ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ И ЛЕКАРСТВЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ Российский патент 2017 года по МПК C07K19/00 C07K14/655 C07K1/107 C07K17/10 C07K17/06 C07H3/06 A61K38/31 A61K47/36 A61P5/02 A61P1/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение имеет отношение к гликозилированным полипептидам и фармацевтическим композициям, содержащим данные полипептиды.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Соматостатин - это циклический пептид, который присутствует и в центральной нервной системе, и в окружающей ткани. Соматостатин был впервые выделен из гипоталамуса млекопитающих и идентифицирован из передней доли гипофиза как важный ингибитор секреции гормона роста. Этот пептид широко распространен, напр., в гипоталамусе, поджелудочной железе и в желудочно-кишечном тракте, а его действие осуществляется посредством связывания с рецептором соматостатина. Кроме того, известно, что соматостатин подавляет секрецию гормона роста (GH) и тиреотропного гормона (TSH) в гипофизе, а также подавляет секрецию различных гормонов, таких как гастрин, селектин, холецистокинин (CCK) и VIP (вазоактивный кишечный полипептид) в желудочно-кишечном тракте и глюкагон и инсулин в поджелудочной железе. Также известно, что он обладает способностью подавлять подвижность желудочно-кишечного тракта.

Природный соматостатин, имеющий структурную формулу: Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (SEQ ID NO. 1) (также известный как фактор, ингибирующий высвобождение соматотропина (SRIF)), был впервые выделен Guillemin и соавт. Данный соматостатин проявляет свое действие при взаимодействии с семейством рецепторов. Соматостатиновые рецепторы (SSTR) подразделяются на 5 подтипов (SSTR1-SSTR5), из которых SSTR2 распространен в каждой из тканей секретирующей GH аденомы гипофиза человека, центральной нервной системы, передней доли гипофиза, сетчатки, мозгового вещества надпочечников, желудка, слизистой двенадцатиперстной кишки, тонкого кишечника и толстой кишки, а также в секретирующих глюкагон А-клетках островков поджелудочной железы. Каждый из этих рецепторов также экспрессируется в различных опухолях. Например, сообщалось, что SSTR1 и SSTR5 экспрессируются в функциональной аденоме гипофиза, а SSTR2, равно как SSTR1 и SSTR3, экспрессируются в опухолях желудочно-кишечного тракта, SSTR3 экспрессируется в феохромоцитоме, SSTR1 и SSTR5 экспрессируются в опухолях простаты, а SSTR5 экспрессируется при колоректальном раке (непатентный документ 1). Кроме того, в отношении SSTR4 известно, что он функционирует как рецептор, обладающий антагонистическим модулирующим действием, и существует возможность его применения при лечении связанных с глаукомой заболеваний (непатентный документ 2). Таким образом, соматостатин и его аналоги являются потенциально полезными лечебными препаратами для связанных с соматостатином заболеваний или различных типов опухолей.

Между тем, поскольку природный соматостатин имеет короткий период полужизни в крови - всего 2-3 мин, он обладает двумя нежелательными свойствами: низкой биодоступностью и короткой продолжительности действия, поэтому его применение в качестве лечебного препарата ограничено. По этой причине были разработаны различные аналоги соматостатина с тем, чтобы найти аналог соматостатина, превосходящий его по эффективности, биостабильности, продолжительности действия или по избирательности в отношении подавления высвобождения гормона роста, инсулина или глюкагона.

Сообщалось, что октреотид (патентные документы 1 и 2) является первым утвержденным аналогом соматостатина, который может применяться в клинике, причем этот октреотид обладает сродством к соматостатиновым рецепторам SSTR2, SSTR3 и SSTR5.

Октреотид был разработан как циклический пептид, состоящий из 8 аминокислот, содержащий последовательность из 4 аминокислот (Phe-Trp-Lys-Thr), которая важна для проявления биологической активности соматостатина, Cys, который образует дисульфидную (S-S) связь на двух концах последовательности, а также D-Phe и Thr(ol) снаружи от Cys на двух концах. Этот октреотид может оказывать продолжительное действие путем улучшения времени полужизни в крови по своей аминокислотной последовательности, а также обладает большей избирательностью к гормону роста (GH), чем соматостатин, что способствует усилению его действия.

Такие аналоги соматостатина, в том числе октреотид, могут применяться для лечения пациентов с секретирующими гормоны и зависящими от гормонов опухолями. В настоящее время с помощью октреотида лечатся симптомы, связанные с метастатическими карциноидными опухолями, которые являются опухолями нейроэндокринной системы (приливы, диарея, заболевания сердечных клапанов и боли в животе), и симптомы, связанные с секретирующей вазоактивный интестинальный пептид (VIP) аденомой (водянистая диарея).

Например, при карциноидных и VIP-продуцирующих опухолях октреотид ингибирует и секрецию, и действие своего активного фактора. Соответственно, при VIP-продуцирующих опухолях, характеризующейся обильной диареей, аналог соматостатина может уменьшить диарею путем ингибирования секреции VIP, а также непосредственным воздействием на кишечную секрецию.

Однако, с другой стороны, многие эндокринные опухоли обладают устойчивостью к таким аналогам соматостатина, как октреотид (непатентный документ 3). Более того, хотя октреотид применяется при лечении акромегалии, сообщалось, что он не оказывает действия примерно на треть больных акромегалией. Далее, отмечено, что у большинства пациентов с карциноидными опухолями октреотид оказывает действие только во время первоначального применения и вызывает тахифилаксию при увеличении продолжительности введения. Также сообщалось, что октреотид не оказывает никакого эффекта на подавление продукции адренокортикотропного гормона (АСТН) у больных на ранней стадии болезни Кушинга.

В свете вышеизложенных проблем, требуется разработать такие аналоги соматостатина, которые бы связывались с несколькими подтипами рецепторов с высоким сродством, подобно природному соматостатину, для опухолей, экспрессирующих множественные рецепторы соматостатина, и предполагается, что аналог соматостатина, обладающий таким сродством к рецепторам соматостатина, мог бы оказывать действие на таких пациентов, у которых последние аналоги соматостатина оказались терапевтически неэффективными, или же устойчивых к ним (непатентный документ 4).

Соответственно, нужно разработать аналог соматостатина, имеющий структуру, близкую природному соматостатину, обладающий аналогичным сродством к рецепторам соматостатина и обладающий большим временем полужизни в крови по сравнению с соматостатином.

Между тем, становится ясно, что сахаридные цепочки отвечают за различные роли in vivo, и уже предложен способ присоединения сахаридных цепочек к октреотиду с тем, чтобы увеличить его время полужизни в крови (как-то патентный документ 3).

Однако исследования задерживаются вследствие сложности или разнообразия его структуры и нельзя сказать, что тип сахаридной цепочки или положение для вставки сахаридной цепочки всегда оптимальны. Еще не было сообщений о гликозилированном полипептиде, который бы преодолел проблемы последних аналогов соматостатина.

Список цитирования

Патентные документы

Патентный документ 1: U.S. Patent No. 4,310,518.

Патентный документ 2: U.S. Patent No. 4,235,886.

Патентный документ 3: Japanese Published Unexamined Patent Application Publication No. Hei 03 (1991)-014599.

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Currrent Opinion in Pharmacology, 2004, Vol.4, pp. 608-

Непатентный документ 2: J. Med. Chem., 2003, Vol. 46, pp. 5587-5596.

Непатентный документ 3: Mol. Endocrinol., 2010, Vol. 24 (1), pp. 240-249.

Непатентный документ 4: Molecular and Cellular Endocrinology, 2008, Vol. 286, pp. 69-74.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачи, поставленные перед изобретением

Целью настоящего изобретения является получение гликозилированных полипептидов, обладающих сродством к рецепторам соматостатина и лучшей стабильностью в крови по сравнению с соматостатином.

Средства для решения задач

В результате многократных исследований для решения вышеуказанных проблем авторы настоящего изобретения обнаружили гликозилированные полипептиды, которые сохраняют сродство к рецепторам соматостатина и обладают лучшей стабильностью в крови.

Иными словами, настоящее изобретение имеет отношение к гликозилированным полипептидам, выбранным из группы, состоящей из: (A) SRIF14, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1; (B) полипептидов, у которых одна или несколько аминокислот подверглись делеции, замене или вставке по сравнению со SRIF14, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1; (С) аналогов SRIF14; (D) полипептидов, на 80% или больше гомологичных SRIF14, состоящему из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1; (E) полипептидов, дополнительно содержащих N аминокислот (где N означает целое число от 1 или больше до 20 или меньше) на N-концевой стороне (А)-(D); и (F) полипептидов, дополнительно содержащих M аминокислот (где М означает целое число от 1 или больше до 6 или меньше) на C-концевой стороне (A)-(D); которые отличаются тем, что у них по меньшей мере одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту, а полипептид обладает сродством к соматостатиновым рецепторам.

При этом одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что у них по меньшей мере одна из аминокислот, замененных на гликозилированные аминокислоты, представлена аминокислотой, соответствующей положению 19 у SRIF14.

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что у данного полипептида (E) по меньшей мере одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту, причем по меньшей мере одна из аминокислот, замененных на гликозилированные аминокислоты, приходится на какую-либо из указанных N аминокислот на N-концевой стороне данного полипептида (E).

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что у данного полипептида (F) по меньшей мере одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту, причем по меньшей мере одна из аминокислот, замененных на гликозилированные аминокислоты, приходится на какую-либо из указанных М аминокислот на N-концевой стороне данного полипептида (F).

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что у данного полипептида (E) по меньшей мере одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту, а также последовательность из указанных N аминокислот, добавленных с N-концевой стороны, представлена X-Y-, где X означает последовательность из любых L аминокислот (где L означает целое число от 1 или больше до 6 или меньше), а Y означает аминокислот подверглись делеции, замене или вставке по сравнению с вышеприведенными последовательностями (2)-(14).

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что по меньшей мере одна из аминокислот, замененных на гликозилированные аминокислоты, приходится на какую-либо из L аминокислот, обозначенных как X в X-Y-, представляющем последовательность из N аминокислот, добавленных с N-концевой стороны полипептида (E).

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что N аминокислот, добавленных с N-концевой стороны, соединяются с N-концевой стороной через линкер.

Далее, в другом воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения полипептид выбран из группы, состоящей из: (A) SRIF28, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 2; (B) полипептидов, у которых одна или несколько аминокислот подверглись делеции, замене или вставке по сравнению со SRIF24, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 2; (C) аналогов SRIF28; (D) полипептидов, на 80% или больше гомологичных SRIF28, состоящему из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 2; (E) полипептидов, дополнительно содержащих J аминокислот (где J означает целое число от 1 или больше до 15 или меньше) на N-концевой стороне (A)-(D); и (F) полипептидов, дополнительно содержащих K аминокислот (где K означает целое число от 1 или больше до 6 или меньше) на C-концевой стороне (A)-(D); которые отличаются тем, что у них по меньшей мере одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту, а полипептид обладает сродством к соматостатиновым рецепторам.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что по меньшей мере одна из аминокислот, замененных на гликозилированные аминокислоты, представлена по меньшей мере одной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты, соответствующей положению 1, аминокислоты, соответствующей положению 5, аминокислоты, соответствующей положению 9, аминокислоты, соответствующей положению 12, аминокислоты, соответствующей положению 13, аминокислоты, соответствующей положению 14, и аминокислоты, соответствующей положению 19 у SRIF28.

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что у данного полипептида (E) по меньшей мере одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту, причем по меньшей мере одна из аминокислот, замененных на гликозилированные аминокислоты, приходится на указанные J аминокислот на N-концевой стороне данного полипептида (E).

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что у данного полипептида (F) по меньшей мере одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту, причем по меньшей мере одна из аминокислот, замененных на гликозилированные аминокислоты, приходится на указанные K аминокислот на N-концевой стороне данного полипептида (F).

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что по сродству к соматостатиновым рецепторам они обладают сродством по меньшей мере к двум или нескольким рецепторам, выбранным из группы, состоящей из SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 и SSTR5.

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что они обладают сродством по меньшей мере к одному из SSTR1 и SSTR4.

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что они обладают сродством и к SSTR1, и к SSTR4.

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что они обладают сродством ко всем из SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 и SSTR5.

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что они обладают повышенной стабильностью в крови по сравнению со SRIF28.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что каждая из гликозилированных аминокислот представлена гликозилированным Asn или гликозилированным Cys.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что у каждой из гликозилированных аминокислот сахаридная цепочка соединяется с аминокислотой без линкера.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что у каждой из гликозилированных аминокислот сахаридная цепочка состоит из 4 или больше сахаридов.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что у каждой из гликозилированных аминокислот сахаридная цепочка представлена биантеннальной сахаридной цепочкой комплексного типа, триантеннальной сахаридной цепочкой комплексного типа или тетраантеннальной сахаридной цепочкой комплексного типа.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что у каждой из гликозилированных аминокислот сахаридная цепочка представлена биантеннальной сахаридной цепочкой комплексного типа.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что биантеннальная сахаридная цепочка комплексного типа представлена сахаридной цепочкой, выбранной из группы, состоящей из дисиалосахаридной цепочки, моносиалосахаридной цепочки, асиалосахаридной цепочки, диGlcNAc-сахаридной цепочки и диманнозосахаридной цепочки.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что у каждой из гликозилированных аминокислот сахаридная цепочка представлена следующей формулой:

[химическая формула 1]

где R¹ и R² одинаковы или различны и означают:

[химическая формула 2]

а Ac означает ацетил.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что сахаридная цепочка содержит по меньшей мере одну сиаловую кислоту на невосстанавливающем конце, а карбоксигруппа данной сиаловой кислоты модифицирована алкиламиногруппой, бензилом, аминогруппой или аминоэтиламино-группой, содержащей 1-30 атомов углерода.

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что они содержат несколько гликозилированных аминокислот, причем сахаридные цепочки на каждой из гликозилированных аминокислот все одинаковы.

Далее, в одном воплощении гликозилированных полипептидов настоящего изобретения такие гликозилированные полипептиды отличаются тем, что они содержат Cys в положениях, соответствующих Cys в положении 17 и Cys в положении 28 у SRIF28, причем эти Cys связаны друг с другом дисульфидной связью.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что С-конец у таких гликозилированных полипептидов амидирован.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что на N-конце таких гликозилированных полипептидов вставлена азидогруппа.

Далее, одно воплощение гликозилированных полипептидов настоящего изобретения отличается тем, что они помечены меткой.

Далее, следующий аспект настоящего изобретения касается фармацевтических композиций, отличающихся тем, что они содержат (I) гликозилированный полипептид, описанный выше, и/или его фармацевтически приемлемую соль, и (II) фармацевтически приемлемый носитель.

Далее, одно воплощение фармацевтических композиций настоящего изобретения отличается тем, что сахаридные цепочки у данного гликозилированного полипептида практически одинаковы.

Далее, одно воплощение фармацевтических композиций настоящего изобретения отличается тем, что они применяются для лечения или профилактики связанных с соматостатином заболеваний.

Далее, одно воплощение фармацевтических композиций настоящего изобретения отличается тем, что связанное с соматостатином заболевание представляет собой по меньшей мере одно заболевание, выбранное из группы, состоящей из акромегалии, гигантизма, болезни Альцгеймера и других форм деменции, рака, продуцирующих гормоны опухолей, эндокринных опухолей, карциноидов, VIРомы, инсулиномы, глюкагономы, болезни Кушинга, нарушений секреции гормонов, диабета и его осложнений, болей, артрита, диареи, язвы желудка, воспалительной болезни кишечника, синдрома раздраженного кишечника, желудочно-кишечной непроходимости, непроходимости кишечника, послеоперационного рестеноза, радиационного повреждения, глазных заболеваний, сухости глаз, глаукомы, интерстициального кератита, ирита, катаракты и конъюнктивита.

Далее, следующий аспект настоящего изобретения касается способа лечения или профилактики связанных с соматостатином заболеваний, который отличается введением эффективного количества описанных выше гликозилированных полипептидов.

Далее, одно воплощение способа лечения или профилактики настоящего изобретения отличается тем, что связанное с соматостатином заболевание представлено по меньшей мере одним заболеванием, выбранным из группы, состоящей из акромегалии, гигантизма, болезни Альцгеймера и других форм деменции, рака, продуцирующих гормоны опухолей, эндокринных опухолей, карциноидов, VIРомы, инсулиномы, глюкагономы, болезни Кушинга, нарушений секреции гормонов, диабета и его осложнений, болей, артрита, диареи, язвы желудка, воспалительной болезни кишечника, синдрома раздраженного кишечника, желудочно-кишечной непроходимости, непроходимости кишечника, послеоперационного рестеноза, радиационного повреждения, глазных заболеваний, сухости глаз, глаукомы, интерстициального кератита, ирита, катаракты и конъюнктивита

Эффекты изобретения

Гликозилированные полипептиды настоящего изобретения обладают сродством к соматостатиновым рецепторам и обладают улучшенной стабильностью в крови по сравнению с соматостатином. Кроме того, гликозилированные полипептиды настоящего изобретения могут применяться для лечения связанных с соматостатином заболеваний в силу вышеприведенных характеристик.

Далее, поскольку сахаридные цепочки, вставленные в гликозилированный соматостатин настоящего изобретения, легко разрушаются in vivo, то не возникает никаких вызванных препаратом проблем при их накоплении в живом организме.

Далее, часть или все сахаридные цепочки, вставленные в гликозилированный соматостатин настоящего изобретения, представлены сахаридами, присутствующими в живом организме, напр., млекопитающих и птиц, в том числе и людей, или же их модифицированными вариантами, то возможность проявления побочных эффектов или антигенности при введении in vivo низка. Существует меньше опасений по поводу, напр., появления аллергических реакций или выработки антител и тем самым потери эффекта препарата.

Кроме того, поскольку многие сахаридные цепочки, используемые при этом, относительно коротки, то можно получить цепочки с однородной структурой, минуя сложные производственные операции. Соответственно, можно стабильно получать в больших масштабах высококачественные гликозилированные полипептиды фармацевтического уровня, обладающие активностью соматостатина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1A-1D представлены названия каждого соединения гликозилированных полипептидов из воплощений настоящего изобретения и информация об аминокислотной последовательности гликозилированных полипептидов с указанием названия соединения. Далее, на фиг. 1E представлен график, на котором приведены значения IC50 в отношении подавления продукции цАМФ (агонистической активности) при обработке экспрессирующих соматостатиновые рецепторы клеток SRIF14, SRIF28 и гликозилированными полипептидами из воплощений настоящего изобретения.

На фиг. 2 представлены графики изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном или подкожном введении крысам SRIF28 и S1C(дисиало)-SRIF28. На фиг. 2 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 3 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам SRIF28, S1C(дисиало)-SRIF28, N5C(дисиало)-SRIF28 и S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)-SRIF28. На фиг. 3 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 4 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам SRIF28, S1C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало)-R13C(дисиало)-SRIF28 и S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28. На фиг. 4 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 5 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам S1C(дисиало)-SRIF28, N5C(дисиало)-SRIF28, A9C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)-SRIF28, N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28 и S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28. На фиг. 5 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 6 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам S1C(дисиало)-SRIF28, S1-2С(дисиало)-SRIF2 и S1-3С(дисиало)-SRIF28. На фиг. 6 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 7 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам S1C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало(амид))-SRIF28 и S1C(дисиало(аминоэтиламид))-SRIF28. На фиг. 7 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 8 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам S1C(дисиало)-SRIF28, SD1C(дисиало)-D-Trp22-SRIF28 и S1C(дисиало(Bn))-SRIF28. На фиг. 8 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 9 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам S1C(дисиало)-SRIF28, R13C(дисиало)-SRIF28 и K14C(дисиало)-SRIF28. На фиг. 9 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 10 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам S1C(дисиало)-SRIF28, E12C(дисиало)-SRIF28, N19C(дисиало)-SRIF28, 29C(дисиало)-SRIF28, S1C(моносиалo)-SRIF28 и S1C(асиало)-SRIF28. На фиг. 10 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 11 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам S1C(дисиало)-SRIF28, К14С(дисиало)-SRIF28 и C(дисиало)-SRIF14. На фиг. 11 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 12 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам C(дисиало)-SRIF14, C(дисиало)-линкер C12-SRIF14 и C(дисиало)-линкер PEG-SRIF14. На фиг. 12 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 13 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам SRIF28, S1C(дисиало)-SRIF28, S1C(асиало)-SRIF28, S1C(диGlcNAc)-SRIF28, S1C(диMan)-SRIF28 и S1C(GlcNAc)-SRIF28. На фиг. 13 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 14 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам S1C(дисиало)-SRIF28, S1C(трисиало)-SRIF28, S1C(тетрасиало)-SRIF28, S1-2C(дисиало)-SRIF28 и S1C(Asn(дисиало))-SRIF28. На фиг. 14 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 15 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам SRIF28, S1C(дисиало)-SRIF28, S1-2С(дисиало)-SRIF28, S1-3C(дисиало)-SRIF28 и S1-4С(дисиало)-SRIF28. На фиг. 15 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 16 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам SRIF14, C(дисиало)-SRIF14, C(дисиало)-K-SRIF14, C(дисиало)-R-K-SRIF14, 2C(дисиало)-R-K-SRIF14 и 3C(дисиало)-R-K-SRIF14. На фиг. 16 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 17 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам S1C(асиало)-SRIF28, S1-2C(асиало)-SRIF28 и S1-3C(асиало)-SRIF28. На фиг. 17 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 18 представлены графики изменения концентрации в плазме при внутривенном или подкожном введении крысам S1C(дисиало)-SRIF28, S1-2C(дисиало)-SRIF28, S1-2C(асиало)-SRIF28, S1-2C(дисиало(амид))-SRIF28, S1-2C(дисиало(Bn))-SRIF28 и С(дисиало(аминоэтиламид))-S1C(дисиало)-SRIF28. На фиг. 18 слева представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при внутривенном введении, а справа представлены изменения концентрации в плазме каждого полипептида при подкожном введении.

На фиг. 19 представлен график, на котором приведены результаты теста на стабильность в плазме при использовании плазмы крыс для гликозилированных полипептидов из воплощений настоящего изобретения.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

"Соматостатин" в настоящем изобретении означает SRIF14, состоящий из последовательности в 14 аминокислот, или SRIF28, состоящий из последовательности в 28 аминокислот.

В настоящем описании в качестве положения 1 принимается N-концевой Ser в аминокислотной последовательности SRIF28, а в качестве положения 28 - C-концевой Cys. SRIF14 абсолютно совпадает по аминокислотной последовательности в положениях 15-28 с аминокислотной последовательностью SRIF28. Следует отметить, что положение 15 в аминокислотной последовательности SRIF28 занимает Ala, а N-концевой Ala принят в качестве положения 15 в аминокислотной последовательности SRIF14 (SEQ ID NO. 1) в соответствии с положением 15 у SRIF28. SRIF14 и SRIF28 содержат дисульфидную связь по Cys в положении 17 и Cys в положении 28.

SRIF14 имеет приведенную ниже аминокислотную последовательность (SEQ ID NO. 1). В нижеприведенной аминокислотной последовательности 15 у "Ala15" означает Ala в положении 15:

SRIF28 имеет приведенную ниже аминокислотную последовательность (SEQ ID NO. 2):

"Аминокислота" в настоящем изобретении применяется в самом широком смысле и включает не только природные аминокислоты, но и не встречающиеся в природе аминокислоты, как-то варианты и производные аминокислот. Специалистам в свете этого широкого определения должно быть понятно, что примеры аминокислот в настоящем изобретении включают, напр., встречающиеся в природных белках L-аминокислоты; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, как-то варианты и производные аминокислот; не встречающиеся в природных белках аминокислоты, такие как норлейцин, β-аланин и орнитин; и химически синтезированные соединения, обладающие хорошо известными характерными свойствами аминокислот. Примеры не встречающихся в природе аминокислот включают α-метиламинокислоты (как-то α-метилаланин), D-аминокислоты, аминокислоты типа гистидина (как-то 2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин и α-метилгистидин), аминокислоты с добавлением метилена в боковой цепи ("гомо"-аминокислоты), и аминокислоты, у которых карбоксильная функциональная группа в боковой цепи аминокислоты замещена сульфонатом (типа цистеиновой кислоты). Как известно, некоторые из аналогов соматостатина, обладающих сродством к соматостатиновым рецепторам, содержат не встречающиеся в природе аминокислоты. В предпочтительном аспекте аминокислоты, содержащиеся в соединениях настоящего изобретения, состоят только из природных аминокислот.

В настоящем изобретении, если одна из аминокислот или несколько аминокислот подвергаются делеции, замене или вставке, то количество аминокислот при этом не имеет особых ограничений, если только сохраняется сродство к соматостатиновым рецепторам, причем оно составляет 1-9, предпочтительно 1-5 и более предпочтительно 1-3 аминокислоты, или же 20% или меньше, а предпочтительно 10% или меньше от всей длины. Аминокислоты, подлежащие замене или вставке, могут представлять собой природные аминокислоты, не встречающиеся в природе аминокислоты или аналоги аминокислот, предпочтительно природные аминокислоты. Примеры пептидов соматостатина, у которых одна из аминокислот или несколько аминокислот подверглись делеции, замене или вставке, включают, напр., пептиды соматостатина, у которых Trp в положении 22 заменен на D-форму Trp (D-Trp), Asn в положении 19 подвергнут делеции (J. Med. Chem., 2001, 44, 2238-2246), Phe в положении 25 заменен на Tyr, а Met в положении 8 заменен на Leu (Endocrinology, 1982, 10:1049-1051).

"Аналог SRIF14 или SRIF28" в настоящем изобретении означает полипептид, который по структуре близок к соматостатину, и/или полипептид, структура которого перекрывается со структурой соматостатина, напр., полипептид, у которого одна из аминокислот или несколько аминокислот соматостатина подверглись консервативной замене, модифицированный соматостатин, фрагмент соматостатина, обладающий сродством к соматостатиновым рецепторам, или удлиненный соматостатин, обладающий сродством к соматостатиновым рецепторам.

"У которого одна из аминокислот или несколько аминокислот соматостатина подверглись консервативной замене" в настоящем изобретении означает такие замены аминокислот, при которых показатели гидрофильности и/или гидрофобности остаются близкими между исходной аминокислотой и заменяющей ее аминокислотой, при этом не происходит явного снижения или уменьшения сродства к соматостатиновым рецепторам до и после такой замены.

"Модифицированный соматостатин" в настоящем изобретении означает модифицированный вариант соматостатина, включая природные варианты соматостатина или искусственно модифицированные соединения соматостатина. Примеры таких модификаций включают, напр., алкилирование, ацилирование (как-то ацетилирование), амидирование, карбоксилирование, образование сложных эфиров, образование дисульфидных связей, гликозилирование, липидирование, фосфорилирование, гидроксилирование и присоединение меченых компонентов к остаткам одной или нескольких аминокислот соматостатина.

"Фрагмент соматостатина, обладающий сродством к соматостатиновым рецепторам" в настоящем изобретении означает пептид, у которого произошла делеция одной или нескольких аминокислот из N- и/или C-конца соматостатина, но сохраняется сродство к соматостатиновым рецепторам.

"Удлиненный соматостатин, обладающий сродством к соматостатиновым рецепторам" в настоящем изобретении означает пептид, у которого произошла вставка одной или нескольких аминокислот к N- и/или C-концу SRIF28 или SRIF14, но сохраняется сродство к соматостатиновым рецепторам.

Гликозилированные полипептиды настоящего изобретения включают гликозилированные полипептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, которая на 80% или больше гомологична аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 1; полипептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, которая на 80% или больше гомологична аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO. 2; или полипептиды со вставкой дополнительных аминокислот к N- или С-концу этих полипептидов; при этом по меньшей мере одна аминокислота подверглась замене на гликозилированную аминокислоту, а сам полипептид обладает сродством к соматостатиновым рецепторам.

У полипептидов, гомологичных SEQ ID NO. 1 или 2, степень гомологичности предпочтительно составляет 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше либо 95% или больше, если только они обладают сродством к соматостатиновым рецепторам.

Гликозилированные полипептиды настоящего изобретения также включают полипептиды с добавлением дополнительных аминокислот по N- и/или C-концу SRIF14 или SRIF28, как описано выше.

У гликозилированных полипептидов настоящего изобретения не существует особых ограничений на аминокислоты, добавляемые дополнительно по N-концу SRIF14, если только они сохраняют сродство к соматостатиновым рецепторам. Например, может быть добавлено от 1 или больше до 20 или меньше аминокислот.

При этом аминокислоты, добавляемые дополнительно по N-концу SRIF14, могут быть представлены в виде X-Y-, где X означает аминокислоту, которая связывается непосредственно с N-концевой аминокислотой полипептида SRIF14, а Y означает любую из нижеследующих аминокислотных последовательностей (1)-(15):

(15) последовательности, у которых одна или несколько аминокислот подверглись делеции, замене или вставке по сравнению с вышеприведенными последовательностями (2)-(14).

Кроме того, X означает любое число аминокислот от 1 или больше до 6 или меньше, то есть 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот. Предпочтительно X означает гликозилированную аминокислоту, более предпочтительно гликозилированный Asn или гликозилированный Cys.

У гликозилированных полипептидов настоящего изобретения нет особых ограничений на аминокислоты, добавляемые дополнительно по N-концу SRIF28, если только они сохраняют сродство к соматостатиновым рецепторам. Например, может быть добавлено от 1 или больше до 6 или меньше аминокислот, то есть 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот. Аминокислоты, добавляемые дополнительно по N-концу SRIF28, предпочтительно представлены гликозилированными аминокислотами, более предпочтительно гликозилированным Asn или гликозилированным Cys. Более того, все из этих от 1 или больше до 6 или меньше аминокислот могут быть гликозилированными аминокислотами.

У гликозилированных полипептидов настоящего изобретения нет особых ограничений на аминокислоты, добавляемые дополнительно по C-концу SRIF14 или SRIF28, если только они сохраняют сродство к соматостатиновым рецепторам. Например, может быть добавлено от 1 или больше до 6 или меньше аминокислот, то есть 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот. Аминокислоты, добавляемые дополнительно по C-концу SRIF14 или SRIF28, предпочтительно представлены гликозилированными аминокислотами, более предпочтительно гликозилированным Asn или гликозилированным Cys. Более того, все из этих от 1 или больше до 6 или меньше аминокислот могут быть гликозилированными аминокислотами.

