СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПЕПТИДА, ИМЕЮЩЕГО СИАЛИРОВАННУЮ САХАРНУЮ ЦЕПЬ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНОГО СИАЛИЛГЛИКОАСПАРАГИНА Российский патент 2016 года по МПК C07K1/04 C07K1/06 C07K9/00 C07K14/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу синтеза гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, который может быть использован, например, в эталонных стандартах, например для фармацевтических агентов, или в качестве аналитических инструментов и реактивов для академических целей.

Предшествующий уровень техники

В последние годы гликомолекулы привлекают внимание как третья из биологических молекул, образующих цепи, после нуклеиновых кислот (ДНК) и белков. Человеческий организм является одним большим сообществом клеток, состоящим из около 60 триллионов клеток, и все поверхности клеток покрыты гликомолекулами. Например, группа крови по системе АВО определяется по различию сахарных цепей на клеточной поверхности.

Функция сахарных цепей связана с межклеточным распознаванием и взаимодействием, и они действуют в качестве краеугольного камня в формировании клеточного сообщества. Беспорядок в клеточном сообществе приводит, например, к злокачественному новообразованию, хроническому заболеванию, инфекции и старению. Например, известно, что, когда клетки становятся злокачественными, на клеточной поверхности происходит структурное изменение сахарных цепей.

Кроме того, известно, что Vibrio cholerae или вирус гриппа и т.д. захватывают клетку и вызывают инфекцию путем распознавания и связывания конкретной сахарной цепи.

Выявление таких функций сахарных цепей приведет, например, к разработке фармацевтических агентов или пищевых продуктов, основанных на новом принципе, для которых ожидают широкий круг применения, таких как профилактика заболеваемости или применение при лечении.

По сравнению со структурами нуклеиновых кислот или белков сахарные цепи имеют очень сложные структуры из-за разнообразия, например, последовательности моносахаридов, способа и участка связывания, длины цепи и вида ветвления и общей структуры высшего порядка. Соответственно, биологическая информация, полученная из структуры сахарной цепи, широко варьирует по сравнению с той, что получена из структуры нуклеиновых кислот или белков. Хотя важность исследования сахарных цепей является признанной, скорость исследований замедлена по сравнению с исследованиями нуклеиновых кислот или белков, из-за сложности и разнообразия структур сахарных цепей.

К множеству белков, присутствующих на поверхности клеточной мембраны или в сыворотке и т.п., прикреплены сахарные цепи. Молекулы, в которых сахарные цепи ковалентно связаны с белком, называются гликопротеинами, и могут быть разделены на две группы, согласно различию по способу связывания сахара и белка. В одной сахарная цепь связана с аспарагином (N-гликозидная связь) через аминогруппу на боковой цепи аспарагина (Asn). В другой сахарная цепь связана с муцином (O-гликозидная связь), где сахарная цепь связана со спиртовой группой серина (Ser) или треонина (Thr). Все сахарные цепи, связанные с аспарагином, имеют основной остов, состоящий из 5 остатков сахара, и классифицируются на подгруппы с высоким содержанием маннозы, комплексного типа и гибридного типа в соответствии с сахарным остатком на невосстанавливающем конце прикрепленной сахарной цепи. С другой стороны, муцин-связанные сахарные цепи классифицируются на четыре группы согласно различию основного остова (ядра).

Хотя белки с сахарной цепью уже использовались в качестве гликопротеиновых составов, существуют проблемы, суть которых в том, что эти гликопротеины могут быть получены только способами, в основном использующими биотехнологию, и в том, что гликопротеины, изготовленные таким образом, загрязнены. Соответственно, необходим способ химического синтеза, который позволяет эффективно получать представляющий интерес гликопротеин с высокой степенью чистоты. В частности, при синтезе гликопептида, имеющего неприродную аминокислоту, биологические способы не позволяют обеспечить прямое получение.

Способ синтеза на твердой фазе, разработанный R. В. Merrifield в 1963 году, в настоящее время широко используется в качестве способа синтеза пептидов. Способ синтеза на твердой фазе является способом, в котором аминокислотные строительные блоки присоединяются к твердой фазе, называемой смолой, а пептидная цепь удлиняется. Если удлинение пептидной цепи закончено, пептидная цепь отщепляется от твердой фазы для получения целевого объекта.

Когда применяют данный подход для синтеза цепи гликопептида, то при удлинении пептидной цепи в нее включают аминокислоту, связанную с сахарной цепью.

В способе твердофазного синтеза аминогруппы аминокислот, которые будут строительными блоками, защищаются, например, флуоренилметоксикарбонильной (Fmoc) группой, трет-бутоксикарбонильной (Boc) группой или бензилоксикарбонильной (Cbz или Z) группой.

В способе твердофазного синтеза, использующем Boc-группу, для снятия защитной группы с боковой цепи пептида и отщепления пептида от смолы используются очень сильная кислота, такая как фторводородная кислота, и проблема заключается в том, что когда в части целевого объекта имеется сахарная цепь, то в результате обработки фтороводородной кислотой часть сахарной цепи, особенно сиаловая кислота, присутствующая на не восстанавливающем конце сахарной цепи, может легко деградировать. Таким образом, трудно изготовить представляющий интерес гликопротеин, имеющий сиалированную сахарную цепь, с помощью Boc-способа твердофазного синтеза.

В способе твердофазного синтеза, использующем Fmoc-группу, Fmoc-группа может быть отсоединена от аминогруппы аминокислоты в щелочных условиях. С другой стороны, поскольку Boc-группа может быть снята с аминогруппы аминокислоты в кислых условиях, Boc-способ твердофазного синтеза необходим, когда способом твердофазного синтеза синтезируется пептид или гликопептид, в котором присутствует лабильная к щелочам неприродная аминокислота.

Неприродные аминокислоты являются аминокислотами, которые не входят в состав белков, но некоторые из них существуют в природе и могут быть получены химическим синтезом. Неприродн аминокислоты имеют чрезвычайно высокое разнообразие структуры или гибкость выбора заместителя. При использовании такой неприродной аминокислоты в синтезе пептида можно ожидать улучшение стабильности in vivo, улучшение активности, улучшение эффективности абсорбции, улучшение распределения по ткани, изменение трехмерной структуры пептида и т.п., и неприродные аминокислоты привлекают внимание как позволяющие спроектировать вещества кандидаты для новых пептидных лекарств и функциональных материалов.

Сообщалось о способе, в котором пептид, полученный отщеплением пептида от смолы, преобразуется в тиоэфирную форму (например, Документ Непатентной Литературы 1). Поскольку получается пептид в тиоэфирной форме, он может быть связан с другими пептидными цепями, с использованием, например, способа Природного Химического Лигирования (NCL) или способа Кинетически Контролируемого Лигирования (KCL), что позволяет изготовить представляющий интерес белок большего размера (Документ Патентной Литературы 1 и Документ Непатентной Литературы 2).

Способ NCL является способом получения пептидной цепи большего размера путем связывания пептидного фрагмента, имеющего Cys в качестве N-концевой аминокислоты, и пептидного фрагмента, имеющего тиоэфир на С-конце. Гликопротеин может быть синтезирован с использованием в качестве такого фрагмента гликозилированного пептида. Каждый фрагмент может быть синтезирован, например, вышеуказанным способом твердофазного синтеза, а гликозилированные фрагменты, имеющие единообразные аминокислотную последовательность и структуру сахарной цепи, могут быть получены в ходе синтеза присоединением вместо аминокислоты гликозилированного аспарагина, имеющего единообразные сахарные цепи (Документ Патентной Литературы 2). Кроме того, способ KCL является способом получения представляющего интерес гликопротеина в относительно больших количествах путем использования различия в скорости реакции, когда оба связываемых пептидных фрагмента имеют тиоэфир на С-конце.

Соответственно, при осуществлении способа NCL или KCL с гликозилированным фрагментом могут быть получены единообразные гликопротеины, которые не варьируют в зависимости от партии выработки и которые также могут быть использованы в качестве фармацевтического агента.

Список процитированной литературы

Патентные документы

[Патентный Документ 1] Международная публикация № 96/34878

[Патентный Документ 2] Международная публикация № 2011/007747

Непатентная литература

[Непатентная литература 1] Xianzhang Bu. et al.: Tetrahedron Letters (2002) 43:2419-2422

[Непатентная литература 2] HutloffA. et al.: Nature (1999) 397:263-266

Сущность изобретения

Техническая проблема

Как указано выше, необходим способ синтеза, в котором возможно предотвратить деградацию сиаловой кислоты на сахарной цепи в Boc-способе твердофазного синтеза. Авторы настоящего изобретения нашли способ синтеза гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, путем защиты карбоксильной группы сиаловой кислоты на сахарной цепи с помощью определенного соединения в процессе твердофазного синтеза. Однако если в Boc-способе твердофазного синтеза используется сверхсильная кислота, сиаловая кислота на сахарной цепи невосстанавливающего конца не может быть полностью сохранена, даже когда используются эти защитные группы, а гликопептид, имеющий сиалированную сахарную цепь, не может быть получен с желаемым выходом.

Соответственно, в настоящем изобретении предлагается способ синтеза гликопептида, имеющего представляющую интерес сиалированную сахарную цепь, с высоким выходом в способе твердофазного синтеза гликопептида, с использованием Вос-группы, без деградации сиаловой кислоты на невосстанавливающем конце сахарной цепи.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ изготовления гликопептида в тиоэфирной форме в способе твердофазного синтеза с использованием Вос-группы гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь.

Решение проблемы

В результате интенсивных исследований, проведенных авторами настоящего изобретения для решения указанных выше проблем, стало возможным значительно улучшить выход гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, даже в Boc-способе твердофазного синтеза путем применения фенацильной группы в качестве защитной группы карбоксильной группы сиаловой кислоты на невосстанавливающем конце сахарной цепи.

Другими словами, настоящее изобретение относится к способу изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, который включает следующие стадии:

(1) связывания смолы, имеющей гидроксильную группу, с аминокислотой, у которой азот аминогруппы защищен Вос-группой;

где указанная стадия связывания является стадией связывания гидроксильной группы указанной смолы с карбоксильной группой указанной аминокислоты путем реакции этерификации;

(2) образования свободной аминогруппы путем отсоединения Вос-группы;

(3) повтор, по меньшей мере, однократно, следующих стадий (i) и (ii):

(i) элонгации аминокислоты, связанной со смолой, путем дополнительного связывания другой аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищена Вос-группой, где указанная стадия элонгации является стадией связывания карбоксильной группы указанной другой аминокислоты с указанной свободной аминогруппой аминокислоты, связанной с указанной смолой.

(ii) образования свободной аминогруппы путем отсоединения указанной в (i) Вос-группы; и

(4) гидролиза смолы с помощью кислоты;

где указанная аминокислота в стадии (1) и/или указанная другая аминокислота, по меньшей мере, единожды в (i) стадии (3) является гликозилированной аминокислотой, где указанная гликозилированная аминокислота имеет сиаловую кислоту, по меньшей мере, на одном из невосстанавливающих концов сахарной цепи, а карбоксильная группа указанной сиаловой кислоты защищена с помощью фенацильной группы.

Одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется тем, что указанная гликозилированная аминокислота имеет сахарную цепь, связанную с аспарагином, или сахарную цепь, муцинового типа.

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется тем, что указанная кислота в указанной стадии (4) является смешанной кислотой, трифторуксусной кислотой/трифторметансульфоновой кислотой/диметилсульфидом/m-крезолом.

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется тем, что указанная аминокислота в указанной стадии (1) и/или указанная другая аминокислота, по меньшей мере, однажды в (i) указанной стадии (3) является лабильной к щелочи еприродной аминокислотой.

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется тем, что, по меньшей мере, одна из указанных гликозилированных аминокислот является сиалилгликоаспарагином, а указанный сиалилгликоаспарагин имеет 6 или большее количество сахарных остатков.

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется тем, что, по меньшей мере, одна из указанных гликозилированных аминокислот является сиалилгликоаспарагином, а указанный сиалилгликоаспарагин имеет от 9 до 11 сахарных остатков.

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению, характеризуется тем, что, по меньшей мере, указанные гликозилированные аминокислоты являются сиалилгликоаспарагином, а указанный гликоаспарагин имеет 6 или большее количество сахарных остатков и имеет биантенарную сахарную цепь, присоединенную к нему.

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется тем, что указанная гликозилированная аминокислота представлена формулой (I):

Химическая формула 1

где один из R³ и R⁴ является (2), а другой является группой, выбранной из группы, состоящей из атома водорода и групп, показанных в формулах (2)-(6).

Химическая формула 2

Химическая формула 3

Химическая формула 4

Химическая формула 5

Химическая формула 6

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется дополнительным включением стадии связывания тиольного соединения со смолой перед указанной стадией (1).

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется дополнительным включением стадии (5) связывания тиоэфирной формы гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, с пептидным фрагментом или гликопептидным фрагментом.

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется дополнительным включением стадии, позволяющей метящему агенту вступить в реакцию перед гидролизом смолы с помощью кислоты в указанной стадии (4).

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется тем, что метящим агентом является дансилгалид.

Кроме того одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется тем, что для реакции конденсации указанной аминокислоты и/или реакции отсоединения Bac-группы, по меньшей мере, в одной из указанных стадий (1)-(3) осуществляется воздействие микроволнами.

Кроме того, одно воплощение способа изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит стадию снятия защиты фенацильной группы, защищающей карбоксильную группу указанной сиаловой кислоты, после указанной стадии (4).

Кроме того, другой аспект настоящего изобретения относится к гликопептиду, имеющему сиалированную сахарную цепь, полученному с помощью вышеуказанного способа изготовления.

Кроме того, другой аспект настоящего изобретения относится к способу изготовления производного сиалилгликоаспарагина, в котором аминогруппа сиалилгликоаспарагина защищена Вос-группой, а карбоксильная группа сиаловой кислоты на невосстанавливающем конце сахарной цепи защищена фенацильной группой, включающему стадии: введения фенацильной группы в производное сиалилгликоаспаспарагина, имеющего аминогруппу аспарагина, защищенную липофильной защитной группой, отщепления липофильной защитной группы сиалилгликоаспарагина, имеющего введенную фенацильную группу, и введение Вос-группы, в сиалилгликоаспарагин, от которого отщеплена липофильная защитная группа.

Кроме того, одно воплощение способа изготовления производного сиалилгликоаспарагина по настоящему изобретению характеризуется тем, что указанной липофильной защитной группой является Fmoc.

Кроме того, в одном воплощении настоящего изобретения гликопептид, изготовленный способом настоящего изобретения для изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, является гликопептидом, имеющим аминоксилотную последовательность, эквивалентную аминокислотной последовательности эритропоэтина и имеющего, по меньшей мере, одну или несколько сиалированных сахарных цепей в любом положении. Кроме того, в одном воплощении настоящего изобретения гликопептид, изготовленный способом настоящего изобретения для изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, является частью гликопептида (т.е. гликопептидного фрагмента), имеющего аминокислотную последовательность, эквивалентную аминокислотной последовательности эритропоэтина, и имеющего, по меньшей мере, одну или несколько сиалированных сахарных цепей в любом положении.

Аминокислотная последовательность, эквивалентная аминокислотной последовательности эритропоэтина, в данном документе относится к аминокислотной последовательности, которая имеет функцию эритропоэтина после сворачивания и имеет делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность эритропоэтина.

Преимущество изобретения

Согласно способу изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, по настоящему изобретению, гликопептид, имеющий сиаловую кислоту на невосстанавливающем конце сахарной цепи, может быть прямо получен Вос-способом твердофазного синтеза. Более того, из-за того, что Вос-группа используется в качестве защитной группы для аминогрупп аминокислот, также возможно получить гликопептид с лабильной к щелочам неприродной аминокислотой.

Гликопептиды, имеющие фактически единообразную структуру сахарной цепи, могут быть синтезированы в больших количествах химическим синтезом, таким как твердофазный синтез с Boc. Такой гликопептид, имеющий единообразную структуру сахарной цепи, является постоянным по качеству и особенно предпочтителен в областях, таких как изготовление фармацевтических агентов и тестов.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 является схематическим чертежом, демонстрирующим технологическую схему аспекта одного воплощения настоящего изобретения, который является способом получения аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин (TN(дифенацил-дисиало сахарная цепь)YSVTDLNY) с помощью Вос-способа твердофазного синтеза с использованием интерферона гамма (INFγ) в качестве модельного пептида.

Фигура 2 демонстрирует профиль ВЭЖХ, в аспекте одного воплощения настоящего изобретения, которое является получением аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин (TN(дифенацил-дисиало сахарная цепь)YSVTDLNY) с помощью Вос-способа твердофазного синтеза с использованием интерферона гамма (INFγ) в качестве модельного пептида.

Фигура 3 является схематическим чертежом, демонстрирующим технологическую схему аспекта одного воплощения настоящего изобретения, которая является способом получения аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин (SLQN(дифенацил-дисиало сахарная цепь)ASAIES) с помощью Вос-способа твердофазного синтеза с использованием интерлейкина 3 (IL-3) в качестве модельного пептида.

Фигура 4 демонстрирует профиль ВЭЖХ, в аспекте одного воплощения настоящего изобретения, которое является получением аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин (SLQN(дифенацил-дисиало сахарная цепь)ASAIES) с помощью Вос-способа твердофазного синтеза с использованием интерлейкина 3 (IL-3) в качестве модельного пептида.

Фигура 5 является схематическим чертежом, демонстрирующим одно воплощение настоящего изобретения, которое является частью стадии способа изготовления аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин, с использованием эритропоэтина в качестве модельного пептида. В частности, она является схематическим чертежом, демонстрирующим стадию связывания фрагмента А, имеющего аминокислотную последовательность 1-21 аминокислот эритропоэтина, с фрагментом В, имеющим аминокислотную последовательность 22-49 аминокислот эритропоэтина для получения фрагмента (А+В).

Фигура 6 является схематическим чертежом, демонстрирующим одно воплощение настоящего изобретения, которое является частью способа изготовления аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин, с использованием эритропоэтина в качестве модельного пептида. В частности, она является схематическим чертежом, демонстрирующим стадию связывания фрагмента Е, имеющего аминокислотную последовательность 98-127 аминокислот эритропоэтина с фрагментом F, имеющим аминокислотную последовательность 128-166 аминокислот эритропоэтина, для получения фрагмента (E+F), и стадии преобразования N-концевого тиазолидинового производного цистеина фрагмента (E+F) в цистеин.

Фигура 7 является схематическим чертежом, демонстрирующим одно воплощение настоящего изобретения, которое является частью стадии способа изготовления аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин, с использованием эритропоэтина в качестве модельного пептида. В частности она является схематическим чертежом, демонстрирующим стадию связывания фрагмента (Е+F), имеющего аминокислотную последовательность 98-166 аминокислот эритропоэтина с фрагментом D, имеющим аминокислотную последовательность 79-97 аминокислот эритропоэтина, для получения фрагмента (D+Е+F), стадию преобразования N-концевого тиазолидинового производного цистеина фрагмента (D+Е+F) в цистеин, и стадию удаления фенацильной группы на сиаловой кислоте сахарной цепи и формильной группы (СНО), которая является защитной группой Trp.

Фигура 8 является схематическим чертежом, демонстрирующим одно воплощение настоящего изобретения, которое является частью стадии способа изготовления аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин, с использованием эритропоэтина в качестве модельного пептида. В частности, она является схематическим чертежом, демонстрирующим стадию связывания фрагмента (D+Е+F) имеющего аминокислотную последовательность 79-166 аминокислот эритропоэтина с фрагментом С, имеющим аминокислотную последовательность 50-78 аминокислот эритропоэтина для получения фрагмента (С+D+Е+F), стадию восстановления цистеина, использованную для лигирования в аланин, и стадию преобразования N-концевого тиазолидинового производного-цистеина фрагмента (С+D+Е+F) в цистеин.

Фигура 9 является схематическим чертежом, демонстрирующим одно воплощение настоящего изобретения, которое является частью стадии способа изготовления аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин с использованием эритропоэтина в качестве модельного пептида. В частности, она является схематическим чертежом, демонстрирующим стадию связывания фрагмента (С+D+Е+F), имеющего аминокислотную последовательность 50-166 аминокислот эритропоэтина с фрагментом (А+В), имеющим аминокислотную последовательность аминокислот 1-49 эритропоэтина для получения фрагмента (А+В+С+D+Е+F).

Фигура 10 является схематическим чертежом, демонстрирующим одно воплощение настоящего изобретения, которое является частью стадии способа изготовления аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин с помощью эритропоэтина в качестве модельного пептида. В частности, она является схематическим чертежом, демонстрирующим стадию преобразования цистеина, использованную для лигирования в аланин в фрагменте (А+В+С+D+Е+F), имеющем аминокислотную последовательность 1-166 аминокислот эритропоэтина.

Фигура 11 является схематическим чертежом, демонстрирующим одно воплощение настоящего изобретения, которое является частью стадии способа изготовления аминокислотной последовательности, имеющей биантенарный дисиалогликоаспарагин, с использованием эритропоэтина в качестве модельного пептида. В частности она является схематическим чертежом, демонстрирующим стадию снятия защитной группы цистеина в фрагменте (А+В+С+D+Е+F), имеющем аминокислотную последовательность 1-166 аминокислот эритропоэтина.

Описание воплощений

«Аминокислота» в данном документе используется в наиболее широком значении, и включает не только природные аминокислоты, но также неприродные аминокислоты, такие как варианты или производные аминокислот. Специалисты в данной области учтут данное широкое определение для понимания примеров аминокислот в данном документе, включая естественные протеиногенные L-аминокислоты; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот; природные непротеиногенные аминокислоты, такие как норлейцин, β-аланин и орнитин; и химически синтезированные соединения, имеющие свойства, хорошо известные в данной области, которые являются характерной особенностью аминокислот. Примеры неприродных аминокислот в данном документе включают α-метиламинокислоты (такие как α-метилаланин), D-аминокислоты, гистидин-подобные аминокислоты (такие как 2-амино-гистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметил-гистидин и α-метил-гистидин), аминокислоты, имеющие экстраметилен на боковой цепи («гомо» аминокислоты), и аминокислоты, в которых функциональная группа карбоновой кислоты в боковой цепи замена на группу сульфоновой кислоты (такой как цистеиновая кислота). В предпочтительном аспекте аминокислота, содержащаяся в соединении настоящего изобретения, включает неприродную аминокислоту.

«Сахарная цепь» в данном документе относится к соединению, состоящему из одной или нескольких сахарных единиц (моносахарида и/или его производного), расположенных в ряд. Когда в ряду два или большее количество сахаров, связь между каждой сахарной единицей образуется в результате конденсации с дегидратацией с образованием гликозидной связи. Примеры такой сахарной цепи, включают, без ограничения перечисленным, широкий спектр, такой как моносахариды и полисахариды, встречающиеся in vivo (глюкоза, галактоза, манноза, фукоза, ксилоза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, сиаловая кислота а также их комплексы и производные), деградированные полисахариды, гликопротеины, протеогликаны, глюкозаминогликаны и сахарные цепи, деградированные или индуцированные из комплексных биомолекул, таких как гликолипиды. Сахарная цепь может быть линейного или разветвленного типа.

«Сахарная цепь» в данном документе также включает производное сахарной цепи, а примеры производного сахарной цепи включают, без ограничения перечисленным, сахарные цепи, в которых сахар, составляющий сахарную цепь, является сахаром, имеющим карбоксильную группу (например, альдоновую кислоту, в которой положение С-1 окислено до карбоновой кислоты (например, D-глюконовой кислоты, которая является окисленной D-глюкозой) и уроновой кислоты, в которой концевой атом С включен в карбоновую кислоту (D-глюкуроновая кислота, которая является окисленной D-глюкозой)), сахара, имеющие аминогруппу или производное аминогруппы (например, ацетилированную аминогруппу) (например, N-ацетил-D-глюкозамин, и N-ацетил-D-галактозамин), сахара, имеющие как аминогруппу и карбоксильную группу (например, N-ацетилнейраминовая кислота (сиаловая кислота) и N-ацетилмураминовая кислота), восстановленные сахара (например, 2-деокси-D-рибоза), сульфатированные сахара, содержащие сульфатную группу, и фосфорилированные сахара, содержащие фосфатную группу.

Производное сахарной цепи в данном документе также включает соединения, в которых другие соединения были связаны с восстановливающим концом сахарной цепи конденсацией с дегидратацией и т.п. Пример может включать структуру, в которой соединение дополнительно связано с N-ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце сахарной цепи в аспарагин-связанной сахарной цепи. Соединение может быть просто добавлено к восстанавливающему концу также в случае других производных сахарной цепи.

Производные сахарной цепи включают те, в которых аминокислота добавлена на восстанавливающем конце сахарной цепи (гликозилированная аминокислота), а также те, в которых добавлены пептид, белок, линкер, флуоресцентная группа, липид, низкомолекулярное соединение, радиоактивное соединение или т.п. Аминокислота включает не только природные аминокислоты, но также неестественные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот. Аминокислоты, пептиды, белки и т.п., могут быть теми, в которых часть или все функциональные группы, содержащиеся в них, такие как гидроксильная группа, аминогруппа и карбоксильная группа, защищены посредством защитной группы. Примеры защитных групп для гидроксильной группы могут включать метильную группу, бензильную группу, бензоильную группу, ацетильную группу, триметилсилильную (TMS) группу, триэтилсилильную (TES) группу, и трет-бутилдиметилсилильную (TBS или TBDMS) группу. Примеры аминозащитной группы могут включать, в качестве липофильной защитной группы, карбонатную или амидную защитную группу, такую как 9-флуоренилметоксикарбонильная (Fmoc) группа, t-бутилоксикарбонильную (Boc) группу, бензильную группу, аллилоксикарбонильную группу, ацетильную группу.

В данном документе при изготовлении гликопротеинов, становящихся фармацевтическими агентами, предпочтительными сахарными цепями являются сахарные цепи, которые присутствуют in vivo в гликоконъюгатах (таких как гликопептиды (или гликопротеины), протеогликанах, или гликолипидах), предпочтительно сахарные цепи, которые связаны in vivo с пептидами (или белками) в гликопептидах (или гликопротеинах), таких как N-связанные сахарные цепи и O-связанные сахарные цепи. N-связанная сахарная цепь является общим термином формата связывания, в котором сахарная цепь связана с белком, и относится к сахарной цепи, в которой аномерная гидроксильная группа в N-ацетилглюкозамин на восстанавливающем конце сахарной цепи конденсируется и связывается с аминогруппой (-NH₂) боковой цепи аспарагина, а O-связанная сахарная цепь является общим термином формата связывания, в котором сахарная цепь связывается с белком и относится к сахарной цепи, в которой аномерная гидроксильная группа на восстанавливающем конце сахарной цепи конденсируется и связывается с гидроксильной группой (-ОН) боковой цепи серина или треонина.

N-связанная сахарная цепь также иногда называется аспарагин-связанная сахарная цепь, гликоаспарагин или сахарная цепь N-типа и т.п. N-связанная сахарная цепь является группой сахарной цепи, имеющей Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac в качестве ядра основного остова. Более того, сильноразветвленные структуры, такие как биантенарные, триантенарные и тетраантенарные также известны как разветвленные структуры сахарной цепи и сахарной цепи, имеющей такие разветвленные структуры, также включены. Эти структуры сахарных цепей также описаны, например, в Словаре Биохимии (Seikagaku Jiten) (3rd Ed., Published by Tokyo Kagaku Dojin).

Кроме того, также включено соединение, существующее в виде N-связанной сахарной цепи комплексного типа, в котором Fuc (фукоза) или Gn (N-ацетилглюкозамин) связаны с вышеуказанной сахарной цепью также. Более конкретно, известно, что Fuc образует α1,6 связь с Gn на восстанавливающем конце, Gn образует β1,4 связь в положение 4 Man, связанной с Gn на восстанавливающем конце, а Fuc образует α1,3 или α1,4 связь с Gn в разветвленной части. Кроме того, также включены сахарные цепи, имеющие различные виды связывания гликозидной связи, такие как соединение, в котором видом связывания вышеуказанной сахарной цепи в ветвящейся части является Gn(β1,4)Man или Gn(β1,2)Man вместо Gn(β1,6)Man, или является Gn(β1,2)Man вместо Gn(β1,4)Man, соединение, в котором часть Sia(α2,6)Gal в участке связывания сиаловой кислоты является Sia(α2,3)Gal вместо Sia(α2,6)Gal, соединение, в котором часть Sia(α2,3)Gal является Sia(α2,6)Gal вместо Sia(α2,3)Gal.

В данном документе Gn или GlcNAc обозначают N-ацетилглюкозамин, Man обозначает маннозу, a Gal обозначает галактозу.

«Гликозилированная аминокислота» в данном документе обозначает аминокислоту, имеющую связанную с ней сахарную цепь, примеры которой могут включать N-связанные и O-связанные сахарные цепи, описанные выше. Сахарная цепь и аминокислота могут быть связаны через линкер. КУчасток связывания между сахарной цепью и аминокислотой никак конкретно не огрнаеичивается, но предпочтительно, если аминокислота связана с восстанавливающим концом сахарной цепи.

Тип аминокислоты, с которой связана сахарная цепь, никак конкретно не ограничен, примеры включают предпочтительно Asn, Ser, Cys, и Lys, более предпочтительно - Asn.

Если сахарная цепь и аминокислота связаны через линкер, то тип линкера никак конкретно не ограничен, примеры могут включать NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂- (где а обозначает число, которое не ограничено при условии, что оно не затрудняет основную функцию линкера, предпочтительно число от 0 до 4), C_1-10 полиметилен, и -CH₂-R- (где R является группой, полученную из группы, от которой отсоединен водород, которая выбрана из групп, включающих алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, карбоциклическую группу, замещенную карбоклическую группу, гетероциклическую группу и замещенную гетероциклическую группу).

«Сиалированная сахарная цепь» в данном документе обозначает сахарную цепь, имеющую сиаловую кислоту, по меньшей мере, на одном из невосстанавливающих концов вышеуказанной сахарной цепи. Соответственно, например, в случае тетраантенарной аспарагин-связанной сахарной цепи, она содержит тетрасиало, трисиало, дисиало или моносиало форму, имеющую одну или большее количество сиаловых кислот на невосстанавливающем конце, в случае триантенарной аспарагин-связанной сахарной цепи, она содержит трисиало, дисиало или моносиало форму, имеющую одну или большее количество сиаловых кислот на невосстанавливающем конце, а в случае биантенарной аспарагин-связанной сахарной цепи, она содержит дисиало или моносиало форму, имеющую одну или большее количество сиаловых кислот на невосстанавливающем конце. Более того, положение невосстанавливающего конца, на котором находится сиаловая кислота, не ограничено.

«Сиаловая кислота» в данном документе является названием семейства, которое, в общем, относится к веществу, в котором замещена амино или гидроксигруппа нейраминовой кислоты. Кроме того, «нейраминовая кислота» является особой нонозой, имеющей аминогруппу и карбоксильную группу в молекуле, и изображенной в представленной ниже формуле.

Химическая формула 7

Что касается структуры сиаловой кислоты, то известными заменами аминогруппы для вышеуказанной нейраминовой кислоты являются ацетилирование или гликозилирование аминогруппы, а также, например, деаминирование, при котором отсоединяется аминогруппа, а известными заменами гидроксигруппы являются, например, ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и лактилирование, без ограничения перечисленным.

Что касается добавления сахарной цепи, которое происходит в природе, то N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac), которая является наиболее широко распространенной в природе, и N-гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc), которая является следующей наиболее широко распространенной, являются предпочтительными в качестве сиаловой кислоты, которая присутствует на невосстанавливающем конце сахарной цепи. В частности, в том, что качается добавления сахарной цепи, которое происходит в природе в виде человеческого гликопротеина, N-ацетилнейраминовая кислота является более предпочтительной.

«Сиалилгликозилированная аминокислота» в данном документе относится к вышеуказанной гликозилированной аминокислоте, имеющей сиалированную сахарную цепь, имеющую сиаловую кислоту, прикрепленную, по меньшей мере, к одному невосстанавливающему концу сахарной цепи.

Сиалилгликозилированная аминокислота, используемая в настоящем изобретении, которая может быть использована, является аминокислотой, которая очищена и процессирована из натурального продукта, гликопротеинов, синтезированных в экспрессирующей системе и затем очищенных, или аминокислот, были химически или ферментативно синтезированы, а также, например, аминокислот, которые дополнительно подвергнуты реакции элонгации сахарной цепи. Реакция элонгации сахарной цепи может быть осуществлена путем подбора фермента, который катализирует образование указанной гликозидной связи согласно виду связывания гликозидов искомой структуры сахарной цепи, с последующим осуществлением вышеуказанной реакции согласно порядку связывания сахаров, которые составляют сахарную цепь.

Пример способа выделения сиалилгликозилированной аминокислоты из природного продукта может включать способ, описанный в публикации японского патента № 2003-128703, описание которой включено в данный документ полностью. Согласно способу, разработанному авторами, очень легко, по сравнению с обычными способами, могут быть получены различные выделенные гликоаспарагиновые производные.

Этот способ, например, является способом изготовления гликоаспарагинового производного полученного из гликоаспарагина, включающим стадии:

(a) введения липофильной защитной группы, в гликоаспаргин, содержащийся в смеси, включающей один или два или большее количество типов гликоаспарагинов, для получения смеси производных гликоаспарагина, и

(b) проведения хроматографии смеси, полученной гидролизом указанной смеси производных гликоаспарагина, или производного гликоаспарагина, содержащегося в указанной смеси производных гликоаспарагина, для разделения каждого производного гликоаспарагина.

