ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЙ ПЕПТИД GLP-1 Российский патент 2015 года по МПК C07K14/605 C07K1/06 C07K1/107 A61K38/26 A61P1/04 A61P3/04 A61P3/10 

Область техники, к которой относится данное изобретение

Настоящее изобретение относится к пептиду GLP-1, модифицированному олигосахаридной цепью.

Уровень техники

GLP-1 (глюкагоноподобный пептид-1) представляет собой пептид кишечного происхождения, который играет важную роль в регуляции гомеостаза глюкозы. GLP-1 синтезируется в L-клетках желудочно-кишечного тракта в результате тканеспецифичной посттрансляционной переработки препроглюкагона, являющегося предшественником глюкагона и выделяющегося в кровоток при приеме пищи. Этот пептид выполняет роль основного медиатора энтероинсулярной оси и функционирует путем связывания с соответствующими рецепторами.

Известно, что GLP-1 действует главным образом на поджелудочную железу и способствует высвобождению инсулина из β-клеток, скорость которого зависит от концентрации глюкозы. Кроме того, считают, что GLP-1 по-видимому подавляет секрецию глюкагона, задерживает опорожнение желудка и усиливает удаление периферической глюкозы.

Введение GLP-1 пациентам с инсулиннезависимым сахарным диабетом может нормализовать уровень глюкозы после приема пищи, что указывает на то, что GLP-1 может быть использован в качестве терапевтического лекарственного средства. GLP-1 также влияет на улучшение гликемического контроля у пациентов с инсулинозависимым сахарным диабетом. Поскольку эффект промотирования выделения инсулина, вызываемый GLP-1, зависит от концентрации глюкозы в плазме, GLP-1 выступает в качестве посредника в уменьшении выделения инсулина при низкой концентрации глюкозы в плазме и, следовательно, преимущественно не вызывает значительной гипогликемии. Таким образом, высокобезопасное лечение диабета при необходимости может быть достигнуто благодаря контролю за количеством GLP-1 в крови. Однако полупериод GLP-1 в крови является настолько низким и равным от 2 до 6 минут, что создает проблему его ограниченного применения в качестве терапевтического лекарственного средства.

Для решения этой проблемы сделана попытка провести модификацию GLP-1. Например, патентный документ 1 раскрывает производное пэгилированного GLP-1, содержащего соединение GLP-1, конъюгированное по меньшей мере с 1 молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ). В соединении пэгилированного производного GLP-1 каждая молекула ПЭГ присоединена к соединению GLP-1 по Cys или Lys- аминокислотам или по концевой карбоксильной группе аминокислоты. Соединение пэгилированного производного GLP-1 характеризуется увеличением полупериода, по меньшей мере на 1 час.

В соответствии с патентным документом 1 полученный биологически активный пептид характеризуется более продолжительным полупериодом и значительно более медленным выведением по сравнению с соответствующими параметрами для непэгилированных пептидов. Было также показано, что пэгилированное производное GLP-1 и композицию используют для лечения таких хронических состояний, как диабет, ожирение и синдром раздраженного кишечника, а также для снижения уровня сахара в крови, подавления желудочной и/или кишечной подвижности, желудочного и/или кишечного опорожнения и контроля за приемом пищи (например, непатентный документ 1).

Однако ПЭГ представляет собой соединение, которое не метаболизируется in vivo. Следовательно, при непрерывном введении соединения пэгилированного производного GLP-1 ПЭГ аккумулируется in vivo и может вызывать неблагоприятные реакции в живых организмах (непатентный документ 1).

Более того, чтобы увеличить полупериод, был также предложен способ присоединения олигосахаридной цепи к GLP-1 или модифицированному GLP-1 (например, патентные документы 3 и 4). Патентный документ 3 раскрывает способ, представляющий собой введение аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью в положениях 26, 34 и/или 37 GLP-1 и т.д. Однако тип олигосахаридной цепи и центры, по которым присоединены олигосахаридные цепи, являются менее чем оптимальными. С другой стороны, патентный документ 4 раскрывает способ, представляющий собой связывание модифицированной гиалуроновой кислоты, имеющей молекулярную массу приблизительно 200 кДа, с аналогом GLP-1. Однако, когда такие большие молекулы гиалуроновой кислоты производят в больших количествах, трудно сделать их одинаковыми по длине или по структуре. Поэтому реальные гиалуроновые кислоты могут значительно отличаться по структуре и по длине. Для фармацевтического применения требуются пептиды, модифицированные олигосахаридной цепью, имеющей одинаковую длину или структуру.

Эксендин-4, выделенный из слюны ящерицы (Heloderma), представляет собой соединение, структурно подобное GLP-1, и обладает подобной активностью и высокой стабильностью в крови (непатентный документ 2), который был выпущен на рынок в США. Однако эксендин-4 имеет последовательность аминокислот, отличающуюся от человеческой, и может индуцировать выработку нейтрализующих антител, что обуславливает необходимость долгосрочного введения, приводящего к снижению эффективности (непатентные документы 3-5).

С другой стороны, стало очевидным, что олигосахаридные цепи выполняют различные функции in vivo. Они являются менее подробно изученными из-за их сложности и разнообразия структур, хотя важность их изучения не вызывает сомнения. Сделана попытка разработать способ получения гликопептида, имеющего постоянный состав (патентный документ 2). Однако этот способ получения еще является менее совершенным с точки зрения преимуществ или крупномасштабной продукции и не является конструктивным способом, особенно для получения длинноцепочечных олигосахаридных цепей, существующих in vivo.

[Патентный документ 1] National Publication of International Patent Application №2006-520818

[Патентный документ 2] WO 2005-095331

[Патентный документ 3] National Republication of International Patent Application №2006-095775

[Патентный документ 4] WO 2007/063907

[Непатентный документ 1] Toxicological Science, 42, 152-157 (1998)

[Непатентный документ 2] J Biol Chem. 267, 7402-5 (1992)

[Непатентный документ 3] Vascular Health and Risk Management 2, 69-77 (2006)

[Непатентный документ 4] JAMA. 298, 194-206 (2007)

[Непатентный документ 5] Endocrine Reviews 28, 187-218 (2007)

Сущность изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

Целью настоящего изобретения является обеспечение пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, имеющего более высокую стабильность в крови, чем у GLP-1 и, более предпочтительно, являющегося более сильным регулятором уровня сахара в крови, по сравнению с GLP-1.

Средства решения проблем

Настоящее изобретение может иметь следующие характерные признаки для решения этой проблемы.

А именно настоящее изобретение обеспечивает пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, где по меньшей мере две аминокислоты замещены аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, в

(а) GLP-1;

(b) пептиде, имеющем аминокислотную последовательность GLP-1 с делецией, замещением или присоединением одной или нескольких аминокислот, или в

(c) аналоге GLP-1.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, где по меньшей мере две аминокислоты замещены аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, в

(a) GLP-1 или

(b) пептиде, имеющем аминокислотную последовательность GLP-1 с делецией, замещением или присоединением одной или нескольких аминокислот, и имеющем активность GLP-1.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, где пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью 1, представляет собой

(a) пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, где по меньшей мере каждая из двух аминокислот GLP-1 замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью и по меньшей мере один из центров замещения находится в положении 18, 20, 22, 26, 30, 34 или 36 в GLP-1; или

(b) пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий аминокислотную последовательность пептида GLP-1, присоединенного к олигосахаридной цепи, характеризующегося (а) делецией, замещением или присоединением одной или нескольких аминокислот, за исключением конъюгатов олигосахаридных цепей с аминокислотами.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, где пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представляет собой

(a) пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, где по меньшей мере каждая из двух аминокислот GLP-1 замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, и каждый из замещенных центров находится в положении 18, 20, 22, 26, 30, 34 или 36 в GLP-1; или

(b) пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий аминокислотную последовательность пептида GLP-1 в конъюгате с олигосахаридной цепью, характеризующуюся (а) делецией, замещением или присоединением одной или нескольких аминокислот, за исключением конъюгатов олигосахаридных цепей с аминокислотами.

В настоящем изобретении пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, может представлять собой предпочтительно, но не ограничиваться конъюгатом олигосахаридной цепи с Asn или конъюгатом олигосахаридной цепи с Cys в зависимости от варианта осуществления.

В настоящем изобретении аминокислоты, модифицированные олигосахаридной цепью, присоединенные к пептиду GLP-1, могут быть одними и теми же или отличными по типу олигосахаридных цепей или аминокислот.

В настоящем изобретении в аминокислоте, модифицированной олигосахаридной цепью, олигосахаридная цепь может быть связана с аминокислотой через линкер или без линкера. Предпочтительно, когда олигосахаридная цепь связана с аминокислотой без линкера (т.е. напрямую), в зависимости от варианта осуществления.

В настоящем изобретении олигосахаридная цепь обычно предпочтительно представляет собой олигосахаридную цепь, состоящую из четырех или более остатков сахаров. Однако олигосахаридная цепь, состоящая из пяти-одиннадцати остатков сахаров, является более предпочтительной, в зависимости от варианта осуществления.

В настоящем изобретении олигосахаридная цепь может представлять собой предпочтительно, но не ограничиваться биантеннальной олигосахаридной цепью комплексного типа, в зависимости от варианта осуществления. Олигосахаридная цепь может представлять собой предпочтительно, но не ограничиваться олигосахаридной цепью, выбранной из группы, состоящей из дисиало, моносиало, асиало, диGlcNAc и диманнозоолигосахаридных цепей, в зависимости от варианта осуществления.

В настоящем изобретении олигосахаридная цепь может представлять собой предпочтительно, но не ограничиваться олигосахаридной цепью, представленной следующей формулой, в зависимости от варианта осуществления.

Формула 1

где

R¹ и R² являются одинаковыми или различными и каждая группа представлена

Формула 2

и

Ас является ацетильной группой.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, в котором по меньшей мере одна аминокислота исходного пептида замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью и олигосахаридная цепь представляет собой олигогиалуроновую кислоту. Примеры олигогиалуроновой кислоты могут включать в себя олигосахаридную цепь, содержащую два (тетрасахарид) или более и восемь или менее звеньев, состоящих из N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты. Олигогиалуроновая кислота может иметь 2 тетрасахаридных или 4 октасахаридных звена.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, где олигосахаридная цепь связана по меньшей мере с одной аминокислотой линкером. Примеры аминокислоты пептида GLP-1, связанного линкером, могут включать в себя Lys. В этом случае линкер может содержать концевую аминокислоту, связанную с олигосахаридной цепью. Пример аминокислоты, находящейся на конце линкера, связанного с олигосахаридной цепью, может включать в себя Asn.

В настоящем изобретении олигосахаридная цепь является предпочтительно гомогенной и предпочтительно имеет, например, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 99% гомогенности.

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения предпочтительно имеет более высокую стабильность в кровотоке, чем стабильность GLP-1.

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения может являться более сильным регулятором уровня сахара в крови, предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз, чем GLP-1 в OGTT (пероральная проба на переносимость глюкозы).

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения может иметь большую устойчивость к дипептидил пептидазе-4 (DPP-IV) предпочтительно по меньшей мере в 20 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 30 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 50 раз, чем GLP-1.

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения может быть использован в качестве нового активного ингредиента при медицинском применении. Такое медицинское применение включает лечение или предотвращение заболеваний, связанных с GLP-1. Типичным примером таких заболеваний является, например, диабет.

Конечно, одна или любая комбинация свойств настоящего изобретения, описанного выше, также характерна для пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью настоящего изобретения.

Содержание настоящего изобретения

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения имеет более высокую стабильность в кровотоке, чем GLP-1. В одном из аспектов настоящего изобретения пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения является более сильным регулятором уровня сахара в крови, чем GLP-1. Соответственно, пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения может быть введен в более низкой дозе и при меньшем количестве доз, чем GLP-1.

Олигосахаридные цепи, которые присоединяют к пептиду GLP-1, модифицированному олигосахаридной цепью, настоящего изобретения легко расщепляются in vivo и поэтому не вызывают неблагоприятных реакций, приводящих к их накоплению в живых организмах.

Некоторые или все олигосахаридные цепи, которые присоединяют к пептиду GLP-1, модифицированному олигосахаридной цепью, настоящего изобретения представляют собой олигосахаридные цепи, in vivo входящие в состав млекопитающих, в том числе человека, птиц и т.д., или их модифицированные олигосахаридные цепи. Едва ли они могут вызывать побочные реакции или антигенность при введении в живой организм. Поэтому они не представляют проблем с точки зрения аллергических реакций, выработки антител или связанной с этим потери активности.

В большинстве случаев олигосахаридные цепи, используемые в настоящем изобретении, являются относительно короткими. Поэтому те из них, которые имеют гомогенную структуру, могут быть получены без использования стадий, вызывающих осложнения. Таким образом, высококачественный пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, фармацевтического уровня может быть легко получен в больших количествах.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлены результаты измерения при помощи пероральной пробы на переносимость глюкозы (OGTT) эффекта подавления увеличения уровня сахара в крови при введении пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью (конъюгат GLP-1 с 26 и 34Cys-дисиалоолигосахаридной цепью или конъюгат GLP-1 с 18 и 36Cys-дисиалоолигосахаридной цепью) или GLP-1. Конъюгат GLP-1 с 26 и 34Cys-дисиалоолигосахаридной цепью или конъюгат GLP-1 с 18 и 36Cys-дисиалоолигосахаридной цепью вводят в дозе, равной 0,9 нмоль/кг, в то время как GLP-1 вводят в дозе, равной 9 нмоль/кг;

на фиг.2 представлены результаты измерения при помощи пероральной пробы на переносимость глюкозы (OGTT) эффекта подавления увеличения уровня сахара в крови при введении пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью (конъюгат GLP-1 с 22 и 30Cys-дисиалоолигосахаридной цепью, конъюгат GLP-1 с 22 и 36Cys-дисиалоолигосахаридной цепью или конъюгат GLP-1 с 30 и 36Cys-дисиалоолигосахаридной цепью) или GLP-1. Конъюгат GLP-1 с 22 и 30Cys-дисиалоолигосахаридной цепью и конъюгат GLP-1 с 22 и 36Cys- дисиалоолигосахаридной цепью или конъюгат GLP-1 с 30 и 36Cys-дисиалоолигосахаридной цепью вводят в дозе, равной 0,9 нмоль/кг, в то время как GLP-1 вводят в дозе, равной 9 нмоль/кг;

на фиг.3 представлены результаты измерения при помощи пероральной пробы на переносимость глюкозы (OGTT) эффекта подавления увеличения уровня сахара в крови при введении пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью (конъюгат GLP-1 с 36Cys-тетрасахаридом гиалуроновой кислоты или конъюгат GLP-1 с 36Cys-октасахаридом гиалуроновой кислоты) или GLP-1. Конъюгат GLP-1 с 36Cys-тетрасахаридом гиалуроновой кислоты или конъюгат GLP-1 с 36Cys-октасахаридом гиалуроновой кислоты, соответственно, вводят в дозе, равной 9 нмоль/кг;

на фиг.4 представлены результаты измерения при помощи пероральной пробы на переносимость глюкозы (OGTT) эффекта подавления увеличения уровня сахара в крови при введении пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью (конъюгат Asn-линкермодифицированного GLP-1 с 26Lys-асиалоолигосахаридной цепью) или GLP-1. Конъюгат Asn-линкермодифицированного GLP-1 с 26Cys-асиалоолигосахаридной цепью и GLP-1 соответственно вводят в дозе, равной 9 нмоль/кг; и

на фиг.5 представлены результаты измерения при помощи пероральной пробы на переносимость глюкозы (OGTT), проведенные для изучения влияния дозы пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью на эффект подавления увеличения уровня сахара в крови. Конъюгат GLP-1 с 8 и 36Cys-дисиалоолигосахаридной цепью вводят в дозе, равной 0,9 нмоль/кг, в то время как GLP-1 вводят в дозе, равной 9 нмоль/кг.

Подробное изучение предпочтительных вариантов осуществления

Термин "GLP-1", используемый здесь, обозначает глюкагоноподобный пептид-1 и называется GLP-1 (7-37).

GLP-1 (7-37) имеет аминокислотную последовательность

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEQ ID №:2).

В настоящем изобретении "аналог GLP-1" представляет собой пептид, структурно подобный GLP-1, и/или пептид, структурно перекрывающийся с GLP-1. Примеры таких пептидов включают в себя: пептид, имеющий аминокислотную последовательность GLP-1 с делецией, замещением или присоединением одной или нескольких аминокислот; пептид, имеющий аминокислотную последовательность GLP-1 с консервативным замещением одной или нескольких аминокислот; модифицированный GLP-1; фрагмент GLP-1, имеющий активность GLP-1; удлиненный GLP-1, имеющий активность GLP-1; и эксендин-4 ("Ех-4" означает эксендин-4 в данном описании патента) и его аналог (Curr. Opin. Investig. Drugs 8, 842-8 (2007), J. Pharmacol. Exp. Ther. 307, 490-496 (2003), Diabetes 50, 2530-9 (2001), etc.).

Термин "аминокислота", используемый здесь, используют в самом широком смысле и включает в себя не только природные аминокислоты, но также и неприродные аминокислоты, например разновидности аминокислот и их производные. Принимая во внимание это широкое определение, специалисты в данной области могут понять, что примеры аминокислот, используемых здесь, включают в себя природные протеиногенные L-аминокислоты; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, например разновидности аминокислот и их производные, природные непротеиногенные аминокислоты, например норлейцин, β-аланин и орнитин; и химически синтезированные соединения, имеющие свойства, характерные для аминокислот, известных в данной области. Примеры таких неприродных аминокислот включают в себя α-метиламинокислоты (α-метилаланин и т.п.), D-аминокислоты, гистидиноподобные аминокислоты (2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин и α-метилгистидин и т.п.), аминокислоты, имеющие дополнительные метиленовые группы в боковой цепи ("гомо"аминокислоты) и аминокислоты, в которых карбоксильная функциональная группа в боковой цепи замещена группой сульфокислоты (цистеиновая кислота и т.п.). Известно, что некоторые аналоги GLP-1, имеющие активность GLP-1, содержат неприродные аминокислоты. В предпочтительном аспекте аминокислоты, входящие в состав соединения настоящего изобретения, состоят только из природных аминокислот.

В предложении "деления, замещение или присоединением одной или нескольких аминокислот", используемом здесь, число замещенных аминокислот и т.д. необязательно ограничено, если активность GLP-1 сохраняется. Число замещенных аминокислот и т.д. находится в диапазоне от 1 приблизительно до 9, предпочтительно от 1 приблизительно до 5, более предпочтительно от 1 приблизительно до 3 или находится в пределах 20%, составляя предпочтительно в пределах 10% от общей длины. Замещенные или присоединенные аминокислоты могут представлять собой природные аминокислоты, неприродные аминокислоты или аналоги аминокислот и предпочтительно являются природными аминокислотами. Примеры пептида GLP-1, содержащего "делецию, замещение или присоединение одной или нескольких аминокислот" включают в себя BIM51077, где каждый из 8Ala и 35Gly в GLP-1 замещены неприродной аминокислотой α-метилаланином (также обозначаемой как аминоизомасляная кислота или Aib); его 37Gly вычеркнут из цепочки; и его 36Arg превращен в амид (Curr. Opin. Investig. Drugs 8, 842-8 (2007)).

Термин "консервативное замещение одной или нескольких аминокислот" используемый здесь, относится к аминокислотному замещению, при котором исходная аминокислота замещается на аминокислоту, имеющую индексы гидрофильности и/или гидрофобности, подобные принадлежащим исходной аминокислоте, и не приводит к заметному уменьшению или потере активности GLP-1 после замещения.

"Модифицированный GLP-1", использованный здесь, представляет собой соединение, в котором GLP-1 подвержен природной или искусственной модификации. Примеры такой модификации включают в себя алкилирование, ацилирование (например, ацетилирование), амидирование, карбоксилирование, этерификацию, образование дисульфидных связей, гликозилирование, липидирование, фосфорилирование, гидроксилирование и мечение одного или нескольких аминокислотных остатков GLP-1.

"Фрагмент GLP-1, имеющий активность GLP-1", использованный здесь, представляет собой пептид, в котором пропущена одна или несколько аминокислот с N-конца и/или С-конца GLP-1 и который сохраняет активность GLP-1.

"Удлиненный GLP-1, имеющий активность GLP-1", используемый здесь, представляет собой пептид, в котором добавлена одна или несколько аминокислот с N-конца и/или С-конца GLP-1 и который сохраняет активность GLP-1 (см., например, Endocrinology, 125, 3109-14 (1989)).

В предложении "пептид, содержащий одну или несколько аминокислот, дополнительно присоединенных к С-концу (положение 37) GLP-1", использованном здесь, аминокислоты, присоединенные к С-концу GLP-1, последовательно относятся к аминокислоте в положении 38, аминокислоте в положении 39 и т.д. В предложении "пептид, содержащий одну или несколько аминокислот, дополнительно присоединенных к N-концу (положение 7) GLP-1", аминокислоты, присоединенные к N-концу GLP-1 соответственно, относятся к аминокислоте в положении 6, аминокислоте в положении 5 и т.д. Примеры "пептида, содержащего одну аминокислоту, дополнительно присоединенную к С-концу (положение 37) GLP-1" включают в себя пептид, содержащий Asn или Cys, присоединенные к 37Gly в GLP-1.

"Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью (гликозилированный пептид GLP-1, конъюгат пептида GLP-1 с углеводной цепью)" настоящего изобретения отличается тем, что по меньшей мере одна аминокислота замещена олигосахаридной цепью, присоединенной к аминокислоте.

"Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью", используемый здесь, включает в себя пептид, в котором по меньшей мере одна аминокислота GLP-1 замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью и пептидом, в котором по меньшей мере одна аминокислота аналога GLP-1 замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью. Такие пептиды внедряются в пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, даже когда они дополнительно содержат делецию, замещение или присоединение одной или нескольких аминокислот за исключением аминокислот, связанных с олигосахаридной цепью. Пептид, в котором С-конец любого из этих пептидов подвергнут амидированию (например, GLP-1(7-36)NH₂, имеющий аминокислотную последовательность His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂ (SEQ ID №:3), где по меньшей мере одна аминокислота замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, также внедряется в пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью. Соли этих пептидов также внедряются в пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью.

Соли, использованные здесь, могут представлять собой аддитивные соли кислоты и аддитивные соли основания. Кислотами, используемыми для получения аддитивных солей кислоты, являются неорганические кислоты, например хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и органические кислоты, например п-толуолсульфокислота, метансульфокислота, щавелевая кислота, п-бромфенилсульфокислота, карбоновая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота и уксусная кислота. Примеры аддитивных солей основания включают в себя соли, полученные на основе гидроксида аммония или гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов, и соли, полученные на основе неорганических оснований, например карбоната и бикарбоната. Особенно предпочтительными являются фармацевтически приемлемые соли.

Термин "аминокислота, модифицированная олигосахаридной цепью", использованный здесь, представляет собой аминокислоту, связанную с олигосахаридной цепью. В контексте данной работы олигосахаридная цепь может быть присоединена к аминокислоте при помощи линкера. Место на олигосахаридной цепи, к которому присоединяется аминокислота, не является строго лимитированным. Предпочтительно, аминокислота связана с восстанавливающей концевой группой олигосахаридной цепи.

Тип аминокислоты, связанной с олигосахаридной цепью, не является строго лимитированным и могут быть использованы как природные, так и неприродные аминокислоты. Исходя из того, что аминокислота, связанная с олигосахаридные цепью, структурно является такой же или подобной той, которая находится в форме гликопептида (гликопротеина) in vivo, аминокислота, модифицированная олигосахаридной цепью, предпочтительно представляет собой Asn, связанный с олигосахаридной цепью, например с N-связанной олигосахаридной цепью, или Ser, связанный с или Thr, связанный с олигосахаридной цепью, например с O-связанной олигосахаридной цепью, особенно предпочтительным является Asn, связанный с олигосахаридной цепью.

Когда олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте через линкер, аминокислота в составе конъюгата с олигосахаридной цепью является: аминокислотой, содержащей две или несколько карбоксильных групп в молекуле, например аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота; аминокислотой, содержащей две или несколько аминогрупп в молекуле, например лизин, аргинин, гистидин или триптофан; аминокислотой, содержащей гидроксильную группу в молекуле, например серин, треонин или тирозин, аминокислотой, содержащей тиольную группу в молекуле, например цистеин; или аминокислотой, содержащей амидную группу в молекуле, например аспарагин или глутамин, с точки зрения более легкого связывания с линкером. Особенно, с точки зрения реакционной способности, предпочтительными являются аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, серин, треонин, цистеин, аспарагин или глутамин.

Конъюгаты олигосахаридных цепей с пептидами GLP-1 настоящего изобретения существенно не отличаются как регуляторы увеличения уровня сахара в крови от конъюгата Asn с олигосахаридной цепью (без линкера) и конъюгата Cys с олигосахаридной цепью (через линкер) в качестве аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью, когда они содержат олигосахаридные цепи одинаковой структуры, те же самые структуры за исключением структуры олигосахаридных цепей, одинаковые центры присоединения олигосахаридных цепей и одинаковое число присоединенных олигосахаридных цепей.

Когда олигосахаридную цепь присоединяют к аминокислоте с помощью линкера, могут быть использованы любые линкеры, широко используемые в данной области. Примеры таких линкеров могут включать в себя: -NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂-, где "а" является целым числом, предпочтительно целым числом от 0 до 4, но не ограничиваются этими числами за исключением случаев, когда подавляются интересующие нас линкерные функции; C_1-10 полиметилен и -CH₂-R-, где R является группой, образующейся при отщеплении одного атома водорода от группы, выбранной из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, карбоциклической группы, замещенной карбоциклической группы, гетероциклической группы и замещенной гетероциклической группы; и -(СО)-(СН₂)_а-(СО)-, где "а" является целым числом, предпочтительно целым числом от 0 до 4, но не ограничиваются этими числами за исключением случаев, когда подавляются интересующие нас линкерные функции.

В аминокислоте, модифицированной олигосахаридной цепью, когда олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте, входящей в состав GLP-1 при помощи линкера, линкер также предпочтительно содержит аминокислоту на конце, связанном с олигосахаридной цепью. Предпочтительные примеры типов аминокислоты могут включать в себя, но не ограничиваться Asn.

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, содержащий аминокислоту, модифицированную олигосахаридной цепью, в котором олигосахаридная цепь связана с аминокислотой без линкера, может обладать более низкой антигенностью, чем пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, в котором олигосахаридная цепь связана с аминокислотой через линкер. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, содержащий аминокислоту, модифицированную олигосахаридной цепью, в котором олигосахаридная цепь связана с аминокислотой через линкер, может обладать более высокой стабильностью в кровотоке, чем пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, в котором олигосахаридная цепь связана с аминокислотой без линкера.

Способ получения пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, настоящего изобретения не ограничивается каким-либо способом описания (например, описанием, утверждающим: "пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, где аминокислота замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью"). Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, полученный любым из следующих процессов А - С, включен в "пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, в котором аминокислота замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью". Более того, например: пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, где олигосахаридная цепь, не связанная с аминокислотой, соединяется напрямую или через линкер с аминокислотой в пептиде; пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, где уже присоединенная олигосахаридная цепь дополнительно удлиняется присоединением к ней сахара или олигосахаридной цепи; пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, в котором одна или несколько аминокислот, связанные с амино и/или карбоксильными группами аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью, дополнительно присоединяются к одному или нескольким фрагментам GLP-1; и пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, в котором связанная с олигосахаридной цепью аминокислота присоединена через линкер с аминокислотой в пептиде, также внедряется в пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью настоящего изобретения при условии, что конечные структуры согласуются с этим.

Число замещений, соответствующих замещению аминокислоты GLP-1 аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, может быть согласовано соответствующим образом со стабильностью в кровотоке, биологической активностью (например, способностью регулирования уровня сахара в крови), числом аминокислот, находящихся в конечном пептиде GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью, молекулярной массой пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью до и после присоединения олигосахаридной цепи, и т.д. Например, предпочтительными являются от 1 до 5 замещений, и более предпочтительны от 1 до 3 замещений. В одном из аспектов настоящего изобретения, предпочтительными являются по меньшей мере 2 замещения, например предпочтительным является от 2 до 5 замещений, и более предпочтительным является от 2 до 3 замещений. Предпочтительно, с точки зрения удобства может быть выбрано одно замещение, если это одно замещение приводит к желаемой активности. Обычно пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, в котором одна аминокислота пептида GLP-1 замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, проявляет повышенную стабильности в кровотоке и пониженную способность регулирования уровня сахара в крови, если одна или несколько аминокислот за исключением аминокислот, модифицированных олигосахаридной цепью, дополнительно замещены аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью (однако пониженная способность регулирования уровня сахара в крови может быть компенсирована повышенной стабильностью в кровотоке).

В пептиде GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью, настоящего изобретения центр замещения аминокислоты аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, может быть соответствующим образом адаптирован к стабильности в кровотоке или способности регулирования уровня сахара в крови.

В одном из аспектов настоящего изобретения центр замещения аминокислоты GLP-1 аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, может быть выбран из любых центров GLP-1 в соответствии с желаемой активностью и является, например, по меньшей мере, одним из центров, выбранных из положений 8, 9, 12, 18, 19, 20, 22, 26, 30, 34, 36 и 38 (= присоединению аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью к аминокислоте в положении 37) в GLP1, предпочтительно по меньшей мере, одним из центров, выбранных из положений 18, 20, 22, 26, 30, 34, 36 и 38, e.g., например одним из центров, выбранных из положений 18, 26, 30, 34 и 36, и особенно одним из центров, выбранных из положений 30 и 36.

В одном из аспектов настоящего изобретения с точки зрения стабильности пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в крови центр замещения аминокислоты аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, может быть выбран из любых центров GLP-1 и является, например, по меньшей мере, одним из центров, выбранных из положений 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 32, 34, 36 и 38 (= присоединению аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью к аминокислоте в положении 37) в GLP1, предпочтительно по меньшей мере одним из центров, выбранных из положений 9, 10, 11, 12, 14 и 28, и особенно одним из центров, выбранных из положений 9, 10, 11 и 12. В частности, замещение аминокислоты в центре, близком к N-концу, GLP-1 также является предпочтительным. В частности, примеры центров замещения по меньшей мере двух аминокислот GLP-1 аминокислотами, модифицированными олигосахаридной цепью, могут включать в себя замещение в положении 18 и 36, замещение в положении 26 и 34, замещение в положении 22 и 30, замещение в положении 22 и 36 и замещение в положении 30 и 36 в GLP-1.

В одном из аспектов настоящего изобретения с точки зрения эффекта контроля за уровнем сахара в крови пептидом GLP-1, модифицированным олигосахаридной цепью, центр замещения аминокислоты аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, является, например, одним из центров, выбранных из положений 18, 19, 20, 22, 26, 30, 34, 36 и 38 (= присоединению аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью к аминокислоте в положении 37) в GLP1, предпочтительно по меньшей мере, одним из центров, выбранных из положений 18, 26, 30, 34 и 36, и особенно одним из центров, выбранных из положений 30 и 36. В частности, примеры центров замещения по меньшей мере двух аминокислот GLP-1 аминокислотами, модифицированными олигосахаридной цепью, могут включать в себя замещение в положении 18 и 36, замещение в положении 26 и 34, замещение в положении 22 и 30, замещение в положении 22 и 36 и замещение в положении 30 и 36 в GLP-1, с точки зрения влияния на контролирование уровня сахара в крови пептидом GLP-1, модифицированным олигосахаридной цепью.

В одном из аспектов настоящего изобретения с точки зрения способности к синтезу сАМР, функционально активными центрами пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, является, например, один из центров замещения аминокислоты аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, предпочтительно по меньшей мере, выбранных из положений 22, 26, 27, 30, 34, 36 и 38 (= присоединению аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью к аминокислоте в положении 37), и более предпочтительно по меньшей мере одним из центров, выбранных из положений 22, 26, 30, 34, 36 и 38.

В одном из аспектов настоящего изобретения центр замещения аминокислоты аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, является по меньшей мере одним центром, выбранным из центров за исключением положений 8, 9 и 12 в GLP-1.

В одном из аспектов настоящего изобретения центр замещения аминокислоты аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, является по меньшей мере одним центром, выбранным из центров за исключением положений 7, 10, 13, 15, 19, 21, 28 и 29 в GLP-1, и особенно одним центром, выбранным из центров за исключением положений 7, 10, 15 и 28.

В одном из аспектов настоящего изобретения центр замещения аминокислоты аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, может быть выбран из центров связывания GLP-1 с рецептором GLP-1.

В одном из аспектов настоящего изобретения, когда две или несколько аминокислот замещены аминокислотами, модифицированными олигосахаридной цепью, центры замещения аминокислот аминокислотами, модифицированными олигосахаридной цепью, могут быть выбраны, но не ограничиваются любыми комбинациями центров, описанных выше. Например, комбинация, в которой один центр выбирают из предпочтительных центров, а другие центры выбирают из любых центров GLP-1 и комбинация, в которой один центр выбирают из предпочтительных центров, а другие центры выбирают из любых центров одной или нескольких аминокислот, дополнительно присоединенных к С-концу (положение 37) в GLP-1 также включены в предпочтительный аспект настоящего изобретения.

В один из аспектов настоящего изобретения предпочтительные примеры делеции, замещения или присоединения одной или нескольких аминокислот за исключением конъюгатов олигосахаридных цепей с аминокислотой(ми) в GLP-1 могут быть включены, но не ограничиваются:

замещением 8Ala аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 9Gly аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Asp и Lys;

замещением 11 Thr аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 12Phe аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Trp и Tyr;

замещением 13Thr на Ser;

замещением 14Ser аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 15Asp на Glu;

замещением 16Val аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Phe, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp и Lys;

замещением 17Ser аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 18Ser аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 19Tyr аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Phe, Trp, Glu, Asp и Lys;

замещением 20Leu аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 21Glu аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Asp и Lys;

замещением 22Glu аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 23Gln аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Asn, Arg, Glu, Asp и Lys;

замещением 24Ala аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp и Lys;

замещением 25Ala аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 26Lys аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Arg, Gln, Glu, Asp и His;

замещением 27Glu аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Asp, Ile и Lys;

замещением 28Phe на Trp;

замещением 29Ile аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Leu, Val и Ala;

замещением 30Ala аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 31Trp аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Phe, Tyr, Glu, Asp и Lys;

замещением 32Leu аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 33Val аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp и Lys;

замещением 34Lys аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и His;

замещением 35Gly аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замещением 36Arg аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Glu, Asp и His; и/или

замещением 37Gly аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys.

В одном из аспектов настоящего изобретения центр делеции, замещения или присоединения одной или нескольких аминокислот за исключением аминокислот, модифицированных олигосахаридной цепью, является предпочтительно по меньшей мере одним из центров, выбранных из центров за исключением положений 7, 10, 13, 15, 19, 21, 28 и 29 в GLP-1, например по меньшей мере одним из центров, выбранных из центров за исключением положений 7, 10, 15 и 28 (Structure-Activity Studies of Glucagon-like Peptide-1, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.269, No. 9, Issue of March 4, pp. 6276-6278, 1994).

Примеры пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, настоящего изобретения включают в себя пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный общей формулой (I):

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Leu-Glu-Xaa₂₂-Gln-Ala-Ala-Xaa₂₆-Glu-Phe-Ile-Xaa₃₀-Trp-Leu-Val-Xaa₃₄-Gly-Xaa₃₆-Xaa₃₇

где:

Xaa₁₈ представляет собой Ser, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Xaa₁₉ представляет собой Tyr, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₂₂ представляет собой Gly, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₂₆ представляет собой Lys, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, конъюгат Asn с олигосахаридной цепью или конъюгат Lys с олигосахаридной цепью;

Хаа₃₀ представляет собой Ala, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₃₄ представляет собой Lys, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, конъюгат Asn с олигосахаридной цепью или конъюгат Lys с олигосахаридной цепью;

Хаа₃₆ представляет собой Arg, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₃₇ представляет собой Gly, NH₂, конъюгат Cys с Gly-олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с Gly-олигосахаридной цепью, и

когда Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys и Хаа₃₆ представляет собой Arg, Хаа₃₇ представляет собой конъюгат Cys с Gly-олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с Gly-олигосахаридной цепью, где: по меньшей мере каждая их двух аминокислот исходного пептида замещены аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью; олигосахаридная цепь представляет собой олигогиалуроновую кислоту; и/или олигосахаридная цепь представляет собой олигосахаридную цепь на основе высшей маннозы. Каждый из конъюгатов Cys с олигосахаридной цепью, конъюгатов Asn с олигосахаридной цепью и конъюгатов Lys с олигосахаридной цепью может содержать линкер между олигосахаридной цепью и аминокислотой. Пептид, представленный общей формулой (1), представлен здесь SEQ ID №:1.

Отдельные примеры пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, настоящего изобретения включают в себя:

(а1) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой represents Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:4);

(а2) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:5);

(а3) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:6);

(а4) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:7);

(а5) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, собой Lys, Хаа₃₆ представляет Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:8);

(а6) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет конъюгат Cys с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:9);

(а7) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет Arg и Хаа₃₇ представляет собой конъюгат Cys с Gly-олигосахаридной цепью (SEQ ID №:10);

(а8) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:11);

(а9) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Xaa₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:12);

(а10) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:13);

(a11) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:14);

(а12) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:15);

(а13) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:16);

(а14) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:17);

(а15) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой конъюгат Asn с Gly-олигосахаридной цепью (SEQ ID №:18);

(а16) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:19);

(а17) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₃₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:20);

(а18) соединение, представленное общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:21);

(а19) соединение, представленное общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:22);

(а20) соединение, представленное общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:23);

(а21) соединение, представленное общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:24);

(а22) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:25);

(а23) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:26);

(а24) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:27);

(а25) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:28);

(а26) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:29);

(а27) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:30);

(а28) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:31);

(а29) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:32); и

(а30) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Xaa₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:33).

В этих примерах пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, олигосахаридная цепь является предпочтительно, например, олигогиалуроновой кислотой или олигосахаридной цепью на основе высшей маннозы.

Примеры пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, настоящего изобретения также включают:

(а31) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Xaa₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой конъюгат Lys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:34); и

(а32) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой конъюгат Lys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:35).

В этих примерах пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, олигосахаридная цепь предпочтительно связана через линкер, как, например, в конъюгате Lys с олигосахаридной цепью.

Примеры пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, также включают:

(а33) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:36);

(а34) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:37);

(а35) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:38);

(а36) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:39);

(а37) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:40);

(а38) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:41);

(а39) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:42);

(а40) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:43);

(а41) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:44);

(а42) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:45).

В этих примерах пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, олигосахаридная цепь представляет собой предпочтительно, например, биантеннальную олигосахаридную цепь комплексного типа.

Примеры пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, настоящего изобретения также включают в себя:

(а43) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой конъюгат Cys с Gly-олигосахаридной цепью (SEQ ID №:46);

(а44) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID №:47);

(а45) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой конъюгат Asn с Gly-олигосахаридной цепью (SEQ ID №:48); и

(а46) пептид, представленный общей формулой (1), где Xaa₁₈ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, Хаа₃₀ представляет собой Ala, Хаа₃₄ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID №:49).

В этих примерах пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, олигосахаридная цепь представляет собой предпочтительно, например, биантеннальную олигосахаридную цепь комплексного типа.

Примеры конъюгатов аналога пептида GLP-1 с олигосахаридной цепью настоящего изобретения может включать в себя эксендин, имеющий аминокислотную последовательность

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂ (SEQ ID №:50)

и имеющий присоединенную к ней олигосахаридную цепь.

Конъюгат эксендина-4 с олигосахаридной цепью представлен, например, общей формулой (2):

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa₁₂-Gln-Xaa₁₄-Glu-Xaa₁₆-Glu-Ala-Val-Xaa₂₀-Leu-Phe-Ile-Xaa₂₄-Trp-Leu-Lys-Xaa₂₈-Gly-Xaa₃₀-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

где:

Xaa₁₂ представляет собой Lys, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Xaa₁₄ представляет собой Met, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Xaa₁₆ представляет собой Glu, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₂₀ представляет собой Arg, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₂₄ представляет собой Glu, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₂₈ представляет собой Asn, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₃₀ представляет собой Gly, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

по меньшей мере один из Xaa₁₂, Xaa₁₄, Xaa₁₆, Хаа₂₀, Хаа₂₄, Xaa₂₈ и Хаа₃₀ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью (SEQ ID №:51).

Среди них Хаа₂₄ и/или Хаа₃₀ представляют собой предпочтительно конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью. Особенно Хаа₃₀ предпочтительно является конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью.

Примеры пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, содержащего делецию, замещение или присоединение одной или нескольких аминокислот, который является пептидом GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью настоящего изобретения, могут включать в себя BIM51077, имеющий аминокислотную последовательность

His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-R²-Arg-NH₂,

где R² представляет собой α-метиаланин (SEQ ID №:52),

и присоединенную к ней олигосахаридную цепь.

Конъюгат олигосахаридной цепи с BIM51077, представленным общей формулой (3):

His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa₁₈-Tyr-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Gln-Ala-Ala-Xaa₂₆-Glu-Phe-Ile-Xaa₃₀-Trp-Leu-Val-Xaa₃₄-R²-Xaa₃₆-NH₂,

где:

R² представляет собой α-метилаланин;

Xaa₁₈ представляет собой Ser, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₂₀ представляет собой Leu, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₂₂ представляет собой Gly, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₂₆ представляет собой Lys, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, конъюгат Asn с олигосахаридной цепью или конъюгат Lys с олигосахаридной цепью;

Хаа₃₀ представляет собой Ala, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью;

Хаа₃₄ представляет собой Lys, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью, конъюгат Asn с олигосахаридной цепью или конъюгат Lys с олигосахаридной цепью;

Хаа₃₆ представляет собой Arg, конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью, и

по меньшей мере один из Xaa₁₈, Хаа₂₀, Хаа₂₂, Хаа₂₆, Хаа₃₀, Хаа₃₄ и Хаа₃₆ представляет собой конъюгат Cys с олигосахаридной цепью или конъюгат Asn с олигосахаридной цепью (SEQ ID №:53).

Когда синтезируют аминокислоту, модифицированную олигосахаридной цепью, в которой олигосахаридную цепь присоединяют к аминокислоте по С-концевому фрагменту пептида, первоначально содержащего амидированный С-конец, например эксендин-4 и BIM51077, С-конец может быть неамидированным.

Термин "олигосахаридная цепь", используемый здесь, относится к соединению, содержащему по меньшей мере одно углеводное звено (моносахарид и/или его производное). Когда связаны два или несколько углеводных звеньев, такие углеводные звенья связывают дегидратирующей конденсацией за счет образования гликозидных связей между ними. Примеры таких олигосахаридных цепей включают в себя, но не ограничиваются моносахаридами и полисахаридами (глюкозой, галактозой, маннозой, фукозой, ксилозой, N-ацетилглюкозамином, N-ацетилгалактозамином, сиаловой кислотой и их комплексами и производными), находящимися в живых организмах, а также широким диапазоном олигосахаридных цепей, например деградировавших полисахаридов и полисахаридов, деградировавших или образующихся из сложных биологических молекул, например гликопротеинов, протеоглюканов, глюкозаминоглюканов и гликолипидов. Олигосахаридные цепи могут быть линейными или разветвленными.

Термин "олигосахаридная цепь", используемый здесь, также включает производные олигосахаридной цепи. Примеры производных олигосахаридных цепей включают в себя, но не ограничиваются олигосахаридными цепями, состоящими из сахаров, содержащих карбоксильную группу (например, альдоновой кислоты, представляющей собой карбоновую кислоту, образующуюся при окислении в положении С-1 (например, D-глюконовую кислоту, образующуюся при окислении D-глюкозы) и уроновую кислоту, в которой концевой атом углерода окислен до карбоксильной группы (D-глюкуроновой кислоты, образующейся при окислении D-глюкозы)); сахар, содержащий аминогруппу или производное аминогруппы (например, ацетилированную аминогруппу) (например, N-ацетил-D-глюкозамин и N-ацетил-D-галактозамин); сахар, содержащий как амино-, так и карбоксильные группы (например, N-ацетилнейраминовую кислоту (сиаловую кислоту) и N-ацетилмураминовую кислоту); дезоксисахара (например, 2-дезокси-D-рибозу); сульфированный сахар, содержащий группу серной кислоты; и фосфорилированный сахар, содержащий группу фосфорной кислоты.

В настоящем изобретении предпочтительные олигосахаридные цепи повышают стабильность GLP-1 в крови и, более предпочтительно, не снижают активности GLP-1 как регулятора уровня сахара в крови, когда они присоединены к GLP-1 (например, когда аминокислота GLP-1 замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью). В одном из аспектов настоящего изобретения предпочтительные олигосахаридные цепи повышают активность GLP- как регулятора уровня сахара в крови, когда они присоединены к GLP-1 (например, когда аминокислота GLP-1 замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью).

Олигосахаридные цепи в пептиде GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью, настоящего изобретения не являются очень лимитированными и могут или не могут находиться in vivo в форме сложного углевода (гликопептида (или гликопротеина), протеоглюкана, гликолипида и т.д.).

Олигосахаридные цепи, которые находятся in vivo в форме сложного углевода, являются предпочтительными, поскольку пептиды GLP-1, модифицированные олигосахаридной цепью, настоящего изобретения вводят в живые организмы. Примеры таких олигосахаридных цепей включают в себя N-связанные олигосахаридные цепи и O-связанные олигосахаридные цепи, которые in vivo соединены с пептидом (или белком) с образованием гликопептида (или гликопротеина). Предпочтительно используют N-связанные олигосахаридные цепи. Примеры N-связанных олигосахаридных цепей могут включать в себя олигосахаридную цепь на основе высшей маннозы, олигосахаридную цепь комплексного типа и олигосахаридную цепь гибридного типа. Особенно предпочтительными являются олигосахаридные цепи комплексного типа.

Примеры предпочтительных олигосахаридных цепей комплексного типа, используемых в настоящем изобретении, включают в себя олигосахаридную цепь, представленную следующей общей формулой:

Формула 3

где

R¹ и R² являются одинаковыми или различными и каждая представляют собой

Формула 4

и

Ас представляет собой ацетильную группу.

В пептиде GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью, настоящего изобретения олигосахаридная цепь может находиться в форме сложного углевода или может быть связана с пептидом GLP-1 способом, отличающимся от O-связывания и N-связывания. Например, пептиды GLP-1, модифицированные олигосахаридной цепью, в которых олигосахаридная цепь связана с Cys или Lys через линкер, как описано выше, также включена в пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью настоящего изобретения.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения олигосахаридная цепь представляет собой относительно низкомолекулярный глюкозаминоглюкан, например гиалуроновую кислоту, хондроитин, хондроитинсульфаты А - С, гепарин, гепарансульфат и кератансульфат. Такие олигосахаридные цепи содержат линейно связанные повторяющиеся дисахаридные звенья, состоящие из аминосахаров (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина) и уроновой кислоты (глюкуроновой кислоты или L-идуроновой кислоты). Термин «относительно низкомолекулярный глюкозаминоглюкан», используемый здесь, означает, что молекулярная масса, например, равна приблизительно 10 кДа или ниже, предпочтительно приблизительно 6 кДа или ниже, более предпочтительно приблизительно 4 кДа или ниже, или число остатков сахара в нем равно приблизительно 50 или ниже, предпочтительно 30 или ниже, более предпочтительно 20 или ниже.

В одном из аспектов настоящего изобретения олигосахаридная цепь в пептиде GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью, настоящего изобретения представляет собой предпочтительно олигосахаридную цепь, состоящую из четырех или более остатков сахара, например пяти или более, семи или более, особенно девяти или более или одиннадцати или более остатков сахара.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения олигосахаридная цепь в пептиде GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью, настоящего изобретения представляет собой содержит от пяти до одиннадцати, от девяти до одиннадцати или одиннадцать остатков сахара.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения олигосахаридная цепь в пептиде GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью, настоящего изобретения представляет собой биантеннальную олигосахаридную цепь комплексного типа. Олигосахаридная цепь комплексного типа характеризуется тем, что состоит из двух или нескольких типов моносахаридов и имеет следующую основную структуру и структуру лактозамина, представленную Galβ1-4GlcNAc:

Формула 5

Биантеннальная олигосахаридная цепь комплексного типа относится к таким структурам, в которых моноантеннальная олигосахаридная цепь, содержащая от 0 до 3 сахаров, связана с каждой из двух концевых манноз основной структуры. Биантеннальная олигосахаридная цепь комплексного типа представляет собой предпочтительно, например, следующую дисиалоолигосахаридную цепь:

Формула 6

моносиалоолигосахаридная цепь

Формула 7

асиалоолигосахаридная цепь:

Формула 8

диGlcNAc-олигосахаридная цепь:

Формула 9

диманнозоолигосахаридная цепь:

Формула 10

и т.д.

Дисиалоолигосахаридная цепь является более предпочтительной.

Термин "Дисиалоолигосахаридная цепь", "моносиалоолигосахаридная цепь", "асиалоолигосахаридная цепь", "диGlcNAc-олигосахаридная цепь" и "диманнозоолигосахаридная цепь", используемые здесь, также обозначают наряду с указанными выше химическими формулами олигосахаридные цепи, имеющие типы связей, отличные от тех, которые представлены химическими формулами. Такие олигосахаридные цепи также предпочтительно используют в качестве олигосахаридных цепей настоящего изобретения. Примеры таких олигосахаридных цепей включают в себя дисиалоолигосахаридную цепь или асиалоолигосахаридную цепь, в которой сиаловая кислота связана с галактозой (α2→3) связью.

Олигосахаридная цепь на основе высшей маннозы, используемая в настоящем изобретении, представляет собой олигосахаридную цепь, в которой два или более остатков маннозы дополнительно связаны с основной структурой олигосахаридной цепи комплексного типа. Поскольку олигосахаридная цепь на основе высшей маннозы является объемистой, присоединение олигосахаридной цепи на основе высшей маннозы к пептиду может значительно сильнее повышать стабильность в крови. Предпочтительной является олигосахаридная цепь, содержащая 5-9 манноз, например олигосахаридная цепь на основе высшей маннозы млекопитающих. Может быть использована олигосахаридная цепь, содержащая большее число манноз, например олигосахаридная цепь на основе высшей маннозы дрожжей. Примеры олигосахаридных цепей на основе высшей маннозы, предпочтительно используемые в настоящем изобретении, могут включать в себя:

высшую маннозу-5 (М-5):

Формула 11

и высшую маннозу-9 (М-9):

Формула 12

В настоящем изобретении примеры предпочтительных олигосахаридных цепей могут включать в себя структурно те же самые олигосахаридные цепи (олигосахаридные цепи, имеющие те же самые типы сахаров, входящих в их состав и те же самые типы связей между сахарами), что и олигосахаридные цепи, которые присоединены к белку при образовании гликопротеина в организме человека (например, олигосахаридные цепи, описанные в "FEBS LETTERS Vol.50, No. 3, Feb. 1975"), или олигосахаридные цепи, в которых отсутствует один или несколько остатков сахара с их невосстанавливающихся концов, которые описаны в нижеприведенных таблицах 1-4.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

В одном из аспектов настоящего изобретения олигосахаридная цепь предпочтительно является олигосахаридной цепью, имеющей линейную структуру. Примеры таких олигосахаридных цепей включают в себя олигогиалуроновые кислоты. Олигогиалуроновая кислота, использованная здесь, относится к олигосахаридной цепи, в которой N-ацетилглюкозамин и глюкуроновая кислота попеременно линейно связаны с образованием от ди- до дотриаконтасахарида, предпочтительно от ди- до гексадекасахарида, более предпочтительно от тетра- до октасахарида.

Примеры особенно предпочтительной олигогиалуроновой кислоты в настоящем изобретении включают в себя олигосахаридную цепь, 2 (тетрасахарид) или большее количество звеньев и 8 (гексадекасахарид) или меньшее количество звеньев, каждое из которых состоит из N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты. Олигосахаридная цепь, имеющая от 2 (тетрасахарид) до 4 (октасахарид) звеньев, является более предпочтительной, и олигосахаридная цепь, имеющая 2 (тетрасахарид) звена, является наиболее предпочтительной.

Примеры гиалуроновой кислоты, предпочтительно используемой в настоящем изобретении, включают в себя олигогиалуроновую кислоту в форме тетрасахарида:

Формула 13

и олигогиалуроновую кислоту в форме октасахарида:

Формула 14

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения гликопептид настоящего изобретения имеет гомогенную олигосахаридную структуру. Структура гомогенной олигосахаридной цепи в гликопептиде, использованном здесь, относится к той же самой олигосахаридной цепи, присоединенной к центру в пептиде, к тому же самому типу входящего в состав сахара олигосахаридной цепи, к тому же самому порядку присоединения сахаров и тому же самому типу связей между сахарами при сравнении гликопептидов и означает, что структура олигосахаридной цепи имеет по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99% гомогенности. Гликопептиды, имеющие гомогенную структуру олигосахаридной цепи, проявляют постоянные качества и особенно предпочтительны в такой области, как фармацевтическая продукция или количественный анализ. Долю гомогенных олигосахаридных цепей можно измерить с помощью такого способа, как, например, ВЭЖХ, капиллярный электрофорез, ЯМР, масс-спектрометрия и т.д.

В настоящем изобретении примеры предпочтительных пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, могут включать в себя пептиды GLP-1, модифицированные олигосахаридной цепью (SEQ ID №:54-66), полученные в примерах 1-15, описанных ниже, т.е. пептиды GLP-1, модифицированные олигосахаридной цепью, имеющие последовательность

His₇-Ala₈-Glu₉-Gly₁₀-Thr₁₁-Phe₁₂-Thr₁₃-Ser₁₄-Asp₁₅-Val₁₆-Ser₁₇-Ser₁₈-Tyr₁₉-Leu₂₀-Glu₂₁-Gly₂₂-Gln₂₃-Ala₂₄-Ala₂₅-Lys₂₆-Glu₂₇-Phe₂₈-Ile₂₉-Ala₃₀-Trp₃₁-Leu₃₂-Val₃₃-Lys₃₄-Gly₃₅-Arg₃₆-Gly₃₇ (SEQ ID №:2, GLP-1), где:

(b1) каждый из 26Lys и 34Lys замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 1) (SEQ ID №:54);

(b2) каждый из 18Ser и 36Arg замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 2) (SEQ ID №:55);

(b3) каждый из 22Gly и 30Ala замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 3) (SEQ ID №:56);

(b4) каждый из 22Gly и 36Arg замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 4) (SEQ ID №:57);

(b5) каждый из 30Ala и 36Arg замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 5) (SEQ ID №:58);

(b6) 30Ala замещен конъюгатом Cys с тетрасахаридом олигогиалуроновой кислоты (НА-4) (пример 6) (SEQ ID №:59);

(b7) 30Ala замещен конъюгатом Cys с октасахаридом олигогиалуроновой кислоты (НА-8) (пример 7) (SEQ ID №:60);

(b8) 36Arg замещен конъюгатом Cys с тетрасахаридом олигогиалуроновой кислоты (НА-4) (пример 8) (SEQ ID №:61);

(b9) 36Arg замещен конъюгатом Cys с октасахаридом олигогиалуроновой кислоты (НА-8) (пример 9) (SEQ ID №:62);

(b10) 30Ala замещен конъюгатом Cys с гексадекасахаридом олигогиалуроновой кислоты (НА-16) (пример 10) (SEQ ID №:63);

(b11) 36Arg замещен конъюгатом Cys с гексадекасахаридом олигогиалуроновой кислоты (НА-16) (пример 11) (SEQ ID №:64);

(b12) 36Arg замещен конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью на основе высшей маннозы (М5) (пример 12) (SEQ ID №:65); и

(b13) конъюгат Asn с асиалоолигосахаридной цепью присоединен к 26Lys через линкер (пример 13) (SEQ ID №:66), и

дополнительно включает в себя:

(b14) пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий последовательность H-His₁-Gly₂-Glu₃-Gly₄-Thr₅-Phe₆-Thr₇-Ser₈-Asp₉-Leu₁₀-Ser₁₁-Lys₁₂-Gln₁₃-Met₁₄-Glu₁₅-Glu₁₆-Glu₁₇-Ala₁₈-Val₁₉-Arg₂₀-Leu₂₁-Phe₂₂-Ile₂₃-Glu₂₄-Trp₂₅-Leu₂₆-Lys₂₇-Asn₂₈-Gly₂₉-Gly₃₀-Pro₃₁-Ser₃₂-Ser₃₃-Gly₃₄-Ala₃₅-Pro₃₆-Pro₃₇-Pro₃₈-Ser₃₉-NH₂ (SEQ ID №:50, эксендин-4), где

30Gly замещен конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 14) (SEQ ID №:67);

(b15) пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий последовательность

His₇-R2₈-Glu₉-Gly₁₀-Thr₁₁-Phe₁₂-Thr₁₃-Ser₁₄-Asp₁₅-Val₁₆-Ser₁₇-Ser₁₈-Tyr₁₉-Leu₂₀-Glu₂₁-Gly₂₂-Gln₂₃-Ala₂₄-Ala₂₅-Lys₂₆-Glu₂₇-Phe₂₈-Ile₂₉-Ala₃₀-Trp₃₁-Leu₃₂-Val₃₃-Lys₃₄-R2₃₅-Arg₃₆-NH₂, где R2 представляет собой α-метилаланин (SEQ ID №:52, BIM51077), где 26Lys замещен конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 15) (SEQ ID №:68); и

(b16) пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий последовательность эксендина-4 (SEQ ID №:50), где 30Gly замещен конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью на основе высшей маннозы (М5) (пример 16).

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения может быть получен включением стадии присоединения олигосахаридной цепи в пептидный синтез, известный специалистам в данной области. Для присоединения олигосахаридной цепи также может быть использован способ, использующий обратную реакцию, катализируемую ферментом, являющимся типичным представителем трансглутаминазы. Однако этот способ заключает в себе проблемы, например большое количество необходимых олигосахаридных цепей, которое нужно присоединить, сложную очистку после проведения конечной стадии, ограниченное количество центров, к которым присоединяются олигосахаридные цепи, и ограниченные типы олигосахаридных цепей, которые могут быть присоединены. Поэтому данный способ не является целесообразным для крупномасштабного получения, например, фармацевтической продукции, хотя он может быть использован для синтеза малых количеств, например для количественного анализа.

Способ для удобного получения пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, настоящего изобретения и для целенаправленного получения пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, имеющих гомогенную структуру олигосахаридных цепей, будет специально подтвержден нижеприведенным примером, описывающим способ получения пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью с помощью аминокислот, модифицированных олигосахаридной цепью, и использовании способа пептидного синтеза, известного как твердофазный синтез или жидкофазный синтез (способ А) и способа получения пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, который состоит в получении пептида, в котором любая аминокислота GLP-1 замещена Cys, в соответствии с известным специалистам в данной области способом пептидного синтеза и последующим присоединением олигосахаридных цепей к Cys химическим синтезом (способ В). Способ получения пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, включающий аминокислоту, модифицированную олигосахаридной цепью, в котором аминокислота связана с олигосахаридной цепью через линкер и линкер содержит аминокислоту на конце цепи, присоединенную к олигосахаридной цепи, подтверждается способом получения пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, согласно которому вначале один конец линкера присоединяется к конъюгату Asn с олигосахаридной цепью, а затем N-гидроксисукцинилимидная группа присоединяется к другому концу линкера и N-гидроксисукцинилимидная группа взаимодействует с боковой аминогруппой остатка Lys пептида GLP-1 (способ С). Специалисты в данной области могут синтезировать различные пептиды GLP-1, модифицированные олигосахаридной цепью, ориентируясь на эти способы получения. Полученные таким образом пептиды GLP-1, модифицированные олигосахаридной цепью и способы их получения являются очень полезными в области производства фармацевтической продукции. Два или более из этих способов от А до С могут быть осуществлены в сочетании. Для синтеза в малых количествах, например для количественного анализа, эти способы могут быть также скомбинированы с реакцией удлинения, катализируемой трансферазой. Способы А и В описаны в инструкциях WO 2004/005330 (US2005222382 (А1)) и WO 2005/010053 (US2007060543 (А1)), соответственно. Их раскрытие целиком включено сюда в виде ссылки. Получение олигосахаридных цепей, имеющих гомогенную структуру олигосахаридных цепей, использованных в способах от А до С, описаны в инструкциях WO 03/008431 (US2004181054 (А1)), WO 2004/058984 (US2006228784 (А1)), WO 2004/058824 (US2006009421 (А1)), WO 2004/070046 (US2006205039 (А1)), WO 2007/011055 и т.д. Их раскрытие целиком включено сюда в виде ссылки.

Способ получения пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью (Способ А)

Во-первых, (1) гидроксильную группу смолы, содержащей гидроксильную группу и карбоксильную группу аминокислоты, содержащей у азота аминогруппы жирорастворимую защитную группу, подвергают реакции этерификации. Поскольку аминогруппа этой же аминокислоты защищена по азоту жирорастворимой защитной группой, гидроксильная группа смолы взаимодействует с карбоксильной группой аминокислоты и самоконденсация аминокислоты предотвращается.

Во-вторых, (2) жирорастворимую защитную группу удаляют из образующегося сложного эфира, что приводит к образованию свободной аминогруппы,

(3) свободную аминогруппу амидируют карбоксильной группой нужной аминокислоты, содержащей у азота аминогруппы жирорастворимую защитную группу,

(4) жирорастворимую защитную группу удаляют, что приводит к образованию свободной аминогруппы, и

(5) стадии (3) и (4) повторяют по меньшей мере еще один раз, благодаря чему получают пептид, содержащий нужное число нужных аминокислот, связанных таким образом и одним концом присоединенным к смоле, а на другом конце содержащий свободную аминогруппу.

После этого (6) свободную аминогруппу амидируют карбоксильной группой остатка аспарагина, связанного с олигосахаридом (конъюгата аспарагина с олигосахаридной цепью), содержащего у азота аминогруппы жирорастворимую защитную группу,

(7) жирорастворимую защитную группу удаляют, что приводит к образованию свободной аминогруппы,

(8) свободную аминогруппу амидируют карбоксильной группой нужной аминокислоты, содержащей у азота аминогруппы жирорастворимую защитную группу,

(9) стадии (7) и (8) повторяют по меньшей мере еще один раз и

(10) жирорастворимую защитную группу удаляют, что приводит к образованию свободной аминогруппы, и таким образом получают гликолипид, содержащий нужное число нужных аминокислот, связанных таким образом и одним концом присоединенным к смоле, на другом конце содержащий свободную аминогруппу и конъюгат аспарагина с олигосахаридной цепью в промежуточном положении.

(11) Смолу отделяют кислотой, благодаря чему может быть получен гликолипид, содержащий конъюгат аспарагина с олигосахаридной цепью, в нужном положении его пептидной цепи.

Альтернативно конъюгат аспарагина с олигосахаридной цепью может быть введен на конец пептидной цепи.

Смола, содержащая гидроксильную группу, обычно представляет собой смолу, содержащая гидроксильную группу, используемую для твердофазных синтезов. Примерами используемых смол являются смола Amino-PEGA (продукт Merck), смола Wang (продукт Merck), смола HMPA-PEGA (продукт Merck) и т.д.

Все аминокислоты являются используют как таковые. Примерами используемых аминокислот являются природные аминокислоты, например серин (Ser), аспарагин (Asn), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), аланин (Ala), тирозин (Tyr), глицин (Gly), лизин (Lys), аргинин (Arg), гистидин (His), аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu), глутамин (Gln), треонин (Thr), цистеин (Cys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp) и пролин (Pro).

Примерами жирорастворимой защитной группы являются 9-флуоренилметоксикарбонильная (Fmoc) группа, трет-бутилоксикарбонильная (Boc) группа, бензильная группа, аллильная группа, аллилоксикарбонильная группа, ацетильная группа и т.п., которые являются защитными группами карбонатного типа или амидного типа. Жирорастворимая защитная группа, например группа Fmoc, может быть введена присоединением 9-флуоренилметил-N-сукцинимидил карбоната и гидрокарбоната натрия к предполагаемому соединению данной реакции. Предпочтительно проводят реакцию при температуре от 0 до 50°С, предпочтительно при комнатной температуре, в течение приблизительно от 1 до приблизительно 5 часов.

Вышеописанные аминокислоты могут быть защищены жирорастворимой защитной группой способом, описанным выше. Вышеописанные защищенные аминокислоты могут быть такими, которые являются коммерчески доступными. Примерами являются Fmoc-Ser, Fmoc-Asn, Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Ile, Fmoc-Ala, Fmoc-Tyr, Fmoc-Gly, Fmoc-Lys, Fmoc-Arg, Fmoc-His, Fmoc-Asp, Fmoc-Glu, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Cys, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Trp и Fmoc-Pro.

Катализаторами этерификации являются дегидратирующие конденсирующие агенты, например 1-мезитиленсульфонил-3-нитро-1,2,4-триазол (MSNT), дициклогексилкарбодиимид (DCC) и диизопропилкарбодиимид (DIPCI). Дегидратирующий конденсирующий агент используют в количестве от 1 до 10 масс.%, предпочтительно от 2 до 5 масс.% в расчете на 1 масс.% аминокислоты.

Реакцию этерификации проводят предпочтительно помещением смолы, например, в твердофазную колонку, промыванием смолы растворителем и после этого присоединением раствора аминокислоты в растворителе к смоле. Примерами растворителей для промывания являются диметилформамид (ДМФ), 2-пропанол, метиленхлорид и т.д. Примерами растворителей для растворения аминокислот являются диметилсульфоксид (ДМСО), ДМФ, метиленхлорид и т.д. Реакцию проводят при температуре от 0 до 50°С, предпочтительно при комнатной температуре в течение приблизительно от 10 до приблизительно 30 часов, предпочтительно приблизительно от 15 минут до приблизительно 24 часов.

Предпочтительно, непрореагировавшие гидроксильные группы, остающиеся в твердой фазе в течение к этому времени ацетилируют, например, уксусным ангидридом для блокирования.

Жирорастворимая защитная группа может быть удалена, например, обработкой основанием. Примерами используемых оснований являются пиперидин, морфолин и т.д. Такую обработку проводят предпочтительно в присутствии растворителя. Примерами используемых растворителей являются ДМСО, ДМФ, метанол и т.д.

Реакцию амидирования свободной аминогруппы карбоксильной группой нужной аминокислоты, содержащей аминогруппу, защищенную по азоту жирорастворимой защитной группой, проводят предпочтительно в присутствии активатора и растворителя.

Примерами используемых активаторов являются дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид/гидрохлорид (WSC/HCl), дифенилфосфорилазид (DPPA), карбонилдиимидазол (CDI), диэтилцианофосфонат (DEPC), диизопропилкарбодиимид (DIPCI), бензотриазол-1-илокси-трис-пирролидинофосфонийгексафторфосфат (РуВОР), 1-гидроксибензотриазол (HOBt), гидроксисукцинимид (HOSu), диметиламинопиридин (DMAP), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt), гидроксифталимид (HOPht), пентафторфенол (Pfp-OH), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат (HBTU), O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-гетраметилуронийгексафторфосфонат (HATU), O-бензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилуронийтетрафторборат (TBTU), 3,4-дигидро-3-гидроди-4-оксо-1,2,3-бензотриазин (Dhbt).

Активатор используют в количестве от 1 до 20 эквивалентов, предпочтительно от 1 до 10 эквивалентов, более предпочтительно от 1 до 5 эквивалентов в расчете на аминокислоту, имеющую аминогруппу, замещенную по азоту жирорастворимой защитной группой.

Примерами используемых растворителей являются ДМСО, ДМФ, метиленхлорид и т.д. Желательно, чтобы при температуре от 0 до 50°С, предпочтительно при комнатной температуре в течение приблизительно от 10 до приблизительно 30 часов, предпочтительно приблизительно от 15 минут до приблизительно 24 часов. Жирорастворимая защитная группа может быть удалена тем же способом, что и описанный выше.

Пептидную цепь отделяют от смолы, предпочтительно обработкой кислотой. Примерами используемых кислот являются трифторуксусная кислота (ТФу), фтористый водород (HF) и т.д.

Гликопептид, содержащий по меньшей мере два конъюгата аспарагина с олигосахаридной цепью в нужном положении его пептидной цепи, может быть получен соответствующим объединением стадии (6), приводящей к амидированию свободной аминогруппы пептида карбоксильной группой остатка аспарагина в конъюгате аспарагина с олигосахаридной цепью, имеющего аминогруппу, замещенную по азоту жирорастворимой защитной группой, и стадии (7), соответствующей удалению жирорастворимой защитной группы, что приводит к образованию свободной аминогруппы. На данном этапе гликопептид, содержащий по меньшей мере два типа конъюгатов аспарагина с олигосахаридной цепью в нужном положении его пептидной цепи, может быть также получен с помощью различных конъюгатов аспарагина с олигосахаридной цепью.

Гликопептид, содержащий по меньшей мере один конъюгат аспарагина с олигосахаридной цепью в нужном положении его пептидной цепи, может быть получен проведением в качестве конечных стадий, т.е. вместо стадий (9) и (10), стадии (6), приводящей к амидированию свободной аминогруппы пептида карбоксильной группой остатка аспарагина в конъюгате аспарагина с олигосахаридной цепью, имеющего аминогруппу, замещенную по азоту жирорастворимой защитной группой, и стадии (7), соответствующей удалению жирорастворимой защитной группы, что приводит к образованию свободной аминогруппы.

Гликопептид, содержащий конъюгат аспарагина с олигосахаридной цепью на С-конце, может быть получен проведением стадии (1), на которой гидроксильную группу смолы подвергают реакции этерификации карбоксильной группой остатка аспарагина в конъюгате аспарагина с олигосахаридной цепью, содержащего аминогруппу, защищенную по азоту жирорастворимой защитной группой, вместо аминокислоты, содержащей аминогруппу, защищенную по азоту жирорастворимой защитной группой. В этом случае стадию (6) можно дополнительно проводить или не проводить.

Таким образом, может быть получен пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, замещенный в нужном положении конъюгатом аспарагина с олигосахаридной цепью.

Способ получения пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью (Способ В)

Во-первых, пептид, содержащий Cys, получают таким способом, как твердофазный синтез, жидкофазный синтез, клеточный синтез и разделением и экстракцией пептидов, существующих в природе. Олигосахаридная цепь может быть присоединена в нужном положении изменением положения Cys.

Далее галоацетамидное производное олигосахаридной цепи сложного типа вступает в реакцию с полученным таким образом пептидом, содержащим Cys, для крупномасштабного производства. Реакция может быть проведена при температуре от 0 до 80°С, предпочтительно от 10 до 60°С, более предпочтительно от 15 до 35°С. Время реакции обычно равно приблизительно от 30 минут до приблизительно 5 часов. После завершения реакции продукт реакции может быть очищен соответствующим образом способом, известным в данной области [например, высокоэффективной жидкостной колоночной хроматографией (ВЭЖХ)].

Галоацетамидное производное олигосахаридной цепи сложного типа, т.е. соединение, в котором гидроксильная группа, связанная с атомом углерода в положении 1, соединенной с аспарагином олигосахаридной цепи сложного типа, замещена -NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂X, где Х представляет собой атом галогена и а является целым числом от 0 до 4, но не ограничивается этими числами до тех пор, пока представляющие интерес линкерные функции не подавляются.

Особенно галоацетамидное производное олигосахаридной цепи сложного типа вводят в реакцию с пептидом, содержащим Cys в фосфатном буфере при комнатной температуре. После завершения реакции пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, замещенный конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью, может быть получен очисткой ВЭЖХ.

Способ получения пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью (Способ С)

Во-первых, пептид, содержащий Lys, получают таким способом, как твердофазный синтез, жидкофазный синтез, клеточный синтез и разделением и экстракцией пептидов, существующих в природе.

Далее глутаровую кислоту присоединяют к аминокислоте, модифицированной олигосахаридной цепью. Например, аминокислоту, модифицированную олигосахаридной цепью растворяют в растворе ДМСО. К этому раствору прибавляют раствор ДМСО, содержащий смесь глутаровая кислота - EDC и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 дня. Реакционная смесь может быть соответствующим образом разбавлена, а затем фракционирована высокоэффективной гель-хроматографией и т.д., чтобы получить аминокислоту, модифицированную олигосахаридной цепью, в котором глутаровая кислота связана с α-аминогруппой.

Впоследствии к раствору ДМСО аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью, связанной с глутаровой кислотой, добавляют раствор N-гидроксисукцинимида и раствор EDC в ДМСО и перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Затем EDC может быть инактивирован для синтеза аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью, связанной со сложным эфиром N-гидроксисукцинимидилированной глутаровой кислоты.

Впоследствии к раствору ДМСО пептида GLP-1 в ДМСО добавляют DIPEA и аминокислоту, модифицированную олигосахаридной цепью, связанной с N-гидроксисукцинимидилированной глутаровой кислотой, и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем реакцию заканчивают присоединением водного раствора глицина. Реакционный раствор может быть подвержен соответствующей очистке для присоединения аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью к остатку Lys в пептиде GLP-1 через линкер, глутаровую кислоту. Таким образом получают пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, содержащий аминокислоту, модифицированную олигосахаридной цепью, в котором олигосахаридная цепь связана с аминокислотой (Lys) через линкер и линкер содержит аминокислоту (Asn) на конце олигосахаридной цепи.

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, содержащий аминокислоту, модифицированную олигосахаридной цепью, связанный с нужным центром, может быть получен замещением аминокислоты в нужном центре пептида GLP-1 лизином (Lys) или замещением остатка Lys, содержащегося в пептиде GLP-1 дикого типа, другой аминокислотой. В соответствии со способом С, когда олигосахаридная цепь присоединена к Lys, находящемуся в GLP-1 дикого типа, может быть получен пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий тот же самый пептидный скелет, что и скелет дикого типа.

Конъюгат GLP-1 с олигосахаридной цепью настоящего изобретения обладает активностью GLP-1.

Термин "активность GLP-1", используемый здесь, относится к некоторым или ко всем видам биологической активности, известным в данной области, как GLP-1. Известно, что GLP-1 обладает помимо способности к регулированию уровня сахара в крови, например, секрецией инсулина, связанной с индукцией синтеза сАМР, защитой панкреатических островков (подавление апоптоза) и роста панкреатических островков в результате действия на панкреатические островки, а также влияет на подавление аппетита, подавление моторики желудочно-кишечного тракта, промотирование секреции кальцитонина и кардиопротективное действие при ишемии в качестве экстрапанкреатических эффектов. Таким образом, активность GLP-1 относится ко всем или некоторым видам биологической активности, связанным с этими эффектами, и эти активности могут быть измерены соответственно с помощью подхода, известного специалистам в данной области.

Из активностей GLP-1, например, активность контроля за уровнем сахара в крови может быть измерена с помощью способности к регулированию уровня сахара в крови у диабетических мышей (мыши db/db) или измерения эффекта подавления роста уровня сахара в крови в тесте на пероральную переносимость глюкозы (OGTT). Фраза "способность к регулированию уровня сахара в крови", используемая здесь, включает в себя обе концепции подавления роста уровня сахара в крови и снижения уровня сахара в крови. В частности, эффект контроля за уровнем сахара в крови у диабетических мышей (мыши db/db) также относится в данном документе к "эффекту снижения уровня сахара в крови", и способности к регулированию уровня сахара в крови в OGTT также относятся в данном документе к "эффекту подавления роста уровня сахара в крови".

Активность регулирования уровня сахара в крови в OGTT может быть определена измерением подавления роста уровня сахара в крови у мышей, которых заставляли пить сахар. Например, когда используют подход следующего тестового примера, где испытуемое соединение сначала вводят мыши, голодавшей в течение ночи. Через 30 минут после введения раствор глюкозы перорально вводят мыши. Уровень сахара в крови у мышей повышается благодаря введению глюкозы, достигает максимума приблизительно через 30 минут после введения и постепенно снижается. Уровень сахара в крови может быть измерен через 30 минут после введения глюкозы и сопоставлен с тем, который получают после введения GLP-1, что, таким образом, позволяет измерить эффект регулирования уровня сахара в крови, вызываемый пептидом GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью. При сравнении уровней сахара в крови, измеренных через 30 минут, с полученными после введения GLP-1, оказалось, что пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, проявляет эффект, равный, предпочтительно, 80% или ниже, более предпочтительно 60% или ниже, еще более предпочтительно 40% или ниже, особенно предпочтительно 20% или ниже контрольного уровня сахара в крови. Интенсивность регулирования уровня сахара в крови пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, настоящего изобретения может быть определена путем сравнения доз, подтвержденных в OGTT, вызывающих эквивалентные эффекты подавления роста уровня сахара в крови. Когда, например, 10 доз GLP-1 и 1 доза пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, приводят к одинаковым эффектам регулирования уровня сахара в крови, эффективность регулирования уровня сахара в крови, вызываемого пептидом GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью, в 10 раз выше, чем активность GLP-1. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения имеет эффективность регулирования уровня сахара в крови предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз большую, чем GLP-1.

Когда пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представляет собой пептид, модифицированный олигосахаридной цепью, содержащего делецию, замещение или присоединение одной или нескольких аминокислот GLP-1 или конъюгат аналога GLP-1 с олигосахаридной цепью, аналог GLP-1 или пептид GLP-1, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную пептиду GLP-1, модифицированному олигосахаридной цепью за исключением аминокислоты, модифицированной олигосахаридной цепью, может быть использован в качестве сравнительного материала для определения активности GLP-1.

Эффективность регулирования уровня сахара в крови мышей db/db может быть определена измерением уровня сахара в крови диабетических мышей после введения испытуемого соединения. Например, когда измерение уровня сахара в крови после введения испытуемого соединения проводят во времени. Эффект снижения уровня сахара в крови может быть подтвержден, если уровень сахара в крови, измеренный, например, в течение 120 минут после введения, является более низким по сравнению с уровнем, измеренным во время введения. Альтернативно, продолжительность эффекта снижения уровня сахара в крови может быть определена измерением уровня сахара в крови, например, в течение 300 минут после введения. Например, когда уровень сахара в крови, измеренного в течение 120 минут после введения, сравнивают с результатами, полученными при введении GLP-1, пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения проявляет предпочтительно 80% или ниже, более предпочтительно 70% или ниже, особенно предпочтительно 60% или ниже контрольного уровня сахара в крови. Альтернативно, когда уровень сахара в крови, измеренный в течение 120 минут после введения, сравнивают с результатами, полученными во время введения, пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения проявляет эффект, равный предпочтительно 70% или ниже, более предпочтительно 60% или ниже, особенно предпочтительно 50% или ниже (например, 45% или ниже) контрольного уровня сахара в крови. Когда уровень сахара в крови, измеренного в течение 300 минут после введения, сравнивают с результатами, полученными при введении GLP-1, пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения проявляет эффект, равный предпочтительно 70% или ниже, более предпочтительно 50% или ниже контрольного уровня сахара в крови. Когда уровень сахара в крови, измеренного в течение 300 минут после введения, сравнивают с результатами, полученными во время введения, пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения проявляет эффект, равный предпочтительно 70% или ниже, более предпочтительно 50% или ниже контрольного уровня сахара в крови.

Даже если эффективность регулирования уровня сахара в крови, обусловленная пептидом GLP-1, модифицированном олигосахаридной цепью настоящего изобретения, является более низкой по сравнению с GLP-1, эта низкая активность может быть компенсирована повышенной стабильностью в крови.

Из активностей, проявляемых GLP-1, например, активность секреции инсулина может быть измерена с помощью теста in vitro, проявляющегося в способности к синтезу сАМР. GLP-1 увеличивает внутриклеточную концентрацию сАМР за счет связывания с его рецептором и промотирования секреции инсулина. Таким образом, например, мышиный рецептор GLP-1, экспрессирующий клетки СНО-K1, стимулируют пептидом GLP-1, модифицированным олигосахаридной цепью, и затем измеряют количество сАМР, синтезированного в клетках. Его значение ЕС50 можно сравнить с полученным в присутствии GLP-1, чтобы таким образом измерить активность пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью в отношении секреции инсулина.

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения обладает более высокой стабильностью в кровотоке, чем GLP-1. Стабильность в кровотоке может быть измерена с помощью подхода, известного специалистам в данной области, и может быть определена измерением, например, стабильности в плазме или устойчивости по отношению к DPP-IV (дипептидилпептидазе IV) и с помощью полупериода, AUC (площади под кривой зависимости концентрации крови от времени), и т.д. в качестве показателя. Повышенный почечный клиренс также вносит вклад в увеличение стабильности в кровотоке.

Стабильность в плазме может быть определена, например, с помощью подхода, описанного в следующем тестовом примере 1. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения обладает более высокой стабильностью в плазме, чем GLP-1.

Устойчивость по отношению к DPP-IV может быть определена измерением полупериода в растворе DPP-IV, как показано, например, в следующем тестовом примере 1. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения обладает более высокой устойчивостью к DPP-IV, чем GLP-1, и имеет полупериод, который по меньшей мере в 1,2 раза (например, по меньшей мере в 2 раза), предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, особенно предпочтительно по меньшей мере в 20 раз выше, чем GLP-1 (например, по меньшей мере в 100 раз), когда устойчивость к DPP-IV измеряют с помощью, например, подхода, описанного в следующем тестовом примере 1.

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения также имеет полупериод в кровотоке, равный предпочтительно по меньшей мере 1 час, более предпочтительно по меньшей мере 3, 5, 7, 10, 15 и 20 часов, даже более предпочтительно по меньшей мере 24 часов.

Далее будет описана фармацевтическая композиция, содержащая пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью настоящего изобретения в качестве активного ингредиента.

Фармацевтическая композиция, содержащая пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, эффективна для лечении или предотвращения заболеваний, связанных с GLP-1. Известно, что GLP-1 оказывает различное действие, как описано выше, и эти эффекты связаны с различными заболеваниями. Было показано, что, например, GLP-1 стимулирует выделение инсулина и поэтому приводит к клеточному захвату глюкозы и снижению уровня сахара в крови. Было также показано, что GLP-1 подавляет перистальтику желудка и/или перистальтику кишечника, опорожнение желудка и/или опорожнение кишечника и прием пищи. Таким образом, заболевания, связанные с GLP-1, включают в себя, например, неинсулинозависимый сахарный диабет (NIDDM), инсулинозависимый сахарный диабет, инсульт (см. WO 00/16797 по Efendic), инфаркт миокарда (см. WO 98/08531 по Efendic), ожирение (см. WO 98/19698 по Efendic), функциональную диспепсию, синдром раздраженной толстой кишки (см. WO 99/64060 по Efendic) и трансплантацию островковых клеток поджелудочной железы. Фармацевтическая композиция, содержащая пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, особенно эффективна для лечения или предотвращения диабета, более конкретно для предотвращения диабета 1-го типа и лечения диабета 2-го типа.

Фармацевтическая композиция может быть разработана в виде обычной фармацевтической композиции с помощью разбавителей или инертных наполнителей, например наполнителей, расширителей, связующих, увлажняющих агентов, разрыхлителей, поверхностно-активных веществ и обычно используемых смазочных материалов.

Примеры такой фармацевтической композиции включают в себя таблетки, пилюли, порошки, жидкие рецептуры, суспензии, эмульсии, гранулы, капсулы, медицинские свечи и инъекции.

Количество пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, настоящего изобретения, содержащихся в фармацевтической композиции, не особенно ограничено и может быть выбрано соответствующим образом в широком диапазоне. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения обычно содержится в фармацевтической композиции в количестве, равном предпочтительно от 1 до 70 масс.%.

Фармацевтическая композиция, содержащая пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, может дополнительно содержать дополнительный активный ингредиент или может также быть использован в комбинации с фармацевтической композицией, содержащей дополнительный активный ингредиент. Более того, фармацевтическая композиция, содержащая пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, может дополнительно содержать по меньшей мере один отличающийся пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью настоящего изобретения в качестве активного ингредиента или может быть также использован в комбинации с фармацевтической композицией, содержащей по меньшей мере один отличающийся пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью настоящего изобретения в качестве активного ингредиента.

Способ введения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению не является особенно ограниченным. Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят способом, подходящим для различных лекарственных форм, возраста и пола пациента, тяжести заболевания и других условий. Примеры способов введения таблеток, пилюль, жидких рецептур, суспензий, эмульсий, гранул и капсул включают в себя пероральное введение. Инъекции могут быть введены внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, подкожно или внутрибрюшинно либо в виде одного компонента, либо в виде смеси с обычной глюкозой или вливанием аминокислот. Медицинские свечи вводят ректально.

Доза фармацевтической композиции может быть выбрана соответствующим образом согласно использованию, возрасту и полу пациента, тяжести заболевания и другим условиям. Фармацевтическую композицию обычно вводят в дозе от 0,1 до 900 нмоль, предпочтительно от 1 до 90 нмоль, в пересчете на пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения, отнесенный к кг массы тела. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет более высокую стабильность в кровотоке, чем GLP-1. В одном из аспектов пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения имеет более высокую эффективность регулирования уровня сахара в крови, чем GLP-1. Поэтому его доза может быть предпочтительно уменьшена.

Число доз фармацевтической композиции может быть выбрано соответствующим образом согласно использованию, возрасту и полу пациента, тяжести заболевания и другим условиям и равно, например, 3 дозам/день, 2 дозам/день или 1 дозе/день. Альтернативно, фармацевтическая композиция может быть введена с меньшей частотой (например, 1 доза/неделя или 1 доза/месяц) в зависимости от ее стабильности в кровотоке. Число доз фармацевтической композиции равно предпочтительно 1 дозе или менее /день. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения имеет более высокую стабильность в кровотоке, чем GLP-1. Поэтому его доза может быть предпочтительно уменьшена.

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения легко деградирует в метаболической системе in vivo. В одном из аспектов настоящего изобретения олигосахаридная цепь имеет структуру, которая связана в форме гликопептида (или гликопротеина) in vivo. Поэтому пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения и фармацевтическая композиция, содержащая этот пептид в качестве активного ингредиента, не вызывает ни побочных эффектов, ни антигенности, даже при их введении в живой организм. Поэтому они предпочтительно не приводят ни к аллергическим реакциям, ни к потере эффективности, связанной с выработкой антител.

Более того, пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, настоящего изобретения может быть стабильно и удобно доставлен в больших количествах и также быть очень полезным с точки зрения обеспечения высококачественного лекарственного соединения, обладающего высокой стабильностью.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения или предотвращения заболеваний, связанных с GLP-1, состоящий во введении эффективных количеств пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью настоящего изобретения.

Термины, используемые в данном документе, используют для описания конкретных вариантов осуществления и не предполагают ограничения настоящего изобретения.

Термин "содержит" или "содержащий", используемый в данном документе, означает существование установленного пункта (члена, стадии, фактора, числа и т.д.) и не исключает существования любых других пунктов (члена, стадии, фактора, числа и т.д.), если в контексте отсутствует другая интерпретация.

Все термины (в том числе технические термины и научные термины), используемые в данном документе, имеют те же самые значения, что и те, которые широко используются специалистами в данной области настоящего изобретения, если не оговорено иное. Термины, используемые в данном документе, следует интерпретировать как имеющие значение, которое согласуется с их значениями в контексте описания патента и относится к данной области и их не следует интерпретировать в идеализированном или чрезмерно формальном смысле, если не оговорены их другие определения.

Варианты осуществления настоящего изобретения могут быть описаны со ссылкой на схематические диаграммы. Такие схематические диаграммы могут быть утрированы для иллюстративности. Такие термины, как "во-первых" и "во-вторых" используют для выражения различных факторов. Следует понимать, что такие факторы не следует ограничивать этими терминами. Такие термины используют только для того, чтобы провести различие между одним фактором и другим. Например, первый фактор может быть описан как второй и наоборот, не выходя за рамки настоящего изобретения.

В дальнейшем настоящее изобретение будет описано более детально со ссылкой на примеры. Однако настоящее изобретение может быть реализовано в различных аспектах и не должно быть ограничено примерами, описанными ниже.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В дальнейшем настоящее изобретение будет описано особенно со ссылкой на примеры. Однако настоящее изобретение ни в коем случае не должно быть ограничено ими.

Пример 1

Синтез конъюгата пептида GLP-1 с 26Cys, 34Cys-дисиалоолигосахаридной цепью

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт Merck), тщательно промывают дихлорметаном (ДХМ) и ДМФ и дают смоле полностью набухнуть в ДМФ. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в ДМФ (2 мл), помещают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают ДМФ и ДХМ и получают смолу HMPB-PEGA, которую используют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3 часов.

После перемешивания смолу промывают ДХМ и ДМФ. Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. После промывания ДМФ аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанным ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту, содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). Добавляют 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем в колонку для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно с использованием аминокислоты, защищенной Fmoc группой (0,5 ммоль) для дальнейшей конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc группой, для получения 31-членного пептида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Boc (последовательность №69).

Полученную смолу, содержащую пептид, образующийся на нем, частично используют в колонке для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2.5:2.5) добавляют так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Образующийся осадок очищают ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] для получения пептида, в котором каждый из 26Lys и 34Lys в GLP-1 замещен Cys.

Следующий бромацетамидилдисиалоолигосахарид (а) (продукт OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (10,5 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (2,1 мг), растворяют в 100 мМ фосфатного буфера (рН 7,5, 210 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 4 часов.

Формула 15

После того как с использованием ВЭЖХ будет показано полное расходование реагентов, реакционный раствор непосредственно тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 0,1 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором каждый из 26Lys и 34Lys в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью (26,34Cys GLP-1-дисиало).

Пример 2

Синтез конъюгата GLP-1 с 18 и 36Cys-дисиалоолигосахаридной цепью

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт Merck), тщательно промывают дихлорметаном (ДХМ) и ДМФ и дают смоле полностью набухнуть в ДМФ. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в ДМФ (2 мл), помещают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают ДМФ и ДХМ и получают смолу HMPB-PEGA, которую используют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Glu (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в ДХМ (2 мл), помещают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3 часов.

После перемешивания смолу промывают ДХМ и ДМФ, Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. После промывания ДМФ, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанным ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту, содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). Добавляют 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), образующуюся смесь помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем в колонку для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно с помощью аминокислоты, защищенной Fmoc-группой у (0,5 ммоль) для дальнейшей конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой для получения 31-членного пептида Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID №:70) на твердофазной смоле.

Полученную смолу, содержащую пептид, образующийся на нем, частично используют в колонке для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2.5:2.5) добавляют так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Образующийся осадок очищают ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА710% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] для получения пептида, в котором каждый из 18LSer и 36Arg в GLP-1 замещен Cys.

Бромацетамидилдисиалоолигосахарид (а) (продукт OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (10,5 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (2,1 мг) растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 210 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 4 часов. После того как с помощью ВЭЖХ будет показано полное расходование реагентов, реакционный раствор тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 0,8 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором каждый из 18LSer и 36Arg в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью (18,36Cys GLP-1-дисиало).

Пример 3

Синтез конъюгата GLP-1 с 22 и 30Cys-дисиалоолигосахаридной цепью

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт Merck), тщательно промывают дихлорметаном (ДХМ) и ДМФ и дают смоле полностью набухнуть в ДМФ. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в ДМФ (2 мл), помещают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают ДМФ и ДХМ и получают смолу HMPB-PEGA, которую используют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Glu (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в ДХМ (2 мл), помещают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3 часов.

После перемешивания смолу промывают ДХМ и ДМФ. Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. После промывания ДМФ аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанным ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту, содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). Добавляют 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем в колонку для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно с использованием аминокислоты, защищенной Fmoc-группой (0,5 ммоль) для дальнейшей конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(Trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой для получения 31-членного пептида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:71) на твердофазной смоле.

Полученную смолу, содержащую пептид, образующийся на ней, частично используют в колонке для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2.5:2.5) добавляют так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный осадок очищают ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] для получения пептида, в котором каждый из 22Gly и 30Ala в GLP-1 замещен Cys.

Бромацетамидилдисиалоолигосахарид (а) (продукт OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (7,9 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (1,3 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,4, 200 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 4 часов. После того как с помощью ВЭЖХ будет показано полное расходование реагентов, реакционный раствор тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С 18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 1,0 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором каждый из 22Gly и 30Ala в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью (22, 30Cys GLP-1-дисиало).

Пример 4

Синтез конъюгата GLP-1 с 22 и 36Cys-дисиалоолигосахаридной цепью

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт Merck), тщательно промывают дихлорметаном (ДХМ) и ДМФ и дают смоле полностью набухнуть в ДМФ. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в ДМФ (2 мл), помещают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают ДМФ и ДХМ и получают смолу HMPB-PEGA, которую используют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Glu (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в ДХМ (2 мл), помещают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3 часов.

После перемешивания смолу промывают ДХМ и ДМФ. Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. После промывания ДМФ, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанным ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту, содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). Добавляют 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), образующуюся смесь помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем в колонку для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно с использованием аминокислоты, защищенной Fmoc-группой (0,5 ммоль) для дальнейшей конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой для получения 31-членного пептида Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Cys(Trt) (SEQ ID NO:72) на твердофазной смоле.

Полученную смолу, содержащую пептид, образующийся на ней, частично используют в колонке для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2.5:2.5) добавляют так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Образующийся осадок очищают ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] для получения пептида, в котором каждый из 22Gly и 36Arg в GLP-1 замещен Cys.

Бромацетамидилдисиалоолигосахарид (а) (продукт OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (11,9 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (2,0 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,4, 400 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 1 часа. После того как с помощью ВЭЖХ будет показано полное расходование реагентов, реакционный раствор тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С 18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 2,9 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором каждый из 22Gly и 36Arg в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью (22, 36Cys GLP-1-дисиало).

Пример 5

Синтез конъюгата GLP-1 с 30, 36Cys-дисиалоолигосахаридной цепью

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт Merck), тщательно промывают дихлорметаном (ДХМ) и ДМФ и дают смоле полностью набухнуть в ДМФ. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в ДМФ (2 мл), помещают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают ДМФ и ДХМ и получают смолу HMPB-PEGA, которую используют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Glu (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в ДХМ (2 мл), помещают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3 часов.

После перемешивания смолу промывают ДХМ и ДМФ. Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. После промывания ДМФ аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанным ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту, содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). Добавляют 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), образующуюся смесь помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем в колонку для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно с использованием аминокислоты, защищенной Fmoc-группой (0,5 ммоль) для дальнейшей конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой для получения 31-членного пептида Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:73) на твердофазной смоле.

Полученную смолу, содержащую пептид, образующийся на ней, частично используют в колонке для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2.5:2.5) добавляют так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Образующийся осадок очищают ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] для получения пептида, в котором каждый из 30Ala и 36Arg в GLP-1 замещен Cys.

Бромацетамидилдисиалоолигосахарид (а) (продукт OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (11,4 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (2,1 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,4, 400 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 1 часа. После того как с помощью ВЭЖХ будет показано полное расходование реагентов, реакционный раствор тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 1,6 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором каждый из 30Ala и 36Arg в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью (30, 36Cys GLP-1-дисиало).

Пример 6

Синтез конъюгата пептида GLP-1 с тетрасахаридом 30Cys-гиалуроновой кислоты (НА-4)

Тетрасахарид 30Cys-гиалуроновой кислоты (ниже в примерах на олигогиалуроновую кислоту также ссылаются как на "гиалуроновую кислоту"), полученную в синтетическом примере 1 (12,7 мг) растворяют в 25,4 мкл воды и 483 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Добавляют 200 мг бикарбоната аммония и инкубируют при 37°С в течение 30 часов и затем лиофильно высушивают. К полученному лиофильно высушенному продукту добавляют 22,4 мг гидрокарбоната натрия, 300 мкл воды и 34,9 мг бромуксусного ангидрида (продукт Sigma-Aldrich Corp.), заранее растворенного в 17 мкл N,N-диметилформамида (ДМФ) и инкубируют в течение 1 часа при охлаждении во льду, а затем еще один час при комнатной температуре. Реакционный раствор подвергают очистке гель-фильтрацией и получают 11,5 мг тетрасахарида бромацетамидилгиалуроновой кислоты следующей формулы (I):

Формула 16

Полученный тетрасахарид бромацетамидилгиалуроновой кислоты (I) (2,4 мг) и пептидную цепь, в которой 30Ala в GLP-1 замещен Cys (SEQ ID №76) (1,3 мг), полученную в синтетическом примере 2, растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 130 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 1,5 часа. После того как с помощью ВЭЖХ будет показано полное расходование реагентов, реакционный раствор тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 1,0 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором 30Ala в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с тетрасахаридом гиалуроновой кислоты (30Cys GLP-1-НА-4).

Пример 7

Синтез конъюгата пептида GLP-1 с октасахаридом 30Cys-гиалуроновой кислоты (НА-8)

Октасахарид гиалуроновой кислоты, полученный в синтетическом примере 1 (8,7 мг) растворяют в 17,4 мкл воды и 314 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Добавляют 100 мг бикарбоната аммония и инкубируют при 37°С в течение 45 часов и затем лиофильно высушивают. К полученному лиофильно высушенному продукту добавляют 7,6 мг гидрокарбоната натрия, 180 мкл воды и 13,8 мг, бромуксусного ангидрида (продукт Sigma-Aldrich Corp.), заранее растворенного в 7 мкл N,N-диметилформамида (ДМФ) и инкубируют в течение 1 часа при охлаждении во льду, а затем еще один час при комнатной температуре. Реакционный раствор подвергают очистке гель-фильтрацией и получают 7,3 мг октасахарида бромацетамидилгиалуроновой кислоты следующей формулы (II):

Формула 17

Полученный октасахарид бромацетамидилгиалуроновой кислоты (2,9 мг) и пептидную цепь, в которой 30Ala в GLP-1 замещен Cys (SEQ ID №76) (1,5 мг) полученную в синтетическом примере 2, растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 150 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 1,5 часа. После того как с помощью ВЭЖХ будет показано полное расходование реагентов, реакционный раствор тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 0,5 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором 30Ala в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с октасахаридом гиалуроновой кислоты (30Cys GLP-1-HA-8).

Пример 8

Синтез конъюгата пептида GLP-1 с тетрасахаридом 36Cys-гиалуроновой кислоты (НА-4)

Тетрасахарид гиалуроновой кислоты, полученный в синтетическом примере 1 (12,7 мг) растворяют в 25,4 мкл воды и 483 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Добавляют 200 мг бикарбоната аммония и инкубируют при 37°С в течение 30 часов и затем лиофильно высушивают. К полученному лиофильно высушенному продукту добавляют 22,4 мг гидрокарбоната натрия, 300 мкл воды и 34,9 мг бромуксусного ангидрида (продукт Sigma-Aldrich Corp.),заранее растворенного в 17 мкл N,N-диметилформамида (ДМФ), и инкубируют в течение 1 часа при охлаждении во льду, а затем еще один час при комнатной температуре. Реакционный раствор подвергают очистке гель-фильтрацией и получают 11,5 мг тетрасахарида бромацетамидилгиалуроновой кислоты (I).

Полученный тетрасахарид бромацетамидилгиалуроновой кислоты (I) (1,1 мг) и пептид GLP-1, в котором 36Arg в GLP-1 замещен Cys (SEQ ID №78) (1,5 мг), полученный в синтетическом примере 3, растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 130 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 1,5 часа. После того как с помощью ВЭЖХ будет показано полное расходование реагентов, реакционный раствор тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 0,9 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором 36Arg в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с тетрасахаридом гиалуроновой кислоты (36Cys GLP-1-НА-4).

Пример 9

Синтез конъюгата пептида GLP-1 с октасахаридом 36Cys-гиалуроновой кислоты (НА-8)

Октасахарид гиалуроновой кислоты (8,7 мг), полученный в синтетическом примере 1, растворяют в 17,4 мкл воды и 314 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Добавляют 100 мг бикарбоната аммония и инкубируют при 37°С в течение 45 часов и затем лиофильно высушивают. К полученному лиофильно высушенному продукту добавляют 7,6 мг гидрокарбоната натрия, 180 мкл воды и 13,8 мг бромуксусного ангидрида (продукт Sigma-Aldrich Corp.), заранее растворенного в 7 мкл N,N-диметилформамида (ДМФ) и инкубируют в течение 1 часа при охлаждении во льду, а затем еще один час при комнатной температуре. Реакционный раствор подвергают очистке гель-фильтрацией и получают 7,3 мг октасахарида бромацетамидилгиалуроновой кислоты (II).

Полученный октасахарид бромацетамидилгиалуроновой кислоты (2,4 мг) и пептид GLP-1, в котором 36Arg в GLP-1 замещен Cys (SEQ ID №78) (1,5 мг), полученный в синтетическом примере 3, растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 130 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 2 часов. После того как с помощью ВЭЖХ будет показано полное расходование реагентов, реакционный раствор тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С 18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 0,5 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором 36Arg в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с октасахаридом гиалуроновой кислоты (36Cys GLP-1-НА-8).

Пример 10

Синтез конъюгата пептида GLP-1 с гексадекасахаридом 30Cys-гиалуроновой кислоты (НА-16)

Гексадекасахарид гиалуроновой кислоты (11,6 мг), полученный в синтетическом примере 1, растворяют в 35 мкл воды и 680 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Добавляют 260 мг бикарбоната аммония и инкубируют при 37°С в течение 75 часов и затем лиофильно высушивают. К полученному лиофильно высушенному продукту добавляют 5,5 мг гидрокарбоната натрия, 230 мкл воды и 10,2 мг бромуксусного ангидрида (продукт Sigma-Aldrich Corp.), заранее растворенного в 5,1 мкл N,N-диметилформамида (ДМФ) и инкубируют в течение 1 часа при охлаждении во льду, а затем еще один час при комнатной температуре. Реакционный раствор подвергают очистке гель-фильтрацией и получают 8,7 мг следующего гексадекасахарида бромацетамидилгиалуроновой кислоты (III):

Формула 18

Гексадекасахарид бромацетамидилгиалуроновой кислоты (III) (3,1 мг) и пептидную цепь, полученную в синтетическом примере 2 (SEQ ID NO:76), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 190 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 1,5 часа. После присоединения 10 мМ водного раствора трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорида (10 мкл) смеси инкубируют при 37°С в течение 8 часов. Поскольку с помощью ВЭЖХ показано, что больше не наблюдается уменьшения сырья, реакционный раствор тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 0,4 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором 30Ala в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с гексадекасахаридом гиалуроновой кислоты (30Cys GLP-1-НА-16).

Пример 11

Синтез конъюгата пептида GLP-1 с гексадекасахаридом 36Cys-гиалуроновой кислоты

Гексадекасахарид бромацетамидилгиалуроновой кислоты (III), полученный в примере 10 (4,9 мг) и 36 Cys пептид GLP-1, синтезированный в синтетическом примере 3 (SEQ ID №:78) (1,2 мг), растворяют в 100 мкл фосфатного буфера (рН 7,5, 190 мкл). Добавляют 10 мМ водного раствора трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорида (36 мкл) смеси и инкубируют при 37°С в течение 4 часов. После того как полное расходование реагентов подтверждено ВЭЖХ, реакционный раствор тотчас же подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ/вода, раствор В: 0,09% ТФА/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 0,3 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором 36Arg в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с гексадекасахаридом гиалуроновой кислоты (36Cys GLP-1-НА-16).

Пример 12

Синтез конъюгата пептида GLP-1 с 36Cys-олигосахаридной цепью на основе высшей маннозы (MS)

Порошок соевых бобов (100 г) дважды промывают 500 мл ацетона и дважды 500 мл метанола и получают 61,4 г порошка обезжиренных соевых бобов.

К полученному порошку обезжиренных соевых бобов (43,0 г) добавляют 430 мл воды и 4,3 г разжижающего фермента Т (продукт HBI Enzymes Inc.) и инкубируют при 70°С в течение 19 часов при перемешивании. Реакционный раствор осаждают центрифугированием (10000 g, 10 мин) и получают 800 мл супернатанта. К осадку дополнительно добавляют 430 мл воды и 4,3 г разжижающего фермента Т и вновь инкубируют при 70°С в течение 19 часов. Реакционный раствор осаждают центрифугированием (10000 g, 10 мин) и получают 600 мл супернатанта. Полученные супернатанты объединяют (общий объем 1400 мл). Добавляют 100 мл 500 мМ фосфатного буфера (рН 7,0) и 3,0 г ориентазы ONS (продукт HBI Enzymes Inc.) и инкубируют при 50°С в течение 19 часов при перемешивании. Реакционный раствор фильтруют для удаления нерастворимого вещества, и фильтрат концентрируют до объема, равного 400 мл с помощью роторного испарителя. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации через ультрафильтрационную мембрану, отсекающую молекулярную массу, равную 1 кДа (Minimate TFF Capsule 1K membrane, продукт PALL Corp.).

После обработки в течение 6 часов отбирают 230 мл раствора, не прошедшего через мембрану. К отобранному раствору добавляют 20 мл 1 М трис-HCl буфера (рН 8,0), 250 мг азида натрия и 423,5 мг актиназы Е (продукт KAKEN PHARMACEUTICAL CO., LTD.) и инкубируют при 37°С в течение 82 часов. Реакционный раствор фильтруют для удаления нерастворимого вещества, и затем фильтрат концентрируют до объема, равного 100 мл с помощью роторного испарителя. Концентрат делят на две части, каждую из которых фракционируют с помощью колонки Сефадекса-G25 (ϕ 25 мм × 100 мм). Собирают только фракцию, содержащую олигосахаридные цепи, концентрируют и получают 2,22 г.

Полученную фракцию, содержащую олигосахаридные цепи, растворяют в 21,0 мл дистиллированной воды и 14,9 мл этанола. Добавляют 1,13 г гидрокарбоната натрия и 2,02 г Fmoc-OSu и инкубируют при комнатной температуре в течение 16 часов. После завершения реакции к ней добавляют 250 мл ацетона, и фильтруют через мембранный фильтр (ϕ 47 мм, размер пор: 0,5 мкм; продукт Advantec Toyo Kaisha, Ltd.). Нерастворимое вещество, оставшееся на мембране, растворяют в дистиллированной воде и концентрируют до объема, равного 10 мл или меньшего, с помощью роторного испарителя. Концентрат фракционируют с помощью колонки Сефадекса-G25 (ϕ 25 мм × 100 мм). Собирают фракцию, содержащую олигосахаридные цепи, концентрируют и получают 1,37 г.

Затем эту фракцию растворяют в 4 мл дистиллированной воды и фракционируют с помощью колонки ODS (Wakogel 100C18, ϕ 25 мм × 150 мм). Собирают только фракцию, содержащую олигосахаридные цепи, концентрируют и получают 48,6 мг полуочищенных олигосахаридных цепей. Полуочищенные олигосахаридные цепи очищают на колонке ВЭЖХ [YMC-Pack ODS-AM ϕ 20×250 мм, элюент: ацетонитрил/буфер 25 мМ ацетата аммония = 82/18, скорость потока: 8,0 мл/мин] и получают 13,0 мг олигосахаридных цепей на основе высшей маннозы, Man5GlcNAc₂ (олигосахаридные цепи М5).

Полученные олигосахаридные цепи М5 (11,0 мг) растворяют в 165 мкл воды. Добавляют 200 мг бикарбоната аммония и инкубируют при комнатной температуре в течение 41 часа и затем лиофильно высушивают. К полученному лиофильновысушенному продукту добавляют 12,5 мг гидрокарбоната натрия, 110 мкл воды и 19,9 мг бромуксусного ангидрида (продукт Sigma-Aldrich Corp.), предварительно растворенного в 10 мкл N,N-диметилформамида (ДМФ), инкубируют в течение 1 часа при охлаждении во льду, а затем еще один час при комнатной температуре. Реакционный раствор подвергают очистке гель-фильтрацией и получают 7,9 мг следующей бромацетамидилолигосахаридной цепи М5 (b):

Формула 19

Полученные бромацетамидилолигосахаридные цепи М5 (b) (4,1 мг) и пептид GLP-1, в котором 36Arg замещен Cys (SEQ ID №:78) (1,2 мг), синтезированный в синтетическом примере 3, растворяют в 100 мМ фосфатного буфера (рН 7,5, 190 мкл). Добавляют 100 мМ водного раствора трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорида (24 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 10 часов. После завершения реакции реакционный раствор подвергают очистке ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ вода, раствор В: 0,09% ТФУ/10% воды/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 0,3 мг пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в котором 36Arg в GLP-1 замещен конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью на основе высшей маннозы М5 (36Cys GLP-1-М5).

Пример 13

Синтез конъюгата пептида Arg34GLP-1(7-37) с модифицированной линкером Asn 26Lys-асиалоолигосахаридной цепью

(1) Синтез связанной с линкером Asn 26Lys-асиалоолигосахаридной цепи, модифицированной глутаровой кислотой

В конической колбе на 10 мл растворяют связанную с аспарагином асиалоолигосахаридную цепь (50,6 мг, 28,7 мкмоль) в смеси ДМСО-вода (4:1, об./об., 1,5 мл). К этому раствору добавляют раствор ДМСО (100 мкл, 51,7 мкмоль), содержащий 0,52 М смеси глутаровая кислота - EDC (1:1, моль/моль) и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 дня. Реакционную смесь разбавляют дистиллированной водой (1,5 мл), а затем повторно фракционируют три раза гель-хроматографией (Сефадекс G-25, ϕ 1.5×45 см, дистиллированная вода). После лиофильного высушивания получают следующую связанную с аспарагином асиалоолигосахаридную цепь, модифицированную глутаровой кислотой (с) (51,4 мг) (MALDI TOF Mass, вычисленная для [M+Na]+ равна 1891.66, определенная равна 1891.78):

Формула 20

(2) Синтез связанной с аспарагином асиалоолигосахаридной цепи, модифицированной N-гидроксисукцинимидиловым эфиром глутаровой кислоты

В пробирку Эппендорф на 1,5 мл добавляют 25 мкл, 0,44 М N-гидроксисукцинимида (11,1 мкмоль) в ДМСО 75 мкл, 0,37 М EDC (27,6 мкмоль) в ДМСО и 200 мкл связанной с аспарагином асиалоолигосахаридной цепи, модифицированной глутаровой кислотой (с) (17,2 мг, 9,2 мкмоль), в DMSO. После перемешивания при комнатной температуре в течение 6 часов EDC инактивируют присоединением DTT (5,7 мг, 36,8 мкмоль) (Grabarek, Z., Gergely, J. Anal. Biochem. 1990, 185, 131-135). Полученный раствор, содержащий конъюгат аспарагина с производным N-гидроксисукцинимидилового эфира глутаровой кислоты и асиалоолигосахаридной цепью (d) непосредственно используют в пептидной конденсации в качестве углеводного линкерного реагента (0,03 М раствор):

Формула 21

(3) Синтез конъюгата Arg34GLP-1(7-37) с модифицированной линкером Asn 26Lys-асиалоолигосахаридной цепью

В пробирку Эппендорф на 1,5 мл добавляют 4,8 мкл DIPEA (27,6 мкмоль) и 150 мкл 0,03 М углеводного линкерного реагента (4,5 мкмоль), получение которого описано выше, и 300 мкл Lys²⁶Arg³⁴GLP-1(7-37), синтезированного в синтетическом примере 4 (SEQ ID №:80) (2,8 мг, 0,83 мкмоль) в ДМСО. После перемешивания при комнатной температуре в течение 2 часов реакцию прекращали добавлением 200 мкл водного раствора глицина (2 мг, 26,6 мкмоль). Фракции, соответствующие пикам при времени удерживания, равном 15,5 мин, сразу же собирают при разделении ВЭЖХ [колонка: Zorbax 300SB-CN, ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1%ТФУ вода, раствор В: 0,09% ТФУ/10% вода /90% AN 1,0 мл/мин; 10→40%В (0-8 мин) 40→50%В (8-20 мин) линейный градиент]. После лиофильного высушивания получают конъюгат пептида Arg34GLP-1(7-37) с модифицированным линкером Asn 26Lys-асиалоолигосахаридной цепью (0,7 мг) (MALDI TOF Mass, рассчитанная для [М (средней)+H]⁺ равна 5236.35, определенная равна 5236.1):

Формула 22

Пример 14

Синтез конъюгата экспендина-4 с 30-Cys-дисиалоолигосахаридной цепью

39-членный пептид, в котором 30Gly в Ех-4 замещен Cys (12,0 мг), синтезированный в синтетическом примере 5, и бромацетамидилдисиалоолигосахаридом (а) (продукт OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (36 мг), инкубируют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,4) и 5 мМ трис(карбоксиэтил)фосфине (1 мл) при 37°С в течение 1 часа. Реакционный раствор тотчас подвергают очистке ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С 18,5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ вода, раствор В: 0,09% ТФУ/10% вода/90% AN 8 мл/мин; 35→50% В, 20 мин линейный градиент] и получают 10,6 мг конъюгата Ех-4 с олигосахаридной цепью, где 30Gly в Ех-4 замещен конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (30Cys Ех-4-дисиало) (M:C271H422N58O123S MALDI TOP MASS, рассчитанная для [М (средней)+Н]⁺ равна 6493,63, определенная равна 6494.33).

Пример 15

Синтез конъюгата BIM51077 с 26-Cys-дисиалоолигосахаридной цепью

30-членный пептид, в котором 26Lys в BIM51077, замещенный Cys (2,4 мг, 0,72 мкмоль), синтезