислот может присутствовать в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 41, 48, 75, 79, 107, 112, 123 и 136 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения, по меньшей мере, три из указанных соответствующих гликозилированных аминокислот могут присутствовать в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 41, 48, 75, 79, 107, 112, 123 и 136 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения указанные соответствующие гликозилированные аминокислоты все могут присутствовать в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений: 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения указанный гликозилированный полипептид может быть синтезирован химически.

Кроме того, в одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей:

(1) указанный гликозилированный полипептид и/или его фармацевтически приемлемую соль, и

(2) фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте настоящего изобретения указанную фармацевтическую композицию можно применять для терапии или предупреждения заболевания, связанного с интерфероном β. В настоящем документе указанное заболевание может быть выбрано из группы, состоящей из опухоли головного мозга, кожной злокачественной меланомы, хронического активного гепатита В, хронического гепатита С, подострого склерозирующего панэнцефалита, компенсированного цирроза печени С и множественного склероза.

Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения последовательность гликозилированного полипептида, аминокислота в гликозилированной аминокислоте, тип и структура сахарной цепи в гликозилированной аминокислоте, положение аминокислотного замещения гликозилированной аминокислотой, способ синтеза гликозилированного полипептида в качестве фармацевтической композиции, описанной ранее, могут представлять собой любую комбинацию, выбранную соответственно из указанных выше групп.

Эффекты изобретения

Гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению имеет однородную структуру сахарной цепи, так как он может быть синтезирован химически. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением может быть обеспечен гликозилированный полипептид, обладающий активностью интерферона β, со стабильным качеством и меньшей вариабельностью между партиями, а также фармацевтическая композиция, содержащая указанный выше гликозилированный полипептид.

Кроме того, гликолизированный полипептид согласно настоящему изобретению может представлять собой полипептид, содержащий добавленную к нему сахарную цепь, которая существует in vivo. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением может быть обеспечен гликолизированный полипептид, который является безопасным для организма человека, даже при длительном введении, а также фармацевтическая композиция, содержащая указанный выше гликолизированный полипептид.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением может быть обеспечен гликозилированный полипептид, имеющий более высокое удерживание в крови и более высокую противоопухолевую активность по сравнению с природным интерфероном β, а также фармацевтическая композиция, содержащая указанный выше гликолизированный полипептид.

Гликолизированный полипептид согласно настоящему изобретению продемонстрировал более высокое удерживание в крови и, кроме того, более высокую противоопухолевую активность по сравнению с природным интерфероном β.

Несмотря на то, что пегилированный интерферон β, известный в качестве традиционного метода, является улучшенным в отношении удерживания в крови по сравнению с природным человеческим интерфероном β, улучшения противоопухолевой активности не наблюдается. Удивительным является то, что с помощью настоящего изобретения улучшение удерживания в крови, которое сходно или превышает удерживание в крови пегилированной формы, может быть достигнуто путем использования сахарной цепи, имеющей более низкую молекулярную массу, чем PEG, а также то, что противоопухолевая активность была значительно улучшена в гликозилированной форме согласно настоящему изобретению, даже когда она не была улучшена в пегилированной форме. Таким образом, гликозилированный полипептид в соответствии с настоящим изобретением, по-видимому, обладает высокой активностью интерферона β и является чрезвычайно полезным для лечения заболевания, связанного с интерфероном β.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлен масс-спектр, показывающий результаты выполнения масс-спектрометрии (метод ионизации ESI) на 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), полученном в примере 3-1, и 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), полученном в примере 4-1.

На фигуре 2 представлен снимок, показывающий результаты выполнения SDS-PAGE на 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112-R123C), полученном в примере 3-1, и 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), полученном в примере 4-1.

На фигуре 3 представлен масс-спектр, демонстрирующий результаты выполнения анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) с нормальными фазами на компонентах сахарной цепи 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), полученном в примере 3-1, и 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), полученном в примере 4-1.

На фигуре 4 представлен график, показывающий изменение концентрации в плазме для каждого гликозилированного полипептида при подкожном введении 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) и 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C).

На фигуре 5 представлена таблица, показывающая фармакокинетические параметры для каждого гликозилированного полипептида при подкожном введении 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) и 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-K112C-R123C).

На фигуре 6 представлены графики, показывающие изменение концентрации в плазме для каждого гликозилированного полипептида при внутривенном и подкожном введении 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C) и 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C). График слева показывает изменение концентрации в плазме для каждого гликозилированного полипептида при внутривенном введении, и график справа показывает изменение концентрации в плазме для каждого гликозилированного полипептида при подкожном введении.

На фигуре 7 представлена таблица, показывающая фармакокинетические параметры для каждого гликозилированного полипептида при внутривенном и подкожном введении 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C) и 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C).

На фигуре 8 представлен график, показывающий изменение концентрации в плазме для каждого гликозилированного полипептида при внутривенном введении 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) и 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C).

На фигуре 9 представлена таблица, показывающая фармакокинетические параметры для каждого гликозилированного полипептида при внутривенном введении 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) и 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C).

На фигуре 10 представлен график, показывающий изменение концентрации в плазме для каждого гликозилированного полипептида при подкожном введении 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) и PEG20K-модифицированного IFN-β.

На фигуре 11 представлена таблица, показывающая фармакокинетические параметры для каждого гликозилированного полипептида при подкожном введении 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) и PEG20K-модифицированного IFN-β.

На фигуре 12 представлен график, показывающий результаты оценки противоопухолевой активности у мышей с раком желчных протоков, которым подкожно вводили 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C), 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) и 2-6 дисиало(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C).

На фигуре 13 представлен график, показывающий результаты оценки противоопухолевой активности у мышей с раком желчных протоков, которым подкожно вводили 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-K112C-R123C) и 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C).

На фигуре 14 представлен график, показывающий результаты оценки противоопухолевой активности у мышей с раком желчных протоков, которым подкожно вводили 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), 2-6 трисиало(S1C-С48С-N79C-K107C-R112C-R123C) и 2-6 тетрасиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C).

На фигуре 15 представлен график, показывающий результаты оценки противоопухолевой активности у мышей с раком желчных протоков, которым подкожно вводили 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) и PEG20K-модифицированный IFN-β.

На фигуре 16 показана аминокислотная последовательность интерферона β-1b (SEQ ID NO. 1) в качестве примера аминокислотной последовательности интерферона β согласно настоящему изобретению.

Описание вариантов осуществления

Настоящее изобретение относится полипептиду, гликозилированному сиалилированной сахарной цепью. В частности, настоящее изобретение относится к гликозилированному полипептиду, обладающему активностью интерферона β, гликозилированному высокооднородными сиалилированными сахарными цепями.

В настоящем документе «сахарная цепь» относится к соединению, образованному одним или несколькими сахарными звеньями (моносахарид и/или его производные), соединенными друг с другом. Когда два или более сахарных звеньев соединяются друг с другом, каждое сахарное звено является связанным вследствие конденсации дегидратацией посредством образования гликозидной связи. Такие сахарные цепи включают, но без ограничения, например, широкий спектр таких как моносахариды и полисахариды, содержащиеся in vivo (глюкозу, галактозу, маннозу, фукозу, ксилозу, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, сиаловую кислоту, и их комплексы и производные), а также сахарные цепи, образованные при деградации или происходящие из сложных биологических материалов, такие как деградированные полисахариды, гликопротеины, протеогликаны, глюкозаминогликаны и гликолипиды.

Предпочтительной сахарной цепью в настоящем документе является сахарная цепь, которая не ослабляет активность интерферона β комплекса интерферона. Такая сахарная цепь конкретным образом не ограничена и может представлять собой сахарную цепь, которая существует в виде гликоконъюгата in vivo (такого как гликопептид или гликопротеин, протеогликан и гликолипид), или может представлять собой карбогидрат, который не существует в виде гликоконъюгата in vivo.

Сахарная цепь, которая существует в виде гликоконъюгата in vivo, является предпочтительной в том отношении, что комплекс интерферона согласно настоящему изобретению вводят in vivo. Примеры сахарной цепи, которая существует в виде гликоконъюгата in vivo, включают Ν- или О-связанные сахарные цепи и тому подобное, которые представляют собой сахарные цепи, связанные с пептидом или белком in vivo в виде гликопептида или гликопротеина.

В одном аспекте настоящего изобретения предпочтительно используют N-связанную сахарную цепь. N-связанные сахарные цепи могут включать, например, форму с высоким содержанием маннозы, сложную форму или гибридную форму, при этом особенно предпочтительной является сложная форма.

Сахарные цепи в настоящем документе характеризуются тем, что все невосстанавливающие концы сахарной цепи являются сиалилированными. Выражение «все невосстанавливающие концы сахарной цепи являются сиалилированными» в настоящем документе означает, например, что оба из двух невосстанавливающих концов являются сиалилированными в случае биантенарной сложной сахарной цепи, все из трех невосстанавливающих концов являются сиалилированными в случае триантенарной сложной сахарной цепи, и все из четырех невосстанавливающих концов являются сиалилированными в случае четырехантенарной сложной сахарной цепи.

Используемый здесь термин «сиалилирование» означает, что сиаловая кислота связана с невосстанавливающим концом сахарной цепи. Сиаловая кислота является общим термином для нейраминовой кислоты, содержащей замещенную аминогруппу или гидроксильную группу. В настоящем изобретении сиаловая кислота, присутствующая на невосстанавливающем конце сахарной цепи, может включать любую или все замещенные формы нейраминовой кислоты, поскольку она не ослабляет или значительно не снижает активности интерферона гликозилированного полипептида настоящего изобретения. Помимо этого, в процедуре сиалилирования сахарной цепи в гликозилированном полипептиде в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно используется природная сиаловая кислота в отношении того, что гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению вводят in vivo. Например, N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac), ацетилированная в положении 5, или N-гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc), модифицированная гликолевой кислотой в положении 5, и тому подобное, известны как природные сиаловые кислоты.

В одном аспекте настоящего изобретения конкретные примеры сахарных цепей, содержащие все из невосстанавливающих концов сиалилированными, включают, например, сложную сахарную цепь N-связанной сахарной цепи, поскольку известно, что сахарная цепь существует in vivo. В качестве сложной сахарной цепи N-связанной сахарной цепи также включены цепи, которые отличаются по своему механизму связывания, присутствию или отсутствию фукозы, присутствию или отсутствию модификации на заместителе боковой цепи, и тому подобное, поскольку содержат основной скелет сахарной цепи, в целом известный как сложная сахарная цепь N-связанной сахарной цепи. В зависимости от различия в разветвленной структуре сахарной цепи, примеры N-связанной сложной сахарной цепи могут включать, например, дисиало-сахарную цепь, трисиало-сахарную цепь и тетрасиало-сахарную цепь. Другими словами, используемый здесь термин «дисиало» относится к N-связанной сложной сахарной цепи, которая имеет биантенарную структуру и содержит невосстанавливающие концы, все из которых являются сиалилированными. Аналогичным образом термин «трисиало-сахарная цепь» относится к N-связанной сложной сахарной цепи, которая имеет триантенарную структуру и содержит невосстанавливающие концы, все из которых являются сиалилированными. Аналогичным образом, «тетрасиало-сахарная цепь» относится к N-связанной сложной сахарной цепи, которая имеет четырехантенарную структуру и содержит невосстанавливающие концы, все из которых являются сиалилированными.

В частности, эти сахарные цепи могут включать α2-6-дисиало-сахарную цепь, представленную следующей формулой (1), α2-3-дисиало-сахарную цепь, представленную формулой (2), α2-6-трисиало-сахарную цепь, представленную формулой (3), α2-6-тетрасилао-сахарную цепь, представленную формулой (4), и тому подобное.

Химическая формула 5

Химическая формула 6

Химическая формула 7

Химическая формула 8

Сиалилированные сахарные цепи, представленные здесь, не ограничиваются указанными выше конкретными примерами и включают такие цепи, в которых механизм связывания между сахарной цепью и сиаловой кислотой различается, такие как α2-3-трисиало-и α2-3-тетрасиало-сахарные цепи. Что касается механизма связывания, все разветвленные цепи в сиалилированной сахарной цепи могут иметь сходный механизм связывания, или могут включать различные механизмы связывания.

Кроме того, сиалилированная сахарная цепь в настоящем документе также включает цепи, которые имеют добавленную фукозу. Конкретные примеры сложной сахарной цепи, содержащей добавленную фукозу, могут включать следующую формулу (13) в случае дисиало-сахарной цепи, следующую формулу (15) и формулу (16) в случае трисиало-сахарной цепи, и следующую формулу (17) в случае тетрасиало-сахарной цепи.

Химическая формула 9

Химическая формула 10

Химическая формула 11

Химическая формула 12

В одном аспекте настоящего изобретения сахарные цепи соответствующей гликозилированной аминокислоты в гликозилированном полипептиде настоящего изобретения могут быть все идентичными или могут также содержать различные сахарные цепи. Используемое здесь выражение «сахарные цепи соответствующей гликозилированной аминокислоты в гликозилированном полипептиде являются идентичными» относится к тому факту, что когда аминокислоты в 4-6 положениях замещены гликозилированными аминокислотами согласно настоящему изобретению, тип составляющего сахарную цепь сахара, порядок связывания и механизм связывания являются идентичными в пределах гликозилированного полипептида при сравнении сахарных цепей гликозилированных аминокислот в 4-6 положениях с друг с другом.

Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения в композиции, содержащей гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению, каждая сахарная цепь в гликозилированном полипептиде предпочтительно является по существу однородной. Используемое здесь выражение «каждая сахарная цепь в гликозилированном полипептиде является по существу однородной» относится к тому факту, что когда каждую сахарную цепь сравнивают между гликозилированными полипептидами для каждого положения гликозилирования, положения на полипептиде являются идентичными, и тип составляющего сахарную цепь сахара в каждом положении, порядок связывания и механизм связывания между сахарами являются по существу идентичными в каждой сахарной цепи. В настоящем изобретении каждая сахарная цепь в гликозилированном полипептиде является однородной, по меньшей мере, на 90% или более предпочтительно на 95% или более, и наиболее предпочтительно на 99% или более.

Композиция, содержащая гликозилированный полипептид, характеризующаяся тем, что каждая сахарная цепь в гликозилированном полипептиде является по существу однородной, имеет стабильное качество и особенно предпочтительна в таких областях, как изготовление лекарственных средств и проведение анализов. Доля однородных сахарных цепей может быть измерена, например, методом с использованием HPLC, капиллярного электрофореза, масс-спектрометрии и т.п.

Используемая здесь «аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO. 1», представляет собой аминокислотную последовательность интерферона β-1b (смотри фигуру 16). Интерферон β-1b, как известно, содержит делецию Met в положении 1 и Cys в положении 17, замещенный на Ser в природном человеческом интерфероне β.

Используемый здесь «гликозилированный полипептид» относится, например, к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, содержащий аминокислоты в 4-6 положениях, замещенные «гликозилированными аминокислотами».

Используемая здесь «гликозилированная аминокислота» представляет собой аминокислоту, содержащую присоединенную к ней Сахарную цепь, при этом сахарная цепь и аминокислота могут соединяться посредством линкера.

Тип аминокислоты, подлежащей гликозилированию, конкретным образом не ограничен, и можно использовать любую из природных и неприродных аминокислот.

Когда сахарная цепь и аминокислота соединены посредством линкера, с точки зрения свойств легкости связывания с линкером, предпочтительная аминокислота гликозилированной аминокислоты представляет собой аминокислоту, содержащую две или более карбоксильных групп в молекуле, такую как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аминокислоту, содержащую две или более аминогрупп в молекуле, такую как лизин, аргинин, гистидин и триптофан; аминокислоту, содержащую гидроксильную группу в молекуле, такую как серии, треонин и тирозин; аминокислоту, содержащую тиольную группу в молекуле, такую как цистеин; и аминокислоту, содержащую амидную группу в молекуле, такую как аспарагин и глутамин. В частности, с точки зрения реакционной способности предпочтительными являются цистеин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, серии, треонин и глутамат.

В отношении любого гликозилированного полипептида согласно настоящему изобретению предполагается, что, если структура сахарной цепи, структура, отличная от сахарной цепи, сайт гликозилирования и количество добавленных сахарных цепей являются идентичными, то отсутствует значительное различие в периоде полувыведения из крови гликозилированного полипептида согласно настоящему изобретению в случаях, когда гликозилированной аминокислотой является гликозилированный Asn и когда гликозилированной аминокислотой является гликозилированный Cys.

В случае, когда сахарная цепь и аминокислота соединены посредством линкера, в качестве линкера можно использовать линкеры, которые широко применяются в данной области, примеры которых могут включать -NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂- (где а означает целое число, которое конкретно не ограничено, при условии, что не ингибирует целевую функцию линкера, но предпочтительно представляет собой целое число от 0 до 4), С_1-10-полиметилен, -CH₂-R- (где R представляет собой группу, полученную путем удаления одного атома водорода из группы, выбранной из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, карбоциклической группы, замещенной карбоциклической группы, гетероциклической группы и замещенной гетероциклической группы), -(СО)-(СН₂)_а-(СО)- (где а означает целое число, которое конкретно не ограничено, при условии, что не ингибирует целевую функцию линкера, но предпочтительно представляет собой целое число от 0 до 4), и тому подобное.

Способ получения гликозилированного полипептида согласно настоящему изобретению не ограничен каким-либо образом его описанием (например, описанием «гликозилированный полипептид, содержащий аминокислоту, является замещенным гликозилированной аминокислотой»), и гликозилированный полипептид, полученный любым из способов А или В, описанных ниже, включен в «гликозилированный полипептид, содержащий аминокислоту, является замещенным гликозилированной аминокислотой». Кроме того, например, гликозилированный полипептид, в котором сахарная цепь без какой-либо присоединенной аминокислоты соединяется напрямую или посредством линкера с аминокислотой на пептиде; гликозилированный полипептид, в котором сахар или сахарная цепь дополнительно добавлена к сахарной цепи, добавленной в гликозилированный полипептид для удлинения уже добавленной сахарной цепи; гликозилированный полипептид, в котором одна или несколько аминокислот соединяются с аминогруппой и/или карбоксильной группой гликозилированной аминокислоты, и дополнительно связаны с одним или несколькими фрагментами интерферона β; и гликозилированный полипептид, в котором сахарная цепь, содержащая присоединенную к ней аминокислоту, соединяется посредством линкера с аминокислотой на пептиде, и т.п. также включены в гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению, при условии совпадения конечных структур.