"Пептид, у которого дополнительно вставлена одна или несколько аминокислот с N-концевой стороны соматостатина (положение 1 у SRIF28 или положение 15 у SRIF14)" в настоящем изобретении, в случае SRIR28, означает такие пептиды, у которых дополнительно вставлена любая аминокислота или гликозилированная аминокислота по N-концевому Ser в положении 1. Кроме того, в случае SRIF14 это означает такие пептиды, у которых дополнительно вставлена любая аминокислота или гликозилированная аминокислота по N-концевому Ala в положении 15.

Точно так же "пептид, у которого дополнительно вставлена одна или несколько аминокислот с C-концевой стороны соматостатина (положение 28 у SRIF28 или SRIF14)" означает такие пептиды, у которых дополнительно вставлена любая аминокислота или гликозилированная аминокислота по Cys в положении 28 у SRIF28 или SRIF14.

Аминокислота также может быть дополнительно вставлена в гликозилированный полипептид настоящего изобретения по его N- или C-концу через линкер. Примеры таких линкеров включают, напр., алкильную или полиэтиленгликолевую цепочку, содержащую амино- и карбоксильные группы на двух концах таким образом, что она может образовать пептидную связь с аминокислотой. Примеры таких линкеров включают, напр., -NH-(CH₂)_n-CO- (где n означает целое число без ограничения, если только оно не ингибирует функцию данного линкера, но предпочтительно целое число от 1 до 15) или -NH-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-CO- (где m означает целое число без ограничения, если только оно не ингибирует функцию данного линкера, но предпочтительно целое число от 1 до 7). Более конкретно, такие примеры включают -NH-(CH₂)₁₁-CO- (линкер C12) или -NH-(CH₂CH₂O)₃-CH₂CH₂-CO- (линкер PEG). Кроме того, нет особых ограничений на аминокислоты, вставляемые в гликозилированный полипептид через линкер, но предпочтительными являются гликозилированные аминокислоты. Примеры гликозилированных аминокислот включают гликозилированный Asn или гликозилированный Cys.

Кроме того, в одном воплощении настоящего изобретения в гликозилированные полипептиды также можно вводить азидогруппы по N-концу. Азидирование N-конца гликозилированного полипептида предпочтительно, так как оно позволяет избирательно вводить различные молекулы с помощью реакции циклоприсоединения азида-алкилена [3+2] или реакции Стаудингера. Способ азидирования гликозилированных полипептидов не имеет особых ограничений, но оно может осуществляться, напр., путем конденсации N-конца гликопептида, синтезированного на смоле при твердофазном синтезе, и замещенной азидом жирной кислоты с помощью конденсирующего реагента. Замещенные азидом жирные кислоты включают 4-азидобутановую кислоту, 5-азидопентановую кислоту и 6-азидогексановую кислоту.

Кроме того, в одном воплощении настоящего изобретения в гликозилированные полипептиды также можно вставлять служащие меткой соединения по N-концу. Примеры соединений, используемых в качестве метки, включают, без ограничения, напр., биотин, флуоресцентные красители и хелаторы ионов металлов. Служащее меткой соединение может соединяться с N-концом гликопептида непосредственно или же через линкер. Например, при добавлении биотина в качестве метки по N-концу гликопептида может использоваться сильное связывание его с авидином, что позволяет использовать их в качестве реагентов для исследований, средств для клинических испытаний или адресной терапии.

Добавление служащего меткой соединения в гликозилированный полипептид настоящего изобретения может осуществляться стандартным методом, хорошо известным специалистам в данной области. Например, можно конденсировать N-концевую часть гликозилированного полипептида на смоле при твердофазном синтезе со служащим меткой соединением с помощью конденсирующего реагента.

"Гликозилированный полипептид" настоящего изобретения характеризуется тем, что у него по меньшей мере одна аминокислота заменена гликозилированной аминокислотой.

"Гликозилированные полипептиды" в настоящем изобретении включают, напр., полипептиды, у которых по меньшей мере одна аминокислота соматостатина заменена на гликозилированную аминокислоту, и полипептиды, у которых по меньшей мере одна аминокислота у вышеприведенных аналогов соматостатина заменена на гликозилированную аминокислоту, причем каждые из них относятся к гликозилированным полипептидам настоящего изобретения, даже если одна из аминокислот или несколько аминокислот, только не гликозилированные аминокислоты, будут подвергнуты делеции, замене или вставке. Также к гликозилированным полипептидам настоящего изобретения относятся и пептиды, у которых по меньшей мере одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту в пептидах с амидированным C-концом ((типа SRIF14NH₂ с аминокислотной последовательностью Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH₂ (SEQ ID NO. 3) или SRIF28NH₂ с аминокислотной последовательностью Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH₂ (SEQ ID NO. 4)). Кроме того, к гликозилированным полипептидам также относятся и соли этих пептидов.

Соли в настоящем изобретении могут быть представлены любыми из солей, образованных с кислотами или основаниями. Кислоты, которые обычно используются для получения солей с кислотами, это неорганические кислоты, такие как соляная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота и фосфорная кислота, или же органические кислоты, такие как n-толуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, n-бромфенилсульфоновая кислота, карбоксикислоты, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота и уксусная кислота. Соли, образованные с основаниями, включают соли, происходящие из неорганических оснований, таких как гидроксид аммония или гидроксиды щелочных и щелочноземельных металлов, карбонаты и бикарбонаты, в частности, предпочтительными являются фармацевтически приемлемые соли.

"Гликозилированная (с прикрепленной сахаридной цепочкой) аминокислота" в настоящем изобретении есть такая аминокислота, с которой связана сахаридная цепочка, причем аминокислота может соединяться с сахаридом через линкер. Место связывания аминокислоты с сахаридной цепочкой не имеет особых ограничений, но аминокислота предпочтительно соединяется с восстанавливающим концом сахаридной цепочки.

Тип аминокислоты, с которой соединяется сахаридная цепочка, не имеет особых ограничений, так что может использоваться любая природная аминокислота или не встречающаяся в природе аминокислота. В отношении гликозилированных аминокислот, имеющих одинаковую или близкую структуру с теми, которые присутствуют в составе гликопептидов (гликопротеинов) in vivo, то предпочтительно гликозилированная аминокислота представлена гликозилированным Asn типа N-связанной сахаридной цепочки, а также гликозилированным Ser и гликозилированным Thr, а особенно предпочтительно гликозилированным Asn типа О-связанной сахаридной цепочки.

Кроме того, если сахаридная цепочка соединяется с аминокислотой через линкер, то в отношении легкости связывания с линкером предпочтительными аминокислотами из гликозилированных аминокислот являются аминокислоты, содержащие две или несколько карбоксильных групп в молекуле, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, аминокислоты, содержащие две или несколько аминогрупп в молекуле, такие как лизин, аргинин, гистидин и триптофан, аминокислоты, содержащие гидроксильную группу в молекуле, такие как серии, треонин и тирозин, аминокислоты, содержащие тиоловую группу в молекуле, такие как цистеин, и аминокислоты, содержащие амидную группу в молекуле, такие как аспарагин и глутамин. В частности, в отношении реакционной способности предпочтительны аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, серии, треонин, цистеин, аспарагин и глутамин.

Считается, что у любых гликозилированных полипептидов настоящего изобретения, если структура сахаридной цепочки, другие структуры, чем сахаридная цепочка, количество сайтов для присоединения сахаридных цепочек и количество добавленных сахаридных цепочек будут одинаковы, то у них не будет больших отличий по времени полужизни в крови независимо от того, что гликозилированная аминокислота будет представлена гликозилированным Asn (без линкера) или гликозилированным Cys (с линкером).

Если сахаридная цепочка соединяется с аминокислотой через линкер, то можно использовать линкеры, широко применяющиеся в данной области, примеры которых включают, напр., -NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂- (где n означает целое число без ограничений, если только оно не ингибирует функцию данного линкера, но предпочтительно это целое число от 0 до 4), C_1-10-полиметилен, -CH₂-R- (где R означает группу, образующуюся при отделении одного атома водорода от группы, выбранной из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, карбоциклической группы, замещенной карбоциклической группы, гетероциклической группы и замещенной гетероциклической группы), и -(CO)-(CH₂)_a-(CO)- (где n означает целое число без ограничений, если только оно не ингибирует функцию данного линкера, но предпочтительно это целое число от 0 до 4).

У гликозилированной аминокислоты, если сахаридная цепочка соединяется с аминокислотой на остове соматостатина через линкер, то предпочтительно, чтобы линкер также содержал аминокислоту на конце сахаридной цепочки. Тип аминокислоты не имеет особых ограничений, но предпочтительным примером может служить Asn.

Способ получения гликозилированных полипептидов настоящего изобретения не должен никоим образом ограничиваться их описанием (типа выражения "гликозилированный полипептид, у которого одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту"), а гликозилированные полипептиды, полученные любым из способов A и B, описанных ниже, относятся к "гликозилированным полипептидам, у которых одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту". Кроме того, к гликозилированным полипептидам настоящего изобретения относятся, к примеру, такие гликозилированные полипептиды, у которых сахаридная цепочка без какой-либо связанной с ней аминокислоты соединяется с аминокислотой в пептиде непосредственно или через линкер; гликозилированные полипептиды, у которых к сахаридной цепочке в гликозилированном полипептиде добавлен дополнительный сахарид или сахаридная цепочка для того, чтобы удлинить уже вставленную сахаридную цепочку; гликозилированные полипептиды, у которых с амино- и/или карбоксильной группой гликозилированной аминокислоты связана одна или несколько аминокислот, которые дополнительно соединяются с одним или несколькими фрагментами соматостатина; и гликозилированные полипептиды, у которых сахаридная цепочка со связанной с ней аминокислотой соединяется с аминокислотой в пептиде через линкер; при условии, что окончательная структура у них совпадает.

У гликозилированных полипептидов настоящего изобретения количество аминокислот, подлежащих замене на гликозилированные аминокислоты, может быть соответствующим образом подобрано, напр., по биоактивности, к примеру, по стабильности в крови или подавлению секреции гормона роста и т.д., по количеству аминокислот, присутствующих в конечном гликозилированном полипептиде, или по молекулярному весу гликозилированного полипептида до и после гликозилирования. Например, предпочтительно подлежат замене 1-10, более предпочтительно 1-5 и еще более предпочтительно 1-3 аминокислоты. В отношении простоты, если требуемая активность получается при одной замене, то предпочтительно следует выбрать одну замену. В одном аспекте настоящего изобретения предпочтительно подлежат замене 2 или больше аминокислот, напр., предпочтительно подлежат замене 2-5, более предпочтительно 2-3 аминокислоты. В общем, у гликозилированных полипептидов с заменой одной аминокислоты соматостатина на гликозилированную аминокислоту обычно стабильность в крови повышается, а сродство к соматостатиновым рецепторам уменьшается при дополнительной замене одной или нескольких еще не гликозилированных аминокислот на гликозилированные аминокислоты. А с другой стороны, стабильность гликозилированных полипептидов в крови будет возрастать, и этим можно компенсировать снижение активности соматостатина или увеличить ее.

Кроме того, если у гликозилированного полипептида есть несколько сахаридных цепочек, то каждая сахаридная цепочка может присоединяться либо к следующим друг за другом аминокислотам, либо к аминокислотам с промежутками в аминокислотной последовательности гликозилированного полипептида. Плотное размещение сахаридных цепочек (подряд) является предпочтительным, так как при этом не будет резкого повышения концентрации в плазме. Кроме того, в отношении биодоступности предпочтительным способом гликозилирования является добавление нескольких сахаридных цепочек с промежутками, а не добавление их подряд к последовательным аминокислотам.

У гликозилированных полипептидов настоящего изобретения положения замены аминокислот на гликозилированные аминокислоты могут быть определенным образом подобраны в отношении сродства к нескольким типам соматостатиновых рецепторов.

В одном аспекте настоящего изобретения положения замены аминокислот на гликозилированные аминокислоты могут включать, в отношении гликозилированных полипептидов, обладающих сродством к нескольким типам рецепторов из числа соматостатиновых рецепторов SSTR1-SSTR5, напр., аминокислоты, соответствующие положению 19 у SRIF14, аминокислоты, вставленные в 1-м, 2-м, 3-м, 6-м, 10-м и 14-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14, и аминокислоты, вставленные в 1-м, 2-м положениях с C-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с C-концевой стороны SRIF14. Предпочтительно они включают аминокислоты, вставленные в 3-м, 6-м, 10-м и 14-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14.

Кроме того, точно так же в отношении обладающих сродством к нескольким типам рецепторов из числа SSTR1-SSTR5 они могут включать аминокислоты, соответствующие положениям 1, 5, 9, 12, 13, 14 и 19 у SRIF28, и аминокислоты, вставленные в 1-м и 2-м положениях с C-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных к С-концу SRIF28. Предпочтительно они включают аминокислоты, соответствующие положениям 1, 5, 9 и 12 у SRIF28.

Кроме того, в частности, примеры замены двух или нескольких аминокислот у гликозилированных полипептидов настоящего изобретения на гликозилированные аминокислоты могут включать, в отношении гликозилированных полипептидов, обладающих сродством к нескольким типам соматостатиновых рецепторов, напр., замены аминокислот, вставленных в 10-м и 14-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14; аминокислот, вставленных в 6-м и 10-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14; аминокислот, вставленных во 2-м и 14-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRJF14; аминокислот, вставленных в 14-м и 15-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14; аминокислот, вставленных в 14-м, 15-м и 16-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14; и аминокислот, вставленных в 6-м, 10-м и 14-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14. Предпочтительно они могут включать, напр., замены аминокислот, вставленных в 10-м и 14-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14; аминокислот, вставленных в 6-м и 10-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14; аминокислот, вставленных в 14-м и 15-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных к N-концевой стороны SRJF14; аминокислот, вставленных в 14-м, 15-м и 16-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14; и аминокислот, вставленных в 6-м, 10-м и 14-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14.

Кроме того, точно так же примеры замены двух или нескольких аминокислот на гликозилированные аминокислоты могут включать, в отношении гликозилированных полипептидов, обладающих сродством к нескольким типам соматостатиновых рецепторов, напр., замены аминокислот, соответствующих положениям 1 и 5; аминокислот, соответствующих положениям 5 и 9; аминокислот, соответствующих положениям 1 и 13; аминокислот, соответствующих положению 1, и аминокислот, вставленных в 1-ом положении с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны положения 1; аминокислот, соответствующих положению 1, и аминокислот, вставленных в 1-м и 2-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны положения 1; и аминокислот, соответствующих положениям 1, 5 и 9; предпочтительно замены аминокислот, соответствующих положениям 1 и 5; замены аминокислот, соответствующих положениям 5 и 9; замены аминокислот, соответствующих положению 1, и аминокислот, вставленных в 1-м положении из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны положения 1; аминокислот, соответствующих положению 1, и аминокислот, вставленных в 1-м и 2-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны положения 1; и замены аминокислот, соответствующих положениям 1, 5 и 9 у SRIF28.

В одном аспекте настоящего изобретения, положения для замены аминокислот на гликозилированные аминокислоты могут включать, в отношении стабильности гликозилированных полипептидов в крови, напр., аминокислоты, соответствующие положению 19 у SRIF14, аминокислоты, вставленные в 1-м, 2-м, 3-м, 6-м, 10-м, 14-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14, и аминокислоты, вставленные в 1-м и 2-м положениях с C-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных к C-концевой стороны SRIF14. Предпочтительно они могут включать аминокислоты, соответствующие положению 19 у SRIF14, аминокислоты, вставленные в 1-м и 2-м положениях с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14, и аминокислоты, вставленные в 1-м и 2-м положениях с C-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с C-концевой стороны SRIF14. Более предпочтительно это аминокислоты, соответствующие положению 19 у SRIF14, аминокислоты, вставленные в 1-ом положении с N-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с N-концевой стороны SRIF14, и аминокислоты, вставленные в 1-ом положении с C-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с C-концевой стороны SRIF14.

Кроме того, точно так же в отношении стабильности гликозилированных полипептидов в крови это будет, напр., одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот, соответствующих положениям 1,5, 9, 12, 13, 14 и 19 у SRIF28, и аминокислот, вставленных в 1-м и 2-м положениях с C-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с C-концевой стороны SRIF28, предпочтительно это одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот, соответствующих положениям 13, 14 и 19 у SRIF28, и аминокислот, вставленных в 1-м и 2-м положениях с C-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с C-концевой стороны SRIF28, и особенно предпочтительно это одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот, соответствующих положениям 14 и 19 у SRIF28, и аминокислот, вставленных в 1-м положении с C-концевой стороны из числа дополнительных аминокислот, добавленных с C-концевой стороны SRIF28. В частности, также предпочтительны замены аминокислот на удалении от N-концевой стороны SRIF28.

При этом "аминокислота, соответствующая определенной аминокислоте" означает аминокислоту в том же самом положении, которое соответствует аминокислотной последовательности SRIF14 или SRIF28, если только у гликозилированного полипептида нет вставки или делеции и т.п. аминокислот. Кроме того, если в аминокислотной последовательности гликозилированного полипептида имеется вставка или делеция аминокислот, то это означает аминокислоту в этом положении с учетом сдвига в аминокислотной последовательности при вставке или делеции аминокислоты. Например, у гликозилированного полипептида, имеющего последовательность Ser1-Ala2-Asn3-Ser4- в положениях 1-4, при вставке одной аминокислоты (Trp) между аминокислотами в положениях 2 и 3 (Ser-Ala-Trp-Asn-Ser-), аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении 3 (Asn), будет означать ту аминокислоту (Asn) в гликозилированном полипептиде, которая была смещена на одно положение в C-концевую сторону при вставке Trp.

В одном аспекте настоящего изобретения аминокислота, замененная на гликозилированную аминокислоту, предпочтительно представлена одной или несколькими аминокислотами, выбранными из других аминокислот, чем аминокислоты, соответствующие положениям 17, 21, 22, 23 и 28 у SRIF28, в частности, более предпочтительно это одна или несколько аминокислот, выбранных из других аминокислот, чем аминокислоты, соответствующие положениям 17, 22, 23 и 28 у SRIF28.

В одном аспекте настоящего изобретения при замене одной или нескольких аминокислот на гликозилированные аминокислоты может использоваться любая из вышеприведенных комбинаций для сайтов замены аминокислот на гликозилированные аминокислоты, без ограничения. Например, комбинация из одного сайта, выбранного из вышеприведенных предпочтительных сайтов, и других сайтов, выбранных из любых сайтов у SRIF14 или SRJF28; или комбинация из одного сайта, выбранного из вышеприведенных предпочтительных сайтов, и других сайтов, выбранных из любых одних или нескольких дополнительных аминокислот, добавленных по N-концу (положение 1 у SRIF28 или положение 15 у SRIF14) или по С-концу соматостатина, также входят в один из предпочтительных аспектов настоящего изобретения.

В одном аспекте настоящего изобретения сайты, по которым осуществляются делеции, замены или вставки других аминокислот, чем гликозилированные аминокислоты, предпочтительно составляют, напр., одна или несколько аминокислот, выбранных из других аминокислот, чем аминокислоты, соответствующие положениям 17, 22, 23 и 28 у SRIF28.

"Сахаридная цепочка" в настоящем изобретении означает соединение, состоящее из цепочки из одного или нескольких элементарных сахаридов (моносахаридов и/или их производных). Когда имеется цепочка из двух или нескольких элементарных сахаридов, то все элементарные сахариды соединяются друг с другом посредством дегидратационной конденсации с образованием гликозидной связи между ними. Такие сахаридные цепочки включают, без ограничения, напр., самые разнообразные моносахариды и полисахариды, содержащиеся in vivo (глюкоза, галактоза, манноза, фукоза, ксилоза, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), N-ацетилгалактозамин (GalNAc), сиаловые кислоты и их конъюгаты и производные)), а также сахаридные цепочки, образовавшиеся при расщеплении или при разложении конъюгированных биомолекул, таких как полисахариды, гликопротеины, протеогликаны, глюкозаминогликаны и гликолипиды. Сахаридные цепочки могут быть линейными или разветвленными.

Кроме того, "сахаридные цепочки" в настоящем изобретении также включают производные сахаридных цепочек, а примеры таких производных сахаридных цепочек включают, без ограничения, сахаридные цепочки, у которых входящие в их состав сахариды представлены, напр., сахаридами, содержащими карбоксильную группу (типа альдоновой кислоты, у которой С-положение 1 подвергается окислению с образованием карбоксикислоты типа D-глюконовой кислоты, которая представляет собой окисленную D-глюкозу, или уроновой кислоты, у которой концевой атом С образует карбоксикислоту - D-глюкуроновую кислоту, то есть окисленную D-глюкозу), сахаридами, содержащими аминогруппу или производные аминогруппы типа ацетилированной аминогруппы (типа N-ацетил-D-глюкозамина или N-ацетил-D-галактозамина), сахаридами, содержащими и аминогруппу, и карбоксильную группу (типа N-ацетилнейраминовой кислоты (сиаловой кислоты) и N-ацетилмурамовой кислоты), дезоксисахаридами (типа 2-дезокси-D-рибозы), сульфосахаридами, содержащими сульфатную группу, и фосфосахаридами, содержащими фосфатную группу.

Предпочтительными сахаридными цепочками в настоящем изобретении являются такие сахаридные цепочки, которые повышают стабильность соматостатина в крови и не ухудшают сродство к соматостатиновым рецепторам при их присоединении к соматостатину (при замене аминокислот у соматостатина на гликозилированные аминокислоты). В одном аспекте настоящего изобретения предпочтительными сахаридными цепочками являются такие сахаридные цепочки, при которых сохраняется сродство к нескольким типам рецепторов соматостатина, а еще более предпочтительны такие сахаридные цепочки, при которых сохраняется сродство ко всем рецепторам соматостатина при их присоединении к соматостатину (при замене аминокислот у соматостатина на гликозилированные аминокислоты).

Сахаридные цепочки у гликозилированных полипептидов настоящего изобретения не имеют особых ограничений и могут представлять собой такие сахаридные цепочки, которые существуют в виде гликоконъюгатов in vivo (типа гликопептидов или гликопротеинов, протеогликанов и гликолипидов), или же такие сахаридные цепочки, которые не существуют в виде гликоконъюгатов in vivo.

Сахаридные цепочки, существующие в виде гликоконъюгатов in vivo, являются предпочтительными в отношении того, что гликозилированные полипептиды настоящего изобретения вводятся in vivo. Примеры таких сахаридных цепочек включают N- или O-связанные сахаридные цепочки, которые представляют собой сахаридные цепочки, связанные с пептидом (или белком) in vivo в виде гликопептида (или гликопротеина).

Предпочтительно используются N-связанные сахаридные цепочки. N-связанные сахаридные цепочки могут включать, напр., формы с высоким содержанием маннозы, комплексные формы или гибридные формы, причем особенно предпочтительны комплексные формы.

Примеры предпочтительных сахаридных цепочек комплексного типа, используемых в настоящем изобретении, включают, напр., сахаридные цепочки, представленные следующей общей формулой:

[химическая формула 3]

где R¹ и R² являются одинаковыми или разными и означают:

[химическая формула 4]

а Ac означает ацетил.

У гликозилированных полипептидов настоящего изобретения сахаридная цепочка может соединяться с пептидом соматостатина таким способом, который отличается от O- и N-связывания, даже если сахаридная цепочка существует в виде гликоконъюгата in vivo. Например, как описано выше, к гликозилированным полипептидам настоящего изобретения относятся и такие, у которых сахаридная цепочка связана с Cys или Lys через линкер.

В одном аспекте настоящего изобретения предпочтительно сахаридные цепочки у гликозилированных полипептидов настоящего изобретения состоят из 4 или больше, например, 5 или больше, 7 или больше, в частности 9 или больше либо 11 или больше сахаридов.

В одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения сахаридные цепочки у гликозилированных полипептидов состоят из 5-11, 9-11 либо 11 сахаридов.

В одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения сахаридные цепочки у гликозилированных полипептидов настоящего изобретения представлены сахаридными цепочками биантеннального комплексного типа. Сахаридные цепочки комплексного типа отличаются тем, что они содержат два или несколько типов моносахаридов и имеют основную структуру, представленную ниже, и структуру лактозамина, представленную Galβ1-4GlcNAc.

Сахаридные цепочки биантеннального комплексного типа означают цепочки, которые содержат моноантеннальную сахаридную цепочку, состоящую из 0-3 сахаридов, связанных с каждой из двух манноз на конце основной структуры. Примером сахаридных цепочек биантеннального комплексного типа предпочтительно являются, напр., дисиало-сахаридные цепочки, представленные ниже:

моносиалосахаридные цепочки:

асиалосахаридные цепочки:

сахаридные цепочки типа диGlcNAc:

и диманнозосахаридные цепочки:

причем более предпочтительны дисиалосахаридные цепочки.

Кроме того, сахаридные цепочки комплексного типа по настоящему изобретению включают не только вышеприведенные биантеннальные сахаридные цепочки комплексного типа, но также и триантеннальные сахаридные цепочки комплексного типа (трижды разветвленные сахаридные цепочки комплексного типа) и тетраантеннальные сахаридные цепочки комплексного типа (четырежды разветвленные сахаридные цепочки комплексного типа). Например, триантеннальные и тетраантеннальные сахаридные цепочки комплексного типа могут включать трисиалосахаридные цепочки, представленные нижеследующими структурными формулами:

[химическая формула - 1]

[химическая формула - 2]

и тетрасиалосахаридные цепочки, представленные нижеследующей структурной формулой:

[химическая формула - 3]

Кроме того, триантеннальные и тетраантеннальные сахаридные цепочки комплексного типа могут включать сахаридные цепочки с делецией одного или нескольких сахаридов из невосстанавливающего конца этих трисиало- или тетрасиалосахаридных цепочек.

Кроме того, сахаридные цепочки комплексного типа настоящего изобретения включают цепочки с добавлением фукозы. Сахаридные цепочки комплексного типа с добавлением фукозы могут включать содержащие фукозу сахаридные цепочки комплексного типа, представленные нижеследующими структурными формулами:

[химическая формула - 4]

[химическая формула - 5]

[химическая формула - 6]

[химическая формула - 7]

[химическая формула - 8]

Кроме того, к ним также относятся сахаридные цепочки с делецией одного или нескольких сахаридов из невосстанавливающего конца этих содержащих фукозу сахаридных цепочек комплексного типа.

Кроме того, "дисиалосахаридные цепочки", "биантеннальные сахаридные цепочки комплексного типа", "моносиалосахаридные цепочки", "асиалосахаридные цепочки", "сахаридные цепочки типа диGlcNAc", "диманнозосахаридные цепочки", "триантеннальные сахаридные цепочки комплексного типа", "тетраантеннальные сахаридные цепочки комплексного типа" и "содержащие фукозу сахаридные цепочки комплексного типа" включают не только те, что представлены в вышеприведенных химических формулах, но также и те, у которых тип связывания отличается от примеров, приведенных в химических формулах, причем такие сахаридные цепочки также предпочтительно используются в качестве сахаридной цепочки настоящего изобретения. Примеры таких сахаридных цепочек включают, напр., дисиало- или моносиалосахаридные цепочки, у которых сиаловая кислота и галактоза соединяются связью (α2→3).

Кроме того, если сахаридная цепочка содержит сиаловую кислоту на невосстанавливающем конце, то можно использовать сахаридные цепочки, содержащие модифицированную карбоксигруппу сиаловой кислоты. Модификация карбоксигруппы сиаловой кислоты предпочтительно составляет группа, способная диссипировать отрицательный заряд карбоксигруппы или преобразовать его в положительный заряд, а примеры их включают, напр., алкиламиногруппы, бензильные группы, аминогруппы и аминоэтил-аминогруппы, содержащие 1-30 атомов углерода. Включение таких модифицированных групп будет диссипировать отрицательный заряд карбоксигруппы сиаловой кислоты (типа бензильной или аминогруппы) или преобразовать его в положительный заряд (типа аминоэтиламиногруппы), и тем самым дает возможность контролировать клиренс в крови или распределение гликозилированных полипептидов в организме.

Кроме того, сахаридные цепочки с высоким содержанием маннозы, используемые в настоящем изобретении, дополнительно содержат 2 или несколько манноз, связанных с основной структурой сахаридной цепочки комплексного типа, описанной выше. Поскольку сахаридные цепочки с высоким содержанием маннозы громоздкие, то стабильность в крови может повыситься при связывании с пептидом сахаридной цепочки с высоким содержанием маннозы. Предпочтительны сахаридные цепочки, содержащие 5-9 манноз, типа сахаридных цепочек с высоким содержанием маннозы у млекопитающих, но это могут быть и сахаридные цепочки, содержащие больше маннозы, типа сахаридных цепочек с высоким содержанием маннозы у дрожжей. Примеры сахаридных цепочек с высоким содержанием маннозы, предпочтительно используемых здесь, включают, напр., цепочки с высоким содержанием маннозы-5 (M-5):

и цепочки с высоким содержанием маннозы-9 (M-9):

Предпочтительные сахаридные цепочки в настоящем изобретении могут включать, напр., сахаридные цепочки, приведенные ниже, а именно сахаридные цепочки, структура которых идентична (то есть идентичен тип входящих в их состав сахаридов и тип связывания) сахаридным цепочкам, существующим в организме человека в виде гликопротеинов, связанных с белком (типа сахаридных цепочек, описанных в FEBS Letters Vol. 50, No. 3, Feb. 1975), или сахаридные цепочки с удалением одного или нескольких сахаридов из невосстанавливающего конца.

В одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения структура сахаридных цепочек у гликозилированных аминокислот в гликозилированных полипептидах настоящего изобретения может быть практически идентичной или же у них могут быть разные структуры сахаридных цепочек. Если структура сахаридных цепочек у гликозилированных полипептидов практически идентична, то они предпочтительно идентичны, напр., на 90% или больше или на 99% или больше, а наиболее предпочтительно, чтобы структура сахаридных цепочек была полностью идентична. В настоящем изобретении идентичность структуры сахаридных цепочек у гликопептидов означает то, что у гликозилированных полипептидов с добавлением двух или нескольких сахаридных цепочек тип сахаридов, входящих в состав сахаридных цепочек, порядок их соединения и способ соединения в гликопептидах будут идентичными при сравнении данных сахаридных цепочек друг с другом. Кроме того, в одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения предпочтительно, чтобы сахаридные цепочки у гликозилированных полипептидов настоящего изобретения были однородными. В настоящем изобретении однородность сахаридных цепочек у гликозилированных полипептидов означает то, что сайты гликозилирования в пептидах, тип каждого из сахаридов, входящих в состав сахаридных цепочек, порядок их соединения и способ соединения между сахаридами будут идентичны между гликопептидами при сравнении сахаридных цепочек между гликозилированными полипептидами, при этом структура сахаридных цепочек одинакова по меньшей мере на 90% или больше, предпочтительно на 95% или больше и более предпочтительно на 99% или больше. В частности, композиции и т.п., содержащие гликопептиды, у которых сахаридные цепочки однородны между гликопептидами, имеют постоянное качество, поэтому они особенно предпочтительны в таких областях, как производство фармацевтических препаратов или анализы. Содержание однородных сахаридных цепочек может быть измерено, к примеру, методом с применением, напр., HPLC, капиллярного электрофореза, ЯМР или масс-спектрометрии.

Предпочтительными гликозилированными полипептидами в настоящем изобретении являются гликозилированные полипептиды (SEQ ID NOs. 5-37, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 123-129, 133-135, 138-141, 148, 155 и 160), полученные в описанных ниже примерах 1-66. Иными словами, при следующей аминокислотной последовательности SRIF28:

предпочтительными являются:

(a1) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 1) (SEQ ID NO. 5);

(a2) гликозилированный полипептид, у которого Asn в положении 5 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 2) (SEQ ID NO. 6);

(a3) гликозилированный полипептид, у которого Ala в положении 9 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 3) (SEQ ID NO. 7);

(a4) гликозилированный полипептид, у которого Glu в положении 12 заменена на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 4) (SEQ ID NO. 8);

(a5) гликозилированный полипептид, у которого Arg в положении 13 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 5) (SEQ ID NO. 9);

(a6) гликозилированный полипептид, у которого Lys в положении 14 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 6) (SEQ ID NO. 10);

(a7) гликозилированный полипептид, у которого Ala в положении 15 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 7) (SEQ ID NO. 11);

(a8) гликозилированный полипептид, у которого Gly в положении 16 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 8) (SEQ ID NO. 12);

(a9) гликозилированный полипептид, у которого Lys в положении 18 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 9) (SEQ ID NO. 13);

(a10) гликозилированный полипептид, у которого Asn в положении 19 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 10) (SEQ ID NO. 14);

(a11) гликозилированный полипептид, у которого Phe в положении 21 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 11) (SEQ ID NO. 15);

(a12) гликозилированный полипептид, у которого Thr в положении 26 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 12) (SEQ ID NO. 16);

(a13) гликозилированный полипептид, у которого с C-концевой стороны от Cys в положении 28 добавлен еще один Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 13) (SEQ ID NO. 17);

(a14) гликозилированный полипептид, у которого с C-концевой стороны от Cys в положении 28 добавлен Thr-Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 14) (SEQ IDNO. 18);

(a15) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, а Trp в положении 22 заменен на D-форму Trp (Пример 15) (SEQ ID NO. 19);

(a16) гликозилированный полипептид, у которого Ala в положении 9 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, а Trp в положении 22 заменен на D-форму Trp (Пример 16) (SEQ ID NO. 20);

(a17) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, а с N-концевой стороны добавлен еще один Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 20) (SEQ ID NO. 21);

(a18) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 и Asn в положении 5 заменены на Cys с прикрепленными дисиалосахаридными цепочками (Пример 21) (SEQ ID NO. 22);

(a19) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 и Arg в положении 13 заменены на Cys с прикрепленными дисиалосахаридными цепочками (Пример 22) (SEQ ID NO. 23);

(a20) гликозилированный полипептид, у которого Asn в положении 5 и Ala в положении 9 заменены на Cys с прикрепленными дисиалосахаридными цепочками (Пример 23) (SEQ ID NO. 24);

(a21) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, а также с N-концевой стороны добавлены два Cys с прикрепленными дисиалосахаридными цепочками (Пример 24) (SEQ ID NO. 25);

(a22) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1, Asn в положении 5 и Ala в положении 9 заменены на Cys с прикрепленными дисиалосахаридными цепочками (Пример 25) (SEQ ID NO. 26);

(a23) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной моносиалосахаридной цепочкой (Пример 26) (SEQ ID NO. 27);

(a24) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной асиалосахаридной цепочкой (Пример 27) (SEQ ID NO. 28);

(a25) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной асиалосахаридной цепочкой, а также с N-концевой стороны добавлен еще один Cys с прикрепленной асиалосахаридной цепочкой (Пример 28) (SEQ ID NO. 29);

(a26) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной асиалосахаридной цепочкой, а также с N-концевой стороны добавлены еще два Cys с прикрепленными асиалосахаридными цепочками (Пример 29) (SEQ ID NO. 30);

(a27) гликозилированный полипептид, у которого Asn в положении 5 заменен на Asn с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 30) (SEQ ID NO. 31);

(a28) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Asn с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 31) (SEQ ID NO. 32);

(a29) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, а Asn в положении 19 заменен на Cys с присоединенным GlcNAc (Пример 32) (SEQ ID NO. 33);

(a30) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, a Asn в положении 19 заменен на гликозилированный диманнозой Cys (Пример 33) (SEQ ID NO. 34);

(a31) гликозилированный полипептид, у которого с N-концевой стороны от Ser в положении 1 добавлен еще один Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 34) (SEQ ID NO. 89);

(a32) гликозилированный полипептид, у которого Arg в положении 11 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 35) (SEQ ID NO. 91);

(a33) гликозилированный полипептид, у которого Phe в положении 20 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 36) (SEQ ID NO. 93);

(a34) гликозилированный полипептид, у которого Thr в положении 24 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 37) (SEQ ID NO. 95);

(a35) гликозилированный полипептид, у которого Phe в положении 25 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 38) (SEQ ID NO. 97);

(a36) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 27 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 39) (SEQ ID NO. 99);

(a37) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, а Phe в положении 25 заменен на Tyr (Пример 41) (SEQ ID NO. 103);

(a38) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, при этом C-конец амидирован (Пример 42) (SEQ ID NO. 105);

(a39) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем данный Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой биотинилирован (Пример 44) (SEQ ID NO. 110);

(a40) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем данный Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой биотинилирован через линкер PEG (Пример 45) (SEQ ID NO. 112);

(a41) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем по С-концу данного Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой введена азидогруппа (Пример 46) (SEQ ID NO. 114);

(a42) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой и Glu в положении 12 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 47) (SEQ ID NO. 116);

(a43) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной сахаридной цепочкой диGlcNAc (Пример 50) (SEQ ID NO. 123);

(a44) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной диманнозосахаридной цепочкой (Пример 51) (SEQ ID NO. 124);

(a45) гликозилированный полипептид, у которого Asn в положении 19 заменен на Cys с прикрепленной диманнозосахаридной цепочкой (Пример 52) (SEQ ID NO. 125);

(a46) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с присоединенным N-ацетилглюкозамином (Пример 53) (SEQ ID NO. 126);

(a47) гликозилированный полипептид, у которого Asn в положении 19 заменен на Cys с присоединенным N-ацетилглюкозамином (Пример 54) (SEQ ID NO. 127);

(a48) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной трисиалосахаридной цепочкой (Пример 55) (SEQ ID NO. 128);

(a49) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной тетрасиалосахаридной цепочкой (Пример 56) (SEQ ID NO. 129);

(a50) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем дисиалосахаридная цепочка модифицирована аминоэтиламиногруппой (Пример 57) (SEQ ID NO. 133);

(a51) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем дисиалосахаридная цепочка модифицирована аминогруппой (Пример 58) (SEQ ID NO. 134);

(a52) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем дисиалосахаридная цепочка блокирована бензилом (Пример 59) (SEQ ID NO. 135);

(a53) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем дисиалосахаридная цепочка модифицирована гексадециламиногруппой (Пример 60) (SEQ ID NO. 138);

(a54) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем дисиалосахаридная цепочка модифицирована аминогруппой, а с N-концевой стороны добавлен еще один Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем дисиалосахаридная цепочка модифицирована аминогруппой (Пример 61) (SEQ ID NO. 139);

(a55) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем дисиалосахаридная цепочка блокирована бензилом, а с N-концевой стороны добавлен еще один Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем дисиалосахаридная цепочка блокирована бензилом (Пример 62) (SEQ ID NO. 140);

(a56) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys, к которому присоединен Asn с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 63) (SEQ IDNO. 141);

(a57) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Asn с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, а Asn в положении 19 заменен на Cys с присоединенной диманнозой (Пример 64) (SEQ ID NO. 148);

(a58) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, а также с N-концевой стороны добавлен еще один Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, причем дисиалосахаридная цепочка модифицирована аминоэтиламиногруппой (Пример 65) (SEQ ID NO. 155); и

(a59) гликозилированный полипептид, у которого Ser в положении 1 заменен на Asn с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, а также с N-концевой стороны добавлены три Cys с прикрепленными дисиалосахаридными цепочками (Пример 66) (SEQ IDNO. 160).

Кроме того, при аминокислотной последовательности SRIF14:

предпочтительными являются:

(a60) гликозилированный полипептид, у которого с N-концевой стороны от Ala в положении 15 еще добавлен Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (Пример 17)(SEQIDNO. 35);

(a61) гликозилированный полипептид, у которого с N-концевой стороны от Ala в положении 15 еще добавлен Cys(c прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой)-Arg-Lys- (Пример 18) (SEQ ID NO. 36);

(a62) гликозилированный полипептид, у которого с N-концевой стороны от Ala в положении 15 еще добавлен Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой через линкер C12 (Пример 19) (SEQ ID NO. 37);

(a63) гликозилированный полипептид, у которого с N-концевой стороны от Ala в положении 15 еще добавлен Cys(c прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой)-Lys- (Пример 40) (SEQ ID NO. 101);

(a64) гликозилированный полипептид, у которого с N-концевой стороны от Ala в положении 15 еще добавлен Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой через линкер PEG (Пример 43) (SEQ ID NO. 107);

(a65) гликозилированный полипептид, у которого с N-концевой стороны от Ala в положении 15 еще добавлен Cys(c прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой)-Cys(с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой)-Arg-Lys- (Пример 48) (SEQ ID NO. 118); и

(а66) гликозилированный полипептид, у которого с N-концевой стороны от Ala в положении 15 еще добавлен Cys(c прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой)-Cys(с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой)-Cys(с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой)-Arg-Lys- (Пример 49) (SEQ ID NO. 120).

Гликозилированные полипептиды настоящего изобретения могут быть получены путем включения стадии гликозилирования в метод синтеза пептидов, хорошо известный специалистам. Для гликозилирования также может применяться метод с использованием фермента, представленного трансглутаминазой, но поскольку при этом возникают такие проблемы, как необходимость добавления большого количества сахаридных цепочек, сложность очистки после заключительной стадии и ограничения на положения для гликозилирования и присоединения сахаридных цепочек, то нельзя сказать, что это практичный способ для крупномасштабного производства типа производства фармацевтических препаратов, хотя его можно использовать для синтеза небольшого количества, как-то для анализа.

В качестве конкретных примеров простых способов получения гликозилированных полипептидов настоящего изобретения, которые являются стабильными способами получения гликозилированных полипептидов с однородной структурой сахаридных цепочек, ниже будет приведен способ получения гликозилированных полипептидов с использованием гликозилированного Asn в качестве гликозилированной аминокислоты и с применением хорошо известных методов пептидного синтеза типа твердофазного и жидкофазного синтеза (способ A), и способ получения гликозилированных полипептидов путем получения пептидов, у которых любая аминокислота соматостатина заменяется на Cys в соответствии с хорошо известными методами пептидного синтеза, а затем к Cys присоединяется сахаридная цепочка методами химического синтеза (способ B). Специалисты смогут получить различные гликозилированные полипептиды с привлечением этих способов получения, а получаемые гликозилированные полипептиды и способы их получения будут исключительно полезными, особенно в области производства фармацевтических препаратов.

Кроме того, эти способы A и B могут выполняться в комбинации из двух или нескольких. Если это будет синтез небольшого количества, как-то для анализа, то можно также дополнительно комбинировать вышеописанный способ с использованием реакции удлинения сахаридной цепочки при помощи трансферазы. Способ A описан в International Publication No. 2004/005330 (US 2005222382 (A1)), а способ В описан в International Publication No. 2005/010053 (US 2007060543 (A1)), содержание которых включено сюда путем ссылки во всей полноте. Кроме того, получение сахаридных цепочек с однородной структурой, используемых в способах A и B, описано, напр., в International Publication No. 03/008431 (US 2004181054 (A1)), International Publication No. 2004/058984 (US 2006228784 (A1)), International Publication No. 2004/058824 (US 2006009421 (A1)), International Publication No. 2004/070046 (US 2006205039 (A1)) и International Publication No. 2007/011055, содержание которых включено сюда путем ссылки во всей полноте.

Способ получения гликозилированных полипептидов (способ A) Гликозилированные полипептиды могут быть получены, к примеру, методом твердофазного синтеза с использованием гликозилированного Asn, который схематически изложен ниже.

(1) Посадка на носитель (смолу) карбоксигруппы аминокислоты, у которой атом азота аминогруппы блокирован липофильным защитным реагентом. При этом, поскольку атом азота у аминогруппы аминокислоты блокирован липофильной защитной группой, то конденсация самой аминокислоты предотвращается, а смола будет реагировать с аминокислотой и вызывать ее связывание.

(2) Удаление липофильной защитной группы из полученного реактанта с образованием свободной аминогруппы.

(3) Проведение реакции амидирования этой свободной аминогруппы и карбоксигруппы какой-либо аминокислоты, у которой атом азота аминогруппы блокирован липофильной защитной группой.

(4) Удаление данной липофильной защитной группы с образованием свободной аминогруппы.

(5) Повторение стадий (3) и (4) еще один или несколько раз с получением пептида, в котором соединяется любое количество аминокислот, при этом он связан со смолой на одном конце и имеет свободную аминогруппу на другом конце.

(6) Наконец, отщепление смолы с помощью кислоты с получением пептида с нужной аминокислотной последовательностью.

На стадии (1), если вместо аминокислоты с атомом азота у аминогруппы, блокированным липофильной защитной группой, использовать гликозилированный Asn с атомом азота у аминогруппы, блокированным липофильной защитной группой, и провести реакцию карбоксигруппы данного аспарагина с гидроксигруппой носителя (смолы), то можно получить пептид с гликозилированным Asn на C-конце.

Кроме того, после стадии (2) или после повторения (3) и (4) любое количество раз, то есть один или несколько раз, если на стадии (3) вместо аминокислоты с атомом азота у аминогруппы, блокированным липофильной защитной группой, использовать гликозилированный Asn с атомом азота у аминогруппы, блокированным липофильной защитной группой, то можно вставить сахаридную цепочку в любом положении.

При этом, при использовании на любой из стадий (1) и (3) гликозилированного Asn с атомом азота у аминогруппы, блокированным липофильной защитной группой, вместо аминокислоты с атомом азота у аминогруппы, блокированным липофильной защитной группой, два или несколько раз, можно получить пептид с сахаридными цепочками, вставленными по любым двум или нескольким положениям.

После связывания гликозилированной аминокислоты, если липофильная защитная группа удаляется с образованием свободной аминогруппы и сразу же после этого проводится стадия (6), то можно получить пептид с гликозилированным Asn на N-конце.

Носитель может быть представлен любой смолой, которая обычно используется при твердофазном синтезе, например, можно использовать 2-хлортритилхлоридную смолу (Merck) с функциональными группами хлора, смолу Amino-PEGA (Merck) с функциональными аминогруппами, смолу NovaSyn TGT alcohol (Merck), смолу Wang (Merck) или смолу HMPA-PEGA (Merck) и т.п. с гидроксильными группами. Кроме того, между смолой Amino-PEGA и аминокислотой может находиться линкер, а примеры таких линкеров включают, напр., 4-гидроксиметилфеноксиуксусную кислоту (НМРА) и 4-(4-гидроксиметил-3-метоксифенокси)-бутилуксусную кислоту (НМРВ). Также можно использовать смолу H-Cys(Trt)-Trityl NovaPEG (Merck) и пр., у которой C-концевая аминокислота заранее связана со смолой.

Кроме того, если нужно амидировать С-концевую аминокислоту, то следует предпочтительно использовать, напр., смолу Rink-Amide-PEGA (Merck) с функциональными аминогруппами. При отщеплении пептида от этой смолы с помощью кислоты можно амидировать C-концевую аминокислоту пептида.

При связывании со смолой аминокислоты с атомом азота у аминогруппы, блокированным липофильной защитной группой, например, при использовании смолы с гидроксильными группами или смолы с функциональными группами хлора, карбоксигруппа аминокислоты соединяется со смолой через сложноэфирную связь. Кроме того, при использовании смолы с функциональными аминогруппами карбоксигруппа аминокислоты соединяется со смолой через амидную связь.

Предпочтительной является 2-хлортритилхлоридная смола, так как она предотвращает рацемизацию концевого Cys при удлинении пептида при твердофазном синтезе.

В качестве аминокислот можно использовать любые аминокислоты, а их примеры включают природные аминокислоты серии (Ser), аспарагин (Asn), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), аланин (Ala), тирозин (Tyr), глицин (Gly), лизин (Lys), аргинин (Arg), гистидин (His), аспарагиновую кислоту (Asp), глутаминовую кислоту (Glu), глутамин (Gin), треонин (Thr), цистеин (Cys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp) и пролин (Pro).

Кроме того, можно использовать и D-формы вышеприведенных природных аминокислот.

Примеры липофильных защитных групп включают, напр., защитные группы на основе карбоната или амида, такие как группа 9-фторенилметоксикарбонил (Fmoc), группа трет-бутилоксикарбонил (Boc), бензил, аллил, аллилоксикарбонил и ацетил. При введении липофильной защитной группы в аминокислоту, напр., при введении группы Fmoc, такое введение может осуществляться путем добавления 9-фторенилметил-N-сукцинимидилкарбоната и бикарбоната натрия и проведения реакции. Реакция может проводиться при 0-50°C, предпочтительно при комнатной температуре, в течение примерно 1-5 часов.

В качестве аминокислоты, блокированной липофильной защитной группой, можно

Кроме того, можно использовать такие аминокислоты, блокированные липофильной защитной группой, у которых защитная группа введена в боковую цепь, напр.,

Кроме того, если нужно вставить линкер в аминокислотную последовательность гликозилированного полипептида, то линкер вставляется в предпочтительном положении с использованием линкера, блокированного липофильной защитной группой, вместо аминокислоты, блокированной липофильной защитной группой, в процессе твердофазного синтеза.

При использовании 2-хлортритилхлоридной смолы эстерификация может проводиться с помощью такого основания, как диизопропилэтиламин (DIPEA), триэтиламин, пиридин и 2,4,6-коллидин. Кроме того, при использовании смолы с гидроксильными группами в качестве катализатора эстерификации можно использовать, напр., такие хорошо известные дегидратационные конденсирующие реагенты, как 1-мезитилен-сульфонил-3-нитро-1,2,4-триазол (MSNT), дициклогексилкарбодиимид (DCC) и диизо-пропилкарбодиимид (DIC). Соотношение между аминокислотой и дегидратационным конденсирующим реагентом обычно составляет 1 часть по массе первого к 1-10 частям по массе, предпочтительно 2-5 частям по массе последнего.

Реакция эстерификации предпочтительно проводится, к примеру, путем внесения смолы в твердофазную колонку, промывки смолы растворителем, а затем добавления раствора аминокислоты. Примеры растворителей для промывки включают, напр., диметилформамид (DMF), 2-пропанол и дихлорметан. Примеры растворителей для растворения аминокислот включают, напр., диметилсульфоксид (DMSO), DMF и дихлорметан. Реакция эстерификации может проводиться при 0-50°C, предпочтительно при комнатной температуре, в течение примерно от 10 мин до 30 ч, предпочтительно от 15 мин до 24 ч.

Предпочтительно также в это время проводится ацетилирование и блокирование непрореагировавших гидроксильных групп на твердой фазе, напр., с помощью уксусного альдегида.

Удаление липофильной защитной группы может проводиться, к примеру, путем обработки основанием. Примеры оснований включают, напр., пиперидин и морфолин. При этом предпочтительно оно проводится в присутствии растворителя. Примеры растворителей включают, напр., DMSO, DMF и метанол.

Реакция амидирования свободной аминогруппы с карбоксигруппой аминокислоты, у которой атом азота у аминогруппы блокирован липофильной защитной группой, предпочтительно проводится в присутствии активатора и растворителя.

Примеры активаторов включают, напр., дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (WSC/HC1), дифенилфосфорилазид (DPPA), карбонилдиимидазол (CDI), диэтилцианофосфонат (DEPC), бензотриазол-1-илокси-триспирролидинофосфоний (DIPCI), бензотриазол-1-илокси-триспирролидино-фосфоний гексафторфосфат (PyBOP), 1-гидроксибензотриазол (HOBt), гидроксисукцинимид (HOSu), диметиламинопиридин (DMAP), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt), гидроксифталимид (HOPht), пентафторфенол (Pfp-OH), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний гексафторфосфат (HBTU), 3-оксид 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1H-бензотриазолия гексафторфосфат (HCTU), O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний гексафторфосфат (HATU), O-(7-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетра-метилуроний тетрафторборат (TBTU) и 3,4-дигидро-3-гидроди-4-окса-1,2,3-бензотриазин (DHBT).

Количество активатора предпочтительно составляет 1-20 эквивалентов, предпочтительно 1-10 эквивалентов и еще более предпочтительно 1-5 эквивалентов к той аминокислоте, у которой атом азота у аминогруппы блокирован липофильной защитной группой.

Примеры растворителей включают, напр., DMSO, DMF и дихлорметан. Реакция может проводиться при 0-50°C, предпочтительно при комнатной температуре, в течение примерно от 10 мин до 30 ч, предпочтительно от 15 мин до 24 ч. Удаление липофильной защитной группы может проводиться так же, как описано выше.

Для отщепления пептидной цепи от смолы предпочтительной является обработка кислотой. Примеры кислот включают, напр., трифторуксусную (TFA) и фтористоводородную кислоту (HF).

Таким способом можно получить гликозилированный полипептид с заменой в нужном положении на гликозилированный Asn. Кроме того, гликозилированный полипептид после соответствующей очистки способствует образованию дисульфидной связи между деблокированными Cys, как описано ниже.

В одном воплощении настоящего изобретения, если на невосстанавливающем конце сахаридной цепочки у гликозилированного Asn при твердофазном синтезе содержится сиаловая кислота, то эту сиаловую кислоту нужно защитить от расщепления при обработке кислотой. Поэтому предпочтительно карбоксигруппа у данной сиаловой кислоты блокируется защитной группой. Примеры защитных групп включают, напр., такие группы, как бензил, аллил и дифенилметил. Введение и удаление защитной группы осуществляется каким-нибудь известным методом. Кроме того, удаление защитной группы предпочтительно проводится после отщепления от смолы гликозилированного полипептида, полученного при твердофазном синтезе. После отщепления от смолы, если гликозилированный полипептид подлежит циклизации путем образования дисульфидной связи у гликозилированного полипептида, то удаление защитной группы может проводиться до или после стадии образования дисульфидной связи.

Способ получения гликозилированных полипептидов (способ B)

Гликозилированные полипептиды также могут быть получены способом, при котором сначала синтезируется пептидная цепь, а затем в синтезированную пептидную цепь вставляется сахаридная цепочка. В частности, производится пептид, содержащий Cys в положении гликозилирования, напр., методом твердофазного синтеза, методом жидко-фазного синтеза, методом клеточного синтеза или методом разделения и выделения уже существующих в природе. При этом Cys, который не подлежит гликозилированию, как-то Cys в положении, намеченном для образования дисульфидной связи, блокируется, к примеру, группой ацетамидометила (Acm). Кроме того, если в гликозилированный полипептид нужно ввести Cys, который не будет подвергаться гликозилированию или образованию дисульфидной связи, то этот Cys вводится при блокировании его защитной группой на стадиях гликозилирования и образования дисульфидной связи, с последующим деблокированием. Такие защитные группы включают, напр., трет-бутил (tBu) и 4-метоксибензил.

Кроме того, если в гликозилированный полипептид нужно вставить другую сахаридную цепочку по Cys, то эта другая сахаридная цепочка вводится таким образом, что сначала деблокируется тот Cys, куда вводится первая сахаридная цепочка, а затем блокируется тот Cys, куда нужно вставить другую сахаридную цепочку, напр., с помощью StBu. В частности, при синтезе пептида, напр., методом твердофазного синтеза, деблокируется тот Cys, куда вводится первая сахаридная цепочка, а тот Cys, куда нужно вставить вторую сахаридную цепочку, преобразуется в Cys, содержащий защитную группу, напр., с помощью Fmoc-Cys(StBu)-OH. Затем вводится сахаридная цепочка по деблокированному Cys, тогда как защитная группа типа StBu остается. После этого проводится удаление защитной группы StBu и пр., чтобы ввести другую сахаридную цепочку по тому Cys, который станет деблокированным. Отметим, что Cys, куда вводится первая сахаридная цепочка, и Cys, куда вводится вторая сахаридная цепочка, может представлять собой один или несколько Cys.

При удалении группы StBu деблокирование может проводиться при реакции с таким восстановителем, как трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (ТСЕР), дитио-треитол (DTT) или трибутилфосфин. Данная реакция обычно проводится при 0-80°C, предпочтительно при 5-60°C и еще более предпочтительно при 10-35°C. Время реакции обычно предпочтительно составляет от 30 мин до 5 ч. По завершении реакции можно провести очистку хорошо известным методом типа высокоэффективной жидкостной колоночной хроматографии (HPLC), как положено.

При введении других сахаридных цепочек предпочтительно введение начинается с тех сахаридных цепочек, которые более устойчивы к восстановительным условиям на стадии деблокирования Cys или условиям кислотности на стадии очистки типа HPLC. В частности, при введении сахаридных цепочек, содержащих сиаловую кислоту, сначала вводятся сахаридные цепочки, не содержащие сиаловой кислоты, или же содержащие меньше остатков сиаловой кислоты.

Кроме того, если нужно вставить линкер в аминокислотную последовательность гликозилированного полипептида, то, к примеру, линкер можно вставить в предпочтительное положение синтезируемого полипептида в процессе твердофазного синтеза, используя линкер, блокированный липофильной защитной группой, вместо аминокислоты, блокированной липофильной защитной группой.

После этого при реакции галоацетилированного производного сахаридной цепочки комплексного типа с полученным выше пептидом, содержащим деблокированный Cys, протекает реакция с тиоловой группой деблокированного Cys и присоединение к пептиду. Данная реакция может проводиться в фосфатном буфере, буфере трис-HCl, цитратном буфере или в их смеси, обычно при 0-80°C, предпочтительно при 10-60°C и еще более предпочтительно при 15-35°C. Время реакции обычно составляет от 10 мин до 24 ч, предпочтительно от 30 мин до 5 ч. По завершении реакции можно провести очистку хорошо известным методом типа HPLC, как положено.

Галоацетилированным производным сахаридной цепочки комплексного типа является, к примеру, соединение, у которого гидроксильная группа, связанная с углеродом в положении 1 связанной с аспарагином сахаридной цепочки, заменена на -NH-(CH₂)_a-(CO)-CH₂X, где X означает атом галогена, а a - целое число без ограничения, если только оно не ингибирует функцию данного линкера, но предпочтительно это целое число от 0 до 4.

В частности, реакция галоацетилированного производного сахаридной цепочки комплексного типа с Cys-содержащим пептидом проводится в фосфатном буфере при комнатной температуре. По завершении реакции гликозилированный полипептид, замещенный гликозилированным Cys, может быть получен при очистке методом HPLC.

Кроме того, реакция может проводиться и в смеси органического растворителя типа DMSO, DMF, метанола или ацетонитрила с вышеприведенным буфером. При этом доля органического растворителя может составлять в пределах 0-99% (об/об). Для содержащих деблокированный Cys пептидов с плохой растворимостью в буфере добавление такого органического растворителя может улучшить растворимость в реакционном буфере, поэтому оно предпочтительно.

С другой стороны, реакция также может проводиться и в органическом растворителе типа DMSO, DMF, метанола или ацетонитрила либо в их смеси. В этом случае она предпочтительно проводится в присутствии основания. Примеры оснований включают, напр., DIPEA, триэтиламин, пиридин и 2,4,6-коллидин. Кроме того, реакция может проводиться и в смеси из раствора гуанидина гидрохлорида или мочевины с буферным раствором. Гуанидин гидрохлорид или мочевину можно добавлять в данный буфер так, чтобы конечная концентрация составляла от 1 М до 8 М. Растворимость пептидов с плохой растворимостью в буфере также может улучшиться при добавлении гуанидина гидрохлорида или мочевины, поэтому оно предпочтительно.

Далее, для того, чтобы предотвратить образование димеров посредством дисульфидной связи у пептидов, содержащих деблокированный Cys, можно также добавлять трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (ТСЕР) или дитиотреитол (DTT) в буфер для реакции. ТСЕР или DTT можно добавлять так, чтобы конечная концентрация составляла от 10 мкМ до 10 мМ.

Кроме того, после присоединения сахаридной цепочки к намеченному Cys проводится удаление защитной группы из Cys, блокированного с помощью Acm и пр. Если защитная группа представлена Acm, ее можно удалить путем реакции, напр., с йодом, ацетатом ртути(II), нитратом серебра(I) или ацетатом серебра(I) в воде, метаноле, уксусной кислоте или их смеси.

Данная реакция обычно проводится при 0-80°C, предпочтительно при 5-60°C и еще более предпочтительно при 10-35°C. Время реакции обычно предпочтительно составляет от 5 мин до 24 ч. По завершении реакции можно провести обработку DTT или соляной кислотой и пр., а затем провести очистку хорошо известным методом типа HPLC, как положено.

Таким способом можно получить гликозилированный полипептид с заменой в нужном положении на гликозилированный Cys. Кроме того, гликозилированный полипептид после соответствующей очистки способствует образованию дисульфидной связи между деблокированными Cys, как описано ниже.

Кроме того, у гликозилированных полипептидов, полученных вышеизложенными способами А и В, может быть образована дисульфидная связь с помощью методов, хорошо известных специалистам, с использованием, напр., воздуха и/или кислорода, йода, DMSO, смеси окисленного и восстановленного глютатиона, феррицианида калия, реагента Эллмана (5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота)), трифторацетата таллия(III) или сульфоксида алкилтрихлорсилана.

При образовании дисульфидной связи Cys-Cys следует блокировать защитной группой такой Cys у гликозилированного полипептида, который не должен образовать дисульфидную связь. При этом можно использовать такие защитные группы, которые устойчивы в окислительных условиях, как-то Acm, tBu, 4-метоксибензил и 4-метилбензил.

Кроме того, в способе В образование дисульфидной связи также может проводиться и перед введением сахаридной цепочки. Однако если защитная группа вводится по Cys, который будет подвергаться дисульфидной связи, то стадия деблокирования должна выполняться перед стадией образования дисульфидной связи.

Активность

Гликозилированные полипептиды настоящего изобретения обладают сродством к соматостатиновым рецепторам. Обладание "сродством к соматостатиновым рецепторам" в настоящем изобретении означает обладание сродством по меньшей мере к одному из соматостатиновых рецепторов SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 и SSTR5.

Гликозилированные полипептиды настоящего изобретения предпочтительно обладают сродством к двум или нескольким типам соматостатиновых рецепторов, более предпочтительно к трем и больше типам рецепторов, еще более предпочтительно к четырем и больше типам рецепторов и наиболее предпочтительно ко всем пяти типам рецепторов SSTR1-SSTR5 аналогично природному соматостатину (SRIF28 и SRIF14). В частности, предпочтительно они обладают сродством по меньшей мере к одному из числа SSTR1 и SSTR4 и обладают сродством к другим SSTRs.

При этом гликозилированные полипептиды настоящего изобретения обладают соматостатиновой активностью (активностью агонистов) и активностью антагонистов в отношении соматостатиновых рецепторов за счет того, что они обладают сродством к рецепторам соматостатина.

Например, сродство к каждому типу соматостатиновых рецепторов можно измерить, напр., методом конкурентного связывания in vitro.

При измерении сродства методом конкурентного связывания измеряется сродство исследуемого вещества (типа концентрации, вызывающей ингибирование на 50%: значение IC50, или ингибирование константы связывания на 50%: значение K_i) при конкурентном связывании меченого лиганда и исследуемого вещества с рецепторами и высвобождении меченого лиганда при введении исследуемого вещества.

Например, соматостатиновую активность (активность агониста) можно определить по подавлению продукции цАМФ in vitro с использованием экспрессирующих рецепторы соматостатина клеток, как показано в примерах 67-3 и 67-4.

Тест на подавление продукции цАМФ может выполняться путем обработки клеток, экспрессирующих рецепторы соматостатина, гликозилированным полипептидом или контрольным соединением SRIF14 или SRIF28, измерения количества цАМФ, накопившегося в клетках после культивирования в течение определенного времени, и сравнения с контрольным соединением. Количество цАМФ можно измерить хорошо известным методом типа метода ферментного иммуноанализа (EIA).

Например, соматостатиновую активность (активность агониста) можно определить по подавлению продукции GH in vivo, как показано в примерах 86 и 87.

Тест на подавление продукции цАМФ может выполняться следующим образом. Гликозилированный полипептид вводится подкожно крысам не натощак. Крысам также вводится усилитель высвобождения GH под общим наркозом, а затем отбирается кровь примерно через 5 мин. Из отобранной крови готовят образцы плазмы и измеряют концентрацию GH хорошо известным методом типа метода ферментного иммуноанализа (EIA). Кроме того, в качестве контроля получают образцы плазмы от крыс, которым вводился физраствор, не содержащий гликозилированного полипептида, и определяют соматостатиновую активность путем сравнения измеренных концентраций GH.

У гликозилированных полипептидов настоящего изобретения, даже если гликозилирование их структуры в некоторой степени вызывает снижение сродства к каждому из рецепторов, время полужизни в крови возрастает, в результате чего может сохраняться соматостатиновая активность, эквивалентная природному соматостатину, не подвергавшемуся гликозилированию (в дальнейшем может именоваться как "негликозилированный соматостатин"), а предпочтительно соматостатиновая активность повышается. В свете такого увеличения времени полужизни в крови соотношение между значением K_i по каждому рецептору у гликозилированного полипептида настоящего изобретения и значением K_i у негликозилированного SRIF14 предпочтительно составляет от 1000:1 до 0,3:1, более предпочтительно от 100:1 до 0,3:1 и еще более предпочтительно от 10:1 до 0,3:1 при измерении, напр., способом, описанным в примере 67-1.

Устойчивость в крови гликозилированных полипептидов настоящего изобретения предпочтительно эквивалентна природному соматостатину (негликозилированному соматостатину) или еще выше. Устойчивость в крови может быть измерена методом, хорошо известным специалистам, и выражается, напр., в виде устойчивости в плазме, времени полужизни в крови или AUC (площади под кривой зависимости концентрации препарата в плазме от времени). Кроме того, снижение почечного или печеночного клиренса также способствует повышению устойчивости в крови.

Гликозилированные полипептиды настоящего изобретения обладают большим временем полужизни в крови по сравнению с негликозилированным SRIF28, причем у них время полужизни повышается в 4 раза или больше, предпочтительно в 10 раз или больше, более предпочтительно в 20 раз или больше и еще более предпочтительно в 30 раз или больше по сравнению со SRIF28 при измерении, напр., способом определения, приведенным в примере 68.

Кроме того, гликозилированные полипептиды настоящего изобретения предпочтительно обладают большей в 4 раза или больше, более предпочтительно в 10 раз или больше и еще более предпочтительно в 20 раз или больше устойчивостью в крови по сравнению со SRIF28 при измерении, напр., способом определения, приведенным в примере 85.

Фармацевтические композиции

Далее будут описаны фармацевтические композиции, содержащие гликозилированные полипептиды настоящего изобретения в качестве активного ингредиента.

Фармацевтические композиции, содержащие гликозилированные полипептиды настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, эффективны при лечении или профилактике связанных со соматостатином заболеваний. Как описано выше, у соматостатина известны различные действия, поэтому и связанные с ними заболевания также разнообразны. Так, примеры связанных со соматостатином заболеваний включают, напр., акромегалию, гигантизм, болезнь Альцгеймера и другие формы деменции, рак, продуцирующие гормоны опухоли, эндокринные опухоли, такие как карциноиды, VIРома, инсулинома и глюкагонома, болезнь Кушинга, нарушения секреции гормонов, диабет и его осложнения, боли, артрит, диарею, язву желудка, воспалительную болезнь кишечника, синдром раздраженного кишечника, желудочно-кишечную непроходимость, непроходимость кишечника, послеоперационный рестеноз, радиационные повреждения и такие глазные заболевания, как сухость глаз, глаукома, интерстициальный кератит, ирит, катаракта и конъюнктивит. Фармацевтические композиции, содержащие гликозилированные полипептиды настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, эффективны при лечении или профилактике вышеприведенных заболеваний, в особенности акромегалии, деменции, рака, продуцирующих гормоны опухолей, эндокринных опухолей, болезни Кушинга, нарушений секреции гормонов, осложнений диабета, диареи, желудочно-кишечной непроходимости, непроходимости кишечника, радиационного повреждения, глазных заболеваний, различных опухолей или кишечных заболеваний и желудочно-кишечных синдромов, сопровождающих чрезмерную продукцию гормонов.

Данные фармацевтические композиции составляются в виде обычных фармацевтических композиций с такими разбавителями или эксципиентами, как общепринятые наполнители, вещества, повышающие объем, связующие, увлажняющие, дезинтегрирующие, поверхностно-активные и смазывающие вещества.

Примеры таких фармацевтических композиций включают, напр., таблетки, пилюли, порошки, жидкости, суспензии, эмульсии, гранулы, капсулы, свечи, средства для ингаляции, глазные растворы и растворы для инъекций.

Количество гликозилированного полипептида настоящего изобретения, содержащегося в фармацевтической композиции, не имеет особых ограничений и может быть выбрано надлежащим образом в широких пределах, но обычно в фармацевтической композиции предпочтительно содержится 1-70% масс, гликозилированного полипептида настоящего изобретения.

Фармацевтические композиция, содержащие гликозилированные полипептиды настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, также могут дополнительно содержать и другие активные ингредиенты или же могут применяться в комбинации с фармацевтическими композициями, содержащими другие активные ингредиенты. Кроме того, фармацевтические композиция, содержащие гликозилированные полипептиды настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, могут содержать гликозилированные полипептиды в виде фармацевтически приемлемых солей или же могут дополнительно содержать один или несколько других гликозилированных полипептидов настоящего изобретения в качестве активных ингредиентов. Кроме того, они также могут применяться в комбинации с фармацевтическими композициями, содержащими один или несколько других гликозилированных полипептидов настоящего изобретения в качестве активного ингредиента. Кроме того, примеры других ингредиентов, которые могут содержаться в фармацевтических композициях, включают фармацевтически приемлемые носители, известные специалистам в данной области.

Кроме того, лечение с помощью гликозилированных полипептидов настоящего изобретения может включать, напр., лучевую терапию, а также может применяться при сцинтиграфии для измерения распределения экспрессирующих какие-либо из SSTR1-SSTR5 клеток и тканей во всем организме. Применение экстракорпоральной томографии методом радиосканирования или магнитного резонанса создает возможность полуколичественного детектирования in vivo.

Радиомеченые гликозилированные полипептиды применимы для терапевтического лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих какие-либо из SSTR1-SSTR5, к примеру, в организме человека в тканях, не содержащих существенного количества SSTR1-SSTR5 в здоровом состоянии. Кроме того, меченые гликозилированные полипептиды могут вводиться для сцинтиграфии либо в качестве композиции, содержащей эффективное количество для подавления опухоли. Примерами таких меток являются различные изотопы, такие как йод (¹²³I, ¹²⁵I и ¹³¹I), индий (¹¹¹In), углерод (¹¹C), фтор (¹⁸F), технеций (⁹⁹mTc) и иттрий (⁹⁰Y), либо флуоресцентные метки. Введение метки может осуществляться методами, хорошо известными специалистам, а метка может содержаться в гликозилированном полипептиде, непосредственно связана с ним или связана с соответствующим соединением, а затем присоединена к гликозилированному полипептиду. Например, при йодировании тирозина введение метки может осуществляться, напр., с помощью хлорамина-Т и др.

Способы введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению не имеют особых ограничений, и они вводятся в соответствии с различными лекарственными формами препарата, возрастом, полом и заболеванием пациента, а также другими условиями. Способы введения таблеток, пилюль, жидких форм, суспензий, эмульсий, гранул и капсул включают, напр., пероральное введение. Кроме того, в случае инъекций они могут вводиться внутривенно, внутримышечно, интрадермально, подкожно или внутрибрюшинно, одни или вместе с обычными кровезаменителями типа растворов глюкозы или аминокислот. В случае свечей они вводятся интраректально. В случае глазных растворов они наносятся на глазную ткань типа конъюнктивального мешочка. В случае средств для ингаляции они вносятся в бронхи или в легкие.

Вводимая доза данных фармацевтических композиций может быть выбрана надлежащим образом в соответствии с практикой, возрастом, полом и тяжестью заболевания у пациента, а также другими условиями, к примеру, вводимая доза может составлять от 0,1 до 900 нмоль, предпочтительно 1-100 нмоль и более предпочтительно 1-10 нмоль гликозилированного полипептида настоящего изобретения на 1 кг массы тела.

Частота введения данных фармацевтических композиций может быть выбрана надлежащим образом в соответствии с практикой, возрастом, полом и тяжестью заболевания у пациента, а также другими условиями, и может составлять 3 раза в день, 2 раза в день, 1 раз в день, а также с меньшей частотой в соответствии с их устойчивостью в крови (как-то 1 раз в неделю или 1 раз в месяц). Предпочтительно частота введения данных фармацевтических композиций составляет 1 раз в день или меньше.

Присоединенные к гликозилированным полипептидам настоящего изобретения сахариды легко разлагаются под действием системы метаболизма в организме. Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения данные сахаридные цепочки имеют такую структуру, которая существует в связанном виде с гликопептидом (или гликопротеином) in vivo. Соответственно, фармацевтические композиции, содержащие гликозилированные полипептиды настоящего изобретения и данные пептиды в качестве активных ингредиентов, обладают такими преимуществами, как отсутствие побочных эффектов или антигенности при введении in vivo и меньше опасений насчет потери эффективности препарата из-за аллергических реакций или выработки антител.

К тому же гликозилированные полипептиды настоящего изобретения могут стабильно и легко поставляться в большом количестве, причем они чрезвычайно полезны в отношении получения фармпрепаратов со стабильным и высоким качеством.

Кроме того, настоящим изобретением также предусмотрен способ лечения или профилактики связанных с соматостатином заболеваний, который характеризуется введением эффективного количества гликозилированного полипептида настоящего изобретения.

Используемые здесь термины должны применяться для описания конкретных воплощений, но не для ограничения изобретения.

Кроме того, термин "включающий" в настоящем изобретении, если из контекста четко не следует иное понимание, обозначает присутствие описанных вещей (как-то компонентов, стадий, элементов и чисел) и не исключает присутствия других вещей (как-то компонентов, стадий, элементов и чисел).

Если не указано иначе, все используемые здесь термины (включая технические и научные термины) имеют такие же значения, как и те, что общепризнаны специалистами в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. Используемые здесь термины, если прямо не указано иначе, следует понимать как имеющие такие значения, которые совпадают со значениями, принятыми в настоящем изобретении и в родственных областях техники, и не должны иметь идеализированные или чрезмерно формальные значения.

Воплощения настоящего изобретения могут быть описаны с привлечением схематических диаграмм. При этом схематические диаграммы могут быть искажены при представлении для более четкого описания.

Такие термины, как первый и второй, применяются для обозначения различных элементов, и следует понимать, что эти элементы не должны ограничиваться этими терминами. Данные термины употребляются исключительно с целью отличения одних элементов от других, поэтому можно, к примеру, описать первый элемент в качестве второго элемента, а второй элемент можно описать в качестве первого элемента, не выходя за рамки настоящего изобретения.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно на примерах. Однако настоящее изобретение может воплощаться в различных аспектах и не должно восприниматься как ограничивающееся приведенными здесь примерами.

ПРИМЕРЫ

Ниже приводится система обозначения гликозилированных полипептидов в настоящем изобретении.

Например, S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)-SRIF28 означает, что Ser в положении 1 (S1) и Asn в положении 5 полипептида SRIF28 заменены на Cys с прикрепленными дисиалосахаридными цепочками (С(дисиало)).

Далее, S1C(дисиало)-D-Trp22-SRIF28 означает, что Ser в положении 1 (S1) полипептида SRIF28 заменен на Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой (C(дисиало)), а также Trp в положении 22 заменен на D-Trp.

Далее, C(дисиало)-R-K-SRIF14 означает, что добавлен гликозилированный Cys-Arg-Lys- с N-концевой стороны SRIF14.

Далее, 29C(дисиало)-SRIF28 или 30С(дисиало)-SRIF28 означает, что пептид дополнительно содержит один Cys с прикрепленной дисиалосахаридной цепочкой, присоединенный к Cys в положении 28, который является C-концевым у SRIF28 (29C(дисиало)-SRIF28), или же дополнительно содержит Cys с прикрепленной -W-дисиалосахаридной цепочкой (где W - любая аминокислота, связанная с Cys в положении 28), присоединенный к Cys в положении 28, который является C-концевым у SRIF28 (30C(дисиало)-SRIF28).

Далее, S1-2C(дисиало)-SRIF28 означает, что Ser в положении 11 находящийся на N-конце полипептида SRIF28, заменен на два последовательных Cys с прикрепленными дисиалосахаридными цепочками.

При этом "дисиало" означает дисиалосахаридную цепочку, "моносиало" означает моносиалосахаридную цепочку, "асиало" означает асиалосахаридная цепочку, "ди-GlcNAc" означает диG1 cNAc-сахаридную цепочку, "GlcNAc" означает N-ацетил-глюкозамин, "диMan" означает диманнозную сахаридную цепочку, "трисиало" означает трисиалосахаридную цепочку и "тетрасиало" означает тетрасиалосахаридную цепочку. Кроме того, (дисиало(аминоэтиламид)) означает, что карбоксигруппа сиаловой кислоты у дисиалосахаридной цепочки блокирована аминоэтиламиногруппой. "Bn", "амид" или "гексадециламид" вместо "аминоэтиламид" означает, что карбоксигруппа сиаловой кислоты у сахаридной цепочки модифицирована бензилом, аминогруппой или гексадецил-аминогруппой.

Пример 1. Синтез S1C(дисиало)-SRIF28

1-1. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 1 (SEQ ID No. 38), представленный нижеследующей формулой (1) (фирмы АРС, Inc.) (60,6 мг, 18,3 мкмоль), и соединение a, представленное нижеследующей формулой (а) (бромацетамидированный олигосахарид фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.) (85,8 мг, 36,6 мкмоль, 2,0 эквивалента к пептиду 1), растворяли в 33 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 5,5 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин.

Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% раствор уксусной кислоты (AcOH), B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 90:10 до 75:25, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 2 (SEQ ID No. 39), представленный нижеследующей формулой (2) (60,5 мг, 10,9 мкмоль, выход 59%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₂₉H₃₅₈N₅₀O₁₀₂S₄: [M+3H]³⁺ 1858.3, [M+4H]⁴⁺ 1394.0, [M+5H]⁵⁺ 1115.4, практ. 1858.1, 1393.8, 1115.2.

1-2. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 2, полученному вышеописанным способом 1-1 (51,2 мг, 9,19 мкмоль), добавляли водный раствор (3,7 мл) ацетата серебра(I) (18,8 мг, 113 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 40 мин. Добавляли DTT (43,6 мг, 282 мкмоль), растворенный в 200 мМ буфере трис-HCl (pH 7,4, 3,7 мл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (0,92 мл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 90:10 до 75:25, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 3 (SEQ ID NO. 40), представленный нижеследующей формулой (3) (29,2 мг, 5,38 мкмоль, выход 58%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₂₃H₃₄₈N₄₈O1₀₀S₄: [M+3H]³⁺ 1810.9, [M+4H]⁴⁺ 1358.4, [M+5H]⁵⁺ 1086.9, [M+6H]⁶⁺ 906.0, практ. 1810.7, 1358.3, 1086.6, 905.7. 1-3. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 3, полученный вышеописанным способом 1-2 (29,2 мг, 5,38 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 10,8 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент А: 0,1% водный TFA, В: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 77:23 до 64:36, 17 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (S1C(дисиало)-SRIF28), представленное нижеследующей формулой (4) (SEQ ID NO. 5).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 90:10 до 75:25, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая S1C(дисиало)-SRIF28 (17,2 мг, 3,17 мкмоль, выход 59%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₂₃H₃₄₆N₄₈O₁₀₀S₄: [M+3H]₃₊ 1810.2, [M+4H]⁴⁺ 1357.9, [M+5H]⁵⁺ 1086.5, практ. 1810.0, 1357.5, 1086.4.

Пример 2. Синтез N5C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (6) (N5C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 6), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (5) (пептид 5) (SEQ ID NO. 41).

Пример 3. Синтез A9C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (8) (A9C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 7), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (7) (пептид 7) (SEQ ID NO. 42).

Пример 4. Синтез E12C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (10) (E12C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 8), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (9) (пептид 9) (SEQ ID NO. 43).

Пример 5. Синтез R13C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (12) (R13C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 9), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (11) (пептид 11) (SEQ ID NO. 44).

Пример 6. Синтез K14C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (14) (K14C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 10), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (13) (пептид 13) (SEQ ID NO. 45).

Пример 7. Синтез A15C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (16) (A15C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 11), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (15) (пептид 15) (SEQ ID NO. 46).

Пример 8. Синтез G16C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (18) (G16C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 12), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (17) (пептид 17) (SEQ ID NO. 47).

Пример 9. Синтез K18C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (20) (K18C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 13), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (19) (пептид 19) (SEQ ID NO. 48).

Пример 10. Синтез N19C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (22) (N19C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 14), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (21) (пептид 21) (SEQ ID NO. 49).

Пример 11. Синтез F21C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (24) (F21C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 15), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (23) (пептид 23) (SEQ ID NO. 50).

Пример 12. Синтез T26C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (26) (T26C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 16), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (25) (пептид 25) (SEQ ID NO. 51).

Пример 13. Синтез 29C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (28) (29С(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 17), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (27) (пептид 27) (SEQ ID NO. 52).

Пример 14. Синтез 30C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (30) (30C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 18), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (29) (пептид 29) (SEQ ID NO. 53).

Пример 15. Синтез S1C(дисиало)-D-Trp22-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (32) (S1C(дисиало)-D-Trp22-SRIF28) (SEQ ID NO. 19), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (31) (пептид 31) (SEQ ID NO. 54).

Пример 16. Синтез A9C(дисиало)-D-Trp22-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (34) (А9С(дисиало)-D-Trp22-SRIF28) (SEQ ID NO. 20), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (33) (пептид 33) (SEQ ID NO. 55).

Пример 17. Синтез C(дисиало)-SRIF14

Соединение, представленное нижеследующей формулой (36) (С(дисиало)-SRIF14) (SEQ ID NO. 35), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (35) (пептид 35) (SEQ ID NO. 56).

Пример 18. Синтез С(дисиало)-R-K-SRIF14

Соединение, представленное нижеследующей формулой (38) (C(дисиало)-R-K-SRIF14) (SEQ ID NO. 36), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (37) (пептид 37) (SEQ ID NO. 57).

Пример 19. Синтез C(дисиало)-линкер C12-SRIF14

19-1. Синтез пептида

В колонку для твердофазного синтеза вносили 2-хлортритилхлоридную смолу (100 мкмоль) и после промывки DMF и дихлорметаном добавляли раствор Fmoc-Cys(Acm)-OH (49,7 мг, 120 мкмоль) и DIPEA (104,5 мкл, 600 мкмоль) в дихлорметане (3,0 мл), а затем встряхивали в течение 1 ч. После промывки дихлорметаном и DMF удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, методом твердофазного синтеза пептидов по стратегии Fmoc с использованием синтезатора пептидов Prelude™ синтезировали блокированный пептид 39 (SEQ ID NO. 58), представленный нижеследующей формулой (39), в связанном со смолой состоянии. Реакцию конденсации проводили в DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента.

Защитную группу Fmoc удаляли путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF и дихлорметаном, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента, проводили конденсацию Fmoc-12-аминододекановой кислоты и Fmoc-Cys(Trt)-OH один за другим. После конденсации удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь ТРА:вода:триизопропилсилан:этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Это приводит к отделению защитной группы от боковой цепи аминокислоты (кроме группы Acm), а также к отщеплению пептида от смолы. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Часть неочищенного пептида очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK С18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90%) ацетонитрила, градиент A:B от 60:40 до 36,2:63,8, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая соединение, представленное нижеследующей формулой (40) (пептид 40) (SEQ ID NO. 59) (11,2 мг).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₉₇H₁₄₄N₂₂O₂₃S₃: [M+2H]²⁺ 1042.3, [M+3H]³⁺ 695.2, практ. 1042.0, 695.0.

19-2. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 40, полученный вышеописанным способом 19-1 (6,8 мг, 3,3 мкмоль), и соединение а, представленное вышеприведенной формулой (а) (19,1 мг, 8,15 мкмоль), растворяли в 0,2 М фосфатном буфере (pH 7,4, 0,96 мл), содержащем 7 М гуанидин гидрохлорид и 330 мкМ ТСЕР, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 ч. После проверки исчезновения исходных материалов по HPLC, реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 80:20 до 50:50, 25 мин, элюирование линейным градиентом], получая соединение, представленное нижеследующей формулой (41) (гликопептид 41) (SEQ ID NO. 60) (7,1 мг, 1,6 мкмоль, выход 50%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₈₃H₂₈₃N₂₉O₈₅S₃: [M+3H]₃₊ 1449.5, [M+4H]⁴⁺ 1087.4, [M+5H]⁵⁺ 870.1, практ. 1449.3, 1087.2, 870.0.

19-3. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 41, полученному вышеописанным способом 19-2 (10,3 мг, 2,37 мкмоль), добавляли водный раствор (0,95 мл) ацетата серебра(I) (9,7 мг, 58 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавляли DTT (22,3 мг, 145 мкмоль), растворенный в 100 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 3,7 мл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (0,95 мл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 80:20 до 50:50, 25 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 42, представленный нижеследующей формулой 42 (SEQ ID NO. 61) (5,8 мг, 1,4 мкмоль, выход 59%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₇₇H₂₇₃N₂₇O₈₃S₃: [M+3H]³⁺ 1402.1, [M+4H]⁴⁺ 1051.8, [M+5H]⁵⁺ 841.7, практ. 1401.9,1051.7, 841.5.

19-4. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 42, полученный вышеописанным способом 19-3 (5,8 мг, 1,4 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 3,5 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK С18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20 х250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 70:30 до 50:50, 25 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (C(дисиало)-линкер C12-SRIF14), представленное нижеследующей формулой 43 (SEQ ID NO. 37).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK С18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 80:20 до 50:50, 25 мин, элюирование линейным градиентом], получая C(дисиало)-линкер С12-SRIF14 (3,6 мг, 0,86 мкмоль, выход 61%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₇₇H₂₇₁N₂₇O₈₃S₃: [M+3H]³⁺ 1401.5, [M+4H]⁴⁺ 1051.3, [M+5H]⁵⁺ 841.3, практ.1401.2, 1051.2, 841.1.

Пример 20. Синтез S1-2C(дисиало)-SRIF28

20-1. Синтез пептида

В колонку для твердофазного синтеза вносили 2-хлортритилхлоридную смолу (100 мкмоль) и после промывки DMF и дихлорметаном добавляли раствор Fmoc-Cys(Acm)-OH (49,7 мг, 120 мкмоль) и DIPEA (104,5 мкл, 600 мкмоль) в дихлорметане (3,0 мл), а затем встряхивали в течение 1 ч. После промывки дихлорметаном и DMF удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, методом твердофазного синтеза пептидов по стратегии Fmoc с использованием синтезатора пептидов Prelude™ синтезировали блокированный пептид на смоле. Реакцию конденсации проводили в DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента.

Защитную группу Fmoc удаляли путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Часть неочищенного пептида очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK CI8 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 72:28 до 68,5:31,5, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая пептид 44 (SEQ ID NO. 62), представленный нижеследующей формулой (44) (30,7 мг).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₄₆H₂₂₄N₄₄O₄₁S₅: [M+3H]³⁺ 1138.3, [M+4H]⁴⁺ 854.0, [M+5H]⁵⁺ 683.4, практ. 1138.2, 853.9, 683.1.

20-2. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 44, полученный вышеописанным способом 20-1 (45,8 мг, 13,4 мкмоль), и соединение a, представленное вышеприведенной формулой (a) (125,8 мг, 53,7 мкмоль, 4,0 эквивалента к пептиду 44), растворяли в 33 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 4,0 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 83:17 до 72:28, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 45, представленный нижеследующей формулой 45 (SEQ ID NO. 63) (44,5 мг, 5,61 мкмоль, выход 42%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₃₁₈H₅₀₂N₅₈O₁₆₅S₅: [M+5H]⁵⁺ 1588.6, [M+6H]⁶⁺ 1324.0, [M+7H]⁷⁺ 1135.0, [M+8H]⁸⁺ 993.3, [M+9H]⁹⁺ 883.0, практ. 1588.6, 1324.0, 1135.0, 993.2, 883.0.

20-3. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 45, полученному вышеописанным способом 20-2 (44,5 мг, 5,61 мкмоль), добавляли водный раствор (2,2 мл) ацетата серебра(I) (14,8 мг, 88,7 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавляли DTT (33,2 мг, 215 мкмоль), растворенный в 200 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 2,2 мл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (561 мкл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 83:17 до 72:28, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 46 (SEQ ID NO. 64), представленный нижеследующей формулой (46) (34,4 мг, 4,41 мкмоль, выход 79%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₃₁₂H₄₉₂N₅₆O₁₆₃S₅: [M+4H]⁴⁺ 1950.0, [M+5H]⁵⁺ 1560.2, [M+6H]⁶⁺ 1300.3, практ. 1949.8,1560.1,1300.2.

20-4. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 46, полученный вышеописанным способом 20-3 (34,4 мг, 4,41 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 8,8 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10%) воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 77:23 до 65:35, 16 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (S1-2С(дисиало)-SRIF28), представленное нижеследующей формулой (47) (SEQ ID NO. 21).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,Р/о водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 83:17 до 72:28, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая S1-2C(дисиало)-SRIF28 (20,1 мг, 2,58 мкмоль, выход 58%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₃₁₂H₄₉₀N₅₆O₁₆₃S₅: [M+4H]⁴⁺ 1949.5, [M+5H]⁵⁺ 1559.8, [M+6H]⁶⁺ 1300.0, практ. 1949.4, 1559.7, 1299.9.

Пример 21. Синтез S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (49) (S1C(дисиало)-N5C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 22), синтезировали аналогично примеру 20, за исключением того, что вместо пептида 44 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (48) (пептид 48) (SEQ ID NO. 65).

Пример 22. Синтез S1C(дисиало)-R13C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (51) (S1C(дисиало)-R13C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 23), синтезировали аналогично примеру 20, за исключением того, что вместо пептида 44 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (50) (пептид 50) (SEQ ID NO. 66).

Пример 23. Синтез N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (53) (N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 24), синтезировали аналогично примеру 20, за исключением того, что вместо пептида 44 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (52) (пептид 52) (SEQ ID NO. 67).

Пример 24. Синтез S1-3С(дисиало)-SRIF28

24-1. Синтез пептида

В колонку для твердофазного синтеза вносили 2-хлортритилхлоридную смолу (100 мкмоль) и после промывки DMF и дихлорметаном добавляли раствор Fmoc-Cys(Acm)-OH (49,7 мг, 120 мкмоль) и DIPEA (104,5 мкл, 600 мкмоль) в дихлорметане (3,0 мл), а затем встряхивали в течение 1 ч. После промывки дихлорметаном и DMF удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, методом твердофазного синтеза пептидов по стратегии Fmoc с использованием синтезатора пептидов Prelude™ синтезировали блокированный пептид на смоле. Реакцию конденсации проводили в DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента.