Одной из основных характеристик способа изготовления гликоаспарагинового производного является, например, введение (связывание) липофильной защитной группы в гликоаспарагин, полученный из природного гликопротеина, предпочтительно в указанный гликоаспарагин, содержащийся в смеси гликоаспарагинов, полученных из аспарагин-связанных сахарных цепей, для получения смеси производных гликоаспарагина, а последующее разделение указанной смеси на отдельные производные гликоаспарагина.

Более того, при получении сиалилгликозилированной аминокислоты, используемой в настоящем изобретении, также можно добавить сиаловую кислоту на невосстанавливающий конец сахарной цепи гликозилированной аминокислоты, выделенной из натурального продукта или химически/ферментативно синтезированной гликозилированной аминокислоты, с помощью способа, хорошо известного специалистам в данной области. Например, при использовании ЦМФ-сиаловой кислоты и сиалилтрансферазы сиаловая кислота может быть перенесена на невосстанавливающий конец сахарной цепи для получения сиалилгликозилированной аминокислоты.

«Сиалилтрансфераза» в данном документе относится к ферменту, который является типом гликозилтрансферазы, которая катализирует реакцию (именуемую в дальнейшем «реакцией переноса сиаловой кислоты») переноса остатка сиаловой кислоты с ЦМФ-сиаловой кислоты, которая является гликозильным донором (также именуемым донорным субстратом) на структуру сахарной цепи, которая является гликозильным акцептором (также именуемым рецепторным субстратом). Известно, что сиалилтрансфераза переносит сиаловую кислоту на невосстанавливающий конец сахарной цепи. Реакция переноса сиаловой кислоты может быть показана представленной ниже формулой реакции. Если вместо сахарной цепи используется производное сахарной цепи, то сахарная цепь в формуле может быть заменена на производное сахарной цепи:

Уравнение 1

где сиаловая кислота - сахарная цепь служит для обозначения соединения, имеющего сиаловую кислоту на невосстанавливающем конце сахарной цепи, присоединенную гликозидной связью.

Известно, что сиалилтрансфераза переносит например, в положение 3 или 6 галактозы, положение 6 N-ацетилгалактозамина или положение 8 сиаловой кислоты, которые присутствуют на невосстанавливающем конце сахарной цепи. Например, фермент, который переносит сиаловую кислоту в положение 3 галактозы, называется α-2,3 сиалилтрансферазой, фермент, который переносит сиаловую кислоту в положение 6 галактозы или N-ацетилгалактозамин, называется α-2,6 сиалилтрансферазой, а фермент, который дополнительно переносит сиаловую кислоту в положение 8 силаловой кислоты, называется α-2,8 полисиалилтрансферазой.

Известными сиалилтрансферазами являются те, которые получены из бактерий, а также из радужной форели и млекопитающих, а белки, обладающие сиалилтрансферазной активностью, также были обнаружены в растениях. В частности, в отношении происходящего в природе добавления сахарной цепи, предпочтительны те, что получены из млекопитающих, а при происходящем в природе создании гликопротеина, такого как человеческий гликопротеин или его сахарная цепь, более предпочтительны те, что получены из человека.

Известными α-2,6 сиалилтрансферазами, которые получены из человека, являются, например, ST6Gal-I (иногда обозначаемую как ST6Gall, тоже самое применимо ниже) и ST6Gal-II в качестве ферментов, которые переносят в положение 6 галактозы, а также ST6GalNAc-I, ST6GalNAc-II, ST6GalNAc-III, и ST6GalNAc-IV в качестве ферментов, которые переносят в положение 6 N-ацетилгалактозамина.

Известными α-2,3 сиалилтрансферазами, которые получены из человека, являются, например, ST3Gal-I - ST3Gal-VI, ферменты, которые переносят в положение 3 галактозы.

«ЦМФ-сиаловая кислота» в данном документе обозначает цитидин 5′-монофосфосиаловую кислоту, и относится к тем, что имеют структуру, полученную при конденсации с дегидратацией гидроксигруппы в положении 2 сиаловой кислоты с фосфатной группой цитидинмонофосфата (ЦМФ). Примеры ЦМФ-сиаловой кислоты с более конкретно определенной сиаловой кислотой включают ЦМФ-N-ацетилнейраминовую кислоту (ЦМФ-Neu5Ac) и ЦМФ-N-гликолинейраминовую кислоту (ЦМФ-Neu5Gc). В настоящем описании ЦМФ-сиаловая кислота, используемая в настоящем изобретении при получении существующего в природе гликопротеина или его сахарной цепи, предпочтительно является ЦМФ-N-ацетилнейраминовой кислотой (ЦМФ-Neu5Ac) и ЦМФ-N-гликонейраминовой кислотой (ЦМФ-Neu5Gc), а, в частности при получении существующего в природе гликопротеина, такого как человеческий гликопротеин или его сахарная цепь, ЦМФ-N-ацетилнейраминовая кислота (ЦМФ-Neu5Ac) является более предпочтительной.

Более того, сиаловая кислота в данном документе включает производное сиаловой кислоты, и то, что имеет производное сиаловой кислоты, связанное с невосстанавливающим концом сахарной цепи, также может быть использовано. Производные сиаловой кислоты включают те, которые имеют гидроксильную группу, связанную с углеродом в положениях 7, 8 и 9 сиаловой кислоты, замещенной водородом или атомом галогена. Примеры атома галогена могут включать фтор, хлор и бром, а предпочтительно - фтор.

Производное сиаловой может быть перенесено на невосстанавливающий конец сахарной цепи с помощью вышеуказанной трансферазы с получением «производного ЦМФ-сиаловой кислоты». Перенос производного сиаловой кислоты на невосстанавливающий конец сахарной цепи описан, например, в международной публикации № 2004/058984, описание которой включено в данный документ полностью.

В одном аспекте настоящего изобретения если гликозилированная аминокислота, имеющая сиаловую кислоту, является аспарагин-связанной сахарной цепью, то она может иметь или может не иметь разветвленную структуру, при условии, что она содержит сиаловую кислоту, по меньшей мере, на одном из невосстанавливающих концов. Кроме того, разветвленная структура ничем особенным не ограничена, и выбрана из биантенарной, триантенарной или тетраантенарной. Кроме того, если аспарагин-связанная сахарная цепь имеет разветвленную структуру, то может быть необходимо, чтобы сиаловая кислота находилась, по меньшей мере, на одном невосстанавливающем конце, и в зависимости от количества невосстанавливающих концов, может содержать сиаловую кислоту на одном, двух, трех или всех концах.

В одном аспекте настоящего изобретения, если гликозилированная аминокислота, имеющая сиаловую кислоту, является аспарагин-связанной сахарной цепью, то предпочтительно, если сахарная цепь содержит 4 или большее количество, например, 5 или большее количество, 7 или большее количество, а предпочтительно 9 или большее количество сахаров в одной сахарной цепи.

В одном аспекте настоящего изобретения если гликозилированная аминокислота имеющая сиаловую кислоту, является аспарагин-связанной сахарной цепью, то эта сахарная цепь имеет 5-11, 9-11 или 9 сахаров в одной сахарной цепи.

В одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения, если гликозилированная аминокислота, имеющая сиаловую кислоту, является аспарагин-связанной сахарной цепью, то сахарная цепь представлена следующей формулой (7):

Химическая формула 8

где один из R³ и R⁴ является формулой (3), а другой являются атомом водорода или группой, представленной в формулах (3)-(6).

Химическая формула 9

Химическая формула 10

Химическая формула 11

Химическая формула 12

Сиалилгликозилированную аминокислоту, полученную с помощью вышеуказанного способа, получают так, что аминогруппа аминокислоты была защищена Вос-группой, а карбоксильная группа сиаловой кислоты, расположенная в невосстанавливающем конце сахарной цепи, была защищена фенацильной группой, перед использованием в способе твердофазного синтеза настоящего изобретения.

«Фенацил» в данном документе представлен следующей формулой (при условии, что Х является атомом водорода).

Химическая формула 13

Кроме того, примеры фенацильного производного, подходящего для настоящего изобретения, включают те, что имеют вышеуказанную формулу, в которой Х=Cl или Br.

«Фенацильная группа» в данном документе представлена следующей формулой.

Химическая формула 14

Введение Вос-группы в аминогруппу сиалилгликозилированной аминокислоты может быть осуществлено обычным известным способом. Например, она может быть введена путем добавления N-(трет-бутиоксикарбонилокси)сукцинимида (Boc-OSu) или ди-трет-бутил дикарбоната [(Вос)₂O] в ДМСО в присуствствии основания (такого как триэтиленамин и диизопропилэтиленамин). Условия реакции ничем конкретным не ограничены и, например, она может быть проведена при комнатной температуре в течение нескольких часов (1-5 часов).

Кроме того, когда производное Вос-сиалилгликозилированной аминокислоты выделяют введением Boc в природный продукт, полученное может быть использовано для способа твердофазного синтеза настоящего изобретения путем введения фенацильной группы прямо в производное Вос-сиалилгликозилированной аминокислоты.

Введение фенацильной группы в производное сиалилгликозилированной аминокислоты может быть проведено, например, предварительным растворением производного гликозилированной аминокислоты в 5 мМ карбонате цезия, лиофилизирования полученного, добавления ДМФА, а затем фенацилбромида к полученному лиофилизированному порошку, и перемешивания при комнатной температуре в течение 6 часов или дольше. рН при растворении в карбонате цезия предпочтительно находится в диапазоне 3-8, предпочтительно в диапазоне 3-4,5, наиболее предпочтительно - 3,6.

Более того, например, если Fmoc вводят в смесь встречающихся в природе сахарных цепей, содержащую искомую сахарную цепь, и выделенное Fmoc-производное сиалилгликозилированной аминокислоты используется в качестве первичного материала, производное сиалилгликозилированной аминокислоты, имеющей аминогруппу аминокислоты, защищенной Вос-группой, и карбоксильную группу сиаловой кислоты, защищенную фенацильной группой, может быть изготовлено способом, включающим стадии:

(a) защиты карбоксильной группы сиаловой кислоты Fmoc-производного сиалилгликозилированной аминокислоты с помощью фенацильной группы,

(b) отсоединения Fmoc указанного Fmoc-производного сиалилгликозилированной аминокислоты, и

(c) введения Вос-группы в сиалилгликозилированную аминокислоту, полученную в вышеуказанной стадии.

Вышеуказанные стадии (а)-(с) могут быть проведены способом, описанным в данном документе или другим, широко известным в данной области.

При использовании Вос-производного сиалилгликозилированной аминокислоты, имеющего сиаловую кислоту, защищенную фенацильной группой, полученной, как указано выше для твердофазного синтеза с Boc, может быть прямо получен гликопептид, имеющий сиаловую кислоту на невосстанавливающем конце сахарной цепи.

Способ твердофазного синтеза

Твердофазный синтез настоящего изобретения может быть проведен согласно хорошо известному способу или способу, похожему на него.

Например, негликозилированный фрагмент может быть синтезирован в виде любой аминокислотной последовательности по следующим стадиям (1)-(4).

(1) Гидроксильная группа смолы, имеющей гидроксильную группу и карбоксильная группа аминокислоты, азот аминогруппы которой защищен Вос-группой подвергаются реакции этерификации. В этом случае, поскольку азот аминогруппы аминокислоты защищен Вос-группой, самоконденсация между аминокислотами предотвращается, а гидроксильная группа смолы и карбоксильная группа аминокислоты реагируют, и происходит этерификация.

(2) Вос-группа эфира, полученного выше, отсоединяется с образованием свободной аминогруппы.

(3) Следующие стадии (i) и (ii) проводятся, по меньшей мере, один раз. Это позволяет присоединить любое количество произвольных аминокислот, и получить пептид, связанный со смолой С-концом и имеющий свободную аминогруппу на N-конце.

(i) Эту свободную аминогруппу и карбоксильную группу произвольной аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищен липофильной защитной группой, подвергают реакции амидирования.

(ii) Вышеуказанная Вос-группа отсоединяется от свободной аминогруппы.

(4) Смолу расщепляют кислотой.

Кроме того, в случае гликозилированного фрагмента, может быть использован способ, описанный, например, в международной публикации № 2004/005330 (US2005222382 (А1)), описание которого включено в данный документ ссылкой во всей полноте.

В частности, после синтеза с С-конца (аминокислотного остатка), прилегающего к аминокислоте, гликозилированной в вышеуказанных стадиях (1)-(3), карбоксильная группа производного сиалилгликозилированной аминокислоты, имеющей защищенную Вос-группой аминогруппу и карбоксильную группу сиаловой кислоты, защищенную фенацильной группой, подвергается реакции амидирования со свободной аминогруппой (3), а затем Вос-группа производного сиалилгликозилированной аминокислоты отсоединяется с образованием свободной аминогруппы.

Затем сиалилгликозилированный пептид, имеющий любую аминокислотную последовательность с сахарной цепью, добавленной в любое положение, может быть получен повторением вышеуказанной (3) необходимое количество раз, и конечным расщеплением смолы с помощью кислоты.

Кроме того, сиалилгликозилированный пептид, имеющий сахарную цепь, добавленную к C-концевой аминокислоте, может быть получен, если гидроксильная группа смолы, имеющей гидроксильную группу, подвергается реакции этерификации с карбоксильной группой производного сиалилгликозилированной аминокислоты, имеющей защищенный с помощью Вос-группы азот аминогруппы, и карбоксильной группы сиаловой кислоты, защищенной с помощью фенацильной группы в вышеуказанной стадии (1).

Кроме того, сиалилгликозилированный пептид, имеющий сахарную цепь, добавленную к N-концевой аминокислоте, может быть получен, если синтез прекращается непосредственно после связывания производного сиалилгликозилированной аминокислоты, имеющего защищенный Вос-группой азот аминогруппы, с последующим расщеплением смолы с помощью кислоты.

Стадия связывания сиалилгликозилированной аминокислоты может быть проведена любое количество раз, т.е., по меньшей мере, один раз или большее количество раз. Если ее проводят множество раз, то стадия связывания сиалилгликозилированной аминокислоты может быть непрерывной или не непрерывной, и может быть соответствующим образом задана так, чтобы добавление могло быть осуществлено в любом положении аминокислотной последовательности целевого гликопептида.

В одном аспекте настоящего изобретения целевой гликопротеин может быть получен разделением на несколько фрагментом, синтеза каждого фрагмента и связывания их лигированием.

В одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения структура изготовленной сиалильной сахарной цепи, может быть фактически единообразной. Структура фактически единообразной сахарной цепи в данном документе означает, что участок гликозилирования, типы каждого из сахаров, входящих в состав сахарной цепи, порядок связывания, и вид связывания между сахарами являются идентичными, при сравнении между гликопептидами, имеющими сиалированную сахарную цепь, и, по меньшей мере, 90% или больше, предпочтительно 95% или больше, более предпочтительно 99% или больше структуры сахарной цепи является единообразной. Гликопептид, имеющий единообразные сахарные цепи, является постоянным по качеству, и является особенно предпочтительным в областях, таких как изготовление фармацевтических агентов или тестов. Доля единообразных сахарных цепей может быть измерена способами, использующими, например, ВЭЖХ, капиллярный электрофорез, ЯМР, и масс-спектрометрию. Изготовление сахарной цепи, имеющей единообразную структуру сахарной цепи, описана в международной публикации № 03/008431 (US2004181054 (А1)), международной публикации № 2004/058984 (US2006228784 (A1)), международной публикации № 2004/058824 (US2006009421 (A1)), международной публикации № 2004/070046 (US2006205039 (A1)), и международной публикации № 2007/011055, описания которых включены в данный документ полностью ссылкой.

Смола, имеющая гидроксильную группу, может быть любой смолой, имеющей гидроксильную группу, обычно используемую в твердофазном синтезе, и, например, может быть использована смола «Amino-PEGA» (Merck), смола «Wang» (Merck), смола «HMPA-PEGA» (Merck) и смола «НМРВ-PEGA» (Merck). Смола «HMPB-PEGA» является предпочтительной в отношении осуществления тиоэтерификации после твердофазного синтеза.

Любая аминокислота может быть использована в качестве аминокислоты, примеры которой включают природные аминокислоты серии (Ser), аспарагин (Asn), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), аланин (Ala), тирозина (Tyr), глицин (Gly), лизин (Lys), аргинин (Arg), гистидин (His), аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu), глутамин (Gln), треонин (Thr), цистеин (Cys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp) и пролин (Pro). Примеры неприродной аминокислоты включают D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот; норлейцин, β-аланин и орнитин.

Из-за того, что способ твердофазного синтеза настоящего изобретения использует защиту с Вос-группой в качестве защитной группы аминогруппы аминокислоты, и отсоединяет Вос-группу в кислых условиях после твердофазного синтеза, то возможно синтезировать гликопептид с помощью лабильной к щелочам неприродной аминокислоты. «Лабильная к щелочам неприродная аминокислота» в данном документе относится к неприродной аминокислоте, химическая структура которой коллапсирует, например, разрушением химической связи в щелочных условиях, в частности в условиях снятия Fmoc в способе твердофазного синтеза с Fmoc. Поэтому, поскольку способ твердофазного синтеза с Boc не использует основание, как показано выше, лабильный к щелочам пептидный тиоэфир может быть получен напрямую в твердофазном синтезе.

Вос-группа может быть введена в условиях, сходных с условиями для введения в вышеуказанную сиалилгликозилированную аминокислоту.

При этом способ твердофазного синтеза, использующий Вос-группу в качестве липофильной защитной группы, называют способом твердофазного синтеза с Boc.

В случае аминокислот, защищенных Вос-группой, вышеуказанная аминокислота может быть изготовлена с помощью вышеуказанного способа. Также могут быть использованы коммерчески доступные аминокислоты. Примеры могут включать oBoc-Ser, Boc-Asn, Boc-Val, Boc-Leu, Boc-Ile, Boc-Ala, Boc-Tyr, Boc-Gly, Boc-Lys, Boc-Arg, Boc-His, Boc-Asp, Boc-Glu, Boc-Gln, Boc-Thr, Boc-Cys, Boc-Met, Boc-Phe, Boc-Trp и Вос-Pro. Более того, неприродная аминокислота, защищенная Вос-группой, может быть изготовлена способом, сходным с защитной аминокислот. Также могут быть использованы коммерчески доступные аминокислоты.

Кроме того, примеры аминокислоты, защищенной липофильной защитной группой, имеющей защитную группу, введенную в боковую цепь, может включать Вос-Arg(di-Z), Boc-Asn(Xan), Boc-Asp(Bn), Boc-Cys(Acm), Boc-Glu(Bn), Boc-His(DNP), Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Ser(Bn), Boc-Thr(Bn), Boc-Trp(CHO) и Boc-Tyr(Br-Z).

Кроме того, Thz в данном документе служит для обозначения тиазолидинового производного Cys (Тиазолидин-4-карбоновая кислота). Помимо этого (di-Z) служит для обозначения дикарбобензоксигруппы (N,N-бис-(бензилоксикарбонил)-), (Xan) служит для обозначения а ксантиловой группы, (Bn) служит для обозначения бензиловой группы, (Acm) служит для обозначения ацетамидометильной группы, (tBu) служит для обозначения трет-бутильной группы, (Trt) служит для обозначения тритильной группы, (DNP) служит для обозначения 2,4-динитрофенильной группы, (Cl-Z) служит для обозначения [(2-хлорфенил)метокси]карбонильной группы, а (СНО) служит для обозначения формильной группы.

Широко известные агенты конденсации с дегидратацией, такие как 1-мезитиленсульфонил-3-нитро-1,2,4-триазол (MSNT), дициклогексилкарбодиимид (DCC) и диизопропилкарбодиимид (DIPCDI) могут быть использованы в качестве катализатора этерификации. Соотношение между аминокислотой и агентом конденсации с дегидратацией составляется 1 часть массы первой, как правило, 1-10 частям массы, предпочтительно 2-5 частей массы последнего.

Реакция этерификации предпочтительно проводится, например, путем помещения смолы в твердофазную колонку, промывки смолы растворителем и последующим добавлением раствора аминокислот. Примеры промывочного растворителя могут включать диметилформамид (ДМФА) и метиленхлорид. Примеры растворителя для растворения аминокислоты могут включать диметидсульфоксид (ДМСО), ДМФА и метиленхлорид. Реакция этерификации может быть проведена при 0-50°С, предпочтительно при комнатной температуре в течение от около 10 минут до около 2 часов, предпочтительно около 5-15 минут.

Также предпочтительно ацетилировать непрореагировавшую гидроксильную группу на твердой фазе в этот момент времени, например, уксусным ангидридом для кэпирования.

Отсоединение Вос-группы может быть проведено, например, обработкой кислотой. Примеры кислоты включают раствор 10% серной кислоты/диоксана, 50% трифторуксусной кислоты/метиленхлорида и p-толуолсульфоновой кислоты/тетрагидрофуранметиленхлорида.

Реакция амидирования свободной аминогруппы с карбоксильной группой произвольной аминокислоты, имеющей защищенный с помощью Вос-группы азот аминогруппы, предпочтительно проводится в присутствии активатора и растворителя.

Примеры активаторов могут включать дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид (WSC/HCl), дифенилфосфорилазид (DPPA), карбонилдиимидазол (CDI), диэтилцианофосфонат (DEPC), диизопропилкарбодиимид (DIPCI), бензотриазол-1-илокси-трис-пирролидинофосфония гексафторфосфат (РуВОР), 1-гидроксибензотриазол (HOBt), гидроксисукцинимид (HOSu), диметиламинопиридин (DMAP), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt), гидроксифталимид (HOPht), пентафторфенол (Pfp-OH), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (HBTU), О-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (HATU), О-бензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат (TBTU) и 3,4-дигидро-3-гидроди-4-окса-1,2,3-бензотриазин (Dhbt).

Количество используемого активатора предпочтительно составляет 0,8-10 эквивалентов, предпочтительно 0,8-2 эквивалента, более предпочтительно, 0,95 эквивалента относительно произвольной аминокислоты, имеющей защищенный Вос-группой азот аминогруппы.

Примеры растворителя могут включать ДМСО, ДМФА и метиленхлорид. Реакция может быть проведена при 0-50°С, предпочтительно при комнатной температуре в течение от около 10 минут до около 2 часов, предпочтительно около 5-15 минут.

Предпочтительно, если пептидная цепь отщепляется от смолы путем обработки кислотой. Примеры кислоты могут включать сверхсильные кислоты, такие как трифторуксусную кислоту/трифторметансульфоновую кислоту (TfOH), плавиковую кислоту (HF), метансульфоновую кислоту, и смесь трифторуксусной кислоты/трифторметансульфоновой кислоты/диметилсульфида/m-крезола.

Сахарная цепь, используемая в настоящем изобретении, может иметь защищенную гидроксильную группу на сахарной цепи. Примеры защитной группы могут включать ацетильную группу и триэтилсилильную группу. Предпочтительно, если защитная группа, которая может быть обработана кислотой одновременно с отщеплением синтезированного гликопептида, и их пример, может включать триэтилсилильную группу.

В настоящем изобретении в способе твердофазного синтеза может быть предпочтительным использование микроволнового способа. Пример микроволнового способа описан в Bacsa В. et aL, J. Org. Chem. (2008) 73:7532-7542, описание которой включено в данный документ ссылкой во всей полноте.

Микроволновой способ является способом облучения микроволнами в стадии конденсации аминокислот или стадии снятия защиты для решения проблем, основанных, например, на внутримолекулярной агрегации или образовании вторичной структуры, и стерического блокирования из-за защитной группы, и является полезным при синтезе пептида, который сложно синтезировать обычным способом, в частности, длинноцепочечного пептида. Условие облучения микроволнами могут быть соответствующим образом определены специалистами в данной области согласно аминокислотной последовательности, с тем, чтобы побочные реакции, происходящие из-за применения нагревания или энергии в ходе реакции, были предотвращены.

C-концевая тиоэтерификация

Кроме того, один аспект настоящего изобретения может давать гликопептидные фрагменты для связывания лигированием для изготовления представляющего интерес гликопротеина. Другими словами C-конец изготовленного гликопептидного фрагмента, имеющего сиалированную сахарную цепь, может быть подвергнут тиоэтерификации, т.е. α-карбокситиоэфирная составляющая может быть образована на C-конце, для лигирования. Широко известный способ или способ, схожий с ним, может быть использован в способе изготовления пептидных фрагментов (или гликопептидных фрагментов), имеющих α-карбокситиоэфирную составляющую, -C(=O)-SR, на C-конце. Такой способ описан, например, в международной публикации № 96/34878 (Патент США № 6184344), описание которой включено в данный документ полностью ссылкой.

R в данном документе ничем конкретным не ограничен, при условии, что является группой, которая не ингибирует реакцию обмена тиолов и становится замещаемой группой в реакции нуклеофильного замещеения на карбонильный углерод, но может быть предпочтительно выбрана, например, из бензил-типа, такого как бензилмеркаптан, арил-типа, такой как тиофенол и 4-(карбоксиметил)-тиофенол, и алкил-типа, такой как соль 2-меркаптоэтансульфоната и 3-меркаптопропионовый амид.

Примеры способа изготовления пептидного фрагмента, имеющего α-карбокситиоэфирную составляющую на C-конце, включает, в частности, способ осуществления тиоэтерификации при отщеплении пептида от твердой фазы, или способ тиоэтерификации C-концевой карбоксильной группы пептида после отщепления пептида от твердой фазы. Как способ осуществления тиоэтерификации при отщеплении пептида от твердой фазы, например, известен способ, в котором используется надежно связанный линкер (сульфамидный линкер) на твердофазной смоле для изготовления пептида и для реакции тиольного соединения с ним (J. Am. Chem. Soc., (1999) 121:11369-11374, Angew. Chem. Int. Ed., (2005) 44:1650-1654).

Однако требуется алкилировать сульфамидный линкер в вышеуказанном способе и существуют ограничения, которые заключаются в том, что эффективность алкилирования низкая, а используемая смола - дорогая.

Другим способом изготовления пептидного фрагмента, имеющего α-карбоксиэфирную составляющую на С-конце, является способ получения тиоэфирной формы при отщеплении пептида от смолы путем присоединения тиоэфирной формы со смолой в начале твердофазного синтеза. Этот способ не может быть применен в способе твердофазного синтеза с Fmoc, который требует щелочи для реакции отсоединения липофильной защитной группы, но может быть применен в способе твердофазного синтеза с Boc по настоящему изобретению. Например, может быть получен пептидный тиоэфир, если пептид, полученный на смоле, отщепляется, путем связывания аминокислот после связывания меркаптопропионовой кислоты через тиоэфир со смолой.

В одном аспекте настоящего изобретения стадия получения гликопептидного фрагмента и стадия тиоэтерификации C-конца гликопептидного фрагмента могут быть проведены одновременно.

Как способ одновременного проведения стадии приготовления гликопептидного фрагмента и стадии тиоэтерификации С-конца гликопептидного фрагмента, например, может быть получен химерный белок, имеющий аминокислотную последовательность интеина, добавленного на C-концевую часть каждого пептида, и интеин может быть отщеплен реакцией интеина с одновременной тиоэтерификацией C-конца фрагмента. Такой способ описан, например, в Muralidharan V, et al. (Nature Methods (2006) Vol.3 №6 429-438), описание которого полностью включено в данный документ ссылкой.

Гликопептидный фрагмент также может быть соединен с помощью KCL-способа. Когда используется способ KCL, тиоэфир на С-конце первого гликопептидного фрагмента может быть предоставлен в виде тиоэфира, имеющего более высокую способность к отсоединению, чем тиоэфир на С-конце второго гликопептидного фрагмента. Таким образом, второй гликопептидный фрагмент может быть связан с С-концом первого гликопептидного фрагмента из-за разницы в скорости реакции, а выработка неправильно связанного побочного продукта и т.п. может быть подавлена.

В общем, поскольку реактивность тиольных групп находится в порядке тиольная группа > тиольная группа бензил-типа > тиольная группа алкил-типа, согласно этому порядку, тиольная группа, имеющая более высокую реактивность, чем C-конец одного пептидного фрагмента предоставляется на С-конце другого пептидного фрагмента.

Например, предпочтительными являются комбинация С-конца первого гликопептидного фрагмента, являющегося тиофенильным эфиром и С-конца второго гликопептидного фрагмента, являющего этиловым тиоэфиром; комбинация С-конца первого гликопептидного фрагмента, являющегося 4-меркаптфенильным тиоэфиром (МРАА) и С-конца второго гликопептидного фрагмента, являющегося бензильным тиоэфиром; и комбинация С-конца первого гликопептидного фрагмента, являющегося тиофенильным эфиром и С-конца второго гликопептидного фрагмента, являющегося меркаптоэтансульфонильным эфиром.

В случае необходимости -SH группа N-концевого Cys на гликопептидном фрагменте также может быть защищена защитной группой. Например, -SH группа может быть защищена в виде тиазолидина. Эта защитная группа снимается в желаемый период времени перед реакцией дотирования. Например, защитная группа, которая естественным образом снимается в условиях лигирования, такая как дисульфидная группа, может быть напрямую использована в проходящей далее реакции лигирования без снятия защиты. Защита дисульфидной группы легко снимается в реакционных условиях дальнейшего способа лигирования.

Стадия связывания путем лигирования)

В одном аспекте настоящего изобретения гликопептидный фрагмент, изготовленный способом по настоящему изобретению, может быть связан с другим пептидным фрагментом или другим гликопептидным фрагментом способом, хорошо известным специалистам в данной области. Другой используемый пептидный фрагмент и другой используемый гликопептидный фрагмент может быть фрагментом, полученный способом, не ограниченным способом твердофазного синтеза с Boc, но также способом хорошо известным специалистам в данной области, таким как способ твердофазного синтеза с Fmoc, а также другим химическим синтезом и биосинтезом.

Например, при необходимости два гликопептидных фрагмента смешиваются в растворе, таком как 100 мМ фосфатный буфер, в присутствии каталитического тиола, такого как 4-меркаптофенилуксусная кислота, бензилмеркаптан и тиофенол. Предпочтительно, если реакция проводится при соотношении 0,5-2 эквивалента второго гликопептидного фрагмента и около 5 эквивалентов каталитического тиола к 1 эквиваленту первого гликопептидного фрагмента. Реакцию предпочтительно проводят в условиях рН около 6,5-7,5 и при около 20-40°С в течение около 1-30 часов. Прогресс реакции может быть подтвержден с помощью широко известного способа, объединяющего ВЭЖХ и МС, и т.п.

К этой смеси добавляли восстановитель, такой как трис-2-карбоксиэтил фосфин гидрохлорид (ТСЕР), чтобы подавить побочные реакции, и очищали по желанию, чтобы осуществить связывание первого и второго пептидных фрагментов.

Помимо этого, KCL-способ является опубликованным Kent NCL-способом с кинетическим контролем реакции (Kent et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3985-3988). NCL-способ является способом, в котором С-конец одного из двух связываемых фрагментов является карбоксильной группой, а C-конец другого является тиоэтерифицированным, а другой фрагмент связан с C-концевой стороной тиоэтерифицированного фрагмента. С другой стороны KCL-способ может быть использован, когда оба связываемых фрагмента тиоэтерифицированы, а тиоэфир с более высокой способностью к отсоединению будет подвергнут реакции связывания.

Как описано выше, реактивность тиольных групп в целом находится в порядке арилтиольная группа > тиольная группа бензил-типа > тиольная группа алкил-типа. Соответственно, C-концевой тиоэфир -C(=O)-SR имеет наиболее высокую способность отсоединения, если R является арильной группой, затем если R является бензильной группой, а затем если R является алкильной группой. Путем определения тиоэфира каждого фрагмента, на основании этого, каждый фрагмент может быть связан в желаемом порядке. Например, если один является тиофенильным эфиром, а другой является этильным тиоэфиром, первым реакции связывания подергают тиофенильный эфир, и получают пептид, имеющий этильный тиоэфир на C-конце. Если один является 4-меркаптофенильным тиоэфиром (МРАА), а другой является бензильным тиоэфиром, МРАА реагирует первым для получения пептида, имеющего бензильный тиоэфир на С-конце, а если один является тиофенильным эфиром, а другой является меркаптоэтансульфонильным эфиром, тиофенильный эфир реагирует первым для получения пептида, имеющего меркаптоэтансульфонильный эфир на С-конце.

По этой причине, поскольку пептидная цепь, полученная KCL-способом, имеет тиоэфир на С-конце, пептидная цепь может быть прямо использована для лигирования с другим фрагментом.

Стадия сворачивания

Кроме того, в другом аспекте настоящего изобретения, после изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, фрагменты могут быть обработаны так, чтобы они связывались и сворачивались для принятия подходящей конформации.

Различные широко известные способы могут быть использованы для стадии сворачивания; например, она может быть проведена диализом в буфере для сворачивания. Буфер для сворачивания содержит, например, соединение, имеющее гуанидино группу, такую как гуанидин, или его соль, и может иметь рН между 6,0 и 9,0. Диализ может быть осуществлен множество раз, в каждом случае композиция или рН буфера для каждой обработки диализом может быть одними и теми же или различными.

Сворачивание пептида может быть подтверждено любым способом анализа конформации полипептида, примеры, которого включают, без ограничения перечисленным, способ картирования дисульфидов, оценка связывания с антителом, специфичным к конформационному эпитопу, и рентгеновский анализ.

Термины, используемые в данном документе, используются для описания конкретных воплощений, и не предназначены для ограничения изобретения.

Термин «включает», при использовании в данном документе, если контекстом явно не указано иное, предназначен для указания наличия описанных элементов (таких как компоненты, стадии, элементы или номера), не исключая наличия других элементов (таких как компоненты, стадии, элементы и номера).

Если не определено иное, все термины, используемые в данном документе (включая технические и научные термины) имеют такие же значения, что и те, что хорошо известны специалистам в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Термины, используемые в данном документе, если явно не определено иное, следует толковать как имеющие значения, соответствующие значениям в данном документе и в связи с техническими областями, и не должны толковаться как имеющие идеализированное или чрезмерно формальное значение.

Варианты осуществления настоящего изобретения могут быть описаны ссылкой на схематические диаграммы. В случае схематических чертежей, они могут быть представлены в преувеличенном виде для более ясного понимания.

Термины, такие как первый и второй используется для выражения различных элементов, и следует понимать, что эти элементы не ограничены этими терминами. Эти термины используются исключительно в целях различения одного элемент от другого, и, например, можно описать первый элемент как второй элемент, и подобным образом, описать второй элемент как первый элемент без отхода от объема настоящего изобретения.

Настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью Примеров. Однако настоящее изобретение может быть воплощено с различными аспектами, и не должно толковаться как ограниченное Примерами, представленными в данном документе.

Примеры

Пример 1. Синтез Вос-дифенацил-дисиалогликоаспарагина (Вос-дифенацил-дисиалоолиго-аспарагина)

(I) Синтез Fmoc-дифенацил-дисиалогликоаспарагина (Fmoc-дифенацил-дисиалоолиго-аспарагина)

Fmoc-дисиалогликоаспарагин (Fmoc-дисиалоолиго-аспарагин) (20 мг) растворяли в 2 мл ледяной воды. Fmoc-дисиалогликоаспарагин, растворенный в ледяной воде, пропускали через смолу Dowex-50 × 8(H⁺) (10,5 см × 5 см), и лиофилизировали элюированный раствор. Лиофилизированный раствор растворяли в 10 мл воды, и использовали 5 мМ водный раствор карбоната цезия (Cs₂CO₃) для корекции рН раствора до 3,6. Затем снова лиофилизировали раствор. Fmoc-дисиалогликоаспарагин после лиофилизации растворяли в сухом ДМФА (4 мл) и добавляли фенацилбромид (5,7 мг). Через 8 часов диэтиловый эфир (20 мл) добавляли к этому смешанному раствору, и осаждали целевой объект. Полученное фильтровали через фильтровальную бумагу. Оставшийся осадок собирали, раствор вода:ацетонитрил = 7:3 добавляли к преципитату и растворяли, полученное очищали с помощью ВЭЖХ. Вышеуказанные операции позволяют получить целевой Fmoc-дифенацил-дисиалогликоаспарагин (16 мг, 76% выход).

Fmoc-дифенацил-дисиалоолиго-аспарагин

ESI-MS: м/з расчетн. для C₁₉H₁₆₆N₈O₆₈: 2796,6 [М+Н]⁺, 1399,3 [М+2H]²⁺; обнаружено: 2798,2 [М+Н]⁺, 1399,6 [М+2Н]²⁺.

(II) Синтез Вос-дифенацил-дисиалогликоаспарагин (Вос-дифенацил-дисиалоолиго-аспарагин)

К Fmoc-дифенацил-дисиалогликоаспарагин (Fmoc-дифеналицил-дисиалоолиго-аспарагин) (20 мг) добавляли 1-метил пирролидин (75 мкл), гексаметиленимин (2 мкл), и HOBt (2 мг), растворенные в сухом ДМФА (100 мкл), и полученное перемешивали при обычной температуре для растворения. Через 30 минут дополнительно добавляли диэтиловый эфир, и дифенацил-дисиалогликоаспарагин с отсоединенным Fmoc осаждали. Осадок собирали, выпаривали диэтиловый эфир, а затем осадок осаждали в дистиллированной воде. Осадок, растворенный в дистиллированной воде, для очистки пропускали через «Shephadex G-15», а затем элюированный раствор лиофилизировали. Полученный дифенацил-дисиалогликоаспарагин растворяли в ДМФА (1 мл), Boc₂O (4,8 мкл) добавляли и перемешивали при комнатной температуре для введения Вос-группы. Через 4 часа добавляли диэтиловый эфир и собирали осадок. Осадок растворяли в 50 мМ ацетате аммония:воде = 82:17 и очищали с помощью ВЭЖХ. Вышеуказанные действия позволяют получить целевой Вос-дифенацил-дисиалогликоаспарагин (13 мг, выход 68%). Вос-дифенацил-дисиалоолиго-аспарагин

ESI-MS: м/з расчетн. для C₁₀₉H₁₆₄N₈O₆₈: 2674,5 [М+Н]⁺, 1338,2 [М+2H]²⁺; обнаружено: 2675,8 [М+Н]⁺, 1338,4 [M+2H]²⁺.

Пример 2. Синтез Тиоэфирной формы Гликопептида (TN(дифенацил-дисиало сахарная цепь)YSVTDLNY-SR)

I) Получение пептидной цепи

Твердофазный синтез проводили с помощью колонки «Prostyrene» (Tokyo Rika, № 183 470). Смолу «Amino-PEGA» (50 мкл, 1,67 г) помещали в колонку «Prostyrene» и кондиционировали в достаточной степени растворителем ДМФА. Затем раствор S-трилил-3-меркаптопропионовой кислоты (200 мкмоль), HBTU (190 мкмоль), и DIPEA (800 мкмоль), растворенных в ДМФА, добавляли к смоле «Amino-PEGA», и перемешивали при обычной температуре. Через 30 минут смолу отмывали с помощью ДМФА и DCM, и добавляли 95% TFA и 5% TIPS. Через 2 минуты раствор фильтровали, опять добавляли TFA и TIPS, и через 2 минуты смолу промывали ДМФА. К этой смоле добавляли перемешанный раствор Вос-Tyr(OBn)-ОН (200 мМ), HBTU (190 мМ), и DIPEA (400 мМ), растворенных в ДМФА, для того чтобы конденсировать первый аминокислотный остаток, тирозин. Через 20 минут смолу тщательно отмывали с помощью ДМФА и диоксана. Для этой смолы добавляли раствор 10% серной кислоты/диоксана, фильтровали через 5 минут, дополнительно добавляли тот же раствор, перемешивали в течение 30 минут для снятия защиты Вос-группы. Последующие аминокислоты (Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OBn)-OH, Boc-Thr(OBn)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ser(OBn)-OH и Boc-Tyr(OBn)-OH) конденсировали схожим способом.

II) Конденсация сиалилгликозилированной аминокислоты и последующая конденсация аминокислот.

После снятия Вос-группы со смолы, имеющей удлиненный пептидный тиоэфир (2 мкмоль), с помощью вышеуказанного способа, полученное промывали ДМФА и добавляли 5% DIPEA/ДМФА. Через 1 минуту полученное хорошо промывали с помощью ДМФА, добавляли раствор Вос-дифенацил-дисиалогликоаспарагина (4 мкмоль), DEPBT (6 мкмоль), и DIPEA (4 мкмоль), растворенных в ДМФА, и перемешивали при обычной температуре. Через 14 часов смолу хорошо отмывали с помощью ДМФА. В последующей элонгации пептида (Вос-Tyr(OBn)-ОН), конденсацию проводили способом, сходным с вышеуказанным, при концентрации аминокислоты 40 мМ в целях предотвращения побочных реакций гидроксильной группы сахарной цепи.

III) Снятие защиты боковой цепи аминокислоты и отщепление от смолы

После промывки смолы DCM, добавляли охлажденный до 0°С коктейль, содержащий TFA (350 мкл), DMS (210 мкл), m-крезол (70 мкл), и TfOH (70 мкл), и перемешивали при 0°С. Через 30 минут раствор фильтровали, смолу промывали TFA, диэтиловым эфиром, ДМФА, DCM и TFA в этом порядке, опять добавляли такое же количество вышеуказанного коктейля, и перемешивали при 0°С. Через 2 часа раствор фильтровали и хорошо отмывали смолу с помощью TFA, диэтилового эфира и ДМФА в этом порядке. MESNa (5 мг) разводили в 200 мМ фосфатном буфере (95 мкл), содержащем 6 М гуанидин гидрохлорид, и добавляли к смоле. Через 12 часов соединение, содержащееся в элюируемом растворе, анализировали и очищали с помощью ВЭЖХ. Как результат, это позволяет получить гликопептид (1), имеющий дифенацил-дисиалогликоаспарагин и имеющий аминокислотную последовательность TN(дифенацил-дисиало сахарная цепь)YSVTDLNY-SR (SEQ ID NO. 1). Следует отметить, что в указанной аминокислотной последовательности N(дифенацил-дисиало сахарная цепь) служит для обозначения гликоаспарагина, a -SR служит для обозначения этилового тиоэфира сульфоновой кислоты.

Пример 3. Синтез тиоэфирной формы гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь (SLQN(дифенацил-дисиало сахарная цепь)ASAIES-SR)

I) Получение Тиоэфирной формы пептида

Твердофазный синтез проводили с помощью колонки «Prostyrene» (Tokyo Rika, No. 183 470). Смолу «Amino-PEGA» (50 мкл, 1,67 г) помещали в колонку «Prostyrene» и кондиционировали в достаточной степени растворителем ДМФА. Затем раствор S-трилил-3-меркаптопропионовой кислоты (200 мкмоль), HBTU (190 мкмоль), и DIPEA (800 мкмоль), растворенных в ДМФА, добавляли к смоле амино-PEGA, и перемешивали при обычной температуре. Через 30 минут смолу хорошо отмывали с помощью ДМФА и DCM, и добавляли 95% TFA и 5% TIPS. Через 2 минуты раствор хорошо фильтровали, опять добавляли TFA и TIPS, и через 2 минуты смолу хорошо промывали с помощью ДМФА. К этой смоле смешанный раствор Boc-Ser(OBn)-OH (200 мМ), HBTU (190 мМ), и DIPEA (400 мМ), растворенных в ДМФА, добавляли для того, чтобы осуществить конденсацию первого аминокислотного остатка, серина. Через 20 минут смолу тщательно отмывали с помощью ДМФА и диоксана. Для этой смолы добавляли раствор 10% серной кислоты/диоксана, фильтровали через 5 минут, дополнительно добавляли тот же раствор, перемешивали в течение 30 минут для снятия защиты Вос-группы. Последующие аминокислоты (Boc-Glu(OBn)-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser(OBn)-OH и Boc-Ala-ОН) конденсировали сходным образом.

II) Конденсация сиалилгликозилированной аминокислоты и последующая конденсация аминокислот.

После снятия Вос-группы со смолы, имеющей удлиненный пептидный тиоэфир (2 мкмоль) с помощью вышеуказанного способа, ее промывали ДМФА и добавляли 5% DIPEA/ДМФА. Через 1 минуту полученное хорошо промывали с помощью ДМФА, добавляли раствор Вос-дифенацил-дисиалогликоаспарагина (4 мкмоль), DEPBT (6 мкмоль), и DIPEA (4 мкмоль), растворенных в ДМФА, и перемешивали при обычной температуре. Через 14 часов смолу хорошо отмывали с помощью ДМФА. Конденсацию сахарной цепи проводили опять в вышеуказанных условиях. В последующей элонгации пептида (Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser(OBn)-OH), конденсацию проводили способом, сходным с вышеуказанным, при концентрации аминокислоты 40 мМ в целях предотвращения побочных реакций гидроксильной группы сахарной цепи.

III) Снятие защиты боковой цепи аминокислоты и отщепление от смолы

После промывки смолы DCM, добавляли охлажденный до 0°С коктейль, содержащий TFA (350 мкл), DMS (210 мкл), m-крезол (70 мкл), и TfOH (70 мкл), и перемешивали при 0°С. Через 30 минут раствор фильтровали, смолу промывали TFA, диэтиловым эфиром, ДМФА, DCM и TFA в этом порядке, опять добавляли такое же количество вышеуказанного коктейля, и перемешивали при 0°С. Через 2 часа раствор фильтровали и хорошо отмывали смолу с помощью TFA, диэтилового эфира и ДМФА в этом порядке. MESNa (5 мг) разводили в 200 мМ фосфатном буфере (95 мкл), содержащем 6 М гуанидин гидрохлорид, и добавляли к смоле. Через 12 часов соединение, содержащееся в элюируемом растворе, анализировали и очищали с помощью ВЭЖХ. Как результат, это позволяет получить гликопептид (2), имеющий дифенацил-дисиалогликоаспарагин и имеющий аминокислотную последовательность SLQN(дифенацил-дисиало сахарная цепь)ASAIES-SR (SEQ ID NO. 2). Следует отметить, что в указанной аминокислотной последовательности N(дифенацил-дисиало сахарная цепь) служит для обозначения гликоаспарагина, a -SR служит для обозначения этилового тиоэфира сульфоновой кислоты.

Гликопептид-тиоэфир

ESI-MS: м/з расчетн. для C₁₄₃H₂₂₂N₁₈O₈₃S₂: 3585,5, [М+Н]⁺, 1793,8 [M+2H]²⁺, 1196,2 [М+3Н]³⁺;

обнаружено: 3586,9, [М+Н]⁺, 1794,0 [M+2H]²⁺, 1196,3 [М+3Н]³⁺.

Обозначения реактивов:

ДМФА: N,N-диметилформамид, DCM: дихлорметан, HOBt: 1-гидроксибензотриазол, TFA: трифторуксусная кислота, DEPBT 3-(диэтокси-фосфорилокси)-3Н-бензо[d] [1,2,3] триазин-4-он, HBTU: 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат, DIPEA: N,N-диизопропилэтиламин

Пример 4. Синтез эритропоэтина

(I) Схема синтеза эритропоетина

Природный эритропоэтин имеет последовательность из 166 аминокислот, и имеет аспарагин (N)-связанные сахарные цепи в положениях 24, 38 и 83 и O-связанную сахарную цепь, которая присоединена к серину в положении 126. В представленных ниже примерах был синтезирован гликопептид, в котором гликозилированный аспарагин в положениях 24 и 38 был преобразован в негликозилированный аспарагин, глутаминовая кислота в положении 21 была преобразована в цистеин, глутамин в положении 78 преобразован в цистеин, и гликозилированный серин в положении 126 преобразован в негликозилированный серин в последовательности природного эритропоэтина, а также имеет сиалилгликоаспарагин в положениии 83 аминокислотной последовательности. Цистеины, вставленные вместо глутаминовой кислоты в положении 21 и глутамина в положении 78, использовали как участки для связывания при лигировании. Настоящие примеры поясняют способ изготовления 1-166 аминокислот аминокислотной последовательности эритропоэтина, разделенных на 6 фрагментов: пептидный фрагмент А, имеющий аминокислоты 1-21, пептидный фрагмент В, имеющий аминокислоты 22-49, пептидный фрагмент С, имеющий аминокислоты 50-78, гликозилированный пептидный фрагмент D, имеющий аминокислоты 79-97, пептидный фрагмент Е имеющий аминокислоты 98-127, и пептидный фрагмент F, имеющий аминокислоты 128-166.

Более конкретно, показан способ изготовления, включающий следующие стадии. (А) Стадия Получения Пептидного Фрагмента А, представленного нижеследующей формулой (8), Пептидного Фрагмента В, представленного нижеследующей формулой (9), Пептидного Фрагмента С, представленного нижеследующей формулой (10), гликозилированного Пептидного Фрагмента D, представленного нижеследующей формулой (11), Пептидного Фрагмента Е, представленного нижеследующей формулой (12) и Пептидного Фрагмента F, представленного нижеследующей формулой (13).

Химическая формула 15

(8)

Химическая формула 16

(9)

Химическая формула 17

(10)

Химическая формула 18

(11)

Химическая формула 19

(12)

Химическая формула 20

(13)

В вышеуказанных формулах R¹ представляет Acm-группу. Каждый из фрагментов А, В и F имеет цистеин Acm-группу в положениях, соответствующих положениям 7, 29, 33 и 161 аминокислотной последовательности природного эритропоэтина. Кроме того, R² служит для обозначения формильной группы (СНО). Фрагмент D имеет триптофан, защищенный формильной группой в положении, соответствующем положению 88 аминокислотной последовательности природного эритропоэтина. Кроме того, R³ вместе с прилегающей S (серой) служит для обозначения этилового эфира сульфоновой кислоты, R⁴ служит для обозначения фенильной группы, а R⁵ служит для обозначения бензильной группы.

В каждом фрагменте С-конец, используемый для связывания лигированием, является тиоэтерифицированным. Более того, в каждом фрагменте N-конец, используемый для связывания лигированием, имеет цистеин. Пептидный фрагмент С, гликозилированный пептидный фрагмент D, и пептидный фрагмент Е, представленные формулами выше, также имеют цистеин на N-концевой части в виде цистеина тиазолидинового типа, для того, чтобы избежать побочных реакций в стадии лигирования на соответствующих C-концевых сторонах.

N-концевыми аминокислотами вышеуказанных фрагмента В, фрагмента С, гликозилированного фрагмента D, фрагмента Е и фрагмента F являются аланинами в положении 22, 50, 79, 98 и 128 аминокислотной последовательности природного эритропоэтина. Однако в настоящем Примере на N-конце фрагмента присоединяемого в стадии дотирования требуется цистеин. Соответственно, N-концевые аминокислоты фрагмента В, фрагмента С, гликозилированного фрагмента D, фрагмента Е и фрагмента F синтезируются цистеинами вместо аланинов в каждом изготовленном образце. Цистеин, вставленный вместо аланина, восстанавливали в аланин после лигирования между фрагментами.