В одном аспекте настоящего изобретения положения для замещения «аминокислот в 4-6 положениях», описанные выше в отношении гликозилированных аминокислот, должны быть выбраны с учетом различных аспектов таким образом, чтобы активность интерферона β не уменьшалась при замещении гликозилированной аминокислоты. Например, Asn в положении 80 (соответствующем положению 79 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1), где сахарная цепь соединена с природным интерфероном β, является предпочтительным в настоящем документе в качестве положения, подлежащего замещению гликозилированной аминокислотой.

В одном аспекте настоящего изобретения положение замещения для гликозилированной аминокислоты предпочтительно выбрано таким образом, чтобы оно не препятствовало формированию конформации интерферона β в процессе сворачивания полипептида. Для того, чтобы избежать нарушения формирования конформации интерферона β, положение замещения для гликозилированной аминокислоты может представлять собой положение аминокислот, присутствующих на поверхности конформационной структуры, когда интерферон β сформировал конформацию, сходную с природной. Другими словами, положение может представлять собой положения аминокислот, которые не находятся вблизи поверхности конформационной структуры, когда интерферон β сформировал конформацию, сходную с природной (также называемые здесь как «положения неповерхностных аминокислот»). Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения положением замещения для гликозилированной аминокислоты предпочтительно не является рецептор-связывающий сайт интерферона β. Авторы настоящего изобретения провели всесторонние исследования данных, полученных в результате анализов, таких как конформационный анализ интерферона β, для определения положений неповерхностных аминокислот интерферона β, и определили положения, которые могут нарушать другое конформационное формирование, или положения, которые могут нарушать связывание с рецептором. На основании этого, в одном аспекте настоящего изобретения гликозилированные аминокислоты предпочтительно не присутствуют в положении, соответствующем положениям 2, 5, 6, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 23, 27, 33, 37, 39, 40, 43, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 73, 78, 83, 86, 87, 90, 93, 94, 100, 124, 125, 128, 131, 132, 138, 141, 142, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 159, 160 или 163 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1. Кроме того, специалисты в данной области, ознакомленные с данным описанием, смогут надлежащим образом изучить сходство непредпочтительных положений замещения для гликозилированной аминокислоты в соответствии с этими положениями.

В одном аспекте настоящего изобретения положение замещения для гликозилированной аминокислоты предпочтительно не представляет собой Cys в положениях 31 и 141, который образует дисульфидную связь в природном интерфероне β (соответствующих положениям 30 и 140 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1).

Авторы настоящего изобретения провели всестороннее перспективное исследование, описанное выше, для синтеза множества гликозилированных полипептидов, содержащих различные аминокислоты в аминокислотной последовательности, замещенные гликозилированными аминокислотами, и провели их измерение на активность интерферона β. В результате было обнаружено, что по меньшей мере положения 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, представляют собой положения, которые содействуют поддержанию или улучшению активности интерферона β путем гликозилирования.

Исходя из указанных выше соображений, в одном аспекте настоящего изобретения по меньшей мере одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения по меньшей мере две из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствуют в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения по меньшей мере три из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствуют в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения по меньшей мере четыре из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствуют в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения, когда 5 или более положений замещены гликозилированными аминокислотами, по меньшей мере пять из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствуют в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения более предпочтительно, чтобы каждая из гликозилированных аминокислот, описанных выше, все присутствовали в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения более предпочтительно, чтобы одна из гликозилированных аминокислот присутствовала в положении, соответствующем положению 79 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения более предпочтительно, чтобы каждая одна или несколько из других гликозилированных аминокислот (отличных от положения 79) присутствовали в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

Кроме того, эти положения представляют собой предпочтительные конкретные примеры и не предназначены для ограничения перечисленных здесь положений. Специалист в данной области после ознакомления с настоящим изобретением сможет выбрать положения, подлежащие замещению гликозилированными аминокислотами аналогично настоящему изобретению.

В одном аспекте настоящего изобретения одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению 1 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению 3 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению 41 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению 48 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению 75 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению 79 в аминокислотной Последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению 107 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению 112 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению 123 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

В одном аспекте настоящего изобретения одна из соответствующих гликозилированных аминокислот предпочтительно присутствует в положении, соответствующем положению 136 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения, в случае замещения аминокислоты гликозилированной аминокислотой, положение может представлять собой любую комбинацию положений, выбранных из указанных выше положений замещения.

Конкретными примерами предпочтительной комбинации положений, в которых присутствуют соответствующие гликозилированные аминокислоты, описанные здесь выше, могут служить, но без ограничения, положения, соответствующие следующим положениям в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1:

положения 1, 48, 79, 107, 112 и 123;

положения 1, 3, 48, 79, 107 и 112;

положения 1, 48, 79, 99, 107 и 112;

положения 1, 48, 79, 107, 112 и 130;

положения 1, 48, 79, 107, 112 и 136;

положения 1, 48, 79, 107, 112 и 139;

положения 1, 48, 79, 107, 112 и 164;

положения 1, 29, 48, 79, 107 и 136;

положения 1, 35, 48, 79, 107 и 136;

положения 1, 41, 48, 79, 107 и 136;

положения 1, 48, 75, 79, 107 и 136;

положения 48, 75, 79, 107, 112 и 136;

положения 41, 75, 79, 103, 107 и 136;

положения 41, 75, 79, 106, 107 и 136;

положения 41, 75, 79, 107, 109 и 136;

положения 41, 75, 79, 107, 112 и 136;

положения 41, 75, 79, 107, 115 и 136;

положения 41, 75, 79, 107, 119 и 136;

положения 1, 28, 48, 70 и 79;

положения 1, 48, 79, 107 и 112;

положения 24, 79, 107, 112 и 136;

положения 25, 79, 107, 112 и 136;

положения 32, 79, 107, 112 и 136;

положения 35, 79, 107, 112 и 136;

положения 38, 79, 107, 112 и 136;

положения 41, 79, 107, 112 и 136;

положения 7, 79, 107, 112 и 136;

положения 48, 79, 107, 112 и 136;

положения 75, 79, 107, 112 и 136;

положения 41, 75, 79, 107 и 136;

положения 42, 75, 79, 107 и 136;

положения 45, 75, 79, 107 и 136;

положения 46, 75, 79, 107 и 136;

положения 47, 75, 79, 107 и 136;

положения 48, 75, 79, 107 и 136;

положения 49, 75, 79, 107 и 136;

положения 50, 75, 79, 107 и 136;

положения 1, 48, 79 и 107;

положения 1, 3, 48 и 79;

положения 79, 107, 112 и 136;

положения 1, 79, 107 и 136;

положения 28, 79, 107 и 136;

положения 35, 79, 107 и 136;

положения 70, 79, 107 и 136; и

положения 75, 79, 107 и 136.

Положение, соответствующее положению в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, в настоящем документе относится к аминокислоте в положении, соответствующем положению аминокислоты в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, при условии отсутствия добавления, делеции, и тому подобного, аминокислот. Кроме того, в случае присутствия добавления или делеции аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, термин относится к аминокислоте в положении, которое учитывает смещение на аминокислотной последовательности вследствие добавления или делеции аминокислот. Например, в гликозилированном интерфероне β-1b, имеющем последовательность Ser₁-Tyr₂-Asn₃-Leu₄- в положениях с 1 по 4, когда одна аминокислота (Trp) добавлена между аминокислотами в положениях 1 и 2 (Ser-Trp-Tyr-Asn-Leu-), «положение, соответствующее положению 2 (Tyr)» относится к положению аминокислоты (Tyr), которая смещена в направлении С-конца вследствие добавления Trp.

Используемый здесь термин «аминокислота» применяется в самом широком смысле и может включать в себя не только природные аминокислоты, но также неприродные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот. Принимая во внимание такое широкое определение, специалисты в данной области должны понимать, что аминокислоты в настоящем документе включают, например, природные протеиногенные L-аминокислоты; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот; природные непротеиногенные аминокислоты, такие как норлейцин, β-аланин и орнитин; химически синтезированные соединения, имеющие свойства, хорошо известные в данной области, которые характерны для аминокислот, и т.п. Примеры неприродных аминокислот включают α-метиламинокислоты (такие как α-метилаланин), D-аминокислоты, подобные гистидину аминокислоты (такие как 2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин и α-метилгистидин), аминокислоты, имеющие дополнительные метиленовые группы в боковой цепи («гомо» аминокислоты), и аминокислоты, в которых карбоксильная функциональная группа аминокислоты в боковой цепи замещена сульфонатной группой (такой как цистеиновая кислота). В предпочтительном аспекте аминокислоты, содержащиеся в соединении согласно настоящему изобретению, состоят только из природных аминокислот.

«Аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO. 1» в настоящем документе означает аминокислотную последовательность интерферона β-1b (смотри фигуру 16). Как известно, интерферон β-1b содержит делецию Met в положении 1 и Cys в положении 17, замещенный на Ser в природном человеческом интерфероне β.

Используемое здесь выражение «содержащая одну или несколько аминокислот, удаленных, замещенных или добавленных в аминокислотную последовательность» означает, что число аминокислот, подлежащих замещению и т.д., конкретным образом не ограничено, если активность интерферона β сохраняется и, например, означает, что около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот являются отличными. Альтернативно, указанное выражение может также включать случаи, когда 20% или менее, предпочтительно 10% или менее аминокислот в аминокислотной последовательности полной длины являются отличными. Аминокислота, подлежащая замещению, или добавлению, может представлять собой природную аминокислоту, неприродную аминокислоту или аналог аминокислоты, предпочтительно природную аминокислоту. В одном аспекте настоящего изобретения полипептид, «имеющий одну или несколько аминокислот, которые являются удаленными, замещенными или добавленными в аминокислотную последовательность», включает природный человеческий интерферон β. Как описано выше, полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, то есть интерферон β-1b, содержит делению Met в положении 1 и Cys в положении 17, замещенный на Ser в природном человеческом интерфероне β. Другими словами, природный человеческий интерферон β содержит одну добавленную аминокислоту и одну замещенную аминокислоту в полипептиде, состоящем из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1. Специалисты в данной области, ознакомленные с настоящим описанием, смогут использовать аминокислотную последовательность природного человеческого интерферона (интерферона β-1а) вместо аминокислотной последовательности человеческого интерферона β-1b, используемой в примерах согласно настоящему изобретению, и, кроме того, получать и применять данный гликозилированный пептид аналогично настоящему изобретению путем обращения к настоящему описанию изобретения. Аминокислотная последовательность природного человеческого интерферона β-1a представлена как SEQ ID NO. 2. В одном аспекте настоящего изобретения, когда аминокислотная последовательность природного человеческого интерферона β-1a используется вместо аминокислотной последовательности человеческого интерферона β-1b, используемого в представленных примерах, предпочтительно использовать аминокислотную последовательность, которая не содержит неоднородных сахарных цепей, присоединенных в природном положении 80.

Используемый здесь «аналог интерферона β» включает полипептид, сходный по структуре с интерфероном β, и/или полипептид, имеющий структуру, перекрывающуюся со структурой интерферона β, например, полипептид, содержащий одну или несколько аминокислот из числа консервативно замещенных аминокислот интерферона β, модифицированный интерферон β, фрагмент интерферона β, обладающий активностью интерферона β, и удлиненный интерферон β, обладающий активностью интерферона β.

Используемое здесь выражение «имеющий одну или несколько аминокислот из числа консервативно замещенных аминокислот» относится к аминокислотному замещению, при котором индекс гидрофильности и/или индекс гидрофобности являются сходными между исходной аминокислотой и аминокислотой, которой заместили, при этом замещение не приводит к заметному уменьшению или ослаблению активности интерферона β после такого замещения.

Используемый здесь «модифицированный интерферон β» представляет собой модифицированную форму интерферона β, которая- включает природные варианты интерферона β или искусственно модифицированные соединения интерферона β, и такие модификации включают, например, алкилирование, ацилирование (например, ацетилирование), амидирование, карбоксилирование, этерификацию, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидизацию, фосфорилирование, гидроксилирование, связывание вещества для мечения, и тому подобное, одного или нескольких аминокислотных остатков интерферона β.

Используемый здесь «фрагмент интерферона β, обладающий активностью интерферона β» представляет собой пептид, в котором пропущена одна или несколько аминокислот с N-конца и/или С-конца интерферона β и который сохраняет активность интерферона β.

«Удлиненный интерферон β, обладающий активностью интерферона β» представляет собой пептид, в котором добавлена одна или несколько аминокислот с Ν-конца и/или С-конца интерферона, и который сохраняет активность интерферона β.

Гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению может включать полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей 80% или более гомологией с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO. 1, в которой аминокислоты в 4-6 положениях являются замещенными гликозилированными аминокислотами.

Гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению может быть получен путем включения стадии гликозилирования в пептидный синтез, известный специалистам в данной области. Хотя способ, в котором используются ферменты, представленные трансглутаминазой, также можно использовать для гликозилирования, существуют проблемы, связанные с необходимостью присоединения большого количества сахарных цепей, сложной очисткой после проведения конечной стадии и ограничением положений гликозилирования и сахарных цепей, которые могут быть добавлены. Поэтому, несмотря на возможность использования для синтеза в лабораторном масштабе, например для анализов, данный способ нельзя назвать практическим способом для производства в крупном масштабе, например, изготовления лекарственных средств.

В качестве конкретных примеров способов, которые представляют собой легкие способы получения гликозилированного полипептида согласно настоящему изобретению, а также стабильные способы получения гликозилированного полипептида с однородной структурой сахарной цепи, можно привести следующие: способ использования гликозилированного Asn в качестве гликозилированной аминокислоты, и применение хорошо известного способа синтеза пептида, такого как твердофазный и жидкофазный синтез, для получения, таким образом, гликозилированного полипептида (способ А); и способ получения полипептида, имеющего любую аминокислоту полипептида, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, и т.п., замещенную Cys в соответствии с хорошо известным способом синтеза пептида, и затем гликозилирование Cys путем химического синтеза для получения гликозилированного полипептида (способ В). Специалисты в данной области смогут получить различные гликозилированные полипептиды с помощью этих способов, и полученные гликозилированные полипептиды, а также способ их получения являются чрезвычайно полезными, особенно в области изготовления лекарственных средств.

Кроме того, эти способы А и В могут быть выполнены в комбинации двух или более способов. В случае синтеза в лабораторном масштабе, используемого для анализов и т.п., указанный выше способ может быть дополнительно комбинирован с реакцией элонгации сахарной цепи трансферазой. Способ А описан в Международной публикации №2004/005330 (US 2005222382 (A1)) и способ В описан в Международной публикации №2005/010053 (US 2007060543 (A1)), полное содержание которых включено здесь путем отсылки. Кроме того, получение сахарной цепи, имеющей однородную структуру сахарной цепи, используемой в способах А и В, описано, например, в Международной публикации №03/008431 (US 2004181054 (A1)), Международной публикации №2004/058984 (US 2006228784 (A1)), Международной публикации №2004/058824 (US 2006009421 (A1)), Международной публикации №2004/070046 (US 2006205039 (A1)), Международной публикации №2007/011055, полное содержание которых включено здесь путем отсылки.

Способ получения гликозилированного полипептида (Способ А)

Гликозилированный полипептид может быть получен, например, с помощью описанного ниже метода твердофазного синтеза с использованием гликозилированного Asn.

(1) Карбоксильную группу аминокислоты, содержащую азот аминогруппы, защищенный липофильной защитной группой, присоединяют к смоле. В этом случае, поскольку азот аминогруппы аминокислоты защищен липофильной защитной группой, самоконденсация аминокислот предотвращается, и смола и аминокислота взаимодействуют с образованием связи;

(2) Полученную липофильную защитную группу реагента отщепляют с образованием свободной аминогруппы;

(3) Эту свободную аминогруппу амидируют карбоксильной группой любой аминокислоты, содержащей азот аминогруппы, защищенный липофильной защитной группой;

(4) Липофильную защитную группу отщепляют с образованием свободной аминогруппы;

(5) Указанные выше стадии (3) и (4) повторяют один или несколько раз с получением пептида, состоящего из любого числа любых аминокислот, связанных вместе, имеющего смолу у одного своего конца и свободную аминогруппу у другого своего конца;

(6) В заключение, смолу отщепляют кислотой и получают пептид, имеющий желаемую аминокислотную последовательность.

В настоящем документе, если гликозилированный Asn, содержащий азот аминогруппы, защищенный липофильной защитной группой, используется вместо аминокислоты, содержащей азот аминогруппы, защищенный липофильной защитной группой, и карбоксильная группа указанного выше фрагмента аспарагина и гидроксильная группа смолы взаимодействуют на стадии (1), может быть получен пептид, содержащий гликозилированный Asn на С-конце.

Кроме того, после стадии (2) или после повторения стадии (3) или (4), которое может составлять один или более раз, если гликозилированный Asn, содержащий азот аминогруппы, защищенный липофильной защитной группой, используется вместо аминокислоты, содержащей азот аминогруппы, защищенный липофильной защитной группой, на стадии (3), сахарная цепь может быть добавлена в любое положение.

Таким образом, путем использования гликозилированного Asn, содержащего азот аминогруппы, защищенный липофильной защитной группой, вместо аминокислоты, содержащей азот аминогруппы, защищенный липофильной защитной группой, два или более раз на любой из стадий (1) или (3), можно получить пептид, имеющий сахарные цепи, добавленные в любые два или более положений.

Если после присоединения гликозилированной аминокислоты липофильная защитная группа отсоединяется и образуется свободная аминогруппа, и сразу же после этого выполняют стадию (6), может быть получен пептид, содержащий гликозилированный Asn на N-конце.