Защитную группу Fmoc удаляли путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Часть неочищенного пептида очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 73:27 до 65:35, 14 мин, элюирование линейным градиентом], получая пептид 54 (SEQ ID NO. 68), представленный нижеследующей формулой (54) (41,7 мг).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₄₉H₂₂₉N₄₅O₄₂S₆: [M+3H]₃₊ 1172.7, [M+4H]⁴⁺ 879.8, [M+5H]⁵⁺ 704.0, практ. 1 172.5, 879.4, 703.9.

24-2. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 54, полученный вышеописанным способом 24-1 (10,7 мг, 3,04 мкмоль), и соединение а, представленное вышеприведенной формулой (а) (36,6 мг, 15,6 мкмоль, 5,2 эквивалента к пептиду 54), растворяли в 33 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 0,91 мл), содержащем 10 мкМ ТСЕР, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 100 мин. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 80:20 до 70:30, 5 мин, затем от 70:30 до 65:35, 12 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 55 (SEQ ID NO. 69), представленный нижеследующей формулой (55) (11,7 мг, 1,14 мкмоль, выход 38%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₄₀₇H₆₄₆N₆₆O₂₂₈S₆: [M+5H]⁵⁺ 2061.8, [M+6H]⁶⁺ 1718.4, [M+7H]⁷⁺ 1473.0, [M+8H]⁸⁺ 1289.0, [M+9H]⁹⁺ 1145.9, [M+10H]¹⁰⁺ 1031.4, практ. 2061.8, 1718.2, 1472.9, 1289.0, 1145.8, 1031.3.

24-3. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 55, полученному вышеописанным способом 24-2 (11,7 мг, 1,14 мкмоль), добавляли водный раствор (0,46 мл) ацетата серебра(I) (4,7 мг, 28 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли DTT (11,3 мг, 73 мкмоль), растворенный в 200 мМ буфере трис-HCl (pH 7,4, 0,46 мл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (0,11 мл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 80:20 до 70:30, 5 мин, затем от 70:30 до 55:45, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 56 (SEQ ID NO. 70), представленный нижеследующей формулой (56)(7,4 мг, 0,73 мкмоль, выход 64%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₄₀₁H₆₃₆N₆₄O₂₂₆S₆: [M+6H]⁶⁺ 1694.7, [M+7H]⁷⁺ 1452.7, [M+8H]⁸⁺ 1271.3, [M+9H]⁹⁺ 1130.1, [M+10H]¹⁰⁺ 1017.2, практ. 1694.6, 1452.5, 1271.4, 1130.0, 1017.2.

24-4. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 56, полученный вышеописанным способом 24-3 (7,4 мг, 0,73 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 1,8 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 25 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 80:20 до 70:30, 5 мин, затем от 70:30 до 69,3:30, 7,5 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (S1-3C(дисиало)-SRIF28), представленное нижеследующей формулой (57) (SEQ ID NO. 25).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 80:20 до 40:60, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая S1-3C(дисиало)-SRIF28 (4,7 мг, 0,46 мкмоль, выход 63%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₄₀₁H₆₃₄N₆₄O₂₂₆S₆: [M+3H]³⁺ 3387.7, [M+4H]⁴⁺ 2541.0, [M+5H]⁵⁺ 2033.0, [M+6H]⁶⁺ 1694.3, [M+7H]⁷⁺ 1452.4, практ. 3387.6, 2540.9, 2032.7, 1694.2, 1452.3.

Пример 25. Синтез S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (59) (S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 26), синтезировали аналогично примеру 24, за исключением того, что вместо пептида 54 использовали пептид 58 (SEQ ID NO. 71), представленный нижеследующей формулой (58).

Пример 26. Синтез S1C(моносиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (60) (S1C(моносиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 27), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо соединения а использовали соединение b, представленное нижеследующей формулой (b) (бромацетамидированный олигосахарид фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.).

У конечного продукта соотношение между гликозилированным полипептидом с сахаридной цепочкой по следующей формуле b1 и гликозилированным полипептидом с сахаридной цепочкой по следующей формуле b2 составляло 45:55. Отметим, что это дает возможность получать гликозилированные полипептиды с практически однородной структурой сахаридной цепочки при использовании производных моносиалосахаридных цепочек с одинаковой структурой.

Пример 27. Синтез S1C(асиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (61) (S1C(асиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 28), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо соединения а использовали соединение с, представленное нижеследующей формулой (c) (бромацетамидированный олигосахарид фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.).

Пример 28. Синтез S1-2C(асиало)-SRIF28

28-1. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 44 (21,2 мг, 6,21 мкмоль) и соединение с (44,5 мг, 25,3 мкмоль, 4,1 эквивалента к пептиду 44) растворяли в 33 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 1,9 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10%) воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 77:23 до 62:38, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 62 (SEQ ID NO. 72), представленный нижеследующей формулой (62) (24,0 мг, 3,54 мкмоль, выход 57%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₇₄H₄₃₄N₅₄O₁₃₃S₅: [M+4H]⁴⁺ 1694.3, [M+5H]⁵⁺ 1355.6, [M+6H]⁶⁺ 1129.8, практ. 1694.3, 1355.6, 1130.0.

28-2. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 62, полученному вышеописанным способом 28-1 (24,0 мг, 3,54 мкмоль), добавляли водный раствор (1,4 мл) ацетата серебра(I) (6,0 мг, 36 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 3 ч. Добавляли DTT (14,0 мг, 90,8 мкмоль), растворенный в 500 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 0,57 мл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (0,35 мл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 65:35, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 63 (SEQ ID NO. 73), представленный нижеследующей формулой (63) (20,1 мг, 3,03 мкмоль, выход 86%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₆₈H₄₂₄N₅₂O₁₃₁S₅: [M+4H]⁴⁺ 1658.7, [M+5H]⁵⁺ 1327.2, практ. 1658.8, 1327.0.

28-3. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 63, полученный вышеописанным способом 28-2 (20,1 мг, 3,03 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 6,1 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 77:23 до 65:35, 16 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (S1-2С(асиало)-SRIF28), представленное нижеследующей формулой (64) (SEQ ID NO. 29).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK С18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 92:8 до 80:20, 16 мин, элюирование линейным градиентом], получая S1-2C(асиало)-SRIF28 (11,0 мг, 1,66 мкмоль, выход 55%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₆₈H₄₂₂N₅₂O₁₃₁S₅: [M+4H]⁴⁺ 1658.2, [M+5H]⁵⁺ 1326.8, [M+6H]⁶⁺ 1105.8, [M+7H]⁷⁺ 948.0, [M+8H]⁸⁺ 829.6, практ. 1658.1, 1326.7, 1105.6, 947.8, 829.4.

Пример 29. Синтез S1-3C(асиало)-SRIF28

29-1. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 54 (21,3 мг, 6,06 мкмоль) и соединение с (53,4 мг, 30,3 мкмоль, 5,0 эквивалентов к пептиду 54) растворяли в 33 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 1,8 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 70:30, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 65 (SEQ ID NO. 74), представленный нижеследующей формулой (65) (39,3 мг, 4,59 мкмоль, выход 76%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C341H544N60O180S6: [M+4H]⁴⁺ 2140.2, [M+5H]⁵⁺ 1712.3, [M+6H]⁶⁺ 1427.1, практ. 2140.2, 1712.4, 1427.2. 29-2. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 65, полученному вышеописанным способом 29-1 (39,3 мг, 4,59 мкмоль), добавляли водный раствор (1,8 мл) ацетата серебра(I) (18,7 мг, 112 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 90 мин. Добавляли DTT (43,4 мг, 28,1 мкмоль), растворенный в 200 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 1,8 мл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (0,46 мл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10%) воды/90%) ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 68:32, 18 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 66 (SEQ ID NO. 75), представленный нижеследующей формулой (66) (27,6 мг, 3,28 мкмоль, выход 71%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₃₃₅H₅₃₄N₅₈O₁₇₈S₆: [M+4H]⁴⁺ 2104.6, [M+5H]⁵⁺ 1683.9, [M+6H]⁶⁺ 1403.4, практ. 2104.6, 1684.0, 1403.3. 29-3. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 66, полученный вышеописанным способом 29-2 (27,6 мг, 3,28 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 8,2 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10%» воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 72:28 до 70,5:29,5, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (S1-3C(асиало)-SRIF28), представленное нижеследующей формулой (67) (SEQ ID NO. 30).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90%) ацетонитрила, градиент A:B от 96:4 до 82:18, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая S1-3C(асиало)-SRIF28 (14,5 мг, 1,72 мкмоль, выход 52%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₃₃₅H₅₃₂N₅₈O₁₇₈S₆: [M+4H]⁴⁺ 2104.1, [M+5H]⁵⁺ 1683.5, [M+6H]⁶⁺ 1403.1, практ. 2103.7, 1683.3, 1403.0.

Пример 30. Синтез N5N(дисиало)-SRIF28

30-1. Твердофазный синтез гликопептида

В колонку для твердофазного синтеза вносили 2-хлортритилхлоридную смолу (100 мкмоль) и после промывки DMF и дихлорметаном добавляли раствор Fmoc-Cys(Trt)-OH (72,5 мг, 120 мкмоль) и DIPEA (104,6 мкл, 600 мкмоль) в дихлорметане (3,0 мл), а затем встряхивали в течение 1 ч. После промывки дихлорметаном и DMF удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, методом твердофазного синтеза пептидов по стратегии Fmoc с использованием синтезатора пептидов Prelude™ синтезировали блокированный пептид 68 (SEQ ID NO. 76), представленный нижеследующей формулой (68), в связанном со смолой состоянии. Реакцию конденсации проводили в DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента.

Затем удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF к смоле последовательно добавляли соединение d, представленное нижеследующей формулой (d) (фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.) (411,9 мг, 150,4 мкмоль), раствор DMSO-DMF (1/1, об/об, 871 мкл), TBTU (64,2 мг, 200 мкмоль) и DIPEA (52,3 мкл, 300 мкмоль), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч для реакции конденсации.

После промывки DMF еще раз повторяли реакцию конденсации. После промывки смолы DMF и дихлорметаном ее встряхивали с 20% пиперидином в DMF в течение 20 мин для удаления защитной группы Fmoc, смолу промывали DMF и на ней синтезировали блокированное соединение, представленное нижеследующей формулой (69) (пептид 69) (SEQ ID NO. 77).

На этой смоле, используя HOBt/DIC в качестве конденсирующего реагента, проводили конденсацию Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ala и Fmoc-Ser(tBu)-OH один за другим. После конденсации удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TAA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. К фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Этот неочищенный пептид очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, A:B=70:30], получая гликопептид 70 (SEQ ID NO. 78), представленный нижеследующей формулой (70) (29,1 мг, 5,26 мкмоль).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₃₅H₃₅₇N₄₇O₁₀₀S₃: [M+3H]³⁺ 1846.6, [M+4H]⁴⁺ 1385.2, [M+5H]⁵⁺ 1108.4, практ. 1846.5, 1385.1, 1108.3. 30-2. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 70, полученный вышеописанным способом 30-1 (12,2 мг, 2,20 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 5,5 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 80:20 до 66:35, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 71 (SEQ ID NO. 79), представленный нижеследующей формулой (71) (8,3 мг, 1,5 мкмоль, выход 68%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₃₅H₃₅₅N₄₇O₁₀₀S₃: [M+3H]³⁺ 1846.5, [M+4H]⁴⁺ 1384.7, [M+5H]⁵⁺ 1108.0, практ. 1846.5, 1384.7, 1108.1.

30-3. Удаление защитной группы бензила

Гликопептид 71, полученный вышеописанным способом 30-2 (7,5 мг, 1,4 мкмоль), растворяли в 50 мМ водном растворе NaOH (20,6 мл) и проводили реакцию при 0°C в течение 80 мин. Добавляли 200 мМ водный раствор уксусной кислоты (5,1 мл) и перемешанный раствор подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 73:27 до 66,3:33,7, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (N5N(дисиало)-SRIF28), представленное нижеследующей формулой (72) (SEQ ID NO. 31).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 80:20 до 60:40, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая N5N(дисиало)-SRIF28 (1,4 мг, выход 19%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₂₁H₃₄₃N₄₇O₁₀₀S₃: [M+3H]³⁺ 1785.9, [M+4H]⁴⁺ 1339.6, [M+5H]⁵⁺ 1071.9, практ. 1785.7, 1339.5, 1071.8.

Пример 31. Синтез S1N(дисиало)-SRIF28

31-1. Твердофазный синтез гликопептида

В колонку для твердофазного синтеза вносили 2-хлортритилхлоридную смолу (100 мкмоль) и после промывки DMF и дихлорметаном добавляли раствор Fmoc-Cys(Trt)-OH (72,5 мг, 120 мкмоль) и DIPEA (104,6 мкл, 600 мкмоль) в дихлорметане (3,0 мл), а затем встряхивали в течение 1 ч. После промывки дихлорметаном и DMF удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, методом твердофазного синтеза пептидов по стратегии Fmoc с использованием синтезатора пептидов Prelude™ синтезировали блокированный пептид 73 (SEQ ID NO. 80), представленный нижеследующей формулой (73), в связанном со смолой состоянии. Реакцию конденсации проводили в DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента.

Затем удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF к смоле последовательно добавляли соединение d (420,2 мг, 153,3 мкмоль), раствор DMSO-DMF (1/1, об/об, 871 мкл), TBTU (64,2 мг, 200 мкмоль) и DIPEA (52,3 мкл, 300 мкмоль), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 2 ч для реакции конденсации. После промывки DMF еще раз повторяли реакцию конденсации. После промывки смолы DMF и дихлорметаном ее встряхивали с 20% пиперидином в DMF в течение 20 мин для удаления защитной группы Fmoc, затем смолу промывали DMF и на ней синтезировали блокированный пептид 74 (SEQ ID NO. 81), представленный нижеследующей формулой (74).

После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. К фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Этот неочищенный пептид очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, A:B=71:29], получая гликопептид 75 (SEQ ID NO. 82), представленный нижеследующей формулой (75) (65,7 мг, 11,8 мкмоль).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₃₆H₃₅₈N₄₈O₁₀₀S₃: [M+4H]⁴⁺ 1392.0, [M+5H]⁵⁺ 1113.8, практ. 1391.9, 1113.8.

31-2. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 75, полученный вышеописанным способом 31-1 (20,3 мг, 3,65 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 9,0 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 72:28 до 67:33, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 76 (SEQ ID NO. 83), представленный нижеследующей формулой (76) (17,0 мг, 3,06 мкмоль, выход 84%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₃₆H₃₅₆N₄₈O₁₀₀S₃: [M+4H]⁴⁺ 1391.5, [M+5H]⁵⁺ 1113.4, практ. 1391.3, 1113.2.

31-3. Удаление защитной группы бензила

Гликопептид 76, полученный вышеописанным способом 31-2 (7,0 мг, 1,3 мкмоль), растворяли в 50 мМ водном растворе NaOH (19,1 мл) и проводили реакцию при 0°C в течение 1 ч. Добавляли 200 мМ водный раствор уксусной кислоты (9,6 мл) и перемешанный раствор подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 85:15 до 77,5:22,5, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая соединение, представленное нижеследующей формулой (77) (S1N(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 32) (2,7 мг, 0,50 мкмоль, выход 40%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₂₂H₃₄₄N₄₈O₁₀₀S₃: [M+3H]³⁺ 1794.9, [M+4H]⁴⁺ 1346.4, [M+5H]⁵⁺ 1077.3, [M+6H]⁶⁺ 897.9, практ. 1794.7, 1346.2, 1077.2, 897.7.

Пример 32. Синтез S1C(дисиало)⋅N19C(GlcNAc)-SRIF28

32-1. Синтез пептида

В колонку для твердофазного синтеза вносили 2-хлортритилхлоридную смолу (100 мкмоль) и после промывки DMF и дихлорметаном добавляли раствор Fmoc-Cys(Acm)-OH (49,7 мг, 120 мкмоль) и DIPEA (104,5 мкл, 600 мкмоль) в дихлорметане (3,0 мл), а затем встряхивали в течение 1 ч. После промывки дихлорметаном и DMF удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF и дихлорметаном, методом твердофазного синтеза пептидов по стратегии Fmoc с использованием синтезатора пептидов Prelude™ синтезировали блокированный пептид на смоле. Реакцию конденсации проводили в DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента.

Защитную группу Fmoc удаляли путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Часть неочищенного пептида очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 72:28 до 64:36, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая пептид 78 (SEQ ID NO. 84), представленный нижеследующей формулой (78) (28,9 мг).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₄₆H₂₂₆N₄₂O₃₉S₆: [M+3H]³⁺ 1129.7, [M+4H]⁴⁺ 847.5, практ. 1129.5,847.4.

32-2. Гликозилирование тиола и удаление защитной группы StBu Пептид 78, полученный вышеописанным способом 32-1 (10,0 мг, 2,95 мкмоль), и соединение е, представленное нижеследующей формулой (е) (бромацетамидированный моносахарид фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.) (2,0 мг, 5,90 мкмоль, 2,0 эквивалента к пептиду 78), растворяли в 33 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 0,89 мл), содержащем 20 мкМ ТСЕР, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 ч.

После реакции добавляли DTT (45,5 мг, 295 мкмоль), растворенный в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4, 3,0 мл), и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 65:35, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 79 (SEQ ID NO. 85), представленный нижеследующей формулой (79) (6,8 мг, 1,9 мкмоль, выход 64%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₅₂H₂₃₄N₄₄O₄₅S₅ [M+3H]³⁺ 1187.0, [M+4H]⁴⁺ 890.5, практ. 1187.0, 890.5.

32-3. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 79, полученный вышеописанным способом 32-2 (6,8 мг, 1,9 мкмоль), и соединение а, представленное вышеприведенной формулой (A) (22,4 мг, 9,56 мкмоль, 5,0 эквивалентов к пептиду 79), растворяли в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4, 2,0 мл), содержащем 7,6 мМ DTT, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 85:15 до 65:35, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 80 (SEQ ID NO. 86), представленный нижеследующей формулой (80) (3,4 мг, 0,58 мкмоль, выход 31%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₃₈H₃₇₃N₅₁O₁₀₇S₅: [M+5H]⁵⁺ 1165.2, [M+6H]⁶⁺ 971.2, [M+7H]⁷⁺ 832.6, [M+8H]⁸⁺ 728.6, практ. 1165.2,971.1, 832.6, 728.6. 32-4. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 80, полученному вышеописанным способом 32-3 (3,8 мг, 0,65 мкмоль), добавляли водный раствор (262 мкл) ацетата серебра(I) (2,7 мг, 16 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляли DTT (10,0 мг, 64,8 мкмоль), растворенный в 100 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 426 мкл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (66 мкл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10%) воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 90:10 до 60:40, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 81 (SEQ ID NO. 87), представленный нижеследующей формулой (81) (2,5 мг, 0,44 мкмоль, выход 67%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₃₂H₃₆₃N₄₉O₁₀₅S₅: [M+3H]³⁺ 1894.0, [M+4H]⁴⁺ 1420.7, [M+5H]⁵⁺ 1136.8, практ. 1893.8, 1420.6, 1136.7.

32-4. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 81, полученный вышеописанным способом 32-3 (2,5 мг, 0,44 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 1,1 мл) и проводили реакцию в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 90:10 до 70:30, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая соединение, представленное нижеследующей формулой (82) (S1C(дисиало)⋅N19C(G1cNAc)-SWF28) (SEQ ID NO. 33) (1,5 мг, 0,26 мкмоль, выход 59%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₃₂H₃₆₁N₄₉O₁₀₅S₅: [M+3H]³⁺ 1893.3, [M+4H]⁴⁺ 1420.2, [M+5H]⁵⁺ 1136.4, практ. 1893.5, 1420.1, 1136.3.

Пример 33. Синтез S1C(дисиало)⋅N9C(диMan)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (83) (S1C(дисиало)-N19C(диMan)-SRIF28) (SEQ ID NO. 34), синтезировали аналогично примеру 32, за исключением того, что вместо соединения e использовали соединение f представленное нижеследующей формулой (f) (бромацетамидированный олигосахарид фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.).

Пример 34. Синтез C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (85) (C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 89), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (84) (пептид 84) (SEQ ID NO. 88).

Пример 35. Синтез R11C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (87) (R11C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 91), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (86) (пептид 86) (SEQ ID NO. 90).

Пример 36. Синтез F20C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (89) (F20C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 93), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (88) (пептид 88) (SEQ ID NO. 92).

Пример 37. Синтез T24C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (91) (T24C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 95), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (90) (пептид 90) (SEQ ID NO. 94).

Пример 38. Синтез F25C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (93) (F25C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 97), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (92) (пептид 92) (SEQ ID NO. 96).

Пример 39. Синтез S27C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (95) (S27C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 99), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (94) (пептид 94) (SEQ ID NO. 98).

Пример 40. Синтез С(дисиало)-K-SRIF14

Соединение, представленное нижеследующей формулой (97) (C(дисиало)-K-SRIF14) (SEQ ID NO. 101), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (96) (пептид 96) (SEQ ID NO. 100).

Пример 41. Синтез S1C(дисиало)-F25Y-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (99) (S1C(дисиало)-F25Y-SRIF28) (SEQ ID NO. 103), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (98) (пептид 98) (SEQ ID NO. 102).

Пример 42. Синтез S1C(дисиало)-SRIF28-амида

Соединение, представленное нижеследующей формулой (101) (S1C(дисиало)-SRIF28-амид) (SEQ ID NO. 105), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (100) (пептид 100) (SEQ ID NO. 104).

Пример 43. Синтез С(дисиало)-линкер PEG-SRIF14

43-1. Синтез пептида

У блокированного пептида 39 (SEQ ID NO. 58) (50 мкмоль), связанного со смолой, полученного вышеописанным способом 19-1, удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента, проводили конденсацию Fmoc-NH-(PEG)2-COOH (фирмы Merck) и Fmoc-Cys(Trt)-OH один за другим. Удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Часть неочищенного пептида очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент А: 0,1% водный TFA, В: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 74:26 до 69:31, 1 мин, затем от 69:31 до 62:38, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая соединение, представленное нижеследующей формулой (102) (пептид 102) (SEQ ID NO. 106) (43,1 мг).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₉₄H₁₃₈N₂₂O₂₆S₃: [M+2H]²⁺ 1045.2, [M+3H]³⁺ 697.1, практ. 1045.0, 697.0.

43-2. Синтез C(дисиало)-линкер PEG-SRIF14

Соединение, представленное нижеследующей формулой (103) (С(дисиало)-линкер PEG-SRIF14) (SEQ ID NO. 107), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали пептид 102, полученный вышеописанным способом 43-1.

Пример 44. Синтез биотин-S1C(дисиало)-SRIF28

44-1. Синтез пептида

В колонку для твердофазного синтеза вносили 2-хлортритилхлоридную смолу (100 мкмоль) и после промывки DMF и дихлорметаном добавляли раствор Fmoc-Cys(Acm)-OH (49,7 мг, 120 мкмоль) и DIPEA (104,5 мкл, 600 мкмоль) в дихлорметане (3,0 мл), а затем встряхивали в течение 1 ч. После промывки дихлорметаном и DMF удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, методом твердофазного синтеза пептидов по стратегии Fmoc с использованием синтезатора пептидов Prelude™ синтезировали блокированный пептид 104 (SEQ ID NO. 108), представленный нижеследующей формулой (104), в связанном со смолой состоянии. Реакцию конденсации проводили в DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента.

Защитную группу Fmoc удаляли путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента, проводили конденсацию биотина. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Это приводит к отделению защитной группы от боковой цепи аминокислоты (кроме группы Acm), а также к отщеплению пептида от смолы. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Неочищенный пептид очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 61:39, 18 мин, элюирование линейным градиентом], получая пептид 105 (SEQ ID NO. 109), представленный нижеследующей формулой (105).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₅₃H₂₃₃N₄₅O₄₂S₅: [M+3H]³⁺ 1179.4, [M+4H]⁴⁺ 884.8, [M+5H]⁵⁺ 708.0, практ. 1179.2, 884.4, 707.9.

44-2. Синтез биотин-S1C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (106) (биотин-S1C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 110), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали пептид 104, полученный вышеописанным способом 44-1.

Пример 45. Синтез биотин-линкер PEG-S1C(дисиало)-SRIF28 45-1. Синтез пептида

У блокированного пептида 104 (SEQ ID NO. 108), связанного со смолой, полученного в примере 44-1, удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента, проводили конденсацию Fmoc-NH-(PEG)₂-COOH (фирмы Merck) и биотина один за другим. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Неочищенный пептид очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 61:39, 22 мин, элюирование линейным градиентом], получая пептид 107 (SEQ ID NO. 111), представленный нижеследующей формулой (107).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₆₂H₂₅₀N₄₆O₄₆S₅: [M+3H]³⁺ 1247.1, [M+4H]⁴⁺ 935.6, [M+5H]⁵⁺ 748.7, практ. 1246.9, 935.4, 748.6.

45-2. Синтез биотин-линкер PEG-S1C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (108) (биотин-линкер PEG-S1C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 112), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали пептид 107, полученный вышеописанным способом 45-1.

Пример 46. Синтез азидо-S1C(дисиало)-SRIF28

46-1. Синтез пептида

У блокированного пептида 104 (SEQ ID NO. 108), связанного со смолой, полученного в примере 44-1, удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента, проводили конденсацию 5-азидопентановой кислоты. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Неочищенный пептид очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент А: 0,1% водный TFA, В: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 70:30 до 60:40, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая пептид 109 (SEQ ID NO. 113), представленный нижеследующей формулой (109).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₄₈H₂₂₆N₄₆O₄₁S₄: [M+3H]³⁺ 1145.6, [M+4H]⁴⁺ 859.5, [M+5H]⁵⁺ 687.8, практ. 1145.5, 859.2, 687.5.

46-2. Синтез азидо-S1C(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (110) (азидо-S1C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 114), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали пептид 109, полученный вышеописанным способом 46-1.

Пример 47. Синтез S1C(дисиало)-Е12С(дисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (112) (S1C(дисиало)-E12C(дисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 116), синтезировали аналогично примеру 20, за исключением того, что вместо пептида 44 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (111) (пептид 111) (SEQ ID NO. 115).

Пример 48. Синтез 2C(дисиало)-R-K-SRIF4

Соединение, представленное нижеследующей формулой (114) (2C(дисиало)-R-K-SRIF14) (SEQ ID NO. 118), синтезировали аналогично примеру 20, за исключением того, что вместо пептида 44 использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (113) (пептид 113) (SEQ ID NO. 117).

Пример 49. Синтез 3C(дисиало)-R-K-SRIF14

Соединение, представленное нижеследующей формулой (116) (3C(дисиало)-R-K-SRIF14) (SEQ ID NO. 120), синтезировали аналогично примеру 24, за исключением того, что вместо пептида 54 синтезировали и использовали соединение, представленное нижеследующей формулой (115) (пептид 115) (SEQ ID NO. 119).

Пример 50. Синтез S1C(диGlcNAc)-SRIF28

50-1. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 1 (SEQ ID NO. 38) (фирмы APC, Inc.) (25,0 мг, 7,56 мкмоль) и соединение h, представленное нижеследующей формулой (h) (бромацетамидированный олигосахарид фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.) (15,6 мг, 15,1 мкмоль, 2,0 эквивалента к пептиду 1), растворяли в 33 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 2,3 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин.

Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 62:38, 13 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 117 (SEQ ID NO. 121), представленный нижеследующей формулой (117) (25,6 мг, 6,01 мкмоль, выход 79%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₉₅H₃₀₄N₄₈O₇₆S₄: [M+3H]³⁺ 1556.0, [M+4H]⁴⁺ 1167.3, практ. 1555.7, 1167.0.

50-2. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 117, полученному вышеописанным способом 50-1 (28,3 мг, 6,07 мкмоль), добавляли водный раствор (2,4 мл) ацетата серебра(I) (12,5 мг, 74,5 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавляли DTT (28,8 мг, 187 мкмоль), растворенный в 200 мМ буфере трис-HCl (pH 7,4, 2,4 мл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (0,6 мл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 73:27 до 60:40, 13 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 118 (SEQ ID NO. 122), представленный нижеследующей формулой (118) (19,8 мг, 4,38 мкмоль, выход 72%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₈₉H₂₉₄N₄₆O₇₄S₄: [M+3H]³⁺ 1508.6, [M+4H]⁴⁺ 1131.7, [M+5H]⁵⁺ 905.6, практ. 1508.3, 1131.5, 905.4.

50-3. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 118, полученный вышеописанным способом 50-2 (19,8 мг, 4,38 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 8,8 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционную смесь подвергали предварительной очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 73:27 до 60:40, 13 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (S1C(диGlcNAc)-SRIF28), представленное нижеследующей формулой (119) (SEQ ID NO. 123).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент А: 0,1% водный AcOH, В: 0,09% AcOH/10%) воды/90%) ацетонитрила, градиент A:B от 90:10 до 78:22, 12 мин, элюирование линейным градиентом], получая S1C(диGlcNAc)-SRIF28 (11,9 мг, 2,63 мкмоль, выход 60%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₈₉H₂₉₂N₄₆O₇₄S₄: [M+3H]³⁺ 1508.0, [M+4H]⁴⁺ 1131.2, [M+5H]⁵⁺ 905.2, практ. 1507.7, 1131.0, 905.0.

Пример 51. Синтез S1C(диMan)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (120) (S1C(диMan)-SRIF28) (SEQ ID NO. 124), синтезировали аналогично примеру 50, за исключением того, что вместо соединения h использовали соединение f

Пример 52. Синтез N19C(диMan)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (121) (N19C(диМаn)-SRIF28) (SEQ ID NO. 125), синтезировали аналогично примеру 50, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали пептид 21 и вместо соединения h использовали соединение f

Пример 53. Синтез S1C(GlcNAc)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (122) (S1C(GlcNAc)-SRIF28) (SEQ ID NO. 126), синтезировали аналогично примеру 50, за исключением того, что вместо соединения h использовали соединение е.

Пример 54. Синтез N19C(GlcNAc)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (123) (N19C(GlcNAc)-SRIF28) (SEQ ID NO. 127), синтезировали аналогично примеру 50, за исключением того, что вместо пептида 1 использовали пептид 21 и вместо соединения h использовали соединение е.

Пример 55. Синтез SlC(трисиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (124) (S1C(трисиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 128), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо соединения а использовали соединение i, представленное нижеследующей формулой (i) (бромацетамидированный олигосахарид фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.).

Пример 56. Синтез S1C(тетрасиало)-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (125) (S1C(тетрасиало)-SRIF28) (SEQ ID NO. 129), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо соединения а использовали соединение j, представленное нижеследующей формулой (j) (бромацетамидированный олигосахарид фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.).

Пример 57. Синтез S1C(дисиало(аминоэтиламид))-SRIF28

57-1. Синтез бромацетамидированного производного дисиалосахаридной цепочки

К соединению k, представленному нижеследующей формулой (k) (фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.) (204,1 мг, 92,1 мкмоль), добавляли воду (2 мл) и трет-бутил-N-(2-аминоэтил)карбамат (0,29 мл, 0,18 ммоль), а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. После лиофилизации к полученному лиофилизату добавляли DMF (5 мл), HATU (349 мг, 921 мкмоль) и DIPEA (161 мкл, 921 мкмоль) и проводили реакцию при 37°C в течение 18 ч. В раствор добавляли толуол (50 мл) и собирали выпавший осадок фильтрованием. Осадок растворяли в DMF (5 мл) и подвергали очистке методом гель-фильтрации [колонка: Sephadex G-25, ϕ 20×200 мм, скорость потока: 30 мл/ч], собирали нужные фракции и лиофилизировали, получая соединение l, представленное нижеследующей формулой (1) (152,4 мг, 60,8 мкмоль, выход 66%).

MALDI-MS: (m/z) теор. для C₉₈H₁₆₆N₁₀O₆₄: [M+Na]⁺ 2530.0, практ. 2529.4.

Соединение l (100 мг, 39,8 мкмоль) и бикарбонат аммония (31,4 мг, 398 мкмоль) растворяли в воде (1 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 7 дней. После лиофилизации к полученному лиофилизату последовательно добавляли воду (1 мл), DCC (41,0 мг, 199 мкмоль) и бромуксусную кислоту (27,7 мг, 199 мкмоль), растворенную в DMF (1 мл). После реакции в течение 1 часа с охлаждением на льду раствор подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока : 8,0 мл/мин, элюент : вода : ацетонитрил = 84:16], получая соединение m, представленное нижеследующей формулой (m) (бромацетамидированное производное дисиалосахаридной цепочки: 100 мг, 38,2 мкмоль, выход 96%).

MALDI-MS: (m/z) (m/z) теор. для C₁₀₀H₁₆₈BrN₁₁O₆₄: [M+Na]⁺2648.9, практ. 2648.5.

57-2. Реакция гликозилирования тиола

Соединение m, полученное вышеописанным способом 57-1 (14,2 мг, 5,40 мкмоль), и пептид 1 (15,0 мг, 4,53 мкмоль) растворяли в 33 мМ фосфатном буфере (рН 7,4, 1,3 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL РАK С18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент А: 0,1% уксусная кислота (АсОН) в воде, В: 0,09% АсОН/10% воды/90% ацетонитрила, градиент А:В от 86:14 до 82:18, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 126 (SEQ ID NO. 130), представленный нижеследующей формулой (126) (13,4 мг, 2,29 мкмоль, выход 51%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₄₃H₃₈₆N₅₄O₁₀₄S₄: [М+4Н]⁴⁺1465.1, [М+5Н]⁵⁺1172.2, [М+6Н]⁶⁺977.0, практ. 1464.9, 1172.1,977.1.

57-3. Удаление защитной группы Boc

Гликопептид 126, полученный вышеописанным способом 57-2 (13,4 мг, 2,29 мкмоль), растворяли в 95% водном растворе TFA (458 мкл) и встряхивали при комнатной температуре в течение 5 мин. После добавления 50 мМ водного раствора ацетата аммония (рН 6,8, 33 мл) реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL РАK С18 UG-120 (5 мкм), φ 20x250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 73:27 до 65:35, 10 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 127 (SEQ ID NO. 131), представленный нижеследующей формулой (136) (12,7 мг, 98 мкмоль, выход 98%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₃₃H₃₇₀N₅₄O₁₀₀S₄: [M+4H]⁴⁺ 1415.1, [M+5H]⁵⁺ 1132.2, [M+6H]⁶⁺ 943.7, [M+7H]⁷⁺ 809.0, практ. 1414.9, 1132.1, 943.6, 808.9.

57-4. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 127, полученному вышеописанным способом 57-3 (12,7 мг, 2,25 мкмоль), добавляли водный раствор (0,9 мл) ацетата серебра(I) (9,2 мг, 55 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем добавляли DTT (21,2 мг, 137 мкмоль), растворенный в 200 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 0,9 мл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (225 мкл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 73:27 до 60:40, 13 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 128 (SEQ ID NO. 132), представленный нижеследующей формулой (128) (5,2 мг, 0,94 мкмоль, выход 42%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₂₇H₃₆₀N₅₂O₉₈S₄: [M+4H]⁴⁺ 1379.5, [M+5H]⁵⁺ 1103.8, [M+6H]⁶⁺ 920.0, [M+7H]⁷⁺ 788.7, практ. 1379.4,1103.7, 919.9, 788.6.

57-5. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 128, полученный вышеописанным способом 57-4 (5,2 мг, 0,94 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 1,9 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20*250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90%) ацетонитрила, градиент A:B от 70:30 до 65:35, 13 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (S1C(дисиало(амино-этиламид))-SRIF28), представленное нижеследующей формулой (129) (SEQ ID NO. 133).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10%) воды/90%) ацетонитрила, градиент A:B от 92:8 до 85:15, 14 мин, элюирование линейным градиентом], получая S1C(дисиало(аминоэтил-амид))-SRIF28 (3,8 мг, 0,69 мкмоль, выход 73%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₂₇H₃₅₈N₅₂O₉₈S₄: [M+3H]³⁺ 1838.3, [M+4H]⁴⁺ 1379.0, [M+5H]⁵⁺ 1103.4, [M+6H]⁶⁺ 919.6, [M+7H]⁷⁺ 788.4, практ. 1838.0, 1378.5, 1103.2, 919.5, 788.2.

Пример 58. Синтез S1C(дисиало(амид))-SRIF28

58-1. Синтез бромацетамидированного производного дисиалосахаридной цепочки K соединению k (фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.) (152 мг, 68,6 мкмоль) последовательно добавляли DMF (1,9 мл), бромид лития (357 мг, 4,12 ммоль) и фенацилхлорид (273 мг, 1,37 ммоль) и проводили реакцию при 37°C. Через 10 ч добавляли воду (19 мл) и удаляли осадок фильтрованием. К фильтрату добавляли 25% аммиачную воду (5 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 18 ч, а затем добавляли 100 мМ фосфатный буфер (pH 7,4, 80 мл) для нейтрализации. Раствор подвергали очистке методом HPLC [колонка: YMC Hydrosphere C18 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 8,0 мл/мин, элюент: 0,1% водный TFA : ацетонитрил от 98:2 до 92:8, 30 мин, элюирование линейным градиентом] и лиофилизировали, получая соединение n, представленное нижеследующей формулой (n) (60,9 мг, 27,4 мкмоль, выход 40%).

MALDI-MS: (m/z) теор. для C₈₄H₁₄₀N₈O₆₀: [M+Na]⁺ 2243.8, практ. 2243.6.

Полученное промежуточное соединение n (37,3 мг, 16,8 мкмоль) и бикарбонат аммония (13,3 мг, 168 мкмоль) растворяли в воде (0,37 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 7 дней. После лиофилизации к полученному лиофилизату последовательно добавляли воду (0,37 мл), DCC (17,3 мг, 84 мкмоль) и бром-уксусную кислоту (11,7 мг, 84 мкмоль), растворенную в DMF (0,37 мл). После реакции в течение 1 часа с охлаждением на льду раствор подвергали очистке методом HPLC [колонка: YMC Hydrosphere C18 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 8,0 мл/мин, элюент: 0,1% водный TFA : ацетонитрил от 98:2 до 92:8, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая соединение о, представленное нижеследующей формулой (о) (бромацетамидированное производное дисиалосахаридной цепочки: 29,0 мг, 12,4 мкмоль, выход 74%).

MALDI-MS: (m/z) теор. для C₈₆H₁₄₂BrN₉O₆₀: [M+Na]⁺ 2362.7, практ. 2362.5.

58-2. Синтез S1C(дисиало(амид))-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (130) (S1C(дисиало (амид))-SRIF28) (SEQ ID NO. 134), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо соединения a использовали соединение o, полученное вышеописанным способом 58-1.

Пример 59. Синтез S1C(дисиало(Bn))-SRIF28

59-1. Синтез бромацетамидированного производного дисиалосахаридной цепочки

К соединению а (28,9 мг, 12,3 мкмоль) последовательно добавляли DMF (0,58 мл), бромид лития (21,5 мг, 248 мкмоль) и бензилбромид (14,6 мкл, 122 мкмоль) и проводили реакцию при 30°C в течение 20 ч. Еще добавляли бензилбромид (14,6 мкл, 122 мкмоль) и проводили реакцию в течение 20 ч. В реакционную смесь добавляли толуол (30 мл) и после центрифугирования (10000×g, 10 мин) осадок растворяли в воде (100 мкл) и подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 8,0 мл/мин, элюент : вода : ацетонитрил от 95:5 до 70:30, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая соединение g, представленное нижеследующей формулой (g) (бромацетамидированная дисиалосахаридная цепочка: 7,6 мг, 3,0 мкмоль, выход 24%).

59-2. Синтез S1C(дисиало(Bn))-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (131) (S1C(дисиало(Bn))-SRIF28) (SEQ ID NO. 135), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо соединения а использовали соединение g.

Пример 60. Синтез S1C(дисиало(гексадециламид))-SRIF28

60-1. Синтез бромацетамидированного производного дисиалосахаридной цепочки

К соединению к (фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.) (140 мг, 63,0 мкмоль) добавляли воду (1,5 мл), метанол (1,5 мл) и гексадециламин (300 мг, 126 мкмоль), а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. После лиофилизации к полученному лиофилизату добавляли DMF (5 мл), HATU (239 мг, 630 мкмоль) и DIPEA (110 мкл, 630 мкмоль) и проводили реакцию при 37°C. Через 18 ч в раствор добавляли диэтиловый эфир и собирали выпавший осадок фильтрованием. Осадок растворяли в DMF (5 мл) и подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 8,0 мл/мин, элюент: вода:ацетонитрил от 40:60 до 10:90, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая соединение p, представленное нижеследующей формулой (p) (71,1 мг, 26,6 мкмоль, выход 42%).

MALDI-MS: (m/z) теор. для C₁₁₆H₂₀₄N₈O₆₀: [M+Na]⁺ 2692.3, практ. 2691.9.

Полученное соединение p (71,7 мг, 26,6 мкмоль) и бикарбонат аммония (21,8 мг, 266 мкмоль) растворяли в воде (0,7 мл) и метаноле (0,7 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре. Через 7 дней к лиофилизату, полученному при лиофилизации, последовательно добавляли воду (0,7 мл), метанол (0,7 мл), DCC (27,4 мг, 133 мкмоль) и бромуксусную кислоту (18,5 мг, 133 мкмоль), растворенную в DMF (0,7 мл). После реакции в течение 1 часа с охлаждением на льду раствор подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 8,0 мл/мин, элюент : вода : ацетонитрил от 40:60 до 10:90, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая соединение q, представленное нижеследующей формулой (q) (бромацетамидированная дисиалосахаридная цепочка: 24,9 мг, 8,9 мкмоль, выход 33%).

MALDI-MS: (m/z) теор. для C₁₁₈H₂₀₆BrN₉O₆₀: [M+Na]⁺ 2811.2, практ. 2811.0.

60-2. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 1 (10,4 мг, 3,14 мкмоль) растворяли в 0,5 М фосфатном буфере (pH 7,4, 62 мкл), содержащем 30 мкМ ТСЕР. В этот раствор добавляли раствор соединения q, полученного вышеописанным способом 60-1 (79,4 мг, 28,5 мкмоль) в DMSO (3,7 мл), и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 20 мин. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 50:50 до 22:78, 14 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 132 (SEQ ID NO. 136), представленный нижеследующей формулой (132) (6,4 мг, 1,1 мкмоль, выход 35%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₆₁H₄₂₄N₅₂O₁₀₀S₄: [M+3H]³⁺ 2007.2, [M+4H]⁴⁺ 1505.7, [M+5H]⁵⁺ 1204.7, [M+6H]⁶⁺ 1004.1, практ. 2007.4, 1505.5, 1204.8, 1004.0.

60-3. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 132, полученному вышеописанным способом 60-2 (6,4 мг, 1,1 мкмоль), добавляли водный раствор (0,8 мл) ацетата серебра(I) (3,8 мг, 23 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 40 мин. Затем добавляли DTT (8,8 мг, 57 мкмоль), растворенный в 200 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 377 мкл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (106 мкл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 48:52 до 38:62, 3 мин, затем от 38:62 до 30:70, 8 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 133 (SEQ ID NO. 137), представленный нижеследующей формулой (133) (3,2 мг, 0,54 мкмоль, выход 49%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₅₅H₄₁₄N₅₀O₉₈S₄: [M+3H]³⁺ 1959.9, [M+4H]⁴⁺ 1470.1, [M+5H]⁵⁺ 1176.3, [M+6H]⁶⁺ 980.4, практ. 1959.6, 1469.9, 1176.1, 980.5.

60-3. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 133, полученный вышеописанным способом 60-2 (3,2 мг, 0,54 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 1,1 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 48:52 до 38:62, 3 мин, затем от 38:62 до 30:70, 8 мин, элюирование линейным градиентом], получая соединение, представленное нижеследующей формулой (134) (S1C(дисиало(гексадециламид))-SRIF28) (SEQ ID NO. 138) (2,8 мг, 0,48 мкмоль, выход 89%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₅₅H₄₁₂N₅₀O₉₈S₄: [M+3H]³⁺ 1959.2, [M+4H]⁴⁺ 1469.6, [M+5H]⁵⁺ 1175.9, [M+6H]⁶⁺ 980.1, практ. 1958.9, 1469.4, 1175.7, 979.9. Пример 61. Синтез S1-2C(дисиало(амид))-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (135) (S1-2C(дисиало (амид))-SRIF28) (SEQ ID NO. 139), синтезировали аналогично примеру 28, за исключением того, что вместо соединения с использовали соединение о.

Пример 62. Синтез S1-2C(дисиало(Bn))-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (136) (S1-2C(дисиало (Bn))-SRIF28) (SEQ ID NO. 140), синтезировали аналогично примеру 28, за исключением того, что вместо соединения с использовали соединение g.

Пример 63. Синтез S1C(Asn(дисиало))-SRIF28

Соединение, представленное нижеследующей формулой (137) (S1C(Asn(дисиало))-SRIF28) (SEQ ID NO. 141), синтезировали аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо соединения а использовали соединение r, представленное нижеследующей формулой (r) (бромацетилированный гликозилированный Asn фирмы Otsuka Chemical Co., Ltd.).

Пример 64. Синтез S1N(дисиало)-N19C(диМаn)-SRIF28

64-1. Твердофазный синтез гликопептида

В колонку для твердофазного синтеза вносили 2-хлортритилхлоридную смолу (100 мкмоль) и после промывки DMF и дихлорметаном добавляли раствор Fmoc-Cys(Trt)-OH (72,5 мг, 120 мкмоль) и DIPEA (104,6 мкл, 600 мкмоль) в дихлорметане (3,0 мл), а затем встряхивали в течение 1 ч. После промывки дихлорметаном и DMF удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, методом твердофазного синтеза пептидов по стратегии Fmoc с использованием синтезатора пептидов Prelude™ синтезировали блокированный пептид 138 (SEQ ID NO. 142), представленный нижеследующей формулой (138), в связанном со смолой состоянии. Реакцию конденсации проводили в DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента.

Затем удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF к смоле последовательно добавляли соединение d (141,0 мг, 51,5 мкмоль), раствор DMSO-DMF (1/1, об/об, 1,1 мл), TBTU (21,2 мг, 66,0 мкмоль) и DIPEA (17,2 мкл, 98,7 мкмоль), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 4 ч для реакции конденсации. После промывки DMF еще раз повторяли реакцию конденсации. После промывки смолы DMF и дихлорметаном ее встряхивали с 20% пиперидином в DMF в течение 20 мин для удаления защитной группы Fmoc, затем смолу промывали DMF и на ней синтезировали блокированный пептид 139 (SEQ ID NO. 143), представленный нижеследующей формулой (139).

После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Этот неочищенный пептид очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, A:B=70:30], получая гликопептид 140 (SEQ ID NO. 144), представленный нижеследующей формулой (140) (5,8 мг, 1,1 мкмоль).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₄₁H₃₆₇N₄₉O₁₀₁S₄: [M+4H]⁴⁺ 1424.8, [M+5H]⁵⁺ 1140.0, практ. 1424.6, 1139.9.

64-2. Реакция гликозилирования тиола

Гликопептид 140, полученный вышеописанным способом 64-1 (10,8 мг, 1,90 мкмоль), и соединение/(5,3 мг, 5,1 мкмоль) растворяли в 66 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 0,8 мл), содержащем 141 мкМ ТСЕР, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 24 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, A:B от 75:25 до 60:40, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 141 (SEQ ID NO. 145), представленный нижеследующей формулой (141) (4,9 мг, 0,74 мкмоль, выход 39%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₇₇H₄₂₆N₅₂O₁₂₇S₄: [M+3H]³⁺ 2216.0, [M+4H]⁴⁺ 1662.2, [M+5H]⁵⁺ 1330.0, практ. 2215.6, 1661.9, 1330.1.

64-3. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 141, полученному вышеописанным способом 64-2 (4,9 мг, 0,74 мкмоль), добавляли водный раствор (148 мкл) ацетата серебра(I) (1,5 мг, 9,0 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Добавляли DTT (3,5 мг, 23 мкмоль), растворенный в 200 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 145 мкл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (37 мкл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 74:26 до 64:36, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 142 (SEQ ID NO. 146), представленный нижеследующей формулой (142) (3,7 мг, 0,57 мкмоль, выход 77%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₇₁H₄₁₆N₅₀O₁₂₅S₄: [M+3H]³⁺ 2168.6, [M+4H]⁴⁺ 1626.7, [M+5H]⁵⁺ 1301.5, практ. 2168.6,1626.4,1301.3.

64-4. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 142, полученный вышеописанным способом 64-3 (3,7 мг, 0,54 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 1,4 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 31 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 60:40, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 143 (SEQ ID NO. 147), представленный нижеследующей формулой (143) (2,9 мг, 0,45 мкмоль, выход 78%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₇₁H₄₁₄N₅₀O₁₂₅S₄: [M+3H]³⁺ 2167.9, [M+4H]⁴⁺ 1626.2, [M+5H]⁵⁺ 1301.1, практ. 2167.9, 1626.0, 1301.2.

64-5. Удаление защитной группы бензила

Гликопептид 143, полученный вышеописанным способом 64-4 (2,9 мг, 0,45 мкмоль), растворяли в 50 мМ водном растворе NaOH (12 мл) и проводили реакцию при 0°C в течение 1 ч. Добавляли 200 мМ водный раствор уксусной кислоты (12 мл) и перемешанный раствор подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 60:40, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (S1N(дисиало)⋅N19C(диМаn)-SRIF28), представленное нижеследующей формулой 144 (SEQ ID NO. 148).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, скорость потока: 0,7 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 95:5 до 65:35, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая S1N(дисиало)⋅N19C(ди-Man)-SRIF28 (1,6 мг, 0,25 мкмоль, выход 57%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₅₇H₄₀₂N₅₀O₁₂₅S₄: [M+3H]³⁺ 2107.8, [M+4H]⁴⁺ 1581.1, [M+5H]⁵⁺1265.1, практ. 2107.9, 1580.9, 1265.1.

Пример 65. Синтез С(дисиало(аминоэтиламид))⋅S81C(дисиало)-SRIF28

65-1. Синтез пептида

В колонку для твердофазного синтеза вносили 2-хлортритилхлоридную смолу (100 мкмоль) и после промывки DMF и дихлорметаном добавляли раствор Fmoc-Cys(Acm)-OH (49,7 мг, 120 мкмоль) и DIPEA (104,5 мкл, 600 мкмоль) в дихлорметане (3,0 мл), а затем встряхивали в течение 1 ч. После промывки дихлорметаном и DMF удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, методом твердофазного синтеза пептидов по стратегии Fmoc с использованием синтезатора пептидов Prelude™ синтезировали блокированный пептид 145 (SEQ ID NO. 149), представленный нижеследующей формулой (145), в связанном со смолой состоянии. Реакцию конденсации проводили в DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента.

Часть смолы извлекали и удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Неочищенный пептид очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 73:27 до 63:37, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая пептид 146 (SEQ ID NO. 150), представленный нижеследующей формулой (146) (30,4 мг).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₅₀H₂₃₂N₄₄O₄₁S₆: [M+3H]³⁺ 1167.7, [M+4H]⁴⁺ 876.0, практ. 1167.5, 875.9.

65-2. Удаление защитной группы Boc у производного сахаридной цепочки Соединение m (50,0 мг, 19,0 мкмоль) растворяли в растворе TFA-H₂O (95/5, об/об, 2,5 мл) и встряхивали при комнатной температуре. Через 10 мин добавляли диэтиловый эфир (15 мл), а выпавший осадок центрифугировали (10000×g, 10 мин). Осадок растворяли в воде и лиофилизировали, получая соединение s, представленное нижеследующей формулой (s) (бромацетамидированная дисиалосахаридная цепочка: 46,0 мг, 18,9 мкмоль, выход 99%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₉₀H₁₅₂BrN₁₁O₆₀: [M+2H]²⁺ 1215.1, [M+3H]³⁺ 810.4, практ. 1214.9,810.3.

65-3. Гликозилирование тиола

Пептид 146, полученный вышеописанным способом 65-1 (20,6 мг, 5,89 мкмоль), и соединение s, полученное вышеописанным способом 65-2 (28,6 мг, 11,8 мкмоль), растворяли в 33 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 1,8 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 74:26 до 64:36, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 147 (SEQ ID NO. 151), представленный нижеследующей формулой (147) (17,1 мг, 2,93 мкмоль, выход 50%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₄₀H₃₈₃N₅₅O₁₀₁S₆: [M+3H]³⁺ 1950.1, [M+4H]⁴⁺ 1462.8, [M+5H]⁵⁺ 1170.5, [M+6H]⁶⁺ 975.6, практ. 1949.9,1462.6, 1170.3, 975.4.

65-4. Удаление защитной группы StBu

К гликопептиду 147, полученному вышеописанным способом 65-3 (17,1 мг, 2,93 мкмоль), добавляли DTT (52,9 мг, 343 мкмоль), растворенный в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4, 3,4 мл), и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 95:5 до 75:25, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 148 (SEQ ID NO. 152), представленный нижеследующей формулой (148) (8,6 мг, 1,5 мкмоль, выход 51%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₂₃₆H₃₇₅N₅₅O₁₀₁S₅: [M+3H]³⁺ 1920.7, [M+4H]⁴⁺ 1440.8, [M+5H]⁵⁺ 1152.8, [M+6H]⁶⁺ 960.9, [M+7H]⁷⁺ 823.7, практ. 1920.5, 1440.6, 1152.7, 960.6, 823.6.

65-5. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 148, полученный вышеописанным способом 65-4 (6,2 мг, 1,1 мкмоль), и соединение а (3,8 мг, 1,6 мкмоль) растворяли в 0,36 М фосфатном буфере (pH 7,4, 339 мл), содержащем 1,6 мМ DTT, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 90:10 до 75:25, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 149 (SEQ ID NO. 153), представленный нижеследующей формулой (149) (6,4 мг, 0,80 мкмоль, выход 73%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₃₂₂H₅₁₄N₆₂O₁₆₃S₅: [M+4H]⁴⁺ 2006.5, [M+5H]⁵⁺ 1605.4, [M+6H]⁶⁺ 1338.0, практ. 2006.6, 1605.3,1338.0.

65-6. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 149, полученному вышеописанным способом 65-5 (8,2 мг, 1,0 мкмоль), добавляли водный раствор (225 мкл) ацетата серебра(I) (2,1 мг, 13 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляли DTT (4,8 мг, 31 мкмоль), растворенный в 100 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 204 мкл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (51 мкл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 90:10 до 75:25, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 150 (SEQ ID NO. 154), представленный нижеследующей формулой (150) (5,5 мг, 0,70 мкмоль, выход 70%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₃₁₆H₅₀₄N₆₀O₁₆₁S₅: [M+4H]⁴⁺ 1971.0, [M+5H]⁵⁺ 1577.0, [M+6H]⁶⁺ 1314.3, практ. 1970.6, 1576.8, 1314.2.

65-7. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 150, полученный вышеописанным способом 65-6 (5,4 мг, 0,69 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 1,7 мл) и проводили реакцию в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 65:35, 30 мин, элюирование линейным градиентом], получая фракцию, содержащую соединение (C(дисиало(амино-этиламид))/S1C(дисиало)-SRIF28), представленное нижеследующей формулой 151 (SEQ ID NO. 155).

Эту фракцию подвергали дальнейшей очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 90:10 до 75:25, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая С (дисиало(аминоэтил-амид))/S1C(дисиало)-SRIF28 (3,1 мг, 0,40 мкмоль, выход 58%).

ESI-MS: теор. для C₃₁₆H₅₀₂N₆₀O₁₆₁S₅: [M+4H]⁴⁺ 1970.5, [M+5H]⁵⁺ 1576.6, [M+6H]⁶⁺ 1314.0, [M+7H]⁷⁺ 1126.4, [M+8H]⁸⁺ 985.8, [M+9H]⁹⁺ 876.3, практ. 1970.3, 1576.4, 1313.9, 1126.4, 985.5, 876.1.

Пример 66. Синтез S1-4C(дисиало)-SRIF28

66-1. Синтез пептида

В колонку для твердофазного синтеза вносили 2-хлортритилхлоридную смолу (100 мкмоль) и после промывки DMF и дихлорметаном добавляли раствор Fmoc-Cys(Acm)-OH (49,7 мг, 120 мкмоль) и DIPEA (104,5 мкл, 600 мкмоль) в дихлорметане (3,0 мл), а затем встряхивали в течение 1 ч. После промывки дихлорметаном и DMF удаляли защитную группу Fmoc путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF, методом твердофазного синтеза пептидов по стратегии Fmoc с использованием синтезатора пептидов Prelude™ синтезировали блокированный пептид 152 (SEQ ID NO. 156), представленный нижеследующей формулой (152), в связанном со смолой состоянии. Реакцию конденсации проводили в DMF, используя HCTU в качестве конденсирующего реагента.

Защитную группу Fmoc удаляли путем обработки 20% пиперидином в DMF. После промывки DMF и дихлорметаном добавляли смесь TFA : вода : триизопропилсилан : этандитиол (90:2,5:5:2,5), а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли холодный диэтиловый эфир и получали неочищенный пептид в виде осадка. Неочищенный пептид очищали методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 50×250 мм, скорость потока: 43,7 мл/мин, элюент A: 0,1% водный TFA, B: 0,09% TFA/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 75:25 до 65:35, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая пептид 153 (SEQ ID NO. 157), представленный нижеследующей формулой (153) (127,2 мг).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₁₅₂H₂₃₄N₄₆O₄₃S₇: [M+3H]³⁺ 1207.1, [M+4H]⁴⁺ 905.6, [M+5H]⁵⁺ 724.6, практ. 1206.9, 905.1, 724.5.

66-2. Реакция гликозилирования тиола

Пептид 153, полученный вышеописанным способом 66-1 (30,4 мг, 8,40 мкмоль), и соединение а (128 мг, 54,7 мкмоль) растворяли в 33 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 2,5 мл) и проводили реакцию в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10%) воды/90%) ацетонитрила, градиент A:B от 82:18 до 71:29, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 154 (SEQ ID NO. 158), представленный нижеследующей формулой (154) (30,9 мг, 2,44 мкмоль, выход 29%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₄₉₆H₇₉₀N₇₄O₂₉₁S₇: [M+6H]⁶⁺ 2112.7, [M+7H]⁷⁺ 1811.1, практ. 2112.8, 1811.0.

66-3. Удаление защитных групп Acm

К гликопептиду 154, полученному вышеописанным способом 66-2 (30,9 мг, 2,44 мкмоль), добавляли водный раствор (0,98 мл) ацетата серебра(I) (5,0 мг, 30 мкмоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем добавляли DTT (11,8 мг, 76,5 мкмоль), растворенный в 200 мМ буфере трис-HCl (pH 7,4, 0,98 мл), и 100 мМ водный раствор аскорбиновой кислоты (244 мкл) и сразу же фильтровали через фильтр. Фильтрат подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi (5 мкм), ϕ 20×250 мм, скорость потока: 7,0 мл/мин, элюент A: 0,1% водный AcOH, B: 0,09% AcOH/10% воды/90% ацетонитрила, градиент A:B от 82:18 до 70:30, 20 мин, элюирование линейным градиентом], получая гликопептид 155 (SEQ ID NO. 159), представленный нижеследующей формулой (155) (20,6 мг, 1,64 мкмоль, выход 67%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₄₉₀H₇₈₀N₇₂O₂₈₉S₇: [M+5H]⁵⁺ 2506.6, [M+6H]⁶⁺ 2089.0, [M+7H]⁷⁺ 1790.7, практ. 2506.5, 2088.8, 1790.4.

66-4. Образование дисульфидной связи

Гликопептид 155, полученный вышеописанным способом 66-3 (20,6 мг, 1,64 мкмоль), растворяли в 100 мМ буфере трис-HCl (pH 8,0) с DMSO (1/1, об/об, 2,1 мл) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 дней. Затем реакционную смесь подвергали очистке методом HPLC [колонка: SHISEIDO Proteonavi (5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, скорость потока: 0,7 мл/мин, элюент A: 10 мМ водный раствор ацетата аммония, B: 10 мМ ацетат аммония-ацетонитрил (1/9, об/об), градиент A:B от 75:25 до 72:28, 15 мин, элюирование линейным градиентом], получая S1-4C(дисиало)-SRIF28 (SEQ ID NO. 160), представленный нижеследующей формулой (156) (11,6 мг, 0,93 мкмоль, выход 57%).

ESI-MS: (m/z) теор. для C₄₉₀H₇₇₈N₇₂O₂₈₉S₇: [M+5H]⁵⁺ 2506.2, [M+6H]⁶⁺ 2088.7, [M+7H]⁷⁺ 1790.5, практ. 2506.1, 2088.6, 1790.4.

В таблицах от 1-1 до 1-7 представлены данные по MS-спектрам (ESI-MS) гликозилированных пептидов SRIF, полученных способами, описанными в примерах 1-66. Молекулярную массу получали посредством деконволюции поливалентных масс-спектров белков с помощью программы MassLynx версии 4.1 (фирмы Waters).

Пример 67-1. Расчет сродства связывания с рецепторами

Для расчета сродства связывания с рецепторами проводили анализ конкурентного связывания описанным ниже способом.

При анализе конкурентного связывания использовали реагенты, которые имеют следующие химические наименования: HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтан-сульфоновая кислота) и BSA (бычий сывороточный альбумин).

Анализ конкурентного связывания был поручен фирме Ricerca Biosciences, где проводились эксперименты и анализ данных. Подтипы рецепторов и мембранные образцы рецепторов приведены в табл. 2. При всех опытах по связыванию в качестве меченого лиганда использовали [¹²⁵I]-Tyr11-соматостатин-14 (Tyr11-SRIF14), в качестве немеченого лиганда использовали соматостатин-14 (SRIF14), а в качестве буфера использовали 25 мМ HEPES, содержащий 5 мМ MgCb, 1 мМ CaCl₂ и 0,1% BSA, pH 7,4. Исследуемые вещества использовали в концентрациях 0,01 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ или 1000 нМ и смешивали с мембранным образцом в реакционной смеси. Кроме того, концентрации меченых и немеченых лигандов, добавленных в реакционную смесь, приведены в табл. 2. Условия инкубации реакционной смеси: 25°C в течение 4 ч для SSTR2 и 25°C в течение 2 ч для SSTR1, SSTR3, SSTR4 и SSTR5. Для каждого эксперимента в качестве положительного контроля использовали SRIF14. Для анализа данных определяли концентрации, вызывающие ингибирование на 50% (значения IC₅₀), с помощью программы MathIQ™ (ID Business Solutions, UK) нелинейным методом наименьших квадратов на основе численных данных по степени ингибирования связывания. Константы ингибирования связывания (значения K_i) рассчитывали по методу Cheng Y et al. (Biochem Pharmacol, 22, 3099-3108, 1973).

Соединения, исследуемые при анализе связывания, и результаты экспериментов по связыванию приведены в табл. 3A. Кроме того, таким же образом оценивали октреотид, SRIF14 и SRJF28 в качестве контрольных соединений. Отметим, что в случае октреотида значения IC₅₀ было невозможно рассчитать для SSTR1 и SSTR4, так как максимальная концентрация составляла 100 нМ, поэтому они приводятся как >100 нМ.

На фиг. 1A и 1B представлены примеры структур гликозилированных пептидов (гликозилированных форм), соответствующих названиям соединений в табл. 3A.

Контрольный октреотид связывался с каждым из рецепторов SSTR2, SSTR3 и SSTR5, а SRIF14 и SRIF28 связывались со всеми типами SSTRs. Как видно из табл.3А, соединения по настоящему изобретению сильно связывались со всеми SSTRs. Сродство связывания у положительного контроля SRIF14 к SSTR1 по значению K_i составляло 0,362 нМ, при этом у соединений с одной или двумя сахаридными цепочками оно составляло от 0,704 до 147 нМ, то есть проявлялось достаточное сродство связывания с рецепторами. Кроме того, соединения настоящего изобретения с тремя сахаридными цепочками (соединения из примеров 24, 25 и 29) также обладали достаточным сродством связывания с рецептором при значениях K_i в 3,49 нМ, 16,9 нМ и 57,3 нМ. Поскольку биодоступность (BA) будет значительно повышаться за счет увеличения времени полужизни в крови, то они должны эффективно действовать на рецепторы in vivo, даже если значения K_i для сродства связывания несколько высоки. Точно так же, если сродство связывания SRIF14 к SSTR2, SSTR3 и SSTR4 по значению K_i составляло 0,00755 нМ, 0,0450 нМ и 0,273 нМ, то у соединений настоящего изобретения оно составляло 0,0119-3,33 нМ, 0,0531-3,77 нМ и 0,564-40,5 нМ, то есть у всех проявлялось достаточное сродство связывания с рецепторами. Кроме того, если сродство связывания SRIF14 к SSTR5 составляло 0,326 нМ, то у соединений настоящего изобретения проявлялось достаточное сродство связывания вплоть до 8,33 нМ.

Соединения из примеров 1-6, 10, 13-19, 26, 27, 30 и 31, представленные моно-гликозилированными модифицированными формами, как оказалось, обладают сродством ко всем рецепторам: SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 и SSTR5. Точно так же соединения из примеров 20-23 и 28, представленные дигликозилированными модифицированными формами, обладают сродством ко всем рецепторам SSTR1-SSTR5, равно как и соединения из примеров 24, 25, и 29, представленные тригликозилированными модифицированными формами, тоже обладают сродством ко всем рецепторам SSTR1-SSTR5. Пример 67-2. Расчет сродства связывания с рецепторами 2 Опыты по конкурентному связыванию проводили с каждым из соединений, приведенных в табл. 3B, описанным в примере 67-1 методом, и рассчитывали сродство связывания с рецепторами. Кроме того, таким же образом оценивали SRIF14 и SRIF28 в качестве контрольных соединений. Результаты по анализу связывания представлены в табл. 3B.

На фиг. 1C и 1D представлены примеры структур гликозилированных пептидов, соответствующих названиям соединений из табл. 3B.

Как видно из табл. 3B, в контроле SRIF14 и SRIF28 связывались со всеми рецепторами SSTR1-SSTR5. Поскольку количество опытов и т.д. отличалось от Примера 67-1, то значения K_i у SRIF14 для каждого из рецепторов отличались и были высокими от 2,5 до 13,2 нМ. Значения K; у соединений из Примеров 1, 7, 8, 9, 26, 27, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 и 66 для SSTR1 составляли 1,46-100 нМ, а также 0,0536-6,51 нМ для SSTR2, 0,160-7,44 нМ для SSTR3, 1,39-59,0 нМ для SSTR4 и 0,310-95,0 нМ для SSTR5, то есть проявлялось высокое сродство связывания ко всем рецепторам. Значения K_i у соединения из Примера 12 для SSTR2 и SSTR5 были в 280-1600 раз больше, чем у SRIF14, но значения K_i для SSTR1, SSTR3 и SSTR4 составляли 17,9, 7,44 и 24,1 нМ, поэтому считали, что сродство связывания сохранялось. У соединения из Примера 38 сродство к SSTR1, SSTR2 и SSTR3 было значительно меньше при значениях K_i в 310-5300 раз больших, чем у SRTF14, но значения K_i для SSTR4 и SSTR5 составляли 110 и 33,0 нМ, поэтому считали, что сродство связывания сохранялось. Значения K_i у соединения из Примера 49 для SSTR2 и SSTR4 были в 170 и 46 с лишним раз больше, чем у SRIF14, но значения K_i для SSTR1, SSTR3 и SSTR5 составляли 270 нМ, 14,0 нМ, и 23,0 нМ, поэтому считали, что сродство связывания сохранялось.

Пример 67-3. Оценка агонистической активности с использованием экспрессирующих рецепторы клеток 1

Соматостатиновые рецепторы относятся к сопряженным с G-белками рецепторам (GPCR). SSTR1-SSTR5 все подавляют аденилатциклазную активность через подсемейство G-белков Gi/Go и снижают внутриклеточную концентрацию цАМФ. В этой серии экспериментов для оценки агонистической активности использовались линии клеток, экспрессирующих каждый из соматостатиновых рецепторов, для расчета значений IC50 по подавлению исследуемыми веществами продукции цАМФ. Кроме того, таким же образом оценивали SRIF14 и SRIF28 в качестве контрольных соединений.

В данных экспериментах использовались реагенты, которые имеют следующие химические наименования: DMEM (модифицированная Дюльбекко среда Игла), IBMX (3-изобутил-1-метилксантин) и HBSS (забуференный солевой раствор Хэнка).

Для оценки по SSTR2-SSTR5 эксперименты проводились в следующих условиях. В качестве буфера использовали среду DMEM, содержащую 0,3% BSA и 0,5 мМ IBMX, а клетки, экспрессирующие рецепторы, приведенные в табл. 3C, высеивали при 104 клеток на лунку. Обработку исследуемыми соединениями проводили путем смешивания в концентрации 0,00001 нМ, 0,0001 нМ, 0,001 нМ, 0,01 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ или 1000 нМ с 10 мкМ форсколина и инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин. По окончании реакции клетки растворяли в 0,2 N HCl и измеряли количество накопившегося в клетках цАМФ с помощью набора Cayman cyclic AMP EIA kit (Cayman, 582002).

Оценка по SSTR1 была поручена фирме Cerep, где и проводились эксперименты. В качестве буфера использовали HBSS, содержащий 20 мМ HEPES (pH 7,4) и 500 мкМ IBMX, а экспрессирующие рецептор SSTR1 клетки высеивали при 104 клеток на лунку. Обработку исследуемыми соединениями проводили путем смешивания в концентрации 0,001 нМ, 0,01 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ или 100 нМ с 1 мкМ NKH477 и инкубации при 37°C в течение 20 мин. По окончании реакции измеряли количество накопленного в клетках цАМФ с помощью набора Cisbio cAMP dynamic2 kit (Cisbio, 62АМ4РЕ).

Экспериментальные результаты (IC₅₀ (нМ)) по оценке агонистической активности при использовании соединений из примеров 1, 18, 27, 28, 57 и 58 в качестве гликозилированных форм представлены в табл. 3D и на фиг. 1E. У контрольных соединений SRIF14 и SRIF28 значения IC₅₀ составляли 0,83-0,89 нМ для SSTR1 и 0,0076-0,073 нМ, 0,029-0,21 нМ, 0,015-0,074 нМ и 0,066-0,12 нМ для SSTR2, SSTR3, SSTR4 и SSTR5, соответственно. Значения IC₅₀ по агонистической активности гликозилированных соединений против SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 и SSTR5 составляли 1,0-2,4 нМ, 0,041-0,10 нМ, 0,12-0,30 нМ, 0,039-0,085 нМ и 0,043-0,081 нМ, соответственно, то есть проявлялась сильная агонистическая активность против всех рецепторов SSTR1-SSTR5. Из результатов, приведенных в примерах 67-1 и 67-2, видно, что эти соединения обладают сродством связывания с рецепторами, причем ясно, что данные соединения оказывают агонистическое действие путем связывания с рецепторами.

Пример 67-4. Оценка агонистической активности с использованием экспрессирующих рецепторы клеток 2

Опыты по оценке агонистической активности проводились аналогично примеру 67-3, используя в качестве гликозилированных форм каждое из соединений, приведенных в табл. 3E. Экспериментальные результаты представлены в табл. 3E. В табл. 3E поля с прочерком "-" означают, что определение не проводилось.

В табл. 3E значения IC₅₀ по агонистической активности гликозилированных соединений к SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 и SSTR5 составляли 1,2-22 нМ, 0,019-1,4 нМ, 0,039-3,8 нМ, 0,033-1,6 нМ и 0,031-1,1 нМ, соответственно, то есть проявлялась агонистическая активность к рецепторам SSTR1-SSTR5. Из результатов, приведенных в примерах 67-1 и 67-2, ясно, что эти соединения обладают сродством связывания к рецепторам, причем данные соединения производят агонистическое действие путем связывания с рецепторами.

Пример 68. Фармакокинетический тест на крысах 1

Для того, чтобы проверить то, что гликозилированные полипептиды настоящего изобретения (гликозилированные формы) обладают улучшенным фармакокинетическим профилем типа площади под кривой концентрации препарата в плазме от времени (AUC), времени полужизни в крови (t_½), среднего времени удержания (MRT) и биодоступности по сравнению с негликозилированным SRIF28, проводили анализ фармакокинетики при внутривенном и подкожном введении на крысах.

68-1. Приготовление раствора для введения и реагентов

Гликозилированную форму (S1C(дисиало)-SRIF28) растворяли в физрастворе согласно Japanese Pharmacopeia (фирмы Otsuka Pharmaceutical, Inc.) так, чтобы получить 40 мкМ раствор в качестве раствора для введения. Раствор PBS готовили путем растворения 1 таблетки физраствора с фосфатным буфером (P4417 от Sigma) в 200 мл сверхчистой воды. EDTA-PBS получали путем растворения EDTA-2Na (фирмы Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в PBS до 2 мг/мл. Содержащий апротинин раствор EDTA-PBS получали путем растворения апротинина (010-11834 от Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в EDTA-PBS до 0,142 мг/мл и использовали его в качестве антикоагулянта для собранной крови.

68-2. Получение образцов плазмы

Самцам крыс SD (Crl: CD (SD), Charles River Japan, в возрасте 6 недель, n=3, вес тела 161,3-239,3 г) в хвостовую вену или подкожно в спину вводили приготовленный выше в примере 68-1 раствор, не натощак, в дозе 1 мл/кг при помощи стеклянного шприца и инъекционной иглы 26 G (все от Terumo Corporation) (40 нмоль/кг в виде S1C(дисиало)-SRIF28). Кровь брали из шейной вены крыс до введения, а также через 2 мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч и 8 ч после введения. 0,2 мл взятой крови сразу же смешивали с 0,2 мл содержащего апротинин раствора EDTA-PBS, полученного выше в примере 68-1, и оставляли на льду на 30 мин или больше. После разделения центрифугированием (1870×g, 4°C, 10 мин) отбирали 250 мкл супернатанта в качестве образца плазмы. В качестве холостой пробы использовали плазму, полученную при аналогичной обработке крови, взятой из шейной вены необработанных крыс. Образцы плазмы замораживали и хранили до использования их при измерении. Использовали наконечники и пробирки из слабо абсорбирующего материала фирмы ВМ Equipment Co., Ltd.

68-3. Измерение концентрации в плазме

Измерение концентрации S1C(дисиало)-SRIF28 в образцах плазмы, полученных выше в примере 68-2, проводили с помощью набора для EIA на соматостатин фирмы Phoenix Pharmaceuticals (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, EK-060-03). Образцы плазмы разбавляли буфером для определения из набора для EIA в 5, 20, 100, 400 и 1600 раз в качестве проб для измерения. Стандартный раствор для построения стандартной кривой получали следующим образом. Сначала холостой образец плазмы, полученный выше в примере 68-2, разбавляли буфером для определения из набора для EIA аналогично образцу плазмы, а затем использовали его в качестве буфера для приготовления стандартных растворов (например, при разведении образца плазмы в 100 раз в буфер из набора для EIA вносили 1/100 количество холостого образца плазмы и использовали его в качестве буфера для приготовления стандартных растворов). S1C(дисиало)-SRIF28 разводили раствором PBS до получения 100 мкМ раствора, а из этого 100 мкМ раствора готовили 2 мкМ раствор. Из полученного 2 мкМ раствора S1C(дисиало)-SRIF28 делали серийные разведения в буфере для приготовления стандартных растворов, получая стандартные растворы в 20 нМ, 10 нМ, 2 нМ, 0,4 нМ, 0,08 нМ и 0,04 нМ. Концентрацию в плазме рассчитывали путем умножения полученных результатов на степень разведения, а также умножения на степень разведения 2 в содержащем апротинин растворе EDTA-PBS, используемом для антикоагуляционной обработки. В качестве контроля проводились аналогичные операции с использованием негликозилированного SRIF28 вместо гликозилированной формы. Полученные изменения концентрации S1C(дисиало)-SRIF28 в плазме представлены на фиг. 2.

68-4. Определение фармакокинетических параметров

Из полученных изменений концентрации S1C(дисиало)-SRIF28 рассчитывали AUC методом моментной площади и по формуле трапеций. Кроме того, определяли оценку начальной концентрации (C₀) методом экстраполяции для внутривенного введения, рассчитывали t_½ и MRT и определяли максимальную концентрацию в плазме (C_max) из фактических значений для подкожного введения. Полученные фармакокинетические параметры представлены в табл. 4.

Из приведенных на фиг. 2 и в табл. 4 результатов видно, что S1C(дисиало)-SRIF28 имеет значительно большие значения t_1/2 и MRT по сравнению с негликозилированным SRIF28, а также проявляется повышение AUC и C_max. По-видимому, это связано с повышением устойчивости к деградирующей активности в крови при гликозилировании. Ясно, что гликозилированная форма обладает лучшей стабильностью in vivo по сравнению с негликозилированной формой. Кроме того, в качестве факторов повышения AUC и C_max можно считать улучшение биодоступности в соответствии с настоящим изобретением, а также улучшение их стабильности in vivo.

Пример 69. Фармакокинетический тест на крысах 2

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, N5C(дисиало)-SRIF28 и S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)-SRIF28. В качестве контроля использовали негликозилированный SRIF28 вместо гликозилированных форм. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 3.

Пример 70. Фармакокинетический тест на крысах 3

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало)⋅R13C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28. В качестве контроля использовали негликозилированный SRIF28 вместо гликозилированных форм. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 4.

Пример 71. Фармакокинетический тест на крысах 4

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, N5C(дисиало)-SRIF28, A9C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)-SRIF28, N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28 и S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28. В качестве контроля использовали негликозилированный SRIF28 вместо гликозилированных форм. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 5.

Пример 72. Фармакокинетический тест на крысах 5

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, S1-2C(дисиало)-SRIF2 и S1-3С(дисиало)-SRIF28. В качестве контроля использовали негликозилированный SRIF28 вместо гликозилированных форм. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 6.

Из изменений концентрации соединений в плазме, полученных в фармакокинетических тестах из примеров 69-72, рассчитывали фармакокинетические параметры каждого соединения аналогично примеру 68. Кроме того, полученные параметры использовали для расчета биодоступности по нижеследующей математической формуле. Результаты представлены в табл. 5A.

где: AUC(SC): AUC при подкожном введении (мин⋅нМ)

Dose(SC): вводимая доза при подкожном введении (нмоль/кг)

AUC(iv): AUC при внутривенном введении (мин⋅нМ)

Dose(iv): вводимая доза при внутривенном введении (нмоль/кг)

Как видно из результатов, приведенных в табл. 5A, биодоступность гликозилированных форм настоящего изобретения возрастает с увеличением количества модифицирующих сахаридных цепочек. Иными словами, если у негликозилированной формы она составляет 5%, то у гликозилированного полипептида с одной добавленной сахаридной цепочкой - 37-60%, то есть увеличение в среднем на 50%, причем она возрастает до 77-85%, в среднем до 81% при добавлении двух сахаридных цепочек с промежутками и до 91% при добавлении трех сахаридных цепочек с промежутками. Кроме того, при сравнении с плотным гликозилированием (подряд) было обнаружено возрастание на 37% при одном добавлении, 55% при двух добавлениях и 69% при трех добавлениях (соединения из примеров 1, 20 и 24). Из этих результатов следует, что биодоступность улучшается при гликозилировании по настоящему изобретению.

В качестве факторов увеличения биодоступности при подкожном введении существуют различные фармакокинетические факторы. В их числе можно выделить стабильность соединения в крови или перенос его в кровь (из места введения). Как видно из табл. 5A, значение AUC при подкожном введении, служащее показателем переноса в кровь при подкожном введении, возрастает с увеличением количества модифицирующих сахаридных цепочек (при 1: 2209 мин⋅нМ, при 2 с промежутками: 3400 мин⋅М, при 3 с промежутками: 4015 мин⋅нМ), поэтому предполагается, что это способствует улучшению биодоступности.

Кроме того, было показано, что с увеличением количества модифицирующих сахаридных цепочек происходит повышение t_1/2 и MRT при внутривенном и подкожном введении (например, t_1/2 при внутривенном введении составлял при 1: 19,0 мин, при 2 с промежутками: 27,2 мин, при 3 с промежутками: 39,8 мин), поэтому предположили, что улучшается стабильность в крови. С другой стороны, AUC при внутривенном введении не возрастала пропорционально количеству модифицирующих сахаридных цепочек (при 1: 4453 мин⋅нМ, при 2 с промежутками: 4198 мин⋅нМ, при 3 с промежутками: 4402 мин⋅нМ), поэтому предполагается, что повышение стабильности соединений в крови при увеличении числа модифицирующих сахаридных цепочек является не единственным фактором, способствующим повышению биодоступности.

C_max при подкожном введении повышалась по сравнению с негликозилированной формой до тех пор, пока количество модифицирующих сахаридных цепочек не достигало двух (при 0: 4,47 нМ, при 1: 30,5 нМ, при 2 с промежутками: 35,6 нМ), а при трех с промежутками (24,8 нМ) уже наблюдалось снижение. С учетом переноса в кровь из места введения (подкожное введение в данном случае) можно предположить такие факторы увеличения AUC в двух форматах: быстрого переноса в кровь либо умеренного, но непрерывного переноса в кровь. Первое дает преимущество избежания деградации по месту введения, но если не будет проблемы со стабильностью, то последний формат должен давать больший перенос в кровь. Тот факт, что C_max снижался при наличии трех модифицирующих сахаридных цепочек с высокой биодоступностью, может быть результатом не резкого, а умеренного и непрерывного поступления в кровь. Исходя из этого, полагаем, что при увеличении количества модифицирующих сахаридных цепочек по настоящему изобретению проявляется непрерывное поступление в кровь без резкого возрастания концентрации в плазме (что в целом можно назвать эффектом замедления всасывания).

Как видно из результатов, приведенных в табл. 5A, не отмечалось существенных отличий по t_1/2 и MRT при наличии промежутков между положениями модификации и при плотном расположении, т.е. подряд (например, t_1/2 при внутривенном введении составлял при 2 подряд: 28,8 мин, при 2 с промежутками: 27,2 мин, при 3 подряд: 38,5 мин, при 3 с промежутками: 39,8 мин).

Кроме того, в отношении AUC, при внутривенном введении AUC возрастала при плотном гликозилировании (подряд). Иными словами, при двух сахаридных цепочках она составляла 4029-4465 мин⋅нМ для соединений 21, 22 и 23 с промежутками в отличие от 7306 мин⋅нМ у "плотного" соединения 20, а при трех сахаридных цепочках у соединения 25 с промежутками оно составляло 4402 мин⋅нМ, тогда как у "плотного" соединения 24 было 5660 мин⋅нМ.

С другой стороны, биодоступность возрастала при наличии промежутков между положениями гликозилирования по сравнению с тем, когда они были "плотными". Иными словами, при двух сахаридных цепочках у "плотного" соединения 20 она составляла 55%, тогда как у соединений 21, 22 и 23 с промежутками было 77-85% (в среднем 81%), а при трех сахаридных цепочках у "плотного" соединения 24 было 69%, тогда как у соединения 25 с промежутками - 91%. Исходя из этого, полагаем, что в отношении положений гликозилирования по настоящему изобретению несколько модификаций с промежутками больше способствуют улучшению биодоступности, чем несколько "плотных" модификаций (подряд).

Пример 73. Фармакокинетический тест на крысах 7

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало(амид))-SRIF28 и S1C(дисиало(аминоэтиламид))-SRIF28. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 7.

Пример 74. Фармакокинетический тест на крысах 8

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало(Bn))-SRIF28 и S1C(дисиало)-D-Trp22-SRIF28. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 8.

Пример 75. Фармакокинетический тест на крысах 9

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, R13C(дисиало)-SRIF28 и K14C(дисиало)-SRIF28. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 9.

Пример 76. Фармакокинетический тест на крысах 10

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, E12C(дисиало)-SRIF28, N19C(дисиало)-SRIF28, 29С(дисиало)-SRIF28, S1C(моносиало)-SRIF28 и S1C(асиало)-SRIF28. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 10.

Пример 77. Фармакокинетический тест на крысах 11

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, K14C(дисиало)-SRIF28 и C(дисиало)-SRIF14. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 11.

Пример 78. Фармакокинетический тест на крысах 12

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали C(дисиало)-SRIF14, C(дисиало)-линкер C12-SRIF14 и С(дисиало)-линкер PEG-SRIF14. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 12.

Пример 79. Фармакокинетический тест на крысах 13

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали SRIF28, S1C(дисиало)-SRIF28, S1C(асиало)-SRIF28, S1C(диGlcNAc)-SRIF28, SlC(диMan)-SRIF28 и S1C(Glc NAc)-SRIF28. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 13.

Пример 80. Фармакокинетический тест на крысах 14

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, S1C(тетрасиало)-SRIF28, S1C(трисиало)-SRIF28, S1C(Asn(дисиало))-SRIF28 и S1-2C(дисиало)-SRIF28. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 14.

Пример 81. Фармакокинетический тест на крысах 15

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали SRIF28, S1C(дисиало)-SRIF28, S1-2C(дисиало)-SRIF28, S1-3C(дисиало)-SRIF28 и S1-4C(дисиало)-SRIF28. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 15.

Пример 82. Фармакокинетический тест на крысах 16

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали SRIF14, C(дисиало)-SRIF14, C(дисиало)-K-SRIF14, C(дисиало)-R-K-SRIF14, 2C(дисиало)-R-K-SRIF14 и 3C(дисиало)-R-K-SRIF14. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 16.

Пример 83. Фармакокинетический тест на крысах 17

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(асиало)-SRIF28, S1-2C(асиало)-SRIF28 и S1-3C(асиало)-SRIF28. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 17.

Пример 84. Фармакокинетический тест на крысах 18

Фармакокинетический тест проводили аналогично примеру 68, за исключением того, что в качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, S1-2C(дисиало)-SRIF28, S1-2C(асиало)-SRIF28, C(дисиало(аминоэтиламид)/S1C(дисиало)-SRIF28, S1-2C(дисиало(Bn))-SRIF28 и S1-2C(дисиало(амид))-SRIF28. Полученные изменения концентрации соединений в плазме представлены на фиг. 18.

Из изменений концентрации соединений в плазме, полученных в фармакокинетических тестах 7-18 из примеров 73-84, рассчитывали фармакокинетические параметры каждого соединения аналогично примеру 68. Полученные фармакокинетические параметры представлены в табл. 5B-5F.

Как видно из результатов, приведенных в табл. 5B, при внутривенном введении у S1C(дисиало)-SRIF28, E12C(дисиало)-SRIF28, R13C(дисиало)-SRIF28, K14C(дисиало)-SRIF28, N19C(дисиало)-SRIF28, 29С(дисиало)-SRIF28 и S1C(дисиало)-D-Trp22-SRIF28 значения t1/2 возрастают в 13-18 раз и AUC в 8-23 раза по сравнению с негликозилированной формой SRIF28. Кроме того, при внутривенном введении у C(дисиало)-SRIF14, C(дисиало)-K-SRIF14 и C(дисиало)-R-K-SRIF14 значения t_1/2 возрастают в 33-38 раз и AUC в 44-55 раз по сравнению с негликозилированной формой SRIF14. Кроме того, у С(дисиало)-линкер C12-SRIF14 и С(дисиало)-линкер PEG-SRIF14 значения t_1/2 возрастают в 22-33 раз и AUC в 14-30 раз по сравнению с негликозилированной формой SRIF14. Иными словами, аналогично примеру 68, это можно считать следствием улучшения стабильности в крови при гликозилировании.

Как видно из результатов, приведенных в табл. 5C, когда размер модифицирующей сахаридной цепочки увеличивается на GlcNAc (моносахарид), диMan (5 сахаридов), диGlcNAc (7 сахаридов), асиало (9 сахаридов), моносиало (10 сахаридов), дисиало (11 сахаридов), трисиало (14 сахаридов) и тетрасиало (17 сахаридов), то значения t_1/2 AUC и биодоступности при подкожном введении возрастают в 2-17 раз, 3-120 раз и 2-11 раз, соответственно, в соответствии с размером модифицирующей сахаридной цепочки. Исходя из этого, стало ясно, что изменение размера модифицирующей сахаридной цепочки не только улучшает стабильность в крови, но и позволяет изменять степень возрастания. Кроме того, поскольку известно, что диманнозо- или асиалосахаридные цепочки и т.д. среди этих сахаридных цепочек взаимодействуют с определенными белками, то их можно было бы использовать для наведения на определенный белок или на органы и клетки, содержащие данный белок. Кроме того, поскольку модификация сиаловой кислоты по невосстанавливающему концу с образованием S1C(дисиало(амино-этиламид))-SRIF28, S1C(дисиало(амид))-SRIF28 и S1C(дисиало(Bn))-SRIF28, содержащих сахаридные цепочки с измененным зарядом, напр., при введении аминоэтиламида, амида и Bn по карбоксигруппе, значения t_1/2 возрастают в 11-14 раз и AUC в 7-12 раз и улучшается стабильность в крови по сравнению с негликозилированной формой при внутривенном введении. Это значит, что карбоксигруппа сиаловой кислоты имеет большое влияние на сохранность в крови, и свидетельствует о возможности (использования при) контролирования клиренса в крови или распределения в организме путем снятия отрицательного заряда у карбоксигруппы (дисиало- и дисиало(амид)) или преобразования его в положительный заряд (дисиало(аминоэтиламид)).

Как видно из результатов, приведенных в табл. 5D, у C(дисиало)-R-K-SRIF14, модифицированного одной дисиалосахаридной цепочкой, 2С(дисиало)-R-K-SRIF14, модифицированного двумя дисиалосахаридными цепочками, и 3C(дисиало)-R-K-SRIF14, модифицированного тремя дисиалосахаридными цепочками на SRIF14, значения t_1/2 возрастают в 38, 63 и 71 раз и AUC в 55, 42 и 36 раз по сравнению с негликозилированной формой при внутривенном введении. Точно так же у S1C(дисиало)-SRIF28, модифицированного одной дисиалосахаридной цепочкой, S1-2C(дисиало)-SRIF28, модифицированного двумя дисиалосахаридными цепочками, S1-3C(дисиало)-SRIF28, модифицированного тремя дисиалосахаридными цепочками, и S1-4C(дисиало)-SRIF28, модифицированного четырьмя дисиалосахаридными цепочками на SRTF28, значения t_1/2 возрастают в 13, 21, 30 и 48 раз и AUC в 11, 12, 12 и 15 раз по сравнению с негликозилированной формой при внутривенном введении. Очевидно, что и у SRIF14, и у SRIF28 стабильность в крови улучшается в соответствии с количеством модифицирующих сахаридных цепочек.