(B) Стадия Связывания Фрагмента А и Фрагмента В Лигированием для Получения Фрагмента (А+В) (см. Фигуру 5).

В настоящем описании, например, фрагмент (А+В) служит для обозначения фрагмента, полученного соединением С-конца фрагмента А и N-конца фрагмента В.

(C) Стадия Связывания Фрагмента Е и Фрагмента F Лигированием для Получения Фрагмента (E+F) и Стадия Преобразования N-концевого Тиазолидинового производного Цистеина Фрагмента (E+F) в Цистеин (см. Фигуру 6).

(D) Стадия Связывания Фрагмента D и Фрагмента (E+F) Лигированием для Получения Фрагмента (D+Е+F), Стадия Преобразования N-концевого Тиазолидинового Производного Цистеина Фрагмента (D+Е+F) в Цистеин, и Стадия Удаления Формильной (СНО) Группы на Триптофане и Фенацильной группы на Сиаловой Кислоте Сахарной Цепи (см. Фигуру 7)

(Е) Стадия Связывания Фрагмента С и Фрагмента (D+Е+F) Лигированием для Получения Фрагмента (С+D+Е+F), Восстановления Цистеина, использованного для Лигирования, в Аланин и Преобразования N-концевого Тиазолидинового производного Цистеина Фрагмента (С+D+Е+F) в Цистеин (см. Фигуру 8)

(F) Стадия Связывания Фрагмента (А+В) и Фрагмента (С+D+Е+F) Лигированием для Получения Фрагмента (A+B+C+D+E+F) (см. Фигуру 9)

(G) Стадия Восстановления Цистеина, Использованного для Лигирования, в Аланин в Фрагменте (A+B+C+D+E+F) (см. Фигуру 10).

(Н) Стадия снятия защитной группы цистеина (см. Фигуру 11)

(II) Синтез Каждого Пептидного Фрагмента

(II-1. Синтез Пептидного Фрагмента A-SPh)

В настоящем описании, «-SPh» в пептидном фрагменте A-SPh означает тиофенил. Другими словами, пептидный фрагмент A-SPh означает, обладающий тиофенилом на С-конце пептидный фрагмент А.

Смолу «HMPB-PEGA» (Merck) (50 мкмоль) помещали в колонку для твердофазного синтеза, Fmoc-Ala (0,25 ммоль), MSNT (0,25 ммоль), и N-метилимидазол (0,27 ммоль) растворяли в DCM (1,25 мл), помещали в колонку для твердофазного синтеза и перемешивали при 25°С в течение 2 часов.

После перемешивания смолу промывали DCM и ДМФА. Fmoc-группу обрабатывали раствором 20% пиперидина/ДМФА (2 мл) в течение 15 минут и снимали защиту. После промывки ДМФА, последующую элонгацию пептидной цепи проводили способом, представленным ниже, для того чтобы осуществить последовательную конденсацию аминокислот.

Аминокислоты, имеющие аминогруппы, защищенные Fmoc-группой, растворяли в диметилформамиде (ДМФА) (1 мл), затем добавляли HOBt (0,25 ммоль) и диизопропилкарбодиимид (DIC) (0,25 ммоль), активировали в течение 5-10 минут, а затем добавляли в колонку для твердофазного синтеза. Полученное оставляли реагировать при 37 градусах в течение 15 минут с помощью микроволн, а смолу промывали DCM и ДМФА. Эту операцию повторяли, а аминокислоты, защищенные Fmoc- и Вос-группами (0,25 ммоль), использовали для последовательной конденсации аминокислот. Следует отметить, что микроволны не использовали для аминокислот Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Cys (Acm), и Fmoc-His (Trt), но оставляли их реагировать при комнатной температуре в течение 15 минут.

В качестве аминокислоты, имеющей азот аминогруппы, защищенный Fmoc-группой, последовательно использовали и присоединяли к твердофазной смоле Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Val, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Cys(Acm), Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Pro, Fmoc-Pro и Fmoc-Ala. Как результат, на твердофазной смоле был получен пептид из 21 аминокислотного остатка (3) Ala-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Ile-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Pro-Ala-NH₂ (SEQ ID NO. 3).

После промывки пептида (3), полученного выше, с помощью DCM и ДМФА, смешанный раствор трифторэтанола и уксусной кислоты (1:1) добавляли так, чтобы смола в достаточной степени намокла, и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре для расщепления на смолу и пептид 3. Отщепленную смолу отфильтровывали, а реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток концентрировали и получали пептид (3), имеющий защищенные аминокислотные боковые цепи: Ala-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Ile-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Pro-Ala-NH₂.

Пептид 3, имеющий 21 аминокислотный остаток, и имеющий защищенные боковые цепи аминокислот, переносили в 25 мл колбу для выделения, и растворяли в ДМФА (2,5 мл). Затем колбу охлаждали в атмосфере азота до -15°С - -20°С. К полученному добавляли тиофенол (10,2 мкл, 0,1 ммоль), затем РуВОР (52,0 мг, 0,10 ммоль), а после этого DIPEA (18,0 мкл, 0,1 ммоль). После перемешивания при -20°С в течение 3 часов к осадку пептида добавляли диэтиловый эфир. К остатку добавляли тирфторуксусную кислоту: воду: TIPS (=95:2.5:2.5), и перемешивали при комнатной температуре. Через 2 часа этот раствор добавляли опять к отдельно приготовленному диетиловому эфиру для осаждения, а затем подвергали разделению центрифугированием для удаления части раствора, тем самым получая остаток, содержащий целевой пептид в тиоэфирной форме. Этот полученный остаток очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: Vydac (С18), φ 10×250 мм, скорость потока: 4,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=75:25->25:75 (30 минут) линейный градиент] для получения целевого пептидного фрагмента A-SPh (4) (SEQ ID NO. 4): H₂N-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys(Acm)-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-Ala-SPh, имеющего тиофенильный эфир на С-конце. ESI-MS: м/з расчетн. для C₁₁₆H₁₉₀N₃₂O₃₀S₂:[M+2H]²⁺ 1289,5, [M+3H]³⁺ 860,0 [M+4Н]⁴⁺ 645,3, обнаружено для [М+2Н]²⁺ 1289,3, [M+3H]³⁺ 860,0, [M+4H]⁴⁺ 645,3.

(II-2. Синтез Пептидного Фрагмента B-SBn)

Пептидный фрагмент B-SBn синтезировали в условиях, похожих на условия способа синтеза представленного выше II-1. пептидного фрагмента A-SPh, с помощью способа твердофазного синтеза с Fmoc.

В качестве аминокислоты, защищенной Fmoc- и Вос-группами, последовательно использовали и присоединяли к твердофазной смоле Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Pro, Fmoc-Val, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Leu, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Cys(Acm), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Cys(Acm), Fmoc-Gly, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Gln(Trt) и Fmoc-Cys(Trt). Как результат, на твердофазной смоле был получен пептид (5) из 28 аминокислотных остатков, Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Val-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Val-Thr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Cys(Acm)-His(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-Cys(Acm)-Gly-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-NH₂ (SEQ ID NO 5).

Пептид (5), полученный выше, обрабатывали в условиях, похожих на условия способа синтеза представленного выше II-1. пептидного фрагмента A-SPh для отщепления от смолы, и получали пептид (5): Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Val-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Val-Thr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Cys(Acm)-His(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-Cys(Acm)-Gly-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-NH₂, имеющий защищенные боковые цепи аминокислот.

Пептид (5), имеющий 28 аминокислотных остатков и имеющий защищенные боковые цепи аминокислот, переносили в 25 мл колбу для выделения и растворяли в ДМФА (2,5 мл). Затем колбу охлаждали в атмосфере азота до -15°С - -20°С. К полученному добавляли бензилмеркаптан (11,7 мкл, 0,1 ммоль), затем РуВОР (52,0 мг, 0,10 ммоль), а затем DIPEA (18,0 мкл, 0.1 ммоль). После перемешивания при -20°С в течение 3 часов, диэтиловый эфир добавляли к преципитату пептида. К остатку добавляли тирфторуксусную кислоту: воду: TIPS (=95:2.5:2.5), и перемешивали при комнатной температуре. Через 2 часа этот раствор добавляли опять к отдельно приготовленному диетиловому эфиру, для осаждения, а затем подвергали разделению центрифугированием для удаления части раствора, тем самым получая остаток, содержащий целевой пептид в тиоэфирной форме. Полученный остаток очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: Vydac (С18), φ 10×250 мм, скорость потока: 4,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=70:30 -> 20:80 (30 минут) линейный градиент] для получения целевого пептидного фрагмента B-SBn (6) (SEQ ID NO. 6): H₂N-Cys-Gln-Asn-Ile-Thr-Thr-Gly-Cys(Acm)-Ala-Glu-His-Cys(Acm)-Ser-Leu-Asn-Glu-Asn-Ile-Thr-Val-Pro-Asp-Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-SBn имеющего тиобензильный эфир на C-конце.

ESI-MS: м/з расчетн. для C₁₄₄H₂₁₉N₃₇O₄₈S₄: [M+2H]²⁺ 1863,4, [М+3Н]³⁺ 1122,6, [М+4H]⁴⁺ 842,2, обнаружено для [M+2H]²⁺ 1863,4, [М+3Н]³⁺ 1122,6, [М+4Н]⁴⁺ 842,2.

(II-3. Синтез Пептидного Фрагмента C-SR)

Твердофазный синтез проводили с помощью колонки «Prostyrene» (Tokyo Rika, No. 183 470). Смолу Амино-PEGA (50 мкл, 1,67 г) помещали в колонку «Prostyrene» и кондиционировали в достаточной степени растворителем ДМФА. Затем раствор S-трилил-3-меркаптопропионовой кислоты (200 мкмоль), HBTU (190 мкмоль) и DIPEA (800 мкмоль), растворенных в ДМФА, добавляли к смоле амино-PEGA, и перемешивали при обычной температуре. Через 30 минут смолу отмывали с помощью ДМФА и DCM, и добавляли 95% TFA и 5% TIPS. Через 2 минуты раствор фильтровали, опять добавляли TFA и TIPS, и через 2 минуты смолу промывали ДМФА. К этой смоле добавляли перемешанный раствор Boc-Ala (200 мМ), HBTU (190 мМ) и DIPEA (400 мМ), растворенных в ДМФА, для того чтобы конденсировать первый аминокислотный остаток, аланин. Через 20 минут смолу тщательно отмывали с помощью ДМФА и диоксана. Для этой смолы добавляли раствор 10% серной кислоты/диоксана, фильтровали через 5 минут, дополнительно добавляли тот же раствор, перемешивали в течение 30 минут для снятия защиты Вос-группы. Последовательно эту операцию повторяли с присоединением аминокислот, защищенных Вос-группой, к последовательно конденсированным аминокислотам.

В качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, последовательно использовали и присоединяли к твердофазной смоле Boc-Gly, Boc-Arg(di-Z), Boc-Leu, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Glu(Bn), Boc-Ser(Bn), Boc-Leu, Boc-Leu, Boc-Ala, Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Val, Boc-Glu(Bn), Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Gln, Boc-Gln, Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Glu(Bn), Boc-Met, Boc-Arg(di-Z), Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Trp(CHO) и Вос-Thz. Как результат, получали на твердофазной смоле пептид (7) из 29 аминокислотных остатков Ala-Gly-Arg(di-Z)-Leu-Val-Ala-Glu(Bn)-Ser(Bn)-Leu-Leu-Ala-Leu-Gly-Gln-Trp(CHO)-Val-Glu(Bn)-Val-Ala-Gln-Gln-Gly-Val-Glu(Bn)-Met-Arg(di-Z)-Lys(Cl-Z)-Trp(CHO)-Thz-NH (SEQ ID NO. 7).

После промывки пептида (7) на смоле, полученного выше, DCM, добавляли охлажденный до 0°С коктейль, содержащий TFA (400 мкл), TfOH (40 мкл), EDT (20 мкл) и тиоанизол (40 мкл), и перемешивали при 0°С. Через 30 минут раствор фильтровали, смолу промывали TFA, диэтиловым эфиром, ДМФА, DCM и TFA в этом порядке, опять добавляли такое же количество вышеуказанного коктейля, и перемешивали при 0°С. Через 30 минут раствор фильтровали и хорошо отмывали смолу с помощью TFA, диэтилового эфира и ДМФА, в этом порядке. MESNa (5 мг) растворяли в 200 мМ фосфатном буфере (95 мкл), содержащем 6 М гуанидин гидрохлорид, и добавляли в эту смолу. Через 12 часов получили раствор-элюат, содержащий целевой пептид в тиоэфирной форме. Этот раствор очищали с помощью ВЭЖХ для получения пептидного фрагмента C-SR (8) (SEQ ID NO. 8): HN-Thz-Trp-Lys-Arg-Met-Glu-Val-Gly-Gln-Gln-Ala-Val-Glu-Val-Trp-Gln-Gly-Leu-Ala-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Val-Leu-Arg-Gly-Ala-SR, имеющего тиоэфир на С-конце. Следует отметить, что -SR обозначает этиловый тиоэфир сульфоновой кислоты.

ESI-MS: м/з расчетн. для C₁₄₅H₂₃₅N₄₁O₄₂S₄: [M+2H]²⁺ 1677,5, [М+3Н]³⁺ 1118,6, [M+4H]⁴⁺ 839,2, обнаружено для [M+2H]²⁺ 1677,5, [М+3Н]³⁺ 1118,6, [M+4H]⁴⁺ 839,2.

(II-4. Синтез Гликопептидного Фрагмента D-SR, имеющего Сахарную Цепь с Сиаловой Кислотой)

Подобно способу синтеза вышеуказанного II-3. пептидного фрагмента C-SR, с помощью способа твердофазного синтеза по Вос-методу, аминокислоты последовательно конденсировали с использованием аминокислот, защищенных Вос-группой, вплоть до аминокислотного остатка серина.

В качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, последовательно использовали и присоединяли к твердофазной смоле Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Asp(Bn), Boc-Val, Boc-His(DNP), Boc-Leu, Boc-Gln, Boc-Leu, Boc-Pro, Boc-Glu(Bn), Boc-Trp(CHO), Boc-Pro, Boc-Gln, Boc-Ser(Bn) и Boc-Ser(Bn). Как результат, получали на твердофазной смоле пептидный фрагмент (9) Lys(Cl-Z)-Asp(Bn)-Val-His(DNP)-Leu-Gln-Leu-Pro-Glu(Bn)-Trp(CHO)-Pro-Gln-Ser(Bn)-Ser(Bn) (SEQ ID NO. 9).

К пептидному фрагменту (9), полученному выше, добавляли 10% раствор серной кислоты/диоксана, фильтровали через 5 минут, дополнительно добавляли тот же раствор, и перемешивали в течение 30 минут для проведения снятия защиты Вос-группы. Затем полученное отмывали ДМФА, и добавляли 5% DIPEA/ДМФА. Через 1 минуту полученное хорошо промывали ДМФА, добавляли раствор Вос-дифенацил-дисиалогликоаспарагина (4 мкмоль), DEPBT (6 мкмоль), и DIPEA (4 мкмоль), растворенных в ДМФА, и перемешивали при обычной температуре. Через 14 часов смолу хорошо отмывали с помощью ДМФА. Опять проводили конденсацию сахарной цепи в вышеуказанных условиях. При этом конденсацию проводили способом, аналогичным приведенному выше при концентрации аминокислоты 40 мМ для того, чтобы избежать побочных реакций гидроксильной группы сахарной цепи. В качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, последовательно использовали и присоединяли к твердофазной смоле Boc-Val, Boc-Leu, Boc-Leu и Boc-Thz. Как результат, получали на твердофазной смоле гликопептид (10) из 19 остатков Lys(Cl-Z)-Asp(Bn)-Val-His(DNP)-Leu-Gln-Leu-Pro-Glu(Bn)-Trp(CHO)-Pro-Gln-Ser(Bn)-Ser(Bn) (SEQ ID NO. 10).

После промывки пептида (10) на смоле, полученного выше, DCM, добавляли охлажденный до 0°С коктейль, содержащий TFA (350 мкл), DMS (210 мкл), m-крезол (70 мкл), и TfOH (70 мкл) и перемешивали при 0°С. Через 30 минут раствор фильтровали, смолу промывали TFA, диэтиловым эфиром, ДМФА, DCM и TFA, в этом порядке, опять добавляли такое же количество вышеуказанного коктейля, и перемешивали при 0°С. Через 30 минут раствор фильтровали, смолу промывали TFA, диэтиловым эфиром, ДМФА, DCM и TFA, в этом порядке, опять добавляли такое же количество вышеуказанного коктейля, и перемешивали при 0°С. Через 2 часа раствор фильтровали и хорошо отмывали смолу с помощью TFA, диэтилового эфира и ДМФА, в этом порядке. MESNa (5 мг) растворяли в 200 мМ фосфатном буфере (95 мкл), содержащем 6 М гуанидин гидрохлорид, и добавляли в эту смолу. Через 12 часов получали раствор-элюат, содержащий целевой пептид в тиоэфирной форме. Этот раствор очищали с помощью ВЭЖХ для получения пептидного фрагмента D-SR (11) (SEQ ID NO. 11): HN-Thz-Leu-Leu-Val-Asn(дифенацил-дисиало сахарная цепь)-Ser-Ser-Gln-Pro-Trp(CHO)-Glu-Pro-Leu-Gln-Leu-His-Val-Asp-Lys-SR, имеющего тиоэфир на С-конце. Следует отметить, что -SR обозначает этиловый тиоэфир сульфоновой кислоты.

ESI-MS: м/з расчетн. для C₂₀₃H₃₀₆N₃₂O₉₅S₃: [М+3Н]³⁺ 1604,7, [М+4H]⁴⁺ 1203,7, [М+5Н]⁵⁺ 963,1, обнаружено для [М+3Н]³⁺ 1605,4, [М+4H]⁴⁺ 1204,3, [M+5H]⁵⁺ 963,2.

(II-5. Синтез Пептидного Фрагмента Е-SR)

Пептидный фрагмент Е-SR синтезировали в условиях, сходных с условиями способа синтеза вышеуказанного II-3. пептидного фрагмента C-SR с помощью способа твердофазного синтеза с Boc. Во-первых, аминокислоты, защищенные Вос-группой, использовали вплоть до остатка серина, который находится сразу перед связью с гликозилированной аминокислотой, и аминокислоты последовательно конденсировали C-концевой стороны.

Аминокислоты, защищенные с помощью Вос-группы, Boc-Ala, Boc-Ser(Bn), Boc-Ala, Boc-Ala, Boc-Asp(Bn), Boc-Pro, Boc-Pro, Boc-Ser(Bn), Boc-Ile, Boc-Ala, Boc-Glu(Bn), Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Glu(Bn), Boc-Ala, Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Ala, Boc-Arg(di-Z), Boc-Leu, Boc-Leu, Boc-Thr(Bn), Boc-Thr(Bn), Boc-Leu, Boc-Ser(Bn), Boc-Arg(di-Z), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Ser(Bn), Boc-Val, и Boc-Thz последовательно использовали и присоединяли к твердофазной смоле. Как результат, получили на твердофазной смоле пептид из 30 остатков (12) Ala-Ser(Bn)-Ala-Ala-Asp(Bn)-Pro-Pro-Ser(Bn)-Ile-Ala-Glu(Bn)-Lys(Cl-Z)-Glu(Bn)-Ala-Gly-Leu-Ala-Arg(di-Z)-Leu-Leu-Thr(Bn)-Thr(Bn)-Leu-Ser(Bn)-Arg(di-Z)-Leu-Gly-Ser(Bn)-Val-Thz-NH (SEQ ID NO. 12).

Пептид (12) на смоле, полученный выше, обрабатывали в условиях, схожих с условиями способа синтеза вышеуказанного II-3. пептидного фрагмента C-SR для отщепления от смолы. Этот раствор очищали с помощью ВЭЖХ для получения пептидного фрагмента E-SPh (13) (SEQ ID NO. 13): HN-Thz-Val-Ser-Gly-Leu-Arg-Ser-Leu-Thr-Thr-Leu-Leu-Arg-Ala-Leu-Gly-Ala-Glu-Lys-Glu-Ala-Ile-Ser-Pro-Pro-Asp-Ala-Ala-Ser-Ala-SPh, имеющего тиоэфир на С-конце. Следует отметить, что -SR обозначает этиловый тиоэфир сульфоновой кислоты.

ESI-MS: м/з расчетн. для C₁₃₁H₂₂₆N₃₈O₄₄S₃: [М+2H]²⁺ 1567,8, [М+3Н]³⁺ 1045,5, обнаружено для [M+2H]²⁺ 1568,0, [М+3Н]³⁺ 1045,6.

(II-6. Синтез Пептидного Фрагмента F-OH)

Пептидный фрагмент F-OH синтезировали в условиях, сходных с условиями способа синтеза вышеуказанного II-1. пептидного фрагмента A-SPh с помощью способа твердофазного синтеза с Fmoc.

Аминокислоты, защищенные Fmoc-группой, moc-Arg(Pbf), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Cys(Acm), Fmoc-Ala, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Leu, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Leu, Fmoc-Phe, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Phe, Fmoc-Leu, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Leu, Fmoc-Pro, и Fmoc-Cys(Trt) последовательно использовали и связывали с твердофазной смолой. В результате, получили на твердофазной смоле пептид из 39 остатков, (14) Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Cys(Acm)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Val-Arg(Pbf)-Phe-Leu-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Phe-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Thr(tBu)-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Pro-Cys(Trt)-NH₂ (SEQ ID NO. 14).

Пептид (14), полученный как указано выше, отщепляли от смолы способом, как правило, используемым с Fmoc-способом и очищенным ВЭЖХ для получения пептидного фрагмента F (15) (SEQ ID NO. 15): H₂N-Cys-Pro-Leu-Arg-Thr-Ile-Thr-Ala-Asp-Thr-Phe-Arg-Lys-Leu-Phe-Arg-Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg-Gly-Lys-Leu-Lys-Leu-Tyr-Thr-Gly-Glu-Ala-Cys(Acm)-Arg-Thr-Gly-Asp-Arg.

ESI-MS: м/з расчетн. для C₂₀₆H₃₃₄N₆₂O₅₆S₂: [М+3Н]³⁺ 1547,5, [M+4H]⁴⁺ 1160,8, [М+5Н]⁵⁺ 928,9, [М+6Н]⁶⁺ 774,2, [М+7H]⁷⁺ 663,8, обнаружено для [М+3Н]³⁺ 1547,2, [M+4H]⁴⁺ 1160,8, [M+5H]⁵⁺ 928,9, [М+6Н]⁶⁺ 774,2, [M+7H]⁷⁺ 663,8.

(III) Синтез дисиалогликозилированного эритропоэтина связыванием каждого фрагмента

Связывание каждого фрагмента, полученного выше, и синтез дисиалогликозилированного эритропоэтина проводили в совокупности в 10 стадиях, показанных ниже.

(III-1. Стадия 1: Связывание Пептидного фрагмента Е и Пептидного фрагмента F)

Два типа фрагментов, пептидный фрагмент Е (13) из 30 остатков, имеющий форму тиофенильного эфира на С-конце (3,7 мг), и пептидный фрагмент А (15) (2.5 мг) помещали в одну и ту же колбу для выделения. После растворения в буферном растворе при рН 6,8 (0,40 мл) (полученный с 6 М раствором гуанидин гидрохлорида, 0,2 М фосфатного раствора 20 мМ раствор трис-карбоксиэтилфосфина (раствор ТСЕР), добавляли МРАА (2,7 мг) и оставляли реагировать при комнатной температуре. Через 3 часа реакцию подтверждали с помощью ВЭЖХ, затем добавляли к реакционному раствору раствор метоксиамина, корректировали рН до 4,0, и оставляли реагировать при комнатной температуре, преобразуя, таким образом, N-концевое тиазолидиновое производное цистеина в цистеин. Через 2 часа выработку целевого объекта подтверждали с помощью ВЭЖХ и ESI-MS. Реакционный раствор очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: Vydac (C18), φ 10×250 мм, скорость потока: 4,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=675:25->25:75 (30 минут) линейный градиент] для получения целевого пептидного фрагмента (Е+F) (16) (SEQ ID NO. 16) (Фигура 6).

ESI-MS: м/з расчетн. для C₃₃₄H₅₅₄N₁₀₀O₉₇S₃: [M+4Н]⁴⁺ 1905,7, [M+5H]⁵⁺ 1524,8, [М+6Н]⁶⁺ 1270,8, [M+7H]⁷⁺ 1089,4, [М+8H]⁸⁺ 953,4, [M+9H]⁹⁺ 847,5, [М+10Н]¹⁰⁺ 762,9, обнаружено 1906,0, 1525,0, 1271,0, 1089,7, 953,7, 847,8, 763,2,

(III-2. Стадия 2: Связывание Пептидного Фрагмента D и Пептидного Фрагмента (Е+F))

Два типа фрагментов, дисиалилгликозилированный пептидный фрагмент D (11) из 19 остатков, имеющий тиофенильный эфир на С-конце (3,8 мг), и пептидный фрагмент (Е+F), полученный в предшествующей стадии 1 (16) (6,0 мг), помещали в одну и ту же колбу для выделения и растворяли в буферном растворе при рН 6,8 (0,40 мл) (полученном из 6 М раствора гидрохлорида гуанидина, 0,2 М раствора фосфата и 40 мМ раствора ТСЕР). Затем добавляли МРАА (2,7 мг) и проводили реакцию при комнатной температуре. После подтверждения окончания реакции с помощью ВЭЖХ и ESI-MS, добавляли 2-меркаптоэтанол (3,0 мкл) (0,2 М фосфатный раствор, рН 8,0, добавленный к 60 мкл и откорректированный) и оставляли реагировать при комнатной температуре для того, чтобы снять фенацильную и формильную защитные группы. Через 2 часа полученное нейтрализовали соляной кислотой, а затем добавляли в реакционный раствор раствор метоксиамина, корректировали до рН 4,0, и оставляли реагировать при комнатной температуре для того, чтобы преобразовать тиазолидиновое производное цистеина в цистеин. Через 3 часа выработку целевого объекта подтверждали с помощью ВЭЖХ и ESI-MS. Реакционный раствор очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: Vydac (C18), φ 10×250 мм, скорость потока: 4,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=75:25->25:75 (30 минут) линейный градиент] для получения целевого гликозилированного полипептидного фрагмента (D+Е+F) (17) (SEQ ID NO. 17) (Фигура 7).

ESI-MS: м/з расчетн. для C₅₁₇H₈₄₂N₁₃₂O₁₈₆S₄ [M+7H]⁷⁺ 1716,9, [M+8H]⁸⁺ 1502,4, [M+9H]⁹⁺ 1335,6, [М+10Н]¹⁰⁺ 1202,1, [М+11H]¹¹⁺ 1092,9, [M+12H]¹²⁺ 1001,9, [М+13H]¹³⁺ 924,9, [М+14Н]¹⁴⁺ 859,0, обнаружено 1717,2, 1502,8, 1335,9, 1202,4, 1093,3, 1002,2, 925,1, 858,7.

(III-3. Стадия 3: Связывание Пептидного Фрагмента С и Гликозилированного Пептидного Фрагмента (D+Е+F))

Два типа фрагментов, пептидный фрагмент С (8) из 29 остатков, имеющий тиофенильноый эфир на С-конце (1,34 мг), и гликозилированный пептидный фрагмент (D+Е+F), полученный в предшествующей стадии 2 (17) (4,8 мг) помещали в одну и ту же колбу для выделения и растворяли в буферном растворе при рН 6,8 (0,40 мл) (полученном из 6 М раствора гидрохлорида гуанидина, 0,2 М раствора фосфата и 40 мМ раствора ТСЕР). Затем добавляли МРАА (1.4 мг) и проводили реакцию при комнатной температуре. После подтверждения выработки целевого объекта с помощью ВЭЖХ и ESI-MS, реакционный раствор очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: Vydac (С18), φ 10×250 мм, скорость потока: 4,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=70:30->20:80 (30 минут) линейный градиент] для получения целевого гликозилированного полипептидного фрагмента (С+D+Е+F) (18) (SEQ ID NO. 18) (Фигура 8).

ESI-MS: м/з расчетн. для C₆₆₁H₁₀₇₁N₁₇₃O₂₃₅S₆: [M+8H]⁸⁺ 1905,3, [M+9H]⁹⁺ 1693,7, [М+10Н]¹⁰⁺ 1524,4, [M+11H]¹¹⁺ 1385,9, [M+12H]¹²⁺ 1270,5, [М+13Н]¹³⁺ 1172,9, [M+14H]¹⁴⁺ 1089,1, [M+15H]¹⁵⁺ 1016,6, [М+16Н]¹⁶⁺ 953,1, [М+17Н]¹⁷⁺ 897,1, обнаружено 1905,1, 1693,8, 1524,5, 1385,9, 1270,7, 1173,0, 1089,2, 1016,7, 953,2, 897,2.

(III-4. Стадия 4: Восстановление Cys в Ala)

Гликозилированный пептидный фрагмент (С+D+Е+F) (18) из 117 остатков, имеющий свободную тиольную группу на Cys в положениях, соответствующих положениям 79, 98 и 128 в аминокислотной последовательности эритропоэтина и имеющий дисиалосахарную цепь на Asn в положении, соответствующем положению 83 аминокислотной последовательности эритропоэтина, полученного выше в Стадии 3 (3,8 мг) помещали в колбу для выделения. После растворения в буферном растворе при рН 7,0 (1,0 мл) (полученном из 6 М раствора гуанидин гидрохлорида, 0,2 М фосфатного раствора) добавляли 20 мМ раствор трис-карбоксиэтилфосфина (раствор ТСЕР) при рН 7,0 (130 мг), MESNa (50 мг) и VA-044 (1,6 мг) и оставляли реагировать при комнатной температуре. Через 10 часов, выработку целевого объекта подтверждали с помощью ВЭЖХ и ESI-MS. Реакционный раствор очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: Vydac (С18), φ 10×250 мм, скорость потока: 4,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=70:30->20:80 (30 минут) линейный градиент] для получения целевого гликозилированного полипептидного фрагмента (С+D+Е+F) (19) (SEQ ID NO. 19) (Фигура 8).

ESI-MS: м/з расчетн. для C₆₆₁H₁₀₇₁N₁₇₃O₂₂₅S₃: [M+9H]⁹⁺ 1683,9, [M+10H]¹⁰⁺ 1514,8, [М+11Н]¹¹⁺ 1377,2, [М+12Н]¹²⁺ 1262,5, [М+13Н]¹³⁺ 1165,5, [М+14H]¹⁴⁺ 1082,3, [М+15H]¹⁵⁺ 1010,2, [М+16Н]¹⁶⁺ 947,1, [M+17H]¹⁷⁺ 891,5, [M+18H]¹⁸⁺ 842,0, обнаружено 1683,1, 1514,9, 1377,2, 1262,7, 1165,6, 1082,3,1010,3, 947,2, 891,6, 842,1.

(III-5. Стадия 5: Реакция De-Thz)

После растворения гликозилированного полипептида (С+D+Е+F) (18) из 117 остатков, имеющего дисиалосахарную цепь на Asn в положении, соответствующем положению 83 аминокислотной последовательности эритропоэтина, полученного выше в Стадии 4 (2,0 мг) в буферном растворе при рН 6,8 (0,05 мл) (приготовленном из 0,2 М фосфатного раствора), к реакционной смеси добавляли раствор 0,2 М метоксиамина, корректировали рН до 4,0, и оставляли реагировать при комнатной температуре. Через 3 часа реакционный раствор очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: Vydac (С18), φ 10×250 мм, скорость потока: 4,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% ТРА-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=75:25->30:70 (30 минут) линейный градиент] для получения целевого гликозилированного полипептидного фрагмента (С+D+Е+F) (20) (SEQ ID NO. 20) (Фигура 8).

ESI-MS: м/з расчетн. для C₆₆₀H₁₀₇₁N₁₇₃O₂₂₅S₃: [M+9H]⁹⁺ 1681,6, [М+10Н]¹⁰⁺ 1513,6, [M+11H]¹¹⁺ 1376,0, [M+12H]¹²⁺ 1261,5, [M+13Н]¹³⁺ 1164,5, [M+14H]¹⁴⁺ 1081,4, [М+15Н]¹⁵⁺ 1009,4, [М+16Н]¹⁶⁺ 946,4, [М+17Н]¹⁷⁺ 890,8, [M+18H]¹⁸⁺ 841,3, обнаружено 1681,6, 1513,6, 1376,0, 1261,4, 1164,4, 1081,3,1009,4, 946,3, 890,7, 841,3.

(III-6. Стадия 6: Связывание Пептидного Фрагмента А и Пептидного Фрагмента В)

Два типа фрагментов, пептидный фрагмент А (4) из 21 остатка, имеющий форму тиофенильного эфира на С-конце (2,0 мг), и пептидный фрагмент В (6) из 28 остатков, помещали в одну и ту же колбу для выделения и растворяли в буферном растворе при рН 6,5 (0,40 мл) (полученный из 6 М раствора гидрохлорида гуанидина, 0,2 М раствора фосфата и 30 мМ раствора трис-карбоксиэтилфосфина (раствора ТСЕР) и оставляли реагировать при комнатной температуре. После окончания реакции добавляли MESNa (5.2 мг) и проводили реакцию при комнатной температуре. Через 2 часа выработку целевого объекта подтверждали с помощью ВЭЖХ и ESI-MS. Реакционный раствор очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: Vydac (С18), φ 10×250 мм, скорость потока: 4,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=65:35->15:85(30 минут) линейный градиент] для получения целевого пептидного фрагмента (А+В) (21) (SEQ ID NO. 21) (Фигура 5).

ESI-MS: м/з расчетн. для C₂₄₉H₄₀₁N₆₉O₈₁S₆: [М+3Н]³⁺ 1950,1, [М+4Н]⁴⁺ 1463,4, [М+5Н]⁵⁺ 1170,9, [М+6Н]⁶⁺ 975,9, [М+7H]⁷⁺ 836,7, обнаружено 1950,7, 1463,6, 1171,1, 976,1, 836,8.

(III-7. Стадия 7: Связывание пептидного фрагмента (А+В) и фрагмента гликозилированного пептида (С+D+Е+F))

Два типа фрагментов, пептидный фрагмент (А+В) (21) из 49 остатков, имеющий форму тиофенильного эфира на С-конце, полученный в выше в Стадии 6 (2,0 мг), и гликозилированный полипептидный фрагмент (С+D+Е+F) (20), полученный выше в Стадии 5 (3,5 мг) помещали в одну и ту же колбу для выделения. После растворения в буферном растворе при рН 7,0 (0,077 мл) (полученном из 6 М раствора гуанидин гидрохлорида, 0,2 М фосфатного раствора и 50 мМ раствора ТСЕР), добавляли МРАА (прибл. 0,8 мг) и оставляли реагировать при комнатной температуре. После подтверждения выработки целевого объекта с помощью ВЭЖХ и ESI-MS, реакционный раствор очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: Vydac (С18), φ 10×250 мм, скорость потока: 1,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=65:35->25:75 (30 минут) линейный градиент] для получения целевого гликозилированного полипептидного фрагмента (A+B+C+D+E+F) (22) (SEQ ID NO. 22) (Фигура 9).

ESI-MS: м/з расчетн. для C₉₀₇H₁₄₆₈N₂₄₂O₃₀₃S₇: [М+11H]¹¹⁺ 1895,1, [M+12H]¹²⁺ 1737,3, [M+13H]¹³⁺ 1603,7, [М+14Н]¹⁴⁺ 1489,2, [M+15H]¹⁵⁺ 1390,0, [М+16Н]¹⁶⁺ 1303,2, [М+17Н]¹⁷⁺ 1226,6, [М+18Н]¹⁸⁺ 1158,5, [М+19Н]¹⁹⁺ 1097,6, [M+20H]²⁰⁺ 1042,8, [M+21H]²¹⁺ 993,2, [М+22H]²²⁺ 948,1, [M+23H]²³⁺ 906,9, [M+24H]²⁴⁺ 869,1, [M+25H]²⁵⁺ 834,4, обнаружено 1895,0, 1737,3, 1603,8, 1489,1, 1389,9, 1303,2, 1226,6, 1158,5, 1097,7, 1042,7, 993,2, 948,0, 906,9, 869,2, 834,4.

(III-8. Стадия 8: Восстановление Cys в Ala)

Гликозилированный полипептид (A+B+C+D+E+F) (22) из 166 остатков, имеющий свободную тиольную группу на Cys в положениях 22 и 50 и имеющий дисиалосахарную цепь на Asn в положении 83, полученный выше в Стадии 7 (1,0 мг), помещали в колбу для выделения. После растворения в буферном растворе при рН 7,0 (0,2 мл) (полученном из 6 М раствора гуанидин гидрохлорида, 0,2 М фосфатного раствора) добавляли 20 мМ раствор трис-карбоксиэтилфосфина (раствор ТСЕР) при рН 7,0 (26 мг), MESNa (10 мг) и VA-044 (0,32 мг) и оставляли реагировать при комнатной температуре. Через 4 часа выработку целевого объекта подтверждали с помощью ВЭЖХ и ESI-MS. Реакционный раствор очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: Vydac (C8), φ 10×250 мм, скорость потока: 4,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=70:30->20:80 (30 минут) линейный градиент] для получения целевого гликозилированного полипептидного фрагмента (A+B+C+D+E+F) (23) (SEQ ID NO. 23) (Фигура 10).

ESI-MS: м/з расчетн. для C₉₀₇H₁₄₆₈N₂₄₂O₃₀₃S₅: [М+13Н]¹³⁺ 1598,8, [М+14Н]¹⁴⁺ 1484,7, [М+15Н]¹⁵⁺ 1385,7, [М+16Н]¹⁶⁺ 1229,2, [М+17Н]¹⁷⁺ 1222,8, [М+18Н]¹⁸⁺ 1155,0, [М+19Н]¹⁹⁺ 1094,2, [М+20H]²⁰⁺ 1039,6, [M+21H]²¹⁺ 990,1, [М+22Н]²²⁺ 945,1, [M+23H]²³⁺ 904,1, [M+24H]²⁴⁺ 866,5, [M+25H]²⁵⁺ 831,9, [M+26H]²⁶⁺ 799,9, [M+27H]²⁷⁺ 770,3, обнаружено 1598,6, 1484,4, 1385,5, 1299,0, 1222,7, 1154,9, 1094,1, 1039,4, 990,0, 945,2, 904,0, 866,4, 831,6, 799,9, 770,3.

(III-9. Стадия 9: Снятие защиты Acm-группы)

Гликозилированный полипептид из 166 остатков (23) имеющий дисиало сахарную цепь на Asn в положении 83, полученный в вышеуказанной Стадии 8 (приблизительно 0,7 мг) поместили в пробирку «Eppendorf». После растворения в 90% водном растворе уксусной кислоты (0,176 мл), добавляли ацетат серебра (приблизительно 0,8 мг) и проводили реакцию при комнатной температуре в тени. Через 3,5 часа выработку целевого объекта подтверждали с помощью ВЭЖХ и ESI-MS. В реакционную смесь добавляли дитиотреитол (6,0 мг) а после перемешивания при комнатной температуре в течение 5 минут, разделяли центрифугированием, и надосадочную жидкость за вычетом осадка собирали. Собранную надосадочную жидкость фильтровали через мембранный фильтр, и часть фильтрата, содержащую целевой объект очищали с помощью ВЭЖХ (колонка: «proteonavi» (С4), φ 4,6×250 мм, скорость потока: 1,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, градиент A:B=65:35->25:75(30 минут) линейный градиент] для получения гликозилированного полипептида из 166 остатков (24) (SEQ ID NO. 24), не имеющего Acm-группы в положениях 7, 29, 33 и 161 и имеющего дисиало дибензил сахарную цепь на Asn в положении 83 (Фигура 11).

ESI-MS: м/з расчетн. для C₈₉₅H₁₄₄₈N₂₃₈O₂₉₉S₅: [M+13H]¹³⁺ 1576,9, [M+14H]¹⁴⁺ 1464,3, [М+15H]¹⁵⁺ 1366,8, [M+16H]¹⁶⁺ 1281,4, [М+17Н]¹⁷⁺ 1206,1, [M+18H]¹⁸⁺ 1139,2, [M+19H]¹⁹⁺ 1079,3, [M+20H]²⁰⁺ 1025,3, [M+21H]²¹⁺ 976,6, [M+22H]²²⁺ 932,2, [M+23Н]²³⁺ 891,7, [M+24H]²⁴⁺ 854,6, [M+25H]²⁵⁺ 820,5, [M+26Н]²⁶⁺ 789,0, [M+27H]²⁷⁺ 759,8, обнаружено 1576,7, 1464,3, 1366,7, 1281,4, 1206,0, 1139,1, 1079,2, 1025,2, 976,5, 932,2, 891,6, 854,6, 820,4, 788,9, 759,8.

(III-10. Стади 10: Стадия Фолдинга)

Гликозилированный полипептид (24) имеющий дисиало сахарную цепь на Asn в положении 83, полученный в вышеуказанной Стадии 9, помещали в центрифужную пробирку. После растворения в буферном растворе при рН 7,5 (13 мл) (полученный с 6 М раствором гуанидин гидрохлорида и 0,1 мМ раствором Трис), полипептид оставляли при комнатной температуре. Этот раствор переносили на диализную мембрану (Spectra/Pro, MWCO; 8000). Эту диализную мембрану помещали во внешний диализат А (приготовленный с раствором 3 М гуанидин гидрохлорида, раствора 0,1 мМ iris, 4 µM цистеина и 0,5 µМ цистина, рН 8,5), и диализовали при 4°С. Через 12 часов, эту диализную мембрану перемещали во внешний диализат В (приготовленный с 1 М раствором гуанидин гидрохлорида и 0,1 мМ раствором Трис, рН 8,0), и диализавали при 4°С. Через 8 часов, эту диализную мембрану перемещали во внешний диализат С (раствор 10 mM tris, рН 7,0), и диализавали при 4°С. Через 24 часа, эту диализную мембрану извлекали из внешнего диализата и раствор внутри диализной мембраны переносили в центрифужную пробирку. Раствор внутри диализной мембраны напрямую очищали с помощью ВЭЖХ [колонка: «proteonavi» (C4), φ 4,6×250 мм, скорость потока: 1,0 мл/мин, раствор элюэнта А: 0,1% TFA-вода раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN, A:B=60:40->25:75 (30 минут) линейный градиент] для получения гликозилированного полипептида (25) (SEQ ID NO. 25). Гликозилированный полипептид (25) после сворачивания имеет дисульфидную связь между цистеином в положении 7 и цистеином в положении 161 и дисульфидную связь между цистеином в положении 29 и цистеином в положении 33.

ESI-MS: м/з расчетн. для C₈₉₅H₁₄₄₄N₂₃₈O₂₉₉S₅ [M+11H]¹¹⁺ 1863,1, [M+12H]¹²⁺ 1707,9, [M+13H]¹³⁺ 1576,6, [М+14Н]¹⁴⁺ 1464,1, [М+15Н]¹⁵⁺ 1366,5, [М+16Н]¹⁶⁺ 1281,2, [М+17Н]¹⁷⁺ 1205,9, [М+18Н]¹⁸⁺ 1138,9, обнаружено 1863,2, 1708,0, 1576,6, 1464,0, 1366,5, 1281,2, 1205,8, 1138,9.

Группа изобретений относится к способам синтеза гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь. Путем реакции этерификации осуществляют связывание смолы, имеющей гидроксильную группу с аминокислотой, у которой азот аминогруппы защищен Вос-группой. Отсоединяют Вос-группу с образованием свободной аминогруппы. Осуществляют элонгацию аминокислоты, связанной со смолой, путем дополнительного связывания другой аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищен Вос-группой. Отсоединяют Вос-группу с образованием свободной аминогруппы. Осуществляют гидролиз смолы с помощью кислоты. Указанные аминокислоты по меньшей мере единожды являются сиалированными, причем карбоксильная группа сиаловой кислоты защищена фенацильной группой. Также получают производное сиалилгликоаспарагина. Изобретения позволяют получать сиалированные гликопептиды, в которых присутствует лабильная к щелочам неприродная аминокислота, а также предотвратить деградацию сиаловой кислоты. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 пр.

1. Способ изготовления гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, отличающийся тем, что включает следующие стадии:
(1) связывания смолы, имеющей гидроксильную группу с аминокислотой, у которой азот аминогруппы защищен Вос-группой;
где указанная стадия связывания является стадией связывания гидроксильной группы указанной смолы с карбоксильной группой указанной аминокислоты путем реакции этерификации;
(2) образования свободной аминогруппы путем отсоединения Вос-группы;
(3) повтор по меньшей мере однократно следующих стадий (i) и (ii):
(i) элонгации аминокислоты, связанной со смолой, путем дополнительного связывания другой аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищен Вос-группой, где указанная стадия элонгации является стадией связывания карбоксильной группы указанной другой аминокислоты с указанной свободной аминогруппой аминокислоты, связанной с указанной смолой,
(ii) образования свободной аминогруппы путем отсоединения указанной Вос-группы в (i); и
(4) гидролиза смолы с помощью кислоты;
где указанная аминокислота в стадии (1) и/или указанная другая аминокислота по меньшей мере единожды в (i) стадии (3) является гликозилированной аминокислотой, где указанная гликозилированная аминокислота имеет сиаловую кислоту по меньшей мере на одном из невосстанавливающих концов сахарной цепи, а карбоксильная группа указанной сиаловой кислоты защищена с помощью фенацильной группы.

2. Способ изготовления по п.1, в котором указанная гликозилированная аминокислота является аспарагин-связанной сахарной цепью или муцин-связанной сахарной цепью.

3. Способ изготовления по п.1, в котором указанная кислота в указанной стадии (4) является смешанной кислотой: трифторуксусной кислотой/трифторметансульфоновой кислотой/диметилсульфидом/m-крезолом.

4. Способ изготовления по п.1, в котором указанная аминокислота в указанной стадии (1) и/или указанная аминокислота по меньшей мере однажды в (i) указанной стадии (3) является лабильной в щелочи неприродной аминокислотой.

5. Способ изготовления по любому из пп.1-4, в котором по меньшей мере одна из указанных гликозилированных аминокислот является сиалилгликоаспарагином, а указанный сиалилгликоаспарагин имеет 6 или большее количество сахарных остатков.

6. Способ изготовления по любому из пп.1-4, в котором по меньшей мере одна из указанных гликозилированных аминокислот является сиалилгликоаспарагином, а указанный сиалилгликоаспарагин имеет от 9 до 11 остатков сахаров.

7. Способ изготовления по любому из пп.1-4, в котором по меньшей мере одна из указанных гликозилированных аминокислот является сиалилгликоаспарагином, а указанный гликоаспарагин имеет 6 или большее количество сахарных остатков и имеет биантеннарную сахарную цепь, присоединенную к нему.

8. Способ изготовления по любому из пп.1-4, в котором указанная гликозилированная аминокислота представлена следующей формулой (1):
Химическая формула 1

где один из R³ и R⁴ является следующей формулой (2), а другой является группой, выбранной из группы, состоящей из атома водорода и групп, указанных в представленных ниже формулах (2)-(6):
Химическая формула 2

Химическая формула 3

Химическая формула 4

Химическая формула 5

Химическая формула 6

9. Способ изготовления по любому из пп.1-4, дополнительно включающий стадию связывания тиольного соединения со смолой перед указанной стадией (1).

10. Способ изготовления по п.9, дополнительно включающий стадию (5) связывания тиоэфирной формы гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь, с пептидом или гликопептидным фрагментом после указанной стадии (4).

11. Способ изготовления по пп.1-4, дополнительно включающий стадию, позволяющую метящему агенту вступить в реакцию перед гидролизом смолы с помощью кислоты в указанной стадии (4).

12. Способ изготовления по п.9, дополнительно включающий стадию, позволяющую метящему агенту вступить в реакцию перед гидролизом смолы с помощью кислоты в указанной стадии (4).

13. Способ изготовления по п.11, в котором метящий агент является дансилгалидом.

14. Способ изготовления по пп.1-4, в котором воздействие микроволнами осуществляется для реакции конденсации указанной аминокислоты и/или для реакции отщепления Вос-группы по меньшей мере в одной из указанных стадий (1)-(3).

15. Способ изготовления по п.9, в котором воздействие микроволнами осуществляется для реакции конденсации указанной аминокислоты и/или для реакции отщепления Вос-группы по меньшей мере в одной из указанных стадий (1)-(3).

16. Способ изготовления по п.11, в котором воздействие микроволнами осуществляется для реакции конденсации указанной аминокислоты и/или для реакции отщепления Вос-группы по меньшей мере в одной из указанных стадий (1)-(3).

17. Способ изготовления гликопептида, обладающего сиалированной сахарной цепью, по пп.1-4, дополнительно включающий стадию снятия защиты фенацильной группы, защищающей карбоксильную группу указанной сиаловой кислоты, после указанной стадии (4).

18. Способ изготовления гликопептида, обладающего сиалированной сахарной цепью, по п.9, дополнительно включающий стадию снятия защиты фенацильной группы, защищающей карбоксильную группу указанной сиаловой кислоты, после указанной стадии (4).

19. Способ изготовления гликопептида, обладающего сиалированной сахарной цепью, по п.11, дополнительно включающий стадию снятия защиты фенацильной группы, защищающей карбоксильную группу указанной сиаловой кислоты, после указанной стадии (4).

20. Способ изготовления гликопептида, обладающего сиалированной сахарной цепью, по п. 14, дополнительно включающий стадию снятия защиты фенацильной группы, защищающей карбоксильную группу указанной сиаловой кислоты, после указанной стадии (4).

21. Способ изготовления производного сиалилгликоаспарагина, в котором аминогруппа сиалилгликоаспарагина защищена Вос-группой, а карбоксильная группа сиаловой кислоты на невосстанавливающем конце сахарной цепи защищена фенацильной группой, включающий стадии:
введения фенацильной группы в производное сиалилгликоаспарагина, в котором аминогруппа аспарагина защищена липофильной защитной группой,
отсоединения липофильной защитной группы сиалилгликоаспарагина, имеющего введенную фенацильную группу, и
введения Вос-группы в сиалилгликоаспарагин, от которого отсоединена липофильная защитная группа.

22. Способ изготовления по п.21, в котором указанной липофильной защитной группой является Fmoc.