Смола может представлять собой любую смолу, применяемую в твердофазном синтезе, например, 2-хлортритил-хлоридную смолу, функционализированную хлором (от фирмы Merck & Co., Inc.), смолу амино-PEGA, функционализированную аминогруппой (от фирмы Merck & Co., Inc.), смолу на основе спирта NovaSyn TGT, содержащую гидроксильную группу (от фирмы Merck & Co., Inc.), смолу Wang (от фирмы Merck & Co., Inc.) и смолу HMPA-PEGA (от фирмы Merck & Co., Inc.). Кроме того, между такой смолой амино-PEGA и аминокислотой может быть расположен линкер, и примеры таких линкеров могут включать в себя 4-гидроксиметилфеноксиуксусную кислоту (НМРА), 4-(4-гидроксиметил-3-метоксифенокси)бутилуксусную кислоту (НМРВ), и т.п.

Кроме того, в случае амидирования С-конца предпочтительно использовать, например, смолу Rink-Amide-PEGA, функционализированную аминогруппой (от фирмы Merck & Co., Inc.). С-концевая аминокислота пептида может быть амидирована путем расщепления этой смолы и пептида при помощи кислоты.

Для связывания между смолой и аминокислотой, содержащей азот аминогруппы, защищенный лиофильной защитной группой, например, для использования смолы, содержащей гидроксильную группу, или смолы, функционализированной хлором, карбоксильную группу аминокислоты подвергают сложноэфирному связыванию со смолой. Кроме того, в случае использования смолы, функционализированной аминогруппой, карбоксильную группу аминокислоты присоединяют к смоле при помощи амидной связи.

В качестве аминокислоты может быть использована любая аминокислота, примеры которой включают природные аминокислоты серии (Ser), аспарагин (Asn), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), аланин (Ala), тирозин (Tyr), глицин (Gly), лизин (Lys), аргинин (Arg), гистидин (His), аспарагиновую кислоту (Asp), глутаминовую кислоту (Glu), глутамин (Gln), треонин (Thr), цистеин (Cys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp) и пролин (Pro).

Можно применять D-форму указанных выше природных аминокислот.

Примеры липофильной защитной группы могут включать, например, защитную группу, которая содержит карбонатную группу или амидную группу, такую как 9-фторенилметоксикарбонильная (Fmoc) группа, трет-бутилоксикарбонильная (Boc) группа, бензильная группа, аллильная группа, аллилоксикарбонильная группа и ацетильная группа. Для введения липофильной защитной группы в аминокислоту, например, когда вводится Fmoc-группа, введение может быть выполнено путем проведения реакции с добавлением 9-фторенилметил-N-сукцинимидилкарбоната и гидрокарбоната натрия. Реакцию можно проводить при температуре от 0 до 50°С, предпочтительно при комнатной температуре приблизительно в течение от 1 до 5 часов.

Коммерчески доступные реагенты также можно использовать в качестве аминокислоты, защищенной липофильной защитной группой. Примеры могут включать Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys-OH, Fmoc-Arg-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Asp-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Trp-OH и Fmoc-Pro-OH.

Кроме того, примеры аминокислоты, защищенной липофильной защитной группой, введенной в боковую цепь, могут включать Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-ОН, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Cys(StBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH и Fmoc-Tyr(tBu)-OH.

Кроме того, в случае добавления линкера в аминокислотную последовательность гликозилированного полипептида, линкер может быть вставлен в предпочтительное положение в процессе твердофазного синтеза путем использования линкера, защищенного липофильной защитной группой, вместо указанной выше аминокислоты, защищенной липофильной защитной группой.

В случае использования 2-хлортритил-хлоридной смолы, этерификация может быть выполнена путем использования основания, такого как диизопропилэтиламин (DIPEA), триэтиламин, пиридин и 2,4,6-коллидин. Кроме того, в случае использования смолы, содержащей гидроксильную группу, в качестве катализатора этерификации могут быть использованы известные агенты дегидратационной конденсации, такие как 1-мезитиленсульфонил-3-нитро-1,2,4-триазол (MSNT), дициклогексилкарбодиимид (DCC), и диизопропилкарбодиимид (DIC). Что касается применяемого соотношения аминокислоты и агента дегидратационной конденсации, в расчете на весовую часть аминокислоты, обычно агент составляет от 1 до 10 частей, предпочтительно от 2 до 5 весовых частей.

Предпочтительно, реакцию этерификации проводят, например, путем помещения смолы в колонку для твердой фазы, и смолу промывают растворителем, после чего добавляют раствор аминокислоты. Примеры растворителей для промывки включают диметилформамид (DMF), 2-пропанол, дихлорметан и т.п. Примеры растворителей для растворения аминокислоты включают диметилсульфоксид (DMSO), DMF, дихлорметан и т.п. Процесс этерификации может быть осуществлен при температуре от 0 до 50°С, предпочтительно при комнатной температуре в течение приблизительно от 10 минут до 30 часов, предпочтительно от 15 минут до 24 часов.

В это время также предпочтительно предохраняют непрореагировавшую гидроксильную группу в твердой фазе путем ацетилирования безводной уксусной кислотой и т.п.

Удаление липофильной защитной группы может быть осуществлено, например, путем обработки основанием. Примеры основания включают пиперидин, морфолин и т.п. Предпочтительно эту реакцию проводят в присутствии растворителя. Примеры растворителя могут включать DMSO, DMF, метанол и т.п.

Предпочтительно реакцию амидирования между свободной аминогруппой и карбоксильной группы любой аминокислоты, в которой азот аминогруппы защищен липофильной защитной группой, проводят в присутствии активатора и растворителя.

Примеры активатора включают дициклогексилкарбодиимид (DCC), гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (WSC/HCl), дифенил фосфорорилазид (DPPA), карбонилдиимидазол (CDI), диэтилцианофосфонат (DEPC), бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидинофосфоний (DIPCI), бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидинофосфоний гексафторфосфат (РуВОР), 1-гидроксибензотриазол (HOBt), гидроксисукцинимид (HOSu), диметиламинопиридин (DMAP), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt), гидроксифталимид (HOPht), пентафторфенол (Pfp-OH), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний гексафторфосфат (HBTU), 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолий 3-оксид-гексафторфосфат (HCTU), O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний гексафторфосфонат (HATU), O-бензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторборат (TBTU), 3,4-дигидро-3-гидроди-4-окса-1,2,3-бензотриазин (Dhbt) и т.п.

Предпочтительно, активатор используется в количестве от 1 до 20 эквивалентов, предпочтительно от 1 до 10 эквивалентов и более предпочтительно от 1 до 5 эквивалентов относительно любой аминокислоты, в которой азот аминогруппы защищен липофильной защитной группой.

Примеры растворителя могут включать DMSO, DMF, дихлорметан и т.п. Этот процесс может быть осуществлен при температуре от 0 до 50°С, предпочтительно при комнатной температуре в течение приблизительно от 10 до 30 часов, предпочтительно в течение приблизительно от 15 минут до 24 часов. Липофильная защитная группа может быть удалена таким же образом, как описано выше.

Отщепление пептидной цепи от смолы предпочтительно проводится с использованием кислоты. Примеры кислот включают трифторуксусную кислоту (TFA), фтористый водород (HF), и т.п.

Таким образом, может быть получен гликозилированный полипептид, у которого желательное положение замещено гликозилированным Asn.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда невосстанавливающий конец на сахарной цепи в гликозилированном Asn, используемом для твердофазного синтеза, содержит сиаловую кислоту, предпочтительно защитить карбоксильную группу указанной выше сиаловой кислоты с помощью защитной группы для предотвращения отщепления сиаловой кислоты при обработке кислотой. Примеры защитных групп включают бензильную группу, аллильную группу, дифенилметильную группу и т.п. Способы введения защитной группы и удаления защитной группы могут быть выполнены хорошо известными способами.

Способы получения гликозилированного полипептида (Способ В)

Гликозилированный полипептид может быть также получен с помощью способа, который включает вначале синтез пептидной цепи и последующее гликозилирование синтезированной пептидной цепи. В частности, пептид, содержащий Cys в положении, подлежащем гликозилированию, получают с помощью твердофазного метода синтеза, методом жидкофазного синтеза, методом клеточного синтеза, методом разделения и экстракции пептидов, существующих в природе и т.п. Cys, который не подлежит гликозилированию, такой как Cys в положении, предварительно определенном для образования дисульфидной связи, защищен в настоящем документе, например, ацетоамидометильной (Acm) группой. Кроме того, при введении в гликозилированный полипептид Cys, который не подлежит гликозилированию и не используется для образования дисульфидной связи, указанный Cys может быть введен путем защиты Cys защитной группой во время стадии гликозилирования и стадии образования дисульфидной связи и затем снятия с него защиты. Примеры такой защитной группы могут включать трет-бутил (tBu) и 4-метоксибензил.

Кроме того, при добавлении другой сахарной цепи в Cys в гликозилированном полипептиде, другая сахарная цепь может быть введена сначала путем приведения Cys для введения сахарной цепи в незащищенное состояние и затем защиты с Cys для введения другой сахарной цепи с помощью StBu и т.п. В частности, при синтезе пептида с помощью твердофазного синтеза и т.д., Cys для введения первой сахарной цепи приводят в незащищенное состояние, и Cys для введения второй сахарной цепи защищают Cys защитной группой Fmoc-Cys(StBu)-OH и т.д. Затем сахарную цепь вводят в незащищенный Cys, при этом защитная группа, такая как StBu все еще удерживается. Затем другая сахарная цепь может быть введена в Cys, который приводят в незащищенное состояние путем снятия защитной группы StBu и т.д. Cys для введения первой сахарной цепи и Cys для введения второй сахарной цепи может быть один или несколько.

Удаление защитной группы StBu может быть осуществлено путем обработки реагентом, таким как трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (ТСЕР), дитиотреитол (DTT), и трибутилфосфин. Указанную выше реакцию обычно проводят при температуре от 0 до 80°С, предпочтительно от 5 до 60°С, и более предпочтительно от 10 до 35°С. Предпочтительно, время реакции составляет приблизительно от 30 минут до 5 часов. После завершения реакции при необходимости можно осуществить очистку хорошо известным способом (таким как высокоэффективная жидкостная колоночная хроматография (HPLC)).

В случае, когда в аминокислотную последовательность гликозилированного полипептида добавлен линкер, указанный линкер может быть вставлен в предпочтительное положение синтезированного полипептида, например, с использованием линкера, защищенного липофильной защитной группой, вместо аминокислоты, защищенной липофильной защитной группой, в процессе твердофазного синтеза.

Далее, при взаимодействии галогенацетилированного производного сложной сахарной цепи с пептидом, содержащим незащищенный Cys, полученный выше, сахарная цепь взаимодействует с тиольной группой незащищенного Cys и присоединяется к пептиду. Указанную выше реакцию можно выполнить в фосфатном буфере, трис-гидрохлоридном буфере, цитратном буфере или их смешанном растворе обычно при температуре от 0 до 80°С, предпочтительно от 10 до 60°С, и более предпочтительно от 15 до 35°С. Предпочтительно, время реакции обычно составляет от 10 минут до 24 часов, и предпочтительно, как правило, приблизительно от 30 минут до 5 часов. После завершения реакции при необходимости можно осуществить очистку хорошо известным способом (таким как HPLC).

Галогенацетилированное производное сложной сахарной цепи представляет собой, например, соединение, содержащее гидроксильную группу, связанную с атомом углерода в положении 1 сложной аспарагин-связанной сахарной цепи, замещенной -NH-(CH₂)_a-(СО)-СН₂Х (где X обозначает атом галогена, и а обозначает целое число, которое не ограничено при условии, что не ингибирует целевую функцию линкера, и предпочтительно представляет собой целое число от 0 до 4).

В частности, галогенацетилированное производное сложной сахарной цепи и Cys-содержащий пептид взаимодействуют в фосфатном буфере при комнатной температуре. После завершения реакции гликозилированный полипептид, замещенный гликозилированным Cys, может быть получен путем очистки HPLC.

Реакция может быть также выполнена в смешанном растворе органического растворителя, такого как DMSO, DMF, метанол и ацетонитрил, с указанным выше буфером. В этом случае в указанный выше буфер может быть добавлен органический растворитель в соотношении в диапазоне от 0 до 99% (об/об). Поскольку добавление такого органического растворителя может улучшить растворимость в реакционном растворе, это является предпочтительным для пептида, содержащего незащищенный Cys, обладающий низкой растворимостью в буфере.

Реакция может быть также выполнена в органическом растворителе, таком как DMSO, DMF, метанол и ацетонитрил, или их смешанном растворе. В этом случае предпочтительно проведение реакции в присутствии основания. Примеры основания могут включать DIPEA, триэтиламин, пиридин, 2,4,6-коллидин и т.п.

Реакция может быть также выполнена в смешанном растворе, содержащем гидрохлорид гуанилина или мочевину, добавленном в буферный раствор. Гидрохлорид гуанидина или мочевину можно добавлять в указанный выше буфер таким образом, чтобы конечная концентрация составила от 1М до 8М. Это является предпочтительным, поскольку добавление гидрохлорида гуанидина или мочевины может также улучшить растворимость пептида, обладающего низкой растворимостью в буфере.

Кроме того, реакция может быть также выполнена путем добавления в буфер соли гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) или дитиотреитола (DTT) для предотвращения образования димера пептидов, содержащих незащищенный Cys, посредством дисульфидной связи. ТСЕР или DTT могут быть добавлены в буфер таким образом, чтобы конечная концентрация составила от 10 мкМ до 10 мМ.

Кроме того, после связывания сахарной цепи с целевым Cys защитную группу Acm и т.п. удаляют. В случае, когда защитная группа представляет собой Acm-группу, снятие защиты может быть выполнено с помощью реакции с йодом, ацетатом ртути (II), нитратом серебра (I) или ацетатом серебра (I) и т.п. в воде, метаноле, уксусной кислоте или их смешанном растворе.

Как правило, указанную выше реакцию проводят при температуре от 0 до 80°С, предпочтительно от 5 до 60°С, и более предпочтительно от 10 до 35°С. Предпочтительно, время реакции составляет приблизительно от 5 минут до 24 часов. После завершения реакции может быть проведена очистка хорошо известным способом (таким как HPLC), при необходимости, после обработки DTT или соляной кислотой и т.п.

Таким образом, может быть получен гликозилированный полипептид, имеющий желательное положение, замещенное гликозилированным Cys. Кроме того, как описано ниже, очищенный таким образом гликозилированный полипептид будет формировать дисульфидную связь между незащищенными Cys.

Кроме того, в случае получения гликозилированного полипептида, имеющего множество содержащих сиаловую кислоту сахарных цепей, таких как дисиало-или моносиало- сахарные цепи, в пептидной последовательности, можно использовать содержащую сиаловую кислоту сахарную цепь, имеющую карбоксильную группу сиаловой кислоты на сахарной цепи, подлежащую введению, защищенную бензильной (Bn) группой, аллильной группой, дифенилметильной группой, фенацильной группой и т.п.

В случае введения сахарной цепи, имеющей защищенную карбоксильную группу сиаловой кислоты, стадия удаления защитной группы сиаловой кислоты может быть выполнена после стадии образования дисульфидной связи в гликозилированном полипептиде.

В этом случае, путем защиты карбоксильной группы сиаловой кислоты бензильной группой и т.п. можно содействовать стадии разделения/очистки путем HPLC и т.п. на стадии получения. Защита карбоксильной группы сиаловой кислоты также позволит предотвратить отщепление кислотонеустойчивой сиаловой кислоты.

Реакцию защиты карбоксильной группы сиаловой кислоты на сахарной цепи можно выполнить с помощью способа, хорошо известного в данной области. Кроме того, в гликозилированном полипептиде, в котором образовалась дисульфидная связь, защитная группа карбоксильной группы сиаловой кислоты может быть удалена путем гидролиза в основных условиях. Указанную выше реакцию обычно проводят при температуре от 0 до 50°С, предпочтительно от 0 до 40°С, и более предпочтительно от 0 до 30°С. Предпочтительно, время реакции составляет приблизительно от 5 минут до 5 часов. После завершения реакции при необходимости можно осуществить очистку хорошо известным способом (таким как HPLC) после нейтрализации слабой кислотой, такой как фосфорная кислота или уксусная кислота.

Кроме того, дисульфидная связь между Cys в гликозилированном полипептиде, полученном указанными выше способами А и В, может быть образована с помощью способа, хорошо известного специалистам в данной области, с использованием воздуха и/или кислорода, йода, DMSO, смеси окисленного и восстановленного глутатиона, феррицианида калия, реагента Эллмана (5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота)), трифторацетата талия (III), сульфоксида алкилтрихлорсилана и т.п.

При образовании дисульфидной связи между Cys-Cys, Cys в гликозилированном полипептиде защищают защитной группой в случае когда образование дисульфидной связи является нежелательным. В качестве такой защитной группы можно использовать защитную группу, стабильную в окислительных условиях, такую как Acm, tBu, 4-метоксибензил, 4-метилбензил и т.п.

В способе В образование дисульфидной связи может быть также выполнено до введения сахарной цепи. Однако, когда защитную группу вводят в Cys для образования дисульфидной связи, стадия снятия защиты предшествует стадии образования дисульфидной связи.

Активность

Гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению обладает активностью интерферона β. «Активность интерферона β» в настоящем документе означает наличие, по меньшей мере, одной активности из числа хорошо известных активностей, таких как иммунорегулирующее действие, антивирусная активность и противоопухолевая активность.

Например, активность интерферона β гликозилированного полипептида может быть измерена с помощью теста, в котором измеряют противоопухолевую активность, описанного в примерах с 11 по 14, и т.п.

Тест, в котором измеряют противоопухолевую активность, может быть проведен, например, путем подкожного введения гликозилированного полипептида несущим опухоль мышам и измерения объема опухоли в динамике по времени.

Фармацевтическая композиция

Фармацевтическая композиция, содержащая гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, является эффективной для терапии или предупреждения заболевания, связанного с интерфероном β. Примеры заболевания, связанного с интерфероном β, включают опухоль головного мозга, кожную злокачественную меланому, хронический активный гепатит В, хронический гепатит С, подострый склерозирующий панэнцефалит, компенсированный цирроз печени С, множественный склероз и т.п. Указанная выше опухоль головного мозга включает глиобластому, медуллобластому, астроцитому и т.п. Фармацевтическая композиция, содержащая гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, является эффективной для терапии или предупреждения указанных выше заболеваний.

Кроме того, субъектом для введения фармацевтической композиции, содержащей гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, является любой биологический индивидуум, предпочтительно животное, более предпочтительно млекопитающее, и более предпочтительно человек.

Указанная выше фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию, формулированную в стандартную форму фармацевтической композиции, содержащую разбавитель или вспомогательные вещества, такие как обычно используемые наполнители, расширители, связующие вещества, смачивающие вещества, дезинтерирующие агенты, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества и т.п.

Примеры таких фармацевтических композиций включают таблетки, пилюли, порошки, жидкости, суспензии, эмульсии, гранулы, капсулы, суппозитории, ингаляции, глазные растворы, инъекции т.п.

Количество гликозилированного полипептида согласно настоящему изобретению, содержащегося в фармацевтической композиции, конкретно не ограничено и может быть выбрано соответствующим образом из широкого диапазона. Указанная фармацевтическая композиция предпочтительно содержит от 1 до 90 масс. %, более предпочтительно от 1 до 70 масс. % гликозилированного полипептида согласно настоящему изобретению.

Фармацевтическая композиция, содержащая гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, может дополнительно содержать другие активные ингредиенты, или может быть использована в комбинации с фармацевтической композицией, содержащей другие активные ингредиенты. Кроме того, фармацевтическая композиция, содержащая гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, может содержать гликозилированный полипептид в виде фармацевтически приемлемой соли, или может также содержать один или несколько дополнительных различных гликозилированных полипептидов согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Указанную фармацевтическую композицию можно использовать в комбинации с одной или несколькими различными фармацевтическими композициями, содержащими гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Кроме того, другие ингредиенты, которые могут содержаться в фармацевтической композиции, могут включать фармацевтически приемлемый носитель и т.п., известные специалистам в данной области.

Способ введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением конкретно не ограничен, и ее вводят способом, который зависит от различных лекарственных форм, возраста пациента, пола, стадии заболевания и других условий. Примером способа введения в случае таблеток, пилюль, жидкостей, суспензий, эмульсий, гранул и капсул является пероральное введение. Кроме того, в случае инъекций введение может включать внутривенное, внутримышечное, интрадермальное, подкожное или интраперитонеальное введение, отдельно или в смеси с типичными заменителями жидкости, такими глюкоза и аминокислоты. В случае суппозиториев введение включает ректальное введение. В случае глазных растворов ее наносят на глазную ткань, такую как конъюнктивная ткань. В случае ингаляций ее применяют в бронхах или легких.

Доза указанной выше фармацевтической композиции может быть выбрана в зависимости от конкретного применения, возраста пациента, пола, стадии заболевания и других условий. Например, доза может составлять от 0,001 до 100 нмоль, предпочтительно от 0,01 до 10 нмоль, и более предпочтительно от 0,01 до 1 нмоль гликозилированного полипептида согласно настоящему изобретению на 1 кг массы тела.

Частота введения указанной выше фармацевтической композиции может быть выбрана в зависимости от конкретного применения, возраста пациента, пола, стадии заболевания и других условий. Например, может быть выбрана частота введения, которая составляет три раза в день, два раза в день, один раз в день, или даже менее частое введение в зависимости от ее стабильности в крови (например, один раз в неделю или один раз в месяц). Частота введения указанной выше фармацевтической композиции предпочтительно составляет один раз в день или реже.

Сахарная цепь, добавленная в гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению, легко разлагается метаболической системой в организме. Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения указанная сахарная цепь имеет структуру, которая существует в связанном с гликопептидом (или гликопртеином) виде in vivo. Таким образом, фармацевтическая композиция, которая содержит гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению и указанный выше гликозилированный полипептид в качестве активных ингредиентов, обладает преимуществами, такими как отсутствие побочных эффектов или антигенных свойств даже при введении in vivo, и вызывает меньше проблем, связанных с утратой эффекта лекарственного средства вследствие аллергических реакций или выработки антител.

Кроме того, гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению является также чрезвычайно полезным в отношении возможности стабильного и легкого изготовления в крупном масштабе и обеспечения высококачественного лекарственного средства со стабильным качеством.

Терминология, используемая в настоящем документе, предназначена для описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема изобретения.

Используемый здесь термин «содержащий», если контекст явно не указывает иначе, означает присутствие описанных наименований (таких как компоненты, стадии, элементы и числа), и не исключает присутствия других наименований (таких как компоненты, стадии, элементы и числа).

Если не указано иное, все используемые здесь термины (включая технические и научные термины), имеют такие же значения, в которых их понимают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. Используемые здесь термины, если не указано иначе, следует рассматривать как имеющие значения, которые согласуются с их смысловыми значениями в контексте настоящего описания и в соответствующих областях техники, и они не должны быть интерпретированы в идеализированном или чрезмерно формальном смысле.

Термины, такие как первый и второй, иногда используются для выражения различных элементов, и следует учесть, что эти элементы не должны ограничиваться указанными терминами. Эти термины используются только с целью отличия одного элемента от другого, и, например, первый элемент может быть назван как второй элемент, и аналогично второй элемент может быть назван как первый элемент без отступления от объема настоящего изобретения.

Настоящее изобретение более подробно описано с помощью примеров. Однако настоящее изобретение может быть осуществлено во многих различных формах и не должно рассматриваться как ограниченное описанными здесь примерами.

Примеры

Описание системы обозначений фрагментов полипептида в настоящем документе приведено ниже.

Например, IFN 1-78(S1Thi-C30Acm)MESNA обозначает пептидный фрагмент, который имеет пептидную последовательность, эквивалентную положениям 1-78 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, при этом серии в положении 1 замещен на цистеин, имеющий структуру тиазолидина, боковая цепь цистеина в положении 30 защищена Acm, и С-конец является алкилтиоэтерифицированным 2-меркаптоэтансульфонатом (MESNA) в его пептидной последовательности.

Кроме того, IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-M35C-Q48C)MESNA обозначает пептидный фрагмент, который имеет пептидную последовательность, эквивалентную положениям 1-78 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, при этом серии в положении 1 замещен на цистеин, имеющий структуру тиазолидина, боковая цепь цистеина в положении 30 защищена Acm, метионин в положении 35 замещен на цистеин, глутамин в положении 48 замещен на цистеин и С-конец алкилтиоэтерифицирован 2-меркаптоэтансульфонатом (MESNA) в его пептидной последовательности.

Аналогичным образом, IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)этан обозначает пептидный фрагмент, который имеет пептидную последовательность, эквивалентную положениям 1-78 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, при этом серии в положении 1 замещен на цистеин, имеющий структуру тиазолидина, боковая цепь цистеина в положении 30 защищена Acm, глутамин в положении 48 замещен на цистеин, и С-конец алкилтиоэтерифицирован этантиолом в его пептидной последовательности.

Кроме того, IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) обозначает пептидный фрагмент, который имеет пептидную последовательность, эквивалентную положениям 79-165 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, при этом аспарагин в положении 79 замещен на цистеин, лизин в положении 107 замещен на цистеин, лизин в положении 112 замещен на цистеин, аргинин в положении 123 замещен на цистеин, и цистеин в положении 140 защищен Acm-группой в его пептидной последовательности.

Описание системы обозначений гликозилированных полипептидов представлено ниже.

Например, 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) обозначает, что каждая аминокислота серина в положении 1, глутамина в положении 48, аспарагина в положении 79, лизина в положении 107, аргинина в положении 112 и аргинина в положении 123 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, замещена на Cys, и структура α2-6-дисиало-сахарной цепи, показанная в следующей формуле (1), присоединена к Cys в каждом замещении.

Химическая формула 13

Кроме того, 2-3дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) обозначает, что каждая аминокислота серина в положении 1, глутамина в положении 48, аспарагина в положении 79, лизина в положении 107, аргинина в положении 112 и аргинина в положении 123 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, замещена на Cys, и структура α2-3-дисиало сахарной цепи, показанная в следующей формуле (2), присоединена к Cys в каждом замещении.

Химическая формула 14

Кроме того, 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) обозначает, что каждая аминокислота серина в положении 1, глутамина в положении 48, аспарагина в положении 79, лизина в положении 107, аргинина в положении 112 и аргинина в положении 123 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, замещена на Cys, и структура α2-6-моносиало-сахарной цепи, показанная в следующей формуле (5) или (6), присоединена к Cys в каждом замещении.

Химическая формула 15

Химическая формула 16

Кроме того, 2-6 трисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) обозначает, что каждая аминокислота серина в положении 1, глутамина в положении 48, аспарагина в положении 79, лизина в положении 107, аргинина в положении 112 и аргинина в положении 123 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, замещена на Cys, и структура α2-6-трисиало сахарной цепи, показанная в следующей формуле (3), присоединена к Cys в каждом замещении.

Химическая формула 17

Кроме того, 2-6 тетрасиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) обозначает, что каждая аминокислота серина в положении 1, глутамина в положении 48, аспарагина в положении 79, лизина в положении 107, аргинина в положении 112 и аргинина в положении 123 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, замещена на Cys, и структура α2-6-тетрасиало-сахарной цепи, показанная в следующей формуле (4), присоединена к Cys в каждом замещении.

Химическая формула 18

Структура сахарной цепи, связанная с Cys, показана в следующей формуле (14) с α2-6-дисиало-сахарной цепью в качестве примера. В следующей формуле волнистые линии указывают, что изображения соседних аминокислот, связанных пептидными связями с цистеином, изображенные в правом крае следующей формулы, являются пропущенными.

Химическая формула 19

«Дисиало» означает дисиало-сахарную цепь, «моносиало» означает моносиало-сахарную цепь, «трисиало» означает трисиало-сахарную цепь, и «тетрасиало» означает тетрасиало-сахарную цепь.

Кроме того, 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79-K107C-R112C-R123C) обозначает, что каждая аминокислота серина в положении 1, глутамина в положении 48, лизина в положении 107, аргинина в положении 112 и аргинина в положении 123 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, замещена на Cys, и структура α2-6-дисиало-сахарной цепи, показанная в следующей формуле (1), присоединена к Cys в каждом указанном выше замещении, и аспарагина в положении 79.

Химическая формула 20

Кроме того, в следующих примерах, IFN-β, содержащий аминокислоты в 4, 5 и 6 положениях, замещенные гликозилированными аминокислотами, может быть представлен, соответственно, как «четырехкратно-, пятикратно- и шестикратно-гликозилированный IFN-β». В настоящем изобретении выражения «гликозилированный полипептид, содержащий аминокислоты в 4 положениях, замещенные гликозилированными аминокислотами» и «четырехкратно-гликозилированный IFN-β» являются синонимами, и аналогичным образом «гликозилированный полипептид, содержащий аминокислоты в 5 положениях, замещенные гликозилированными аминокислотами» и «пятикратно-гликозилированный IFN-β» являются синонимами, и аналогичным образом «гликозилированный полипептид, содержащий аминокислоты в 6 положениях, замещенные гликозилированными аминокислотами» и «шестикратно-гликозилированный IFN-β» являются синонимами.

Пример 1. Синтез фрагментов сложного тиоэфира

Пример 1-1. Синтез IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)этан (SEP ID NO. 31

Смолу амино-PEGA (от фирмы Merck & Co., Inc.) (50 мкмоль) помещали в колонку твердофазного синтеза, 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (125 мкмоль), тетрафторборат O-бензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилурония (TBTU) (125 мкмоль) и N-этилморфолин (125 мкмоль) растворяли в диметилформамиде (DMF) (1,25 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу промывали достаточным количеством DMF и дихлометана (DCM). Затем Fmoc-Trp(Boc)-OH (0,25 ммоль), 1-мезитиленсульфонил-3-нитро-1,2,4-триазол (MSNT) (0,25 ммоль) и N-метилимидазол (0,187 ммоль) растворяли в DCM (1,25 мл) и добавляли в колонку твердофазного синтеза, и затем перемешивали в течение 4 часов.

Затем смолу промывали DCM и DMF, и Fmoc-группу обрабатывали в течение 15 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. Смесь промывали DMF и последующее элонгацию пептидной цепи использовали в способе, показанном ниже, для последующей конденсации аминокислот.

Аминокислоту, защищенную Fmoc- или Вос-группой, растворяли в DMF, и раствор добавляли в колонку твердофазного синтеза (0,25 ммоль). 0,2 M раствор гексафторфосфата 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU) в DMF (0,25 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, и 0,8 M раствор N-метил-морфолина в DMF (0,50 ммоль) или 0,8 M раствор 2,6,4-триметилпиридина в DMF (0,50 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 или 30 минут смолу промывали DMF, и Fmoc-группу обрабатывали в течение 10 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. Данную операцию повторяли, и аминокислоты последовательно конденсировали с помощью Fmoc-стратегии твердофазного синтеза.

После промывки полученной смолы DCM и DMF добавляли смешанный раствор трифторэтанола и уксусной кислоты (1:1), и защищенный пептид отделяли от смолы путем перемешивания в течение 18 часов при комнатной температуре. Реакционный раствор, содержащий защищенный пептид, концентрировали при пониженном давлении и затем сушили при пониженном давлении. Высушенный защищенный пептид растворяли в DMF (3,0 мл) и затем охлаждали в атмосфере азота до температуры от -15°С до -20°С. В этот продукт добавляли этантиол (5,0 ммоль) и затем бензотриазол-1-илокси-триспирролидинофосфония гексафторфосфат (РуВОР) (0,50 ммоль), затем диизопропилэтиламин (DIPEA) (0,5 ммоль). После перемешивания при температуре от -15°С до -20°С в течение 2 часов добавляли уксусную кислоту (0,8 мл) и оставляли для постепенного охлаждения до комнатной температуры. После возвращения температуры до комнатной реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. В полученный остаток добавляли смесь трифторуксусная кислота : вода : фенол : тиоанизол : триизопропилсилан (= 95 : 2.5 : 2.5 : 2.5 : 5) и перемешивали при комнатной температуре. Через 2 часа этот раствор снова добавляли в отдельно приготовленный диэтиловый эфир и оставляли для осаждения, затем подвергали разделению путем центрифугирования, и часть раствора удаляли с получением остатка, содержащего целевой пептид в форме триэфира. Полученный остаток очищали путем HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi], и по данным анализа масс методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе целевого IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-С48С)этана (расчетная величина = 9445,8 Да, фактическая величина = 9445,5 Да).

Пример 1-2. Синтез IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 4)

Смолу амино-PEGA (от фирмы Merck & Co., Inc.) (50 мкмоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, 3-Fmoc-4-диаминобензойную кислоту (150 мкмоль), гексафторфосфат 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU) (150 мкмоль) и диизопропилэтиламин (300 мкмоль) растворяли в DMF (1,25 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов.

После перемешивания смолу промывали DMF, Fmoc-группу обрабатывали в течение 15 минут 20% раствором пиперидинв в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты, и затем смолу промывали достаточным количеством DMF. Последующую элонгацию пептидной цепи использовали в способе, показанном ниже, для последующей конденсации аминокислот.

Аминокислоту, защищенную Fmoc- или Boc- группой, растворяли в DMF, и раствор добавляли в колонку твердофазного синтеза (0,25 ммоль). 0,2 M раствор гексафторфосфата 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU) в DMF (0,25 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, и 0,8 M раствор N-метил-морфолина в DMF (0,50 ммоль) или 0,8 M раствор 2,6,4-триметилпиридина в DMF (0,50 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 или 30 минут смолу промывали DMF, и Fmoc-группу обрабатывали в течение 10 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. Данную операцию повторяли, и аминокислоты последовательно конденсировали с помощью Fmoc-стратегии твердофазного синтеза.

После промывки полученной смолы DCM и DMF, 4-нитрофенил-хлорформат (0,25 ммоль) растворяли в DCM, добавляли в колонку твердофазного синтеза и затем перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. После перемешивания смолу промывали DCM и DMF, добавляли диизопропилэтиламин (2,5 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. После промывки полученной смолы DMF и DCM, добавляли смесь трифторуксусная кислота : вода : фенол : тиоанизол : триизопропилсилан (= 95 : 2.5 : 2.5 : 2.5 : 5) и перемешивали при комнатной температуре. Через 5 часов смолу промывали достаточным количеством буферного раствора при рН 7,2, содержащего натрий 2-меркаптоэтансульфонат (8 M раствор гуанидина в соляной кислоте, ОДМ раствор фосфорной кислоты и 300 мМ раствор натрий 2-меркаптоэтансульфоната). Указанный выше буфер добавляли в смолу и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. \

После перемешивания полученный раствор очищали путем HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi], и по данным анализа масс методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе целевого IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C-N75C)MESNA (расчетная величина = 9540,9 Да, фактическая величина = 9541,6 Да).

Пример 1-3. Синтез других триоэфирных фрагментов

Тиоэфирные фрагменты, представленные ниже, синтезировали аналогично примеру 1-1.

IFN 1-78(S1Thi-N3C-C30Acm-Q48C)этан (SEQ ID NO. 5)

IFN 1-78(S1Thi-E28C-C30Acm-Q48C-R70C)этан (SEQ ID NO. 6)

Следующие тиоэфирные фрагменты синтезировали аналогично примеру 1-2

IFN 1-78(C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 7)

IFN 1-78(S1Thi-C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 8)

IFN 1-78(F7C-C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 9)

IFN 1-78(N24C-C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 10)

IFN 1-78(G25C-C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 11)

IFN 1-78(E28C-C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 12)

IFN 1-78(C30Acm-K32C)MESNA (SEQ ID NO. 13)

IFN 1-78(C30Acm-M35C)MESNA (SEQ ID NO. 14)

IFN 1-78(C30Acm-D38C)MESNA (SEQ ID NO. 15)

IFN 1-78(C30Acm-E41C)MESNA (SEQ ID NO. 16)

IFN 1-78(C30Acm-Q48C)MESNA (SEQ ID NO. 17)

IFN 1-78(C30Acm-R70C)MESNA (SEQ ID NO. 18)

IFN 1-78(C30Acm-S75C)MESNA(SEQ ID NO. 19)

IFN 1-78(C30Acm-E41C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 20)

IFN 1-78(C30Acm-E42C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 21)

IFN 1-78(C30Acm-Q45C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 22)

IFN 1-78(C30Acm-L46C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 23)

IFN 1-78(C30Acm-Q47C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 24)

IFN 1-78(C30Acm-Q48C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 25)

IFN 1-78(C30Acm-F49C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 26)

IFN 1-78(C30Acm-Q50C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 27)

IFN 1-78(S1Thi-Y29C-C30Acm-Q48C)MESNA (SEQ ID NO. 28)

IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-M35C-Q48C)MESNA (SEQ ID NO. 29)

IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-E41C-Q48C)MESNA (SEQ ID NO. 30)

Результаты масс-спектрометрии соединений, полученных в примере 1-1, примере 1-2 и примере 1-3 представлены в таблице 1 ниже.

Пример 2. Синтез пептидных фрагментов

Пример 2-1. Синтез IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) (SEQ ID NO. 31)

Смолу амино-PEGA (от фирмы Merck & Co., Inc.) (50 мкмоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (125 мкмоль), С-бензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат (TBTU) (125 мкмоль) и N-этилморфолин (125 мкмоль) растворяли в DMF (1,25 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу промывали достаточным количеством DMF и DCM. Затем Fmoc-Asn(Trt)-OH (0,25 ммоль), 1-мезитиленсульфонил-3-нитро-1,2,4-триазол (MSNT) (0,25 ммоль), и N-метилимидазол (0,187 ммоль) растворяли в DCM (1,25 мл) и помещали в колонку твердофазного синтеза, и затем перемешивали в течение 4 часов.

После перемешивания смолу промывали DCM и DMF, Fmoc-группу обрабатывали в течение 15 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. После промывки DMF последующую элонгацию пептидной цепи использовали в способе, показанном ниже, для последующей конденсации аминокислот.

Аминокислоту, защищенную Fmoc- или Boc-группой, растворяли в DMF, и раствор добавляли в колонку твердофазного синтеза (0,25 ммоль). 0,2 M раствор гексафторфосфата 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU) в DMF (0,25 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, и 0,8 M раствор N-метил-морфолина в DMF (0,50 ммоль) или 0,8 M раствор 2,6,4-триметилпиридина в DMF (0,50 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 или 30 минут смолу промывали DMF, и Fmoc-группу обрабатывали в течение 10 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. Данную операцию повторяли, и аминокислоты последовательно конденсировали с помощью Fmoc-стратегии твердофазного синтеза.

В полученную смолу добавляли смесь трифторуксусная кислота : вода : фенол : тиоанизол : триизопропилсилан (= 95 : 2.5 : 2.5 : 2.5 : 5) и перемешивали при комнатной температуре. Через 3 часа этот раствор снова добавляли в отдельно приготовленный диэтиловый эфир и оставляли для осаждения, затем подвергали разделению путем центрифугирования, и часть раствора удаляли с получением остатка, содержащего целевой пептид. Этот полученный остаток очищали методом обращенно-фазовой HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi], и по данным анализа масс методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) (расчетная величина = 10499,1 Да, фактическая величина = 10498,1 Да).

Пример 2-2. Синтез других пептидных фрагментов

Следующие пептидные фрагменты синтезировали аналогично примеру 2-1.

IFN 79-165(N79C-C140Acm) (SEQ ID NO. 32)

IFN 79-165(N79C-K107C-C140Acm) (SEQ ID NO. 33)

IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm) (SEQ ID NO. 34)

IFN 79-165(N79C-K107C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 35)

IFN 79-165(N79C-T99C-K107C-R112C-C140Acm) (SEQ ID NO. 36)

IFN 79-165(N79C-E103C-K107C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 37)

IFN 79-165(N79C-E106C-K107C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 38)

IFN 79-165(N79C-K107C-D109C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 39)

IFN 79-165(N79C-K107C-L115C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 40)

IFN 79-165(N79C-K107C-L119C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 41)

IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-H130C-C140Acm) (SEQ ID NO. 42)

IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 43)

IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-H139C-C140Acm) (SEQ ID NO. 44)

IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm-R164C) (SEQ ID NO. 45)

Результаты масс-спектрометрии соединений, полученных в примере 2-1 и примере 2-2, представлены в таблице 2 ниже.

Пример 3. Синтез дисиало-гликозилированного IFN-β

Пример 3-1. Синтез 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46)

IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)этан (SEQ ID NO. 3) и IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) (SEQ ID NO. 31) растворяли в буферном растворе при рН 7,2, содержащем 4-меркаптофенилуксусную кислоту (8 М раствор гуанидина в соляной кислоте, 0,1 М раствор фосфорной кислоты и 125 мМ раствор 4-меркаптофенилуксусной кислоты), и оставляли при комнатной температуре. Через 24 часа в реакционную смесь добавляли раствор дитиотреитола (2 М дитиотретиол) и оставляли при комнатной температуре на 3 часа. После завершения реакции в раствор добавляли раствор метоксиамина (1 М гидрохлорид метоксиамина) и раствор соляной кислоты (1 М соляная кислота и 8М гидрохлорид гуанидина), рН доводили до 4,0 и затем оставляли при комнатной температуре на 24 часа. После завершения реакции раствор деминерализовали путем обращенно-фазовой HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi] и лиофилизировали.

Полученный очищенный сырой продукт растворяли в буферном растворе при рН 8,5 (8 М раствор гуанидина в соляной кислоте и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан), добавляли бромацетилированную дисиало-сахарную цепь, представленную следующей формулой (7) (5 эквивалентов), и оставляли на 1 час.

Химическая формула 21

После завершения реакции добавляли раствор меркаптоэтансульфоната натрия (200 мМ меркаптоэтансульфонат натрия) и оставляли при комнатной температуре на 30 минут. После завершения реакции раствор деминерализовали путем обращенно-фазовой HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi] и лиофилизировали.

Сырой очищенный продукт, полученный на указанной выше стадии, растворяли в растворе ацетата серебра (60 мМ ацетат серебра, 7,5 М мочевина и 875 мМ уксусная кислота) и оставляли при комнатной температуре на 4 часа. После завершения реакции добавляли раствор дитиотреитола (2 М дитиотреитол). В реактант добавляли буферный раствор при рН 8,5 (8 М гидрохлорид гуанидина и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан) и деминерализовали путем HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi], и лиофилизировали.

Полученный лиофилизат растворяли в буферном растворе при рН 8,5 (8 М раствор гуанидина в соляной кислоте и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан) и оставляли при комнатной температуре на 30 минут. Раствор заменяли в условиях охлаждения (4°С) разбавленным раствором гидрохлорида гуанидина (4,5 М гидрохлорид гуанидина и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан). В замененный раствор добавляли раствор сульфата меди (300 мМ пентагидрат сульфата меди (И)) и оставляли на 4 часа в условиях охлаждения (4°С). После завершения реакции добавляли этилендиаминтетрауксусную кислоту (400 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота) и оставляли на 4 часа в условиях охлаждения (4°С). После завершения реакции раствор подвергали замене в течение ночи на раствор уксусной кислоты (10 мМ раствор уксусной кислоты) в условиях охлаждения (4°С) для удаления денатурирующего агента. Раствор после сворачивания очищали HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi] и по данным масс-спектрометрии (метод ионизации ESI) масса полученного соединения соответствовала массе целевого 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (расчетная величина = 33304,8 Да, фактическая величина = 33303,6 Да).

Пример 3-2. Синтез 2-6 дисиало(Q48C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 47)

IFN 1-78(C30Acm-Q48C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 25) и IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 43) растворяли в буферном растворе при рН 7,2, содержащем 4-меркаптофенилуксусную кислоту (8 M раствор гуанидина в соляной кислоте, 0,1 M раствор фосфорной кислоты и 125 мМ 4-меркаптофенилуксусная кислота) и оставляли при комнатной температуре. Через 24 часа в реакционный раствор добавляли раствор дитиотреитола (2 M дитиотреитол) и оставляли при комнатной температуре на 3 часа. После завершения реакции раствор деминерализовали обращенно-фазовой HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi] и лиофилизировали.

Масс-спектрометрию (метод ионизации ESI) выполняли на сыром очищенном продукте, полученном аналогично примеру 3-1. В результате масса полученного соединения соответствовала массе целевого 2-6 дисиало (Q48C-S75C-N79C-K107C-R112C-Е136С) (расчетная величина = 33331,8 Да, фактическая величина = 33331,2 Да).

Пример 3-3. Синтез 2-3 дисиало(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 48)

С IFN 1-78(S1Thi-N3C-C30Acm-Q48C)этаном (SEQ ID NO. 5) и IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm) (SEQ ID NO. 34) дисиало-гликозилированный IFN-β синтезировали аналогично примеру 3-1, за исключением того, что альтернативно использовали бромацетилированную дисиало-сахарную цепь, представленную следующей формулой (8). В результате выполнения масс-спектрометрии (метод ионизации ESI) масса полученного соединения соответствовала массе целевого 2-3дисиало(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (расчетная величина = 33346,9 Да, фактическая величина = 33346,6 Да).

Химическая формула 22

Пример 3-4. Синтез других дисиало-гликозилированных IFN-β

Синтез соединений, представленных ниже, выполняли способом, аналогичным примеру 3-1.

2-6 дисиало(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 49)

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-T99C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 50)

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-H130C) (SEQ ID NO. 51)

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 52)

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-H139C) (SEQ ID NO. 53)

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R164C) (SEQ ID NO. 54)

2-6 дисиало(S1C-Y29C-Q48C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 55)

2-6 дисиало(S1C-M35C-Q48C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 56)

2-6 дисиало(S1C-E41C-Q48C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 57)

2-6 дисиало(S1C-Q48C-S75C-N79C-K107C-Е136С) (SEQ ID NO. 58)

2-6 дисиало(S1C-E28C-Q48C-R70C-N79C) (SEQ ID NO. 59)

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 60)

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 61)

2-6 дисиало(S1C-N3C-Q48C-N79C) (SEQ ID NO. 62)

2-6 дисиало(S1C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 63)

Синтез соединений, представленных ниже, выполняли способом, аналогичным примеру 3-2.

2-6 дисиало(Е41С-S75C-N79C-Е103С-K107C-Е136С) (SEQ ID NO. 64)

2-6 дисиало(Е41С-S75C-N79C-Е106С-K107C-Е136С) (SEQ ID NO. 65)

2-6 дисиало(E41C-S75C-N79C-K107C-D109C-E136C) (SEQ ID NO. 66)

2-6 дисиало(E41C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 67)

2-6 дисиало(Е41С-S75C-N79C-K107C-L115C-Е136С) (SEQ ID NO. 68)

2-6 дисиало(Е41С-S75C-N79C-K107C-L119C-E136C) (SEQ ID NO. 69)

2-6 дисиало(N24C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 70)

2-6 дисиало(G25C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 71)

2-6 дисиало(K32C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 72)

2-6 дисиало(M35C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 73)

2-6 дисиало(D38C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 74)

2-6 дисиало(E41C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 75)

2-6 дисиало(F7C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 76)

2-6 дисиало(Q48C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 77)

2-6 дисиало(S75C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 78)

2-6 дисиало(Е41С-S75C-N79C-K107C-Е136С) (SEQ ID NO. 79)

2-6 дисиало(Е42С-S75C-N79C-K107C-Е136С) (SEQ ID NO. 80)

2-6 дисиало(Q45C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 81)

2-6 дисиало(L46C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 82)

2-6 дисиало(Q47C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 83)

2-6 дисиало(Q48C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 84)

2-6 дисиало(F49C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 85)

2-6 дисиало(Q50C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 86)

2-6 дисиало(N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 87)

2-6 дисиало(Е28С-N79C-K107C-Е136С) (SEQ ID NO. 88)

2-6 дисиало(М35С-N79C-K107C-Е136С) (SEQ ID NO. 89)

2-6 дисиало(R70C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 90)

2-6 дисиало(S75C-N79C-K107C-Е136С) (SEQ ID NO. 91)

Синтез соединения, представленного ниже, выполняли способом, аналогичным примеру 3-3.

2-3 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 92)

Пример 3-5. Синтез 2-6 дисиало(S1C-R26C-Q48C-A67C-N79-A88C) (SEQ ID NO. 100)

Пример 3-5-A. Синтез IFN 1-25(S1Thi)тиофенила (SEQ ID NO. 101)

Смолу амино-PEGA (от фирмы Merck & Co., Inc.) (50 мкмоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (125 мкмоль), тетрафторборат O-бензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилурония (TBTU) (125 мкмоль) и N-этилморфолин (125 мкмоль) растворяли в диметилформамиде (DMF) (1,25 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу промывали достаточным количеством DMF и дихлорметана (DCM). Затем Fmoc-Trp(Boc)-OH (0,25 ммоль), 1-мезитиленсульфонил-3-нитро-1,2,4-триазол (MSNT) (0,25 ммоль) и N-метилимидазол (0,187 ммоль) растворяли в DCM (1,25 мл) и добавляли в колонку твердофазного синтеза, и затем перемешивали в течение 4 часов.

Смолу промывали DCM и DMF, и Fmoc-группу обрабатывали в течение 15 мин 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. Смесь промывали DMF и последующую элонгацию пептидной цепи использовали в способе, показанном ниже, для последующей конденсации аминокислот.

Аминокислоту, защищенную Fmoc- или Вос-группой, растворяли в DMF, и раствор добавляли в колонку твердофазного синтеза (0,25 ммоль). 0,2 M раствор гексафторфосфата 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU) в DMF (0,25 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, и 0,8 M раствор N-метил-морфолина в DMF (0,50 ммоль) или 0,8 M раствор 2,6,4-триметилпиридина в DMF (0,50 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 или 30 минут смолу промывали DMF, и Fmoc-группу обрабатывали в течение 10 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. Данную операцию повторяли, и аминокислоты последовательно конденсировали с помощью Fmoc-стратегии твердофазного синтеза.

После промывания полученной смолы DCM и DMF добавляли смешанный раствор трифторэтанола и уксусной кислоты (1:1), и защищенный пептид отделяли от смолы путем перемешивания в течение 18 часов при комнатной температуре. Реакционный раствор, содержащий защищенный пептид, концентрировали при пониженном давлении и затем сушили при пониженном давлении. Высушенный защищенный пептид растворяли в DMF (2,1 мл) и затем охлаждали в атмосфере азота до температуры от -15°С до -20°С. В этот раствор добавляли тиофенол в качестве источника тиола (0,2 ммоль) и затем добавляли гексафторфосфат бензотриазол-1-илокси-триспирролидинофосфония (РуВОР) (1,4 ммоль), затем диизопропилэтиламин (DIPEA) (0,2 ммоль). После перемешивания при температуре от -15°С до -20°С в течение 2 часов добавляли трифторуксусную кислоту (0,2 мл) и Оставляли для постепенного возвращения температуры до комнатной. После возвращения температуры до комнатной реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. В полученный остаток добавляли смесь трифторуксусная кислота : триизопропилсилан (= 92,5 : 2,5 : 5), и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 2 часа этот раствор снова добавляли в отдельно приготовленный диэтиловый эфир и оставляли для осаждения, затем подвергали разделению путем центрифугирования, и часть раствора удаляли с получением остатка, содержащего целевой пептид в форме тиоэфира. Этот полученный остаток очищали HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi], и по данным анализа масс методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе целевого IFN 1-25(S1Thi)тиофенила (SEQ ID NO. 101) (расчетная величина = 3062,6 Да, фактическая величина = 3062,5 Да).

Пример 3-5-В. Синтез IFN 26-47 (R26C-C30Acm)этантиола (SEQ ID NO. 102)

Пептидный фрагмент синтезировали аналогично методике, описанной в примере 3-5-А. Этантиол использовали в качестве источника для IFN 26-47(R26C-C30Acm)этантиола.

По данным анализа масс методом ESI-MS масса синтезированного соединения соответствовала массе целевого IFN 26-47(1126С-C30Acm)этантиола (SEQ ID NO. 102) (расчетная величина = 2844,4 Да, фактическая величина = 2844,5 Да).

Пример 3-5-С. Синтез IFN 48-66(Q48Thi)MESNA (SEQ ID NO. 103)

Смолу амино-PEGA (фирмы Merck & Co., Inc.) (50 мкмоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, 3-Fmoc-4-диаминобензойную кислоту (150 мкмоль), гексафторфосфат 3-оксид 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU) (150 мкмоль) и диизопропилэтиламин (300 мкмоль) растворяли в DMF (1,25 мл), и перемешивали в течение 1 часа.

После перемешивания смолу промывали DMF, Fmoc-группу обрабатывали в течение 15 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты и затем смолу промывали достаточным количеством DMF. Аминокислоты затем конденсировали в последовательной элонгации пептидной цепи с использованием способа, представленного ниже. Затем элонгацию пептидной цепи использовали в способе, показанном ниже, для последующей конденсации аминокислот.

Аминокислоту, защищенную Fmoc- или Вос-группой, растворяли в DMF, и раствор добавляли в колонку твердофазного синтеза (0,25 ммоль). 0,2 M раствор гексафторфосфата 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU) в DMF (0,25 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, и 0,8 M раствор N-метил-морфолина в DMF (0,50 ммоль) или 0,8 M раствор 2,6,4-триметилпиридина в DMF (0,50 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 или 30 минут смолу промывали DMF, и Fmoc-группу обрабатывали в течение 10 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. Эту операцию повторяли, и аминокислоты последовательно конденсировали с помощью Fmoc-стратегии твердофазного синтеза.

После промывания полученной смолы DMF и DCM, 4-нитрофенил-хлорформат (1,4 ммоль) растворяли в DCM, добавляли в колонку твердофазного синтеза и затем перемешивали при комнатной температуре в течение 40 минут. После перемешивания смолу промывали DCM и DMF, добавляли раствор диизопропилэтиламина (5,0 ммоль) в DMF и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. После промывания полученной смолы DMF и DCM добавляли смесь трифторуксусная кислота : триизопропилсилан (= 92.5 : 2.5 : 5), и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 2 часа смолу промывали достаточным количеством DMF и DCM, и затем смолу промывали достаточным количеством буферного раствора при рН 8,5, содержащего натрий 2-меркаптоэтансульфонат (6 M раствор гуанидина в соляной кислоте, 0,2 M раствор фосфорной кислоты и 1 M натрий 2-меркаптоэтансульфонат). Указанный выше буфер добавляли в смолу и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После перемешивания полученный раствор очищали HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi], и по данным анализа масс методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе целевого IFN 48-66(Q48Thi)MESNA (SEQ ID NO. 103) (расчетная величина = 2413,8 Да, фактическая величина = 2413,9 Да).

Пример 3-5-D. Синтез дисиало-гликозилированного IFN 67-87(A67Thi,N79)тиофенила (SEQ ID NO. 104)

Смолу амино-PEGA (от фирмы Merck & Co., Inc.) (50 мкмоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, 3-Fmoc-4-диаминобензойную кислоту (150 мкмоль), гексафторфосфат 3-оксид 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU) (150 мкмоль) и диизопропилэтиламин (300 мкмоль) растворяли в DMF (1,25 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа.

После перемешивания смолу промывали DMF, Fmoc-группу обрабатывали в течение 15 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты и затем смолу промывали достаточным количеством DMF. Затем элонгацию пептидной цепи использовали в способе, показанном ниже, для последующей конденсации аминокислот.

Аминокислоту, защищенную Fmoc- или Вос-группой, растворяли в DMF, и раствор добавляли в колонку твердофазного синтеза (0,25 ммоль). 0,2 M раствор гексафторфосфата 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU) в DMF (0,25 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, и 0,8 M раствор N-метил-морфолина в DMF (0,50 ммоль) или 0,8 M 2,6,4-триметилпиридина в DMF (0,50 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 или 30 минут смолу промывали DMF, и Fmoc-группу обрабатывали в течение 10 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. Эту операцию повторяли и затем аминокислоты конденсировали с помощью Fmoc-стратегии твердофазного синтеза.

В полученном пептиде, содержащем 8 остатков, Fmoc-группу удаляли путем обработки 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания DMF, аспарагин дибензил дисиало-сахарной цепи (0,2 ммоль) и DEPBT (0,2 ммоль) растворяли в DMF/DMSO (1:1 смешанный раствор, 2,2 мл) в отдельно приготовленной центрифужной пробирке, помещали в колонку твердофазного синтеза, добавляли DIPEA (0,15 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. После промывания DMF и DCM получали пептид сахарной цепи из 9 остатков, присоединенный к аспарагину дибензил дисиало-сахарной цепи, представленный следующей формулой (18), на твердой фазе.

Химическая формула 23

Затем элонгацию пептидной цепи использовали в способе, показанном ниже, для последующей конденсации аминокислот.

Аминокислоту, защищенную Fmoc-группой, HOBt (0,50 ммоль) и DIPCI (0,475 ммоль) растворяли в DMF (6,3 мл), активировали в течение 15 минут и затем помещали в колонку твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 часа Fmoc-группу обрабатывали в течение 20 минут 20% раствором пиперидина в DMF для обеспечения снятия защиты. Эту операцию повторяли, и аминокислоты последовательно конденсировали.

После промывания полученной смолы DCM и DMF добавляли смешанный раствор трифторэтанола и уксусной кислоты (1:1) таким образом, чтобы смола в достаточной степени пропиталась, и смолу и гликозилированный пептидный фрагмент расщепляли путем перемешивания в течение 18 часов при комнатной температуре. Отщепленную смолу отфильтровывали, и реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток концентрировали с получением пептида сахарной цепи, имеющего защищенную аминокислотную боковую цепь.

Полученный гликозилированный пептидный фрагмент (50 ммоль) переносили в колбу для восстановления, растворяли в DMF и затем охлаждали в атмосфере азота до температуры от -15°С до -20°С. В этот раствор добавляли тиофенол (0,15 ммоль) и затем РуВОР (2,5 ммоль), затем DIPEA (0,15 ммоль). После перемешивания при температуре от -15°С до -20°С в течение 2 часов добавляли трифторуксусную кислоту и оставляли для постепенного возвращения температуры до комнатной. После возвращения температуры до комнатной реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. В полученный остаток добавляли смесь трифторуксусная кислота : вода: TIPS (= 95 : 2.5 : 2.5), и перемешивали при комнатной температуре. Через 2 часа этот раствор снова добавляли в отдельно приготовленный диэтиловый эфир и оставляли для осаждения, затем подвергали разделению путем центрифугирования и часть раствора удаляли с получением остатка, содержащего целевой пептид в форме тиоэфира. Полученный остаток очищали HPLC [колонка: SHISEIDO proteonavi], и по данным анализа масс методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала целевому дисиало-гликозилированному IFN 67-87(A67Thi,N79)тиофенилу (SEQ ID NO. 104) (расчетная величина = 4903,1 Да, фактическая величина = 4903,1 Да).

Пример 3-5-Е. Синтез IFN 88-165(C140Acm) (SEQ ID NO. 105)

Смолу амино-PEGA (от фирмы Merck & Co., Inc.) (50 мкмоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (125 мкмоль), тетрафторборат O-бензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилурония (TBTU) (125 мкмоль) и N-этилморфолин (125 мкмоль) растворяли в DMF (1,25 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу промывали достаточным количеством DMF или DCM. Затем Fmoc-Asn(Trt)-OH (0,25 ммоль), 1-мезитиленсульфонил-3-нитро-1,2,4-триазол (MSNT) (0,25 ммоль) и N-метилимидазол (0,187 ммоль) растворяли в DCM (1,25 мл) и помещали в колонку твердофазного синтеза, и затем перемешивали в течение 4 часов.

После перемешивания смолу промывали DCM и DMF, Fmoc-группу обрабатывали в течение 15 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. После промывания DMF элонгацию пептидной цепи использовали в способе, показанном ниже, для последующей конденсации аминокислот.

Аминокислоту, защищенную Fmoc- или Вос-группой, растворяли в DMF, и раствор добавляли в колонку твердофазного синтеза (0,25 ммоль). 0,2 M раствор гексафторфосфата 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU) в DMF (0,25 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза, и 0,8 M раствор N-метил-морфолина в DMF (0,50 ммоль) или 0,8 M раствор 2,6,4-триметилпиридина в DMF (0,50 ммоль) добавляли в колонку твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 или 30 минут смолу промывали DMF, и Fmoc-группу обрабатывали в течение 10 минут 20% раствором пиперидина в DMF (2 мл) для обеспечения снятия защиты. Эту операцию повторяли и затем аминокислоты конденсировали с помощью Fmoc-стратегии твердофазного синтеза.

В полученную смолу добавляли смесь трифторуксусная кислота : вода : фенол : тиоанизол : триизопропилсилан (= 95 : 2,5 : 2,5 : 2,5 : 5) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 3 часа этот раствор снова добавляли в отдельно приготовленный диэтиловый эфир и оставляли для осаждения, затем подвергали разделению путем центрифугирования и часть раствора удаляли с получением остатка, содержащего целевой пептид. Этот полученный остаток очищали обращенно-фазовой HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi], и по данным анализа масс методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе IFN 88-165(C140Acm) (SEQ ID NO. 105) (расчетная величина = 9647,3 Да, фактическая величина = 9647,2 Да).

Пример 3-5-F. Связывание каждого фрагмента

Стадия 1. Стадия кинетического лигирования

IFN 1-25(S1Thi)тиофенил (SEQ ID NO. 101) и IFN 26-47(1126С-C30Acm)этантиол (SEQ ID NO. 102) растворяли в буферном растворе при рН 6,8 (8 M раствор гуанидина в соляной кислоте, 0,2 M раствор фосфорной кислоты и 20 мМ ТСЕР), и оставляли для взаимодействия при комнатной температуре на 3 часа. После завершения реакции раствор очищали обращенно-фазовой HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi] и лиофилизировали. По данным анализа масс этого лиофилизированного продукта методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе IFN 1-47(S1Thi-R26C-C30Acm)этантиола (SEQ ID NO. 106) (расчетная величина = 5796,8 Да, фактическая величина = 5796,7 Да).

Стадия 2. Стадия А нативного химического лигирования

Дисиало-гликозилированный IFN 67-87(A67Thi,N79)тиофенил (SEQ ID NO. 104) и IFN 88-165(C140Acm) (SEQ ID NO. 105) растворяли в буферном растворе при рН 7,2 (8 M раствор гуанидина в соляной кислоте, 0,2 M раствор фосфорной кислоты и 20 мМ ТСЕР), и оставляли для взаимодействия при комнатной температуре. Через 23 часа в реакционный раствор добавляли раствор метоксиамина (6 M гидрохлорид гуанидина, 0,2 M гидрохлорид метоксиамина и 20 мМ ТСЕР), рН доводили до 4,0 и затем оставляли для взаимодействия при комнатной температуре на 4 часа. В реакционный раствор добавляли 50 мМ водный раствор NaOH для того, чтобы сделать реакционный раствор основным, и затем оставляли для взаимодействия на льду на 0,5 часов. После завершения реакции раствор очищали обращенно-фазовой HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi] с получением лиофилизированного продукта. На основании анализа масс этого лиофилизированного продукта методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе дисиало-гликозилированного IFN 67-165(A67C-N79-A88C-C140Acm) (SEQ ID NO. 107) (расчетная величина = 14247,9 Да, фактическая величина = 14247,2 Да).

Стадия 3. Стадия В нативного химического дотирования

Дисиало-гликозилированный IFN 67-165(A67C-N79-A88C-C140Acm) (SEQ ID NO. 107), полученный на стадии 2, и IFN 48-66(Q48Thi)MESNA (SEQ ID NO. 103) растворяли в буферном растворе при рН 7,2 (8 M раствор гуанидина в соляной кислоте, 0,2 M раствор фосфорной кислоты, 20 мМ ТСЕР и 30 мМ МРАА) и оставляли для взаимодействия при комнатной температуре. Через 18 часов в реакционный раствор добавляли раствор метоксиамина (6 M гидрохлорид гуанидина, 0,2 M гидрохлорид метоксиамина и 20 мМ ТСЕР), рН доводили до 4,0 и затем оставляли для взаимодействия при комнатной температуре. Через 5 часов в реакционный раствор добавляли натрий 2-меркаптоэтансульфонат и оставляли для взаимодействия при комнатной температуре на 1 час. После завершения реакции раствор очищали обращенно-фазовой HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi] с получением лиофилизированного продукта. По данным анализа масс этого лиофилизированного продукта методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе дисиало-гликозилированного IFN 48-165(Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm) (SEQ ID NO. 108) (расчетная величина = 16507,6 Да, фактическая величина = 16507,9 Да).

Стадия 4. Стадия С нативного химического лигирования

Аналогично стадии 3 IFN 1-47(S1Thi-K26C-C30Acm)этантиол (SEQ ID NO. 106), полученный на стадии 1, и дисиало-гликозилированный IFN 48-165(Q48C,A67C,N79,A88C,C140Acm) (SEQ ID NO. 108) оставляли для взаимодействия. По данным анализа масс методом ESI-MS полученное в результате реакции соединение соответствовало массе целевого дисиало-гликозилированного IFN 1-165(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm) (SEQ ID NO. 109) (расчетная величина = 22230,2 Да, фактическая величина = 22230,3 Да).

Стадия 5. Стадия гликозилирования

Дисиало-гликозилированный IFN 1-165(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm) (SEQ ID NO. 109), полученный на стадии 4, растворяли в буферном растворе при рН 8,5 (8 M раствор гуанидина в соляной кислоте, 0,1 M трис-раствор), добавляли бромацетилированную дисиало-сахарную цепь, представленную следующей формулой (19) (25 эквивалентов), и оставляли для взаимодействия при комнатной температуре на 2 часа.

Химическая формула 24

После завершения реакции реакционный раствор очищали обращенно-фазовой HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi] с получением лиофилизированного продукта. По данным анализа масс этого лиофилизированного продукта методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе 2-6 дисиало(S1C-R26C-C30Acm-С48С-A67C-N79-A88C-C140Acm), содержащего дисиало-сахарные цепи, добавленные в положениях 1, 26, 48, 67 и 88 посредством атомов серы боковой цепи цистеина, и содержащего сахарную цепь, добавленную в положении 79 посредством боковой цепи аспарагина (SEQ ID NO. 110) (расчетная величина = 33545,4 Да, фактическая величина = 33545,5 Да).

Стадия 6. Удаление защитной группы Acm

Лиофилизат, полученный на указанной выше стадии 5, растворяли в растворе ацетата серебра (100 мМ ацетат серебра и 90% водный раствор уксусной кислоты), и оставляли для взаимодействия при комнатной температуре. Через 4 часа получение целевого продукта подтверждали с помощью HPLC и ESI-MS. В реакционный раствор добавляли дитиотреитол, перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут и затем подвергали разделению центрифугированием, и собирали супернатант, оставляя осадок. Этот собранный супернатант фильтровали через мембранный фильтр, часть фильтрата, содержащего целевой продукт, очищали обращенно-фазовой HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi] с получением лиофилизированного продукта. По данным анализа масс этого лиофилизированного продукта методом ESI-MS масса полученного соединения соответствовала массе 2-6 дисиало(S1C-R26C-Q48C-А67С-N79-А88С), содержащего дисиало-сахарные цепи, добавленные в положениях 1, 26, 48, 67 и 88 посредством атомов серы боковой цепи цистеина, и содержащего сахарную цепь, добавленную в положении 79 посредством боковой цепи аспарагина (SEQ ID NO. 111) (расчетная величина = 33403,3 Да, фактическая величина = 33403,2 Да).

Стадия 7. Стадия сворачивания

Лиофилизат, полученный на вышеуказанной стадии 6, растворяли в буферном растворе при рН 8,5 (8 M раствор гуанидина в соляной кислоте и 0,1 M трисгидроксиметиламинометан) и оставляли при комнатной температуре на 30 минут. Раствор заменяли в условиях охлаждения (4°С) на разбавленный раствор гидрохлорида гуанидина (4,5 M гидрохлорид гуанидина и 0,1 M трисгидроксиметиламинометан). В замененный раствор добавляли раствор сульфата меди (300 мМ пентагидрат сульфата меди (II)) и оставляли на 3 часа в условиях охлаждения (4°С). После завершения реакции добавляли этилендиаминтетрауксусную кислоту (400 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота) и оставляли в условиях охлаждения (4°С) на 0,5 часов. После завершения реакции раствор подвергали замене в течение ночи на раствор уксусной кислоты (10 мМ раствор уксусной кислоты) в условиях охлаждения (4°С) для удаления денатурирующего агента. Раствор после сворачивания очищали HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi], и по данным масс-спектрометрии (метод ионизации ESI) масса полученного соединения соответствовала массе целевого 2-6 дисиало(S1C-R26C-Q48C-А67С-N79-А88С) (SEQ ID NO. 100) (расчетная величина = 33401,2 Да, фактическая величина = 33401,2 Да).

Пример 4. Синтез моносиало-гликозилированного IFN-β

Пример 4-1. Синтез 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 93)

Вместе с IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)этаном (SEQ ID NO. 3) и IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) (SEQ ID NO. 31), моносиало-гликозилированный IFN-β синтезировали способом, аналогичным примеру 3-1, за исключением того, что альтернативно использовали смесь бромацетилированной моносиало-сахарной цепи, представленной следующими формулами (9) и (10) (соотношение соединений 1:1) (5 эквивалентов). По данным масс-спектрометрии (метод ионизации ESI), масса полученного соединения соответствовала массе целевого 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (расчетная величина = 31557,2 Да, фактическая величина = 31556,6 Да). Результаты масс-спектрометрии для примера 3-1 и примера 4-1 показаны на фигуре 1.

Химическая формула 25

Химическая формула 26

Соединения, полученные в примере 3-1 и примере 4-1, анализировали методом SDS-PAGE и обращенно-фазовой HPLC [колонка: Waters ВЕН300]. Результаты SDS-PAGE показаны на фигуре 2.

При рассмотрении результатов SDS-PAGE было сделано предположение о том, что оба соединения были равномерно гликозилированы, поскольку были детектированы четкие полосы. Аналогичным образом, анализ методом обращенно-фазовой HPLC также показал результаты, которые дают основание предположить однородное гликозилирование (данные не показаны).

Кроме того, часть сахарной цепи отщепляли от соединений, полученных в примере 3-1 и примере 4-1, путем добавления эндо-β-N-ацетилглюкозаминидазы (Endo-M) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) в фосфатно-буферном растворе (0,1 M фосфорная кислота) при рН 6,0. Результат анализа методом нормально-фазовой HPLC [колонка: Shodex NH2P-50] после мечения восстанавливающего конца свободной сахарной цепи, полученной с помощью 2-аминобензойной кислоты (Sigma Aldrich), показан на фигуре 3. На основании результатов анализа структуры сахарной цепи был подтвержден пик при времени удерживания, сходном с целевой дисиало-сахарной цепью и подтверждено добавление целевой сахарной цепи.

Пример 4-2. Синтез других моносиало- гликозилированных IFN-β

Синтез соединений, представленных ниже, выполняли способом, аналогичным примеру 4-1.

2-6 моносиало(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 94)

2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 95)

Пример 5. Синтез трисиало-гликозилированной) IFN-β

Пример 5-1. Синтез 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123Q (SEP ID NO. 96)

Вместе с IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)этаном (SEQ ID NO. 3) и IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) (SEQ ID NC. 31), трисиало-гликозилированный IFN-β синтезировали способом, аналогичным примеру 3-1, за исключением того, что добавляли бромацетилированную трисиало-сахарную цепь, представленную следующей формулой (И) (5 эквивалентов). В результате выполнения масс-спектрометрии (метод ионизации ESI) масса полученного соединения соответствовала массе целевого 2-6 трисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (расчетная величина = 37244,3 Да, фактическая величина = 37243,2 Да).

Химическая формула 27

Пример 5-2. Синтез другого трисиало-гликозилированного IFN-β

Синтез соединения, представленного ниже, выполняли способом, аналогичным примеру 5-1.

2-6 трисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 97)

Пример 6. Синтез тетрасиало-гликозилированного IFN-β

Пример 6-1. Синтез 2-6 тетрасиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEP ID NO. 98

Вместе с IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)этаном (SEQ ID NO. 3) и IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) (SEQ ID NO. 31), тетрасиало-гликозилированный IFN-β синтезировали способом, аналогичным примеру 3-1, за исключением того, что добавляли бромацетилированную тетрасиало-сахарную цепь, представленную следующей формулой (12) (5 эквивалентов). В результате выполнения масс-спектрометрии (метод ионизации ESI) масса полученного соединения соответствовала массе целевого 2-6 тетрасиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (расчетная величина = 41183,8 Да, фактическая величина = 41182,6 Да).

Химическая формула 28

Пример 6-2. Синтез другого тетрасиало-гликозилированного IFN-β

Синтез соединения, представленного ниже, выполняли способом, аналогичным примеру 6-1.

2-6 тетрасиало(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 99)

Результаты масс-спектрометрии соединений, полученных в примере 3-1, примере 3-2, примере 3-3, примере 3-4, примере 4-1, примере 4-2, примере 5-1, примере 5-2, примере 6-1 и примере 6-2, показаны в таблице 3 ниже.

Пример 7. Фармакокинетика четырехкратно-, пятикратно- и шестикратно-модифицированного дисиало-сахарной цепью IFN-β у мышей

Пример 7-1. Приготовление агентов и реагентов для введения

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 61), 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 60), 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46) и Avonex (Biogen Idee) готовили при концентрации 588 нМ с использованием ацетатного буфера, содержащего L-аргинин и полисорбат. Avonex представляет собой природный IFN-β (IFN-β-1a), который использовали в качестве контрольного агента. Avonex получен с помощью линии клеток СНО, имеет одну сахарную цепь в положении, которое соответствует положению 80 природного человеческого интерферона β (положение, соответствующее положению 79 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1 в настоящем документе), и структура его сахарной цепи может представлять собой различные сахарные цепи сложных N-связанных сахарных цепей для каждого полипептида.

Пример 7-2. Введение и сбор крови

Мышам (мыши линии Ba1b/c, самцы, возраст 8 недель, масса тела 21-23 г) содержащимся в условиях неограниченного доступа к пище вводили дозу, равную 2352 пмоль/кг путем подкожного введения на дорсальной стороне с помощью инсулинового шприца Myjector 29G × 1/2 (Terumo Corporation) в дозе 4 мл/кг. Из хвостовой вены собирали 75 мкл крови с помощью обработанной гепарином гематокритной капиллярной трубки (HIRSHMANN LABORGERATE) перед подкожным введением, а также через 10 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 12 часов, 16 часов, 24 часа и 30 часов после введения. Кровь быстро смешивали с 6 мМ EDTA-PBS такого же объема, что и собранная кровь, и подвергали разделению путем центрифугирования (15000 об/мин, 4°С, 10 минут). 90 мкл супернатанта собирали в качестве образца плазмы крови. Образец плазмы крови хранили в замороженном виде до проведения измерений.

Пример 7-3. Измерение концентрации в крови

Набор Human interferon β ELISA kit (Kamakura Techno-Science) использовали для измерения концентрации IFN-β в крови. Четырехкратно-шестикратно модифицированной дисиало-сахарной цепью IFN-β и Avonex из той же партии, из которой осуществляли введение, использовали в качестве стандартов для построения стандартной кривой, и доводили до концентрации 200 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 25 пМ, 12,5 пМ, 6,25 пМ и 3,125 пМ с помощью разбавителя, содержащегося в наборе. Бланковую плазму крови добавляли к стандартной кривой в соответствии с коэффициентом разведения образца плазмы крови таким образом, чтобы внесенное количество было одинаковым. График изменения концентрации в плазме IFN-β показан на фигуре 4.

Как показано на фигуре 4, при сравнении концентрация IFN-β в плазме крови четырехкратно-, пятикратно- и шестикратно модифицированный дисиало-сахарной цепью IFN-β сохранял гораздо более высокую концентрацию в плазме, чем контрольный агент Avonex в любой точке измерения, подтверждая улучшение или удерживание в крови. Кроме того, так как Tmax уменьшается по мере увеличения числа дисиало-сахарных цепей, можно предположить, что перенос соединения из подкожной ткани в кровь уменьшается. Максимальная концентрация в плазме крови (Cmax) или концентрация в крови в фазе рассеивания увеличивается по мере увеличения числа дисиало-сахарных цепей. Исходя из этого, было показано, что путем добавления дисиало-сахарных цепей стабильность IFN-β in vivo улучшается в соответствии с числом дисиало-сахарных цепей.

Пример 7-4. Расчет фармакокинетических параметров

На основе полученных данных по изменению концентрации IFN-β в плазме рассчитывали площадь под кривой зависимости концентрации в крови от времени (AUC∞) методом трапеций. Кроме того, максимальную концентрацию в крови (Cmax) и время до достижения максимальной концентрации в крови (Tmax) определяли из времени полувыведения из крови (t1/2), среднего времени удерживания (MRT) и фактической величины в результате подкожного введения. Полученные фармакокинетические параметры показаны на фигуре 5.

Как показано на фигуре 5, и как видно из результатов моментного анализа, что эффект дисиало-гликозилированного IFN-β в отношении улучшения t1/2, AUC и MRT возрастает в зависимости от числа модификаций.

Пример 8. Фармакокинетика четырехкратно-гликозилированного дисиало-сахарной цепью и моносиало-сахарной цепью IFN-β у мышей

Пример 8-1. Приготовление агентов и реагентов для введения

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 61), 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 95) и Avonex готовили при концентрации 112 нМ с использованием ацетатного буфера, содержащего L-аргинин и полисорбат.

Пример 8-2. Введение и сбор крови

Мышам (мыши линии Ba1b/c, самцы, возраст 8 недель, масса тела 21-23 г) вводили дозу, равную 448 пмоль/кг в условиях неограниченного доступа к пище путем подкожного введения на дорсальной стороне с помощью инсулинового шприца Myjector 29G × 1/2 (Terumo Corporation) в дозе 4 мл/кг. Из хвостовой вены собирали 75 мкл крови с помощью обработанной гепарином гематокритной капиллярной трубки (HIRSHMANN LABORGERATE) до введения, а также через 2 минуты, 10 минут, 30 минут, 1 час, 3 часа, 6 часов, 8 часов и 24 часа после введения в случае внутривенного введения, и до введения, а также через 10 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 12 часов, 16 часов, 24 часа и 30 часов после введения в случае подкожного введения. Кровь быстро смешивали с EDTA-PBS в таком же объеме, что и собранная кровь, и подвергали разделению путем центрифугирования (15000 об/мин, 4°С, 10 минут). 90 мкл супернатанта собирали в качестве образца плазмы крови. Образец плазмы крови хранили в замороженном виде до проведения измерений.

Пример 8-3. Измерение концентрации в крови

Набор Human interferon β ELISA kit (Kamakura Techno-Science) использовали для измерения концентрации IFN-β в крови. Четырехкратно-гликозилированный дисиало-сахарной цепью, четырехкратно-гликозилированной моносиало-сахарной цепью IFN-β и Avonex из той же партии, из которой осуществляли введение, использовали в качестве стандартов для построения стандартной кривой, и доводили до концентрации 200 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 25 пМ, 12,5 пМ, 6,25 пМ и 3,125 пМ с помощью разбавителя, содержащегося в наборе. Бланковую плазму крови добавляли к стандартной кривой в соответствии с коэффициентом разведения образца плазмы крови таким образом, чтобы внесенное количество было одинаковым. График изменения концентрации в плазме IFN-β показан на фигуре 6.

Как показано на фигуре 6, при сравнении концентрация IFN-β в плазме крови, было подтверждено значительное улучшение для 2-6 дисиало(S1C-С48С-N79C-K107C) по всем показателям t1/2, AUC∞ и MRT по сравнению с контрольным агентом Avonex в любой точке измерения. В противоположность этому, как в случае подкожного введения, так и в случае внутривенного введения в хвостовую вену, 2-6 моносиало(S1C-С48С-N79C-K107C), в котором сиалилирование было неполным, показал незначительное изменение концентрации в крови по сравнению с контрольным агентом Avonex. На основе этого результата было показано, что все концы сахарной цепи, являющиеся сиалилированными, значительно способствуют улучшению удержания IFN-β в крови.

Пример 8-4. Расчет фармакокинетических параметров

На основе полученных данных по изменению концентрации IFN-β в плазме рассчитывали площадь под кривой зависимости концентрации в крови (AUC∞) методом трапеций. Кроме того, расчетную начальную концентрацию (СО) в случае внутривенного введения определяли методом экстраполяции и, кроме того, максимальную концентрацию в крови (Cmax) и время до достижения максимальной концентрации в крови (Tmax) определяли из времени полувыведения из крови (t1/2), среднего времени удерживания (MRT) и фактической величины в случае подкожного введения. Результаты показаны на фигуре 7.

Как показано на фигуре 7, а также как видно из результатов моментного анализа, что четырехкратно-модифицированный дисиало-сахарной цепью IFN-β обладает эффектом по улучшению t1/2, AUC и MRT в большей степени, чем контрольный агент Avonex. С другой стороны, четырехкратно-модифицированный моносиало-сахарной цепью IFN-β, показал более низкие значения для любого из показателей t1/2, AUC∞, и MRT по сравнению с контрольным агентом Avonex, что подтверждает его более быстрое выведение из крови.

Пример 9. Фармакокинетика шестикратно-гликозилированного дисиало-сахарной цепью и моносиало-сахарной цепью IFN-β

Пример 9-1. Приготовление агентов и реагентов для введения

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 93) и Avonex готовили при концентрации 588 нМ с использованием ацетатного буфера, содержащего L-аргинин и полисорбат.

Пример 9-2. Введение и сбор крови

Мышам (мыши линии Ba1b/c, самцы, масса тела 21-23 г), находящимся в условиях неограниченного доступа к пище, вводили дозу, равную 2352 пмоль/кг, путем подкожного введения на дорсальной стороне с помощью инсулинового шприца Myjector 29G × 1/2 (Terumo Corporation) в дозе 4 мл/кг. Из хвостовой вены собирали 75 мкл крови с помощью обработанной гепарином гематокритной капиллярной трубки (HIRSHMANN 1ABORGERATE) до внутривенного введения, а также через 2 минуты, 10 минут, 30 минут, 1 час, 3 часа, 6 часов, 8 часов и 24 часа после введения. Кровь быстро смешивали с EDTA-PBS в таком же объеме, что и собранная кровь, и подвергали разделению путем центрифугирования (15000 об/мин, 4°С, 10 минут). 90 мкл супернатанта собирали в качестве образца плазмы крови. Образец плазмы крови хранили в замороженном виде до проведения измерений.

Пример 9-3. Измерение концентрации в крови

Набор Human interferon β ELISA kit (Kamakura Techno-Science) использовали для измерения концентрации IFN-β в крови. Шестикратно-гликозилированный дисиало-сахарной цепью, шестикратно-гликозилированной моносиало-сахарной цепью IFN-β и Avonex из той же партии, из которой осуществляли введение, использовали в качестве стандартов для построения стандартной кривой, и доводили до концентрации 200 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 25 пМ, 12,5 пМ, 6,25 пМ и 3,125 пМ с помощью разбавителя, содержащегося в наборе. Бланковую плазму крови добавляли к стандартной кривой в соответствии с коэффициентом разведения образца плазмы крови таким образом, чтобы внесенное количество было одинаковым. График изменения концентрации в плазме IFN-β показан на фигуре 8.

Результаты, сходные с результатами, полученными для описанного выше четырехкратно-модифицированного IFN-β, получали также для шестикратно-модифицированного IFN-β. Другими словами, было подтверждено значительное улучшение 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) во всем параметрам t1/2, AUC∞ и MRT по сравнению с контрольным агентом Avonex. С другой стороны, 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) показал незначительное изменение концентрации в крови по сравнению с контрольным агентом Avonex в случае внутривенного введения в хвостовую вену. Таким образом, было также подтверждено, что для шестикратно-гликозилированного IFN-β, аналогично четырехкратно-гликозилированному IFN-β, все концы сахарной цепи, являющиеся сиалилированными, являются крайне важными для улучшения удерживания IFN-β в крови.

Пример 9-4. Расчет фармакокинетических параметров

На основе полученных данных по изменению концентрации IFN-β в плазме рассчитывали площадь под кривой зависимости концентрации в крови от времени (AUC) методом трапеций. Кроме того, расчетную начальную концентрацию (СО) в случае внутривенного введения определяли методом экстраполяции и, кроме того, определяли время полувыведения из крови (t1/2) и среднее время удерживания (MRT). Результаты показаны на фигуре 9.

Как показано на фигуре 9, и также подтверждается результатами моментного анализа, 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) показал значительное улучшение по всем параметрам t1/2, AUC и MRT по сравнению с контрольным агентом Avonex. С другой стороны, 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) продемонстрировал более низкие значения по всем параметрам t1/2, AUC∞, и MRT по сравнению с контрольным агентом Avonex, что указывает его более быстрое выведение из крови.

Пример 10. Фармакокинетика шестикратно-модифицированного дисиало-сахарной цепью IFN-β и PEG20K-модифицированного IFN-β у мышей

Пример 10-1. Приготовление агентов и реагентов для введения

2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), PEG20K-модифицированный IFN-β и Avonex готовили при концентрации 558 нМ с использованием ацетатного буфера, содержащего L-аргинин и полисорбат.

Пример 10-2. Введение и сбор крови

Мышам (мыши линии Ba1b/c, самцы, возраст 8 недель, масса тела 21-23 г), содержащимся в условиях неограниченного доступа к пище, вводили дозу, равную 2352 пмоль/кг путем подкожного введения на дорсальной стороне с помощью инсулинового шприца Myjector 29G × 1/2 (Terumo Corporation) в дозе 4 мл/кг. Из хвостовой вены собирали 75 мкл крови с помощью обработанной гепарином гематокритной капиллярной трубки (HIRSHMANN 1ABORGERATE) до подкожного введения, а также через 10 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 12 часов, 16 часов, 24 часа и 30 часов после введения. Кровь быстро смешивали с EDTA-PBS в таком же объеме, что и собранная кровь, и подвергали разделению путем центрифугирования (15000 об/мин, 4°С, 10 минут). 90 мкл супернатанта собирали в качестве образца плазмы крови. Образец плазмы крови хранили в замороженном виде до проведения измерений.

Пример 10-3. Измерение концентрации в крови

Набор Human interferon β ELISA kit (Kamakura Techno-Science) использовали для измерения концентрации IFN-β в крови. Шестикратно-модифицированный дисиало-сахарной цепью IFN-β, PEG20K-модифицированный IFN-β и Avonex из той же партии, из которой осуществляли введение, использовали в качестве стандартов для построения стандартной кривой, и доводили до концентрации 200 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 25 пМ, 12,5 пМ, 6,25 пМ и 3,125 пМ с помощью разбавителя, содержащегося в наборе. Бланковую плазму крови добавляли к стандартной кривой в соответствии с коэффициентом разведения образца плазмы крови таким образом, чтобы внесенное количество было одинаковым. График изменения концентрации в плазме IFN-β показан на фигуре 10. Пример 10-4. Расчет фармакокинетических параметров

На основе полученных данных по изменению концентрации IFN-β в плазме рассчитывали площадь под кривой зависимости концентрации в крови от времени (AUC) методом трапеций. Кроме того, расчетную начальную концентрацию (СО) в случае внутривенного введения определяли методом экстраполяции и, кроме того, определяли время полувыведения из крови (t1/2) и среднее время удерживания (MRT). Результаты показаны на фигуре 11.

Как показано на фигурах 10 и 11, и также как видно из результатов изменения концентрации в плазме и моментного анализа, шестикратно-модафицированный дисиало-сахарной цепью IFN-β и PEG20K-модифицированный IFN-β показали значительное улучшение по всем параметрам t1/2, AUC и MRT по сравнению с Avonex. Кроме того, наблюдалось, что шестикратно-модифицированный дисиало-сахарной цепью IFN-β превосходит PEG20K-модифицированный IFN-β в отношении AUC∞ и Cmax.

Что касается t1/2 и MRT, сравнение между шестикратно-модифицированным дисиало-сахарной цепью IFN-β и PEG20K-модифицированным IFN-β показало сопоставимые результаты.

Полученные результаты показали, что шестикратно-модифицированный дисиало-сахарной цепью IFN-β улучшает стабильность Avonex in vivo до уровня, сопоставимого с PEG20K, или более высокого уровня.

Пример 11. Противоопухолевая активность in vivo четырехкратно-, пятикратно- и шестикратно-модифицированного дисиало-сахарной цепью IFN-β

Противоопухолевую активность in vivo четырехкратно-, пятикратно- и шестикратно-модифицированного дисиало-сахарной цепью IFN-β оценивали у имеющих рак мышей.

Пример 11-1: Клеточная культура

Несущих рак мышей, полученных путем инокуляции клеток Daudi, которые являются человеческими клетками лимфомы Беркитта, использовали для тестирования противоопухолевой активности. Использовали среду RPMI1640 (Invitrogen), дополненную 10%-ной фетальной бычьей сывороткой (GIBCO), инактивированной при 56°С в течение 30 минут, и пенициллином/стрептомицином (SIGMA). Использовали культуральный планшет Non-treat dish (IWAKI). Культивирование проводили при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂, и перевивали каждые 2-3 дня. Пример 11-2.

Получение несущих рак мышей

Культивированные клетки Daudi собирали в пробирку и подвергали разделению путем центрифугирования (1300 об/мин, 4°С, 3 минуты). Супернатант удаляли с помощью аспиратора, добавляли HBSS (Nacalai) и клетки суспендировали. Затем повторно подвергали разделению путем центрифугирования и супернатант удаляли. Клетки промывали три раза. Кроме того, количество клеток рассчитывали с помощью гемоцитометра и клеточную суспензию готовили с HBSS при плотности 2×10⁸ клеток/мл. Непосредственно перед инокуляцией клетками Daudi добавляли Матригель (BD) в таком же объеме, что и клеточная суспензия, для обеспечения двойного разведения и готовили клеточную суспензию для инокуляции. Клеточную суспензию для инокуляции хранили на льду до инокуляции. В качестве анестезирующего средства использовали сомнопентил (Kyoritsu Seiyaku), разбавленный PBS до 5 мг/мл. 300 мкл анестезирующего средства вводили интраперитонеально мышам SCID (мыши C.B-17/Icr-scid/scidJcl, самцы, возраст 6 недель) (CLEA Japan) с помощью инсулинового шприца Myjector 29G × 1/2 (Terumo Corporation). После выполнения анестезии правый бок мышей брили с помощью бритвы. Для подкожной инокуляции 100 мкл клеточной суспензии использовали инъекционную иглу A 26G 1/2 (Terumo) и 1 мл стеклянный шприц (Terumo).

Примерно через 30 дней после инокуляции клеток измеряли большую ось (мм) и малую ось (мм) образованной опухолевой ткани с помощью калипера (Mitsutoyo). Объем опухоли (мм³) определяли с помощью полученных значений. Объем опухоли рассчитывали по формуле: объем опухоли (мм³) = большая ось (мм) × малая ось (мм) × малая ось (мм) × 0,5, и несущих рак мышей распределяли на 4 группы (n=4/группа). Объем опухоли на момент распределения составил приблизительно 800 мм³.

Пример 11-3. Приготовление раствора для введения

2-6 дисиало(S1C-С48С-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 61), 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 60), 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46) и 2-6 дисиало(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 49), а также контрольный агент Avonex готовили при концентрации 588 нМ с использованием ацетатного буфера, содержащего L-аргинин и полисорбат. Раствор для введения готовили непосредственно перед введением.

Пример 11-4. Способ введения

Приготовленный раствор для введения использовали для подкожного введения на дорсальной стороне, таким образом, чтобы доза составила 2352 пмоль/кг при объеме 4 мл/кг, с помощью инсулинового шприца Myjector 29G × 1/2. Группе введения носителя вводили ацетатный буферный раствор, содержащий L-аргинин и полисорбат, используемый для приготовления раствора для введения в объеме 4 мл/кг. День распределения по группам и начального введения был установлен как день 0, и подкожное введение на дорсальной стороне выполняли через день пять раз до дня 9.

Пример 11-5. Оценка противоопухолевой активности

Злокачественную ткань извлекали из тел мышей на день 24 после начала введения и измеряли влажную массу ткани. В качестве показателя противоопухолевой активности рассчитывали относительную величину массы влажной ткани в группах введения четырехкратно-шестикратно модифицированного дисиало-сахарной цепью IFN-β и Avonex, при этом влажная масса ткани в группе введения носителя была установлена равной 100% (%Т/С : тестируемый образец/контроль). Результаты показаны на фигуре 12.

Как показано на фигуре 12, относительная величина влажной массы злокачественной ткани (%Т/С) составила 44,5% для группы введения Avonex, тогда как указанная величина составила 0,3% для группы введения 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), 0,4% для группы введения дисиало(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C), 18,9% для группы введения 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) и 28,1% для группы введения 2-6 дисиало(S1C-С48С-М79С-K107C), и четырехкратно-, пятикратно- и шестикратно-модифицированный дисиало-сахарной цепью IFN-β согласно настоящему изобретению почти полностью уничтожил раковую ткань или показал превосходную противоопухолевую активность, при которой злокачественная ткань значительно уменьшилась.

Исходя из указанных выше результатов, при подкожном введении один раз в день, через день × 5 раз и в дозе 2352 пмоль/кг наблюдалась сильная противоопухолевая активность, так как число дисиало-сахарных цепей увеличивалось.

Пример 12. Противоопухолевая активность in vivo шестикратно-модифицированного дисиало-/моносиало-сахарной цепью IFN-β

Клетки культивировали способом, аналогичным примеру 11-1, и несущих опухоль мышей получали способом, аналогичным примеру 11-2.

Раствор для введения готовили способом, аналогичным примеру 11-3, за исключением того, что вводимый раствор в примере 11-3 представлял собой 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), 2-6 моносиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 93) и контрольный агент Avonex, и введение проводили несущим опухоль мышам способом, аналогичным примеру 11-4.

Злокачественную ткань извлекали из мышей на день 22 после начала введения и измеряли влажную массу ткани. В качестве показателя противоопухолевой активности рассчитывали сравнительную величину влажной массы ткани для группы введения Avonex, при этом влажная масса ткани для группы введения носителя была установлена равной 100% (%Т/С; тестируемый образец/контроль). Результаты показаны на фигуре 13.

Как показано на фигуре 13, относительная величина влажной массы злокачественной ткани (%T/С) составила 63% для группы введения Avonex, в то время как величина составила 1,3% для группы введения шестикратно-модифицированного дисиало-сахарной цепью IFN-β, и была подтверждена высокая противоопухолевая активность. С другой стороны, величина составила 79,3% для группы введения шестикратно-модифицированного моносиало-сахарной цепью IFN-β.

Исходя из указанных выше результатов, при подкожном введении один раз в день, через день × 5 раз и в дозе 2352 пмоль/кг с использованием шестикратно-модифицированного дисиало-сахарной цепью IFN-β была показана сильная противоопухолевая активность, при которой злокачественная ткань почти полностью уничтожалась, которая намного превосходила противоопухолевую активность в группе введения Avonex. С другой стороны, в случае шестикратно-модифицированного моносиало-сахарной цепью IFN-β, где только один из двух невосстанавливающих концов является сиалилированным, противоопухолевая активность, превосходящая противоопухолевую активность в группе введения Avonex, не наблюдалась. Было обнаружено, что все из невосстанавливающих концов, являющихся сиалилированными, являются важными для противоопухолевой активности.

Пример 13. Противоопухолевая активность in vivo шестикратно-модифицированного дисиало-/трисиало-/тетрасиало-сахарной цепью IFN-β

Клетки культивировали способом, аналогичным примеру 11-1, и несущих опухоль мышей получали способом, аналогичным примеру 11-2.

Раствор для введения готовили способом, аналогичным примеру 11-3, за исключением того, что вводимым раствором в примере 11-3 являлся 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), 2-6 трисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 96), 2-6 тетрасиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 98) и контрольный агент Avonex, и вводили несущим опухоль мышам способом, аналогичным примеру 11-4.

Злокачественную ткань извлекали из мышей на день 21 после начала введения, и измеряли влажную массу ткани. В качестве показателя противоопухолевой активности рассчитывали относительную величину влажной массы ткани в группе введения Avonex, при этом влажная масса ткани в группе введения носителя была установлена равной 100% (%Т/С; тестируемый образец/контроль). Результаты показаны на фигуре 14.

Как показано на фигуре 14, относительная величина влажной массы злокачественной ткани (%Т/С) составила 55,5% для группы введения Avonex, тогда как величина составила 3,6% для группы введения шестикратно-модифицированного дисиало-сахарной цепью IFN-β, 9,1% для группы введения шестикратно-модифицированного тетрасиало-сахарной цепью IFN-β и 28,7% для группы введения шестикратно-модифицированного трисиало-сахарной цепью IFN-β, и было показано, что любой из шестикратно-модифицированных сахарной цепью IFN-β обладал сильной противоопухолевой активностью.

Что касается структуры сахарной цепи, при рассмотрении различия в количестве ветвей в сахарной цепи, хотя шестикратно-модифицированная дисиало-сахарной цепью биантенарная форма показывает сильную противоопухолевую активность, шестикратно-модифицированная трисиало-сахарной цепью триантенарная форма и шестикратно-модифицированная тетрасиало-сахарной цепью четырехантенарная форма продемонстрировали более слабую активность, чем шестикратно-модифицированная дисиало-сахарной цепью форма. Предполагается, что это связано с различием в ингибирующей клеточный рост активности in vitro, как показано в результатах в примере 16, описанных ниже (таблица 4), или различием в кинетике крови in vivo и т.п..

Пример 14. Противоопухолевая активность in vivo шестикратно-модифицированного дисиало-сахарной цепью IFN-β и PEG20K-модифицированного IFN-β

Клетки культивировали способом, аналогичным примеру 11-1, и несущих опухоль мышей готовили способом, аналогичным примеру 11-2.

Раствор для введения готовили способом, аналогичным примеру 11-3, за исключением того, что вводимым раствором в примере 11-3 являлся 2-6 дисиало(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), PEG20K-модифицированный IFN-β, и контрольный агент Avonex, и вводили несущим опухоль мышам способом, аналогичным примеру 11-4.

Злокачественную ткань извлекали из мышей на день 21 после начала введения, и измеряли влажную массу ткани. В качестве показателя противоопухолевой активности рассчитывали относительную величину влажной массы ткани в группе введения Avonex, при этом влажная масса ткани в группе введения носителя была установлена равной 100% (%Т/С; тестируемый образец/контроль). Результаты показаны на фигуре 15.

Как показано на фигуре 15, относительная величина влажной массы злокачественной ткани (%Т/С) составила 62,6% для группы введения Avonex, тогда как величина составила 0,3% для группы введения шестикратно-модифицированного дисиало-сахарной цепью IFN-β, и была показана чрезвычайно высокая противоопухолевая активность, при которой злокачественная ткань почти уничтожалась. С другой стороны, величина %Т/С для группы введения PEG20K-модифицированного IFN-β составила 58,5%, которая является сопоставимой с группой введения контрольного агента Avonex. Исходя из этого становится очевидным, что шестикратно-модифицированный дисиало-сахарной цепью ΙΓΝβ обладает значительно более высокой активностью ΙΡΝβ по сравнению с контрольным агентом Avonex и PEG20K-модифицированным IFN-β, известным как общепринятая методика.

В целом, согласно общепринятой методике, добавление PEG в полипептиды выполняли для улучшения физической стабильности или стабильности белков в плазме. Также, в примере 10 настоящего изобретения пегилированный IFN-β продемонстрировал значительно улучшенное изменение концентрации в крови по сравнению с Avonex. Однако, в примере 14 пегилированный IFN-β продемонстрировал противоопухолевую активность, уровень которой был сопоставим лишь с уровнем противоопухолевой активности Avonex. Другими словами, улучшения противоопухолевой активности IFN-β не наблюдалось при пегилировании, которое, как известно, улучшает удерживание в крови, в то время как гликозилированный IFN-β согласно настоящему изобретению удивительным образом имел более высокое удерживание в крови по сравнению с Avonex, как показано в примере 10, и также значительно улучшенную противоопухолевую активность. Исходя из этого было показано, что гликозилированный IFN-β согласно настоящему изобретению является чрезвычайно полезным в качестве фармацевтического средства по сравнению с природным или пегилированным IFN-β.

Пример 15. Ингибирующая клеточный рост активность in vitro четырехкратно-, пятикратно- и шестикратно-гликозилированного IFN-β

Ингибирующую клеточный рост активность in vitro четырехкратно-, пятикратно- и шестикратно-гликозилированного IFN-β оценивали следующим способом.

Линию клеток Daudi человеческой лимфомы Беркитта суспендировали в среде RPMI 1640, дополненной 10%-ной фетальной бычьей сывороткой, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (10% FCS-RPMI1640) до плотности 1,25×10⁵ клеток/мл. Клеточную суспензию засевали в 96-луночный планшет с плоским дном при плотности 1×10⁴ клеток/80 мкл/лунку. Затем добавляли 20 мкл/лунку каждого из многократно гликозилированного IFN-β, серийно разведенного 10% FCS-RPMI1640, и культивировали в атмосфере, содержащей 5% СО₂, при 37 градусах в течение 3 дней. В качестве показателя ингибирующей клеточный рост активности измеряли активность дегидрогеназы митохондий на день 3 культивирования с помощью набора Cell counting kit-8 (DOJINDO).

Кроме того, в качестве контроля использовали Avonex. Величину IC50 рассчитывали с помощью GraphPad Prism. Результаты показаны в таблице 4 ниже.

monoSialo - моносиало, diSialo - дисиало, triSialo - трисиало, tetraSialo - тетрасиало

Как показано в таблице 4, улучшение ингибирующей клеточный рост активности in vitro также наблюдалось при использовании различных гликозилированных полипептидов, которые были гликозилированы в положении, отличном от гликозилированного IFN-β, для которого в настоящем документе наблюдался эффект улучшения противоопухолевой активности. Что касается гликозилированных полипептидов, показанных в таблице 4, можно предположить, что аналогично указанным выше гликолизированным полипептидам, гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению, в котором все из невосстанавливающих концов являются сиалилированными, также можно применять в качестве фармацевтического средства, обладающего активностью интерферона β, и в качестве фармацевтического средства, обладающего активностью, такой как противоопухолевая активность, которая превосходит активность интерферона.

Исходя из указанного выше, было показано, что четырехкратно-шестикратно гликозилированный IFN-β согласно настоящему изобретению обладает более высоким удерживанием в крови и более высокой противоопухолевой активностью, чем природный IFN-β (Avonex).

Как показано на фигурах 4, 5 и 12, дисиало-гликозилированный IFN-β обладает более высоким удерживанием в крови, а также более высокой противоопухолевой активностью по мере увеличения числа сахарных цепей от четырехкратного до шестикратного, от пятикратного до шестикратного и т.д.

Кроме того, в настоящем изобретении показано, что все из невосстанавливающих концов сахарной цепи, которые являются сиалилированными, являются важными для улучшения удерживания IFN-β в крови и улучшения противоопухолевой активности in vivo.

Кроме того, во всех случаях использования различных сахарных цепей, таких как дисиало-сахарные цепи, а также трисиало-сахарные цепи и тетрасиало-сахарные цепи, которые содержат все из невосстанавливающих концов сахарной цепи сиалилированными, было показано, что они обладают более высоким удерживанием в крови и более высокой противоопухолевой активностью по сравнению с природным IFN-β (Avonex).

Таким образом, гликозилированный полипептид согласно настоящему изобретению является полезным в качестве фармацевтического средства, обладающего активностью, превосходящей активность интерферона β.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая гликозилированный полипептид, обладающий активностью интерферона β и имеющий лучшее удерживание в крови по сравнению с природным человеческим интерфероном β (варианты), и фармацевтическая композиция, содержащая вышеуказанный гликозилированный полипептид. В одном из вариантов гликозилированный полипептид содержит гликозилированные аминокислоты в 4-6 положениях, и причем все из невосстанавливающих концов сахарных цепей являются сиалилированными. В другом варианте изобретения гликозилированный полипептид представляет собой любой полипептид, выбранный из группы, состоящей из: (1) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1; (2) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, в которой от одной до десяти аминокислот удалены, замещены или добавлены; (3) полипептида, обладающего 90% или более гомологией с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1. Изобретение расширяет арсенал гликозилированных полипептидов, обладающих активностью интерферона β. 3 н. и 12 з. п. ф-лы, 16 ил., 4 табл., 15 пр.

1. Гликозилированный полипептид, обладающий активностью интерферона β и имеющий лучшее удерживание в крови по сравнению с природным человеческим интерфероном β, характеризующийся тем, что указанный полипептид содержит гликозилированные аминокислоты в 4-6 положениях, и причем все из невосстанавливающих концов сахарных цепей, указанных гликозилированных аминокислот, являются сиалилированными.

2. Гликозилированный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что указанная соответствующая гликозилированная аминокислота, каждая, независимо представляет собой гликозилированный Cys или гликозилированный Asn.

3. Гликозилированный полипептид по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что сахарные цепи в указанных соответствующих гликозилированных аминокислотах все независимо выбраны из группы, состоящей из дисиало-сахарной цепи, трисиало- сахарной цепи и тетрасиало-сахарной цепи.

4. Гликозилированный полипептид по любому из пп. 1-3, характеризующийся тем, что сахарные цепи в указанных соответствующих гликозилированных аминокислотах все независимо выбраны из группы, состоящей из следующей формулы (1), формулы (2), формулы (3) и формулы (4):

Химическая формула 1

Формула (1),

Химическая формула 2

Формула (2),

Химическая формула 3

Формула (3),

Химическая формула 4

Формула (4).

5. Гликозилированный полипептид по любому из пп. 1-4, характеризующийся тем, что сахарные цепи в указанных соответствующих гликозилированных аминокислотах все являются идентичными.

6. Гликозилированный полипептид по любому из пп. 1-5, характеризующийся тем, что, по меньшей мере, одна из указанных соответствующих гликозилированных аминокислот находится в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

7. Гликозилированный полипептид по п. 6, характеризующийся тем, что, по меньшей мере, одна из указанных соответствующих гликозилированных аминокислот находится в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 1, 3, 41, 48, 75, 79, 107, 112, 123 и 136 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

8. Гликозилированный полипептид по п. 6, характеризующийся тем, что, по меньшей мере, три из указанных соответствующих гликозилированных аминокислот находятся в положениях, соответствующих положениям, выбранным из группы, включающей положения 1, 3, 41, 48, 75, 79, 107, 112, 123 и 136 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

9. Гликозилированный полипептид по п. 6, характеризующийся тем, что ни одна из указанных соответствующих гликозилированных аминокислот не находится в положении, соответствующем положениям 2, 5, 6, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 23, 27, 33, 37, 39, 40, 43, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 73, 78, 83, 86, 87, 90, 93, 94, 100, 124, 125, 128, 131, 132, 138, 141, 142, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 159, 160 или 163 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

10. Гликозилированный полипептид по п. 6, характеризующийся тем, что все из указанных соответствующих гликозилированных аминокислот находятся в положении, соответствующем положению, выбранному из группы, включающей положения 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 и 164 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1.

11. Гликозилированный полипептид по любому из пп. 1-5 или 7-10, характеризующийся тем, что указанный гликозилированный полипептид синтезирован химически.

12. Фармацевтическая композиция, характеризующаяся тем, что указанная фармацевтическая композиция содержит:

(1) гликозилированный полипептид по любому из пп. 1-11 и/или его фармацевтически приемлемую соль; и

(2) фармацевтически приемлемый носитель.

13. Фармацевтическая композиция по п. 11, характеризующаяся тем, что ее применяют для терапии или предупреждения заболевания, связанного с интерфероном β.

14. Фармацевтическая композиция по п. 12, характеризующаяся тем, что указанное заболевание, связанное с интерфероном β, выбрано из группы, состоящей из опухоли головного мозга, кожной злокачественной меланомы, хронического активного гепатита В, хронического гепатита С, подострого склерозирующего панэнцефалита, компенсированного цирроза печени С и множественного склероза.

15. Гликозилированный полипептид, обладающий активностью интерферона β и имеющий лучшее удерживание в крови по сравнению с природным человеческим интерфероном β, характеризующийся тем, что указанный гликозилированный полипептид представляет собой любой полипептид, выбранный из группы, состоящей из следующих (1)-(3):

(1) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1;

(2) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1, в которой от одной до десяти аминокислот удалены, замещены или добавлены;

(3) полипептид, обладающий 90% или более гомологией с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1,

в котором аминокислоты в 4-6 положениях являются замещенными гликозилированными аминокислотами, и

в котором все из невосстанавливающих концов сахарных цепей, указанных гликозилированных аминокислот, являются сиалилированными.