Как видно из результатов, приведенных в табл. 5E, у S1C(асиало)-SRIF28, модифицированного одной асиалосахаридной цепочкой, S1-2C(асиало)-SRIF28, модифицированного двумя асиалосахаридными цепочками, и S1-3C(асиало)-SRIF28, модифицированного тремя асиалосахаридными цепочками на SRJF28, значения t_1/2 возрастают в 10, 6 и 5 раз и AUC в 10, 6 и 6 раз по сравнению с негликозилированной формой при внутривенном введении. Очевидно, что стабильность в крови тоже улучшается, когда модифицирующая сахаридная цепочка представлена асиалосахаридной цепочкой.

Как видно из результатов, приведенных в табл. 5F, у S1-2C(дисиало)-SRIF28, S1-2C(асиало)-SRIF28, C(дисиало(аминоэтиламид))/S1C(дисиало)-SRIF28, S1-2C(дисиало (Bn))-SRIF28 и S1-2C(дисиало(амид))-SRIF28 значения t_1/2 возрастают в 6-21 раз и AUC в 6-12 раз по сравнению с негликозилированной формой при внутривенном введении. Иными словами, стабильность в крови улучшается при модифицировании SRIF28 сахаридными цепочками. Кроме того, значения t_1/2, AUC, C_max и BA возрастают и при внутривенном, и при подкожном введении в соответствии с увеличением количества сахаридных цепочек с сиаловой кислотой. С другой стороны, при удалении отрицательного заряда у карбоксигруппы сиаловой кислоты (2C(дисиало(Bn))/2C(дисиало(амид))) или при добавлении положительного заряда по соседству (C(дисиало(аминоэтиламид)/S1C(дисиало)), хотя значения t_1/2 возрастают при подкожном введении, но AUC или C_max не повышаются. Поскольку карбоксигруппа сиаловой кислоты имеет большое влияние на сохранность в крови или на перемещение в крови, то это свидетельствует о возможности (использования при) контролирования клиренса в крови или распределения в организме путем преобразования заряда на конце сахаридной цепочки.

Пример 85. Тест на стабильность в плазме на плазме крыс

85-1. Приготовление растворов соединений, реагентов и плазмы крыс Гликозилированные формы и негликозилированный SRIF28 растворяли в растворе PBS, получая 2 мкМ растворы в качестве рабочих растворов. 10% TFA получали путем растворения трифторуксусной кислоты (208-02746 от Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в воде до 10% об/об. Плазму крыс получали из крыс Wistar (Crlj: Wistar, самцы, Charles River Japan, 7-недельные) в виде плазмы с добавлением гепарина (гепарин: раствор гепарина натрия для инъекций согласно Japanese Pharmacopeia (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.)).

85-2. Приготовление образцов с добавлением плазмы

Быстро смешивали 0,27 мл плазмы крыс (n=3) и 0,03 мл раствора гликозилированного соединения, полученного выше в примере 85-1, и держали теплым в термостатируемой бане при 37°C в качестве образца с добавлением плазмы. После перемешивания отбирали 0,04 мл образца с добавлением плазмы в точке 0 мин и по времени через 1-24 ч, а затем быстро смешивали с 0,01 мл 10% TFA. После разделения центрифугированием (20000×g, 4°C, 10 мин) отбирали по 0,04 мл супернатанта в качестве проб для измерения стабильности в плазме. Время отбора проб: 0, 1, 2 и 4 ч либо 0, 4, 8 и 24 ч. В качестве холостой пробы использовали плазму, полученную при такой же обработке, за исключением того, что в качестве рабочего раствора использовали раствор PBS. Образцы плазмы замораживали и хранили до использования их при измерении. Для каждого опыта в качестве положительного контроля использовали негликозилированный SRIF28.

85-3. Измерение концентрации в образцах и расчет индекса стабильности в плазме

Концентрацию гликозилированной формы, оставшейся в образцах для измерения стабильности в плазме, полученных выше в примере 85-2, измеряли таким же способом, что и при измерении концентрации в плазме из примера 68-3. Концентрацию гликозилированной формы в точке 0 мин после перемешивания принимали за 100%, а оставшееся количество по времени выражали в процентах (%) и рассчитывали время полужизни из константы скорости элиминации по нижеследующей экспоненциальной формуле (1), используя расчетную формулу (2). Затем время полужизни негликозилированного SRIF28 для каждого эксперимента принимали за 1 и рассчитывали индекс стабильности гликозилированной формы в плазме (индекс PS). Результаты представлены в табл. 6 и на фиг. 19. Значения индекса стабильности в плазме, равные 20 или выше, приводятся как >20. На фиг.19 значения индекса стабильности в плазме больше 20 также представлены в виде 20 в качестве верхнего предела.

где e: основание натуральных логарифмов

k: константа скорости элиминации

t: время (ч)

Как видно из результатов, приведенных на фиг. 19, стабильность в плазме у гликозилированных полипептидов настоящего изобретения повышалась по сравнению со SRIF28. Иными словами, повышение составляло 4,5-6,7 раз при добавлении одной сахаридной цепочки в положениях 1, 5, 9 и 12 (соединения из примеров 1, 2, 3 и 4), 15,9 раз при добавлении сахаридной цепочки в положении 13 (соединение из примера 5), 19,1 раз при добавлении сахаридной цепочки в положении 14 (соединение из примера 6) и 16,8 раз при добавлении сахаридной цепочки в положении 30 (соединение из примера 14), по сравнению с таковым у SRIF28. Кроме того, оно составляло 20 раз или больше при добавлении еще одной гликозилированной аминокислоты в положении 19, то есть с C-концевой стороны (соединения из примеров 10 и 13). Как оказалось, в отношении положения гликозилирования стабильность в плазме возрастает от положения 1 в направлении С-конца.

Пример 86. Тест на подавление продукции GH у крыс

Как показано в примере 67, гликозилированные полипептиды настоящего изобретения обладают сродством к каждому типу рецепторов SSTR. С другой стороны, у некоторых наблюдается ослабление сродства к каждому SSTR, но для того, чтобы доказать, что даже в таких случаях проявляется фармакологически эффективное действие по отношению к рецепторам in vivo, напр., по увеличению времени полужизни в крови или повышению биодоступности, как это показано в примерах 68-85, проводили тест для оценки эффекта введения гликозилированных полипептидов настоящего изобретения на продукцию гормона роста (GH) в виде теста in vivo на крысах. Повышение количества образовавшегося GH в крови должно вызывать пролиферацию или дифференцировку клеток либо активацию или подавление биосинтетической системы в различных тканях через паракринный эффект GH и тем самым будет влиять на биологические реакции. Соматостатин, высвобождаемый из гипоталамуса, подавляет секрецию GH из передней доли гипофиза в кровь. Эта серия экспериментов проводилась как серия тестов для оценки фармакологического действия гликозилированных форм на SSTR и их нахождение в крови после введения, используя в качестве показателя количество образовавшегося GH в крови.

86-1. Приготовление растворов для введения и реагентов

Используя S1C(дисиало)-SRIF28, N19C(дисиало)-SRIF28 и 29С(дисиало)-SRIF28 в качестве гликозилированных форм, их растворяли в физрастворе согласно Japanese Pharmacopeia (фирмы Otsuka Pharmaceutical, Inc.) так, чтобы получить 1-100 мкМ растворы в качестве растворов для введения. Кроме того, в качестве усилителя высвобождения GH использовали GRF (GH-высвобождающий гормон, фактор высвобождения гормона роста). GRF готовили путем растворения препарата GRF для инъекций (GRF Sumitomo 50 для инъекций, серия 2006C, от Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) в 1 мл воды для инъекций (серия 09H18C, от Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.), а затем разводили в 25 раз физраствором, получая 2 мкг/мл. В качестве антикоагулянта при сборе крови использовали гепарин (раствор гепарина натрия для инъекций согласно Japanese Pharmacopeia, серия В084 от Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), прямо в виде исходного раствора.

86-2. Приготовление образцов плазмы

Самцам крыс SD (Crl: CD (SD), Charles River Japan, 6-недельные, n=3, вес тела 145,2-163,9 г) подкожно в спину не натощак вводили растворы для введения, приготовленные выше в примере 86-1, в дозе 1 мл/кг стеклянным шприцом с инъекционной иглой 26 G (все от Terumo Corporation). В качестве контрольной группы таким же образом вводили физраствор без гликозилированных полипептидов (группа носителя). Затем, т.е. через 5-6 мин после введения гликозилированной формы, внутрибрюшинно вводили пентобарбитал натрия (somnopentyl, серия 0608101, фирмы Kyoritsuseiyaku Corporation) в качестве общего наркоза стеклянным шприцом с инъекционной иглой, получая 50 мг/кг. Через 1 ч после введения гликозилированной формы, т.е. через 50 мин или больше после наркоза, в хвостовую вену вводили GRF в качестве усилителя высвобождения GH в дозе 1 мл/кг стеклянным шприцом с инъекционной иглой. Через 5 минут после введения GRF из шейной вены крыс брали кровь стеклянным шприцом, содержащим гепарин, с инъекционной иглой. 0,4 мл отобранной крови оставляли на льду на 20 мин или больше, а затем центрифугировали (1870×g, 4°C, 10 мин) и отбирали 100 мкл супернатанта в качестве образца плазмы. В качестве холостой пробы использовали плазму, полученную при аналогичной обработке крови, взятой из шейной вены необработанных крыс. Образцы плазмы замораживали и хранили до использования их при измерении.

86-3. Измерение концентрации GH в плазме

Измерение концентрации GH в образцах плазмы, полученных выше в примере 86-2, проводили с помощью набора Rat Growth Hormone EIA kit фирмы SPI-Bio (SPI-Bio, A05104). Образцы плазмы разводили буфером для анализа из набора для EIA в 20, 100 и 500 раз в качестве проб для измерения. Стандартный раствор для построения стандартной кривой получали по прилагаемым инструкциям, путем приготовления раствора в 40 нг/мл на дистиллированной воде и выполнения серийных разведений буфером для анализа, получая 20 нг/мл, 10 нг/мл, 5 нг/мл, 2,5 нг/мл, 1,25 нг/мл, 0,63 нг/мл и 0,31 нг/мл. Концентрацию GH рассчитывали путем умножения полученных результатов на степень разведения. Полученные концентрации GH в образцах плазмы представлены в табл. 7.

Как видно из результатов, приведенных в табл. 7, гликозилированные формы по настоящему изобретению подавляют продукцию GH у крыс. Соотношение между значением K_i у гликозилированных форм из примеров 1, 10 и 13 против каждого рецептора и значением K_i у негликозилированного SRIF14 оказались в пределах от 100:1 до 1,3:1 при измерении способом из примера 67-1. Кроме того, гликозилированная форма из примера 1 проявляла повышение времени полужизни в крови в 10 раз и больше при измерении способом из примеров 68-72. Из настоящего примера следует, что гликозилированные формы эффективно оказывают фармакологическое действие даже in vivo.

Кроме того, гликозилированные формы по настоящему изобретению проявляют подавляющее действие на продукцию GH даже при введении их за 1 ч до введения GRF.

Как оказалось, эффективная доза при введении крысам для воздействия на продукцию GH отличалась между гликозилированными формами из примеров 1, 10 и 13 примерно в 10 раз. Это аналогично их отличиям по сродству к рецепторам, по которому они отличаются примерно в 10 раз по значениям K_i при измерении способом из примера 67-1. Таким образом, они обладают фармакологической активностью даже тогда, когда сродство у гликозилированных форм несколько ослаблено.

Пример 87. Тест на подавление продукции GH у крыс 2

Аналогично примерам от 86-1 до 86-3, проводили тесты на подавление продукции GH у крыс приведенными ниже гликозилированными соединениями. В качестве гликозилированных форм использовали S1C(дисиало)-SRIF28, N5C(дисиало)-SRIF28, A9C(дисиало)-SRIF28, Е12С(дисиало)-SRIF28, R13C(дисиало)-SRIF28, K14C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало)-D-Trp22-SRIF28, S1C(дисиало(Bn))-SRIF28, S1C(дисиало(амид))-SRIF28, S1C(дисиало(аминоэтиламид))-SRIF28, S1C(моносиало)-SRIF28, S1C(асиало)-SRIF28, C(дисиало)-R-K-SRIF14, S1-2С(асиало)-SRIF28, S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)-SRIF28 и S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)⋅А9С(дисиало)-SRIF28. Полученные концентрации GH в образцах плазмы представлены в табл. 8.

Как видно из результатов, приведенных в табл. 8, гликозилированные полипептиды настоящего изобретения подавляют продукцию GH у крыс. В данной серии опытов S1C(дисиало)-SRIF28 подавлял продукцию GH, начиная с 1 нмоль/кг, и проявлял эффект подавления продукции GH на 82-99% при 3-10 нмоль/кг. Полагаем, что это связано с усилением сродства к SSTR1-SSTR5 и улучшением сохранности в крови, как показано в примерах 67-1, 67-2 и 68-85.

N5C(дисиало)-SRIF28, A9C(дисиало)-SRIF28, E12C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало)-D-Trp-SRIF28, S1C(дисиало(Bn))-SRIF28 и C(дисиало)-R-K-SRIF14, которые в примерах 67-1 и 67-2 проявляли сродство, эквивалентное SlC(дисиало)-SRIF28, проявляли эффект подавления продукции GH на 95-99% при 10 нмоль/кг, то есть эффект, эквивалентный S1C(дисиало)-SRIF28.

Судя по результатам, полученным способами из примеров 68-85, S1C(моносиало)-SRIF28, S1C(асиало)-SRIF28, S1-2C(асиало)-SRIF28 и S1C(дисиало(амид))-SRIF28 проявляли значения AUC при подкожном введении, которые составляли от 1/3 до 1/2 от S1C(дисиало)-SRIF28, а S1C(дисиало(аминоэтиламид))-SRIF28 - 1/7. Тем не менее, все они проявляли более высокое сродство, чем S1C(дисиало)-SRIF28 согласно способам, приведенным в примерах 67-1 и 67-2. Соответственно, в этой серии экспериментов S1C(моносиало)-SRIF28, S1C(асиало)-SRIF28, S1-2C(асиало)-SRIF28, S1C(дисиало(аминоэтиламид))-SRIF28 и S1C(дисиало(амид))-SRIF28 подавляли продукцию GH на 70-99% при 10 нмоль/кг, то есть проявляли эффект, эквивалентный S1C(дисиало)-SRIF28.

R13C(дисиало)-SRIF28, K14C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)-SRIF28 и S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28 проявляли меньшее сродство, чем S1C(дисиало)-SRIF28 согласно способам, приведенным в примерах 67-1 и 67-2. Тем не менее, судя по результатам, полученным способами из примеров 68-85, значения AUC у этих соединений при подкожном введении улучшались в 1,8-2,8 раз перед S1C(дисиаор)-SRIF28. В этой серии экспериментов R13C(дисиало)-SRIF28, K14C(дисиало)-SRIF28, S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)-SRIF28 и S1C(дисиало)⋅N5C(дисиало)⋅A9C(дисиало)-SRIF28 проявляли активность подавления продукции GH при введении в дозе 10 или 100 нмоль/кг. Эти результаты показывают, что соматостатиновая активность может компенсироваться или возрастать при повышении стабильности в крови, даже если сродство к рецепторам снижается.

Пример 88. Проверка эффективности препаратов на модели желудочно-кишечной непроходимости

Как показано в примерах 86 и 87, гликозилированные полипептиды настоящего изобретения обладают эффективным действием в качестве агонистов даже на крысах in vivo. Поэтому, чтобы доказать, что они также проявляют эффективность на моделях заболеваний, проводилась оценка на модели желудочно-кишечной непроходимости у крыс. При желудочно-кишечной непроходимости типа кишечной непроходимости проявляются такие желудочно-кишечные симптомы, как чувство переполненности брюшной полости, рвота и боли в животе при нарушении тканей желудочно-кишечного тракта и снижении способности к всасыванию, напр., воды или электролитов. Такие патологии обычно возникают при обструкции содержимого желудочно-кишечного тракта или выделении желудочного сока или биологически активного материала в желудочно-кишечный тракт. Соматостатин проявляет эффект уменьшения содержимого желудочно-кишечного тракта путем подавления секреции различных пищеварительных соков или усиления всасывания воды и электролитов через рецепторы SSTR, экспрессированные в желудочно-кишечной системе, поэтому полагают, что он будет эффективным для улучшения этих симптомов. Данная серия экспериментов проводилась как серия тестов для оценки усиления всасывания жидкости в кишечнике или подавления секреции, используя в качестве показателя изменение массы кишечной жидкости в тощей кишке после обструкции кишечника. Кроме того, в качестве показателей повреждения тканей измеряли параметры индикаторных ферментов в крови: амилазы (поджелудочная железа), лактатдегидрогеназы (LDH: печень) и креатинфосфокиназы (CPK: скелетные мышцы, сердечная мышца и др.).

88-1. Постановка модели желудочно-кишечной непроходимости

Данный тест был поручен и выполнялся на фирме Mitsubishi Chemical Medience Corporation. Самцов крыс SD (Crl: CD (SD), Charles River Japan, 8-недельные, n=5 или больше, масса тела 251, 1-278,1 г) не кормили в течение 12 ч или больше. Делали наркоз с помощью ингаляции 2% изофлурана и смеси веселящий газ : кислород = 7:3, которую поддерживали на протяжении всей операции. Делали надрез по средней линии брюшины и накладывали лигатуру на тощую кишку примерно в 10 см от musculus suspensorius duodeni с помощью хирургической нити. Затем место разреза быстро зашивали и крыс не кормили до введения соединений. В группе ложной обработки наложение лигатуры на тощую кишку не проводилось, только зашивали место надреза после надреза по средней линии брюшины.

88-2. Приготовление и введение соединений

Используя SlC(дисиало)-SRIF28, C(дисиало)-R-K-SRIF14 и S1-2C(асиало)-SRIF28 в качестве гликозилированных форм, их растворяли в физрастворе согласно Japanese Pharmacopeia (фирмы Otsuka Pharmaceutical, Inc.) так, чтобы получить 40 мкМ растворы в качестве растворов для введения. Через 18 часов после операции обструкции желудочно-кишечного тракта их вводили подкожно в загривок в дозе 1 мл/кг стеклянным шприцом с инъекционной иглой 25G (все от Terumo Corporation). В качестве группы носителя точно так же вводили физраствор без гликозилированных полипептидов. Кроме того, в качестве контрольной группы вводили октреотид.

88-3. Измерение массы кишечной жидкости

Через 1 час после введения соединений делали надрез по средней линии брюшины под ингаляционным наркозом и отбирали 1,5 мл крови из брюшной полой вены. Затем тощую кишку с лигатурой подвергали резекции со стороны musculus suspensorius duodeni. Из поверхности тощей кишки удаляли жидкость и кровь с помощью бумажного полотенца, а нервы, кровеносные сосуды и жир, прилегающий к тощей кишке, извлекали, нарезали на полоски длиной 6 см и измеряли их сырой вес. Затем высушивали при 36°C в течение 24 ч и измеряли сухой вес. Массу кишечной жидкости (мг) рассчитывали по разности сырой вес - сухой вес. Полученная масса жидкости из тощей кишки представлена в табл. 9.

Как видно из табл. 9, носитель значительно повышал массу кишечной жидкости по сравнению с ложной обработкой, что может быть вызвано усилением секреции кишечной жидкости, сопровождающим желудочно-кишечную непроходимость из-за лигатуры. Как известно, соматостатин или октреотид оказывают подавляющее действие на секрецию кишечной жидкости в желудочно-кишечном тракте и усиливающее действие на всасывание кишечной жидкости со стороны кишечных тканей на таких моделях желудочно-кишечной непроходимости (Scand. J. Gastroenterol. 1995, 30(5): 464-9), причем в этой серии экспериментов было подтверждено, что октреотид оказывает такое же действие. S1C(дисиало)-SRIF28, С(дисиало)-R-K-SRIF14 и S1-2C(асиало)-SRIF28, как оказалось, повышают массу кишечной жидкости по сравнению с носителем, поэтому ясно, что гликозилированные формы по настоящему изобретению также эффективно проявляют подавление секреции кишечной жидкости и усиление всасывания воды и электролитов. Кроме того, очевидно, что в примерах 83 и 84 значение AUC при подкожном введении S1-2C(асиало)-SRIF28 составило 1/2 по сравнению с S1C(дисиало)-SRIF28, но в примере 67-1 сродство к SSTR1-SSTR5 было примерно в 1,7-2,9 раз выше, чем у S1C(дисиало)-SRIF28. Это может быть причиной того, что улучшение сродства к рецепторам вызывает сходные эффекты у препаратов на данной модели, даже при низкой концентрации в плазме. Точно так же это может быть причиной того, что препараты дают сходные эффекты, поскольку сродство к рецепторам примерно в 0,7-2,4 раза выше несмотря на то, что C(дисиало)-R-K-SRIF14 имеет немного меньшее значение AUC при подкожном введении по сравнению с таковым у S1C(дисиало)-SRIF28.

88-4. Измерение параметров в крови

Используя кровь, собранную в примере 88-3, измеряли концентрации (в МЕ/л) амилазы, LDH и СРК с помощью автоматического анализатора 7170 (Hitachi, Ltd.). Для измерения применяли такие методы, как BG5B, скорость по УФ и JSCC, соответственно. Полученные результаты представлены в табл. 10.

Как видно из таблицы 10, носитель давал повышенную активность амилазы и LDH по сравнению с ложной обработкой, поэтому было предположено, что возникали повреждения тканей желудочно-кишечной системы при желудочно-кишечной обструкции. При введении S1C(дисиало)-SRIF28 и С(дисиало)-R-K-SRIF14 были низкие значения активности амилазы по сравнению с носителем. С другой стороны, у октреотида активность амилазы была эквивалентна носителю. Как видно из примеров 67-1 и 67-2, S1 C(дисиало)-SRIF28, C(дисиало)-R-K-SRIF14 и S1-2C(асиало)-SRIF28 обладают сродством связывания со всеми рецепторами SSTR1-SSTR5, тогда как октреотид обладает специфическим сродством к SSTR2, SSTR3 и SSTR5. В поджелудочной железе крыс, поскольку имеется сообщение, что экспрессируются все рецепторы SSTR1-SSTR5 (J. Histochem. Cytochem. 2004, 52(3): 391-400), предполагается возможность того, что гликозилированная форма уменьшает повреждения тканей, воздействуя на другие рецепторы, чем октреотид. Кроме того, при введении октреотида и C(дисиало)-R-K-SRIF14 были низкие значения активности LDH по сравнению с носителем. Другие гликозилированные формы не вызывали снижения этих параметров при введении.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению гликозилированных полипептидов, обладающих сродством к соматостатиновым рецепторам, и может быть использовано в медицине для лечения или профилактики связанных с соматостатином заболеваний. Гликозилированные полипептиды SRIF14 и SRIF28 получают путем гликозилирования Asn или Cys. Изобретение обеспечивает получение гликозилированных полипептидов, обладающих сродством к соматостатиновым рецепторам и лучшей стабильностью в крови по сравнению с соматостатином. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 19 ил., 10 табл., 88 пр.

1. Гликозилированный полипептид, обладающий активностью соматостатина, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1, который дополнительно включает N аминокислот (где N означает целое число от 1 или больше до 5 или меньше) на N-конце указанной последовательности полипептида, и последовательность указанных N аминокислот, добавленных к N-концу, представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) Lys,

(2) Arg-Lys,

(3) Glu-Arg-Lys,

(4) Arg-Glu-Arg-Lys и

(5) Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,

отличающийся тем, что одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту, причем указанная одна аминокислота, замененная на указанную гликозилированную аминокислоту, присутствует в любой из указанных N аминокислот; указанная гликозилированная аминокислота представляет собой гликозилированный Asn или гликозилированный Cys; в каждой из указанных гликозилированных аминокислот сахарная цепь представлена следующей формулой:

[химическая формула 1]

где R¹ и R² одинаковые или разные и означают:

[химическая формула 2]

а Ac означает ацетил.

2. Гликозилированный полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанный гликозилированный полипептид обладает повышенной стабильностью в крови по сравнению со SRIF28.

3. Гликозилированный полипептид по п. 1, отличающийся тем, что у каждой из гликозилированных аминокислот сахарная цепочка состоит из 4 или больше сахаридов.

4. Гликозилированный полипептид по п. 1, отличающийся тем, что сахарная цепочка содержит, по меньшей мере, одну сиаловую кислоту на невосстанавливающем конце, а карбоксигруппа данной сиаловой кислоты модифицирована алкиламиногруппой, бензилом, аминогруппой или аминоэтиламиногруппой, содержащей 1-30 атомов углерода.

5. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики связанных с соматостатином заболеваний, отличающаяся тем, что она включает:

(I) терапевтически эффективное количество гликозилированного полипептида по п. 1 и/или его фармацевтически приемлемую соль и

(II) фармацевтически приемлемый носитель, где связанные с соматостатином заболевания представлены, по меньшей мере, одним заболеванием, выбранным из группы, состоящей из акромегалии, гигантизма, болезни Альцгеймера и других форм деменции, рака, продуцирующих гормоны опухолей, эндокринных опухолей, карциноидов, VIPомы, инсулиномы, глюкагономы, болезни Кушинга, нарушений секреции гормонов, диабета и его осложнений, болей, артрита, диареи, язвы желудка, воспалительной болезни кишечника, синдрома раздраженного кишечника, желудочно-кишечной непроходимости, непроходимости кишечника, послеоперационного рестеноза, радиационного повреждения, глазных заболеваний, сухости глаз, глаукомы, интерстициального кератита, ирита, катаракты и конъюнктивита.

6. Способ лечения или профилактики связанных с соматостатином заболеваний, который включает введение терапевтически эффективного количества гликозилированного полипептида по п. 1, где связанные с соматостатином заболевания представлены, по меньшей мере, одним заболеванием, выбранным из группы, состоящей из акромегалии, гигантизма, болезни Альцгеймера и других форм деменции, рака, продуцирующих гормоны опухолей, эндокринных опухолей, карциноидов, VIPомы, инсулиномы, глюкагономы, болезни Кушинга, нарушений секреции гормонов, диабета и его осложнений, болей, артрита, диареи, язвы желудка, воспалительной болезни кишечника, синдрома раздраженного кишечника, желудочно-кишечной непроходимости, непроходимости кишечника, послеоперационного рестеноза, радиационного повреждения, глазных заболеваний, сухости глаз, глаукомы, интерстициального кератита, ирита, катаракты и конъюнктивита.

7. Гликозилированный полипептид, обладающий активностью соматостатина, выбранный из группы, состоящей из:

(A) SRIF28, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ IDNO. 2;

(E) полипептида, дополнительно содержащего J аминокислот (где J означает целое число 1) на N-конце (А); и

(F) полипептида, дополнительно содержащего K аминокислот (где K означает целое число от 1 или 2) на С-конце (А);

который отличается тем, что одна аминокислота заменена на гликозилированную аминокислоту,

где

указанная одна аминокислота, замененная на указанную гликозилированную аминокислоту, представлена одной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты, соответствующей положению 1, аминокислоты, соответствующей положению 5, аминокислоты, соответствующей положению 9, аминокислоты, соответствующей положению 12, аминокислоты, соответствующей положению 13, аминокислоты, соответствующей положению 14, аминокислоты, соответствующей положению 19 в SRIF28;

указанная одна аминокислота, замененная на указанную гликозилированную аминокислоту, приходится на указанные J аминокислоты; и/или

указанная одна аминокислота, замененная на указанную гликозилированную аминокислоту, приходится на любые из указанных K аминокислот,

и где указанная гликозилированная аминокислота представляет собой гликозилированный Asn или гликозилированный Cys; в каждой из указанных гликозилированных аминокислот сахарная цепь представлена следующей формулой:

[химическая формула 1]

где R¹ и R² одинаковые или разные и означают:

[химическая формула 2]

а Ac означает ацетил.

8. Гликозилированный полипептид по п. 7, отличающийся тем, что он обладает повышенной стабильностью в крови по сравнению со SRIF28.

9. Гликозилированный полипептид по п. 7, отличающийся тем, что у каждой из гликозилированных аминокислот сахарная цепочка состоит из 4 или больше сахаридов.

10. Гликозилированный полипептид по п. 7, отличающийся тем, что сахарная цепочка содержит, по меньшей мере, одну сиаловую кислоту на невосстанавливающем конце, а карбоксигруппа данной сиаловой кислоты модифицирована алкиламиногруппой, бензилом, аминогруппой или аминоэтиламиногруппой, содержащей 1-30 атомов углерода.

11. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики связанных с соматостатином заболеваний, отличающаяся тем, что она включает:

(I) терапевтически эффективное количество гликозилированного полипептида по п. 7 и/или его фармацевтически приемлемую соль и

(II) фармацевтически приемлемый носитель, где связанные с соматостатином заболевания представлены, по меньшей мере, одним заболеванием, выбранным из группы, состоящей из акромегалии, гигантизма, болезни Альцгеймера и других форм деменции, рака, продуцирующих гормоны опухолей, эндокринных опухолей, карциноидов, VIРомы, инсулиномы, глюкагономы, болезни Кушинга, нарушений секреции гормонов, диабета и его осложнений, болей, артрита, диареи, язвы желудка, воспалительной болезни кишечника, синдрома раздраженного кишечника, желудочно-кишечной непроходимости, непроходимости кишечника, послеоперационного рестеноза, радиационного повреждения, глазных заболеваний, сухости глаз, глаукомы, интерстициального кератита, ирита, катаракты и конъюнктивита.

12. Способ лечения или профилактики связанных с соматостатином заболеваний, который включает введение терапевтически эффективного количества гликозилированного полипептида по п. 7, где связанные с соматостатином заболевания представлены, по меньшей мере, одним заболеванием, выбранным из группы, состоящей из акромегалии, гигантизма, болезни Альцгеймера и других форм деменции, рака, продуцирующих гормоны опухолей, эндокринных опухолей, карциноидов, VIРомы, инсулиномы, глюкагономы, болезни Кушинга, нарушений секреции гормонов, диабета и его осложнений, болей, артрита, диареи, язвы желудка, воспалительной болезни кишечника, синдрома раздраженного кишечника, желудочно-кишечной непроходимости, непроходимости кишечника, послеоперационного рестеноза, радиационного повреждения, глазных заболеваний, сухости глаз, глаукомы, интерстициального кератита, ирита, катаракты и конъюнктивита.

13. Гликозилированный полипептид, обладающий активностью соматостатина, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO. 35-37, 101, 107, 118 и 120.

14. Гликозилированный полипептид, обладающий активностью соматостатина, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO. 5-34, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 103, 105, 110, 112, 114, 116, 123-129, 133-135, 138-141, 148, 155 и 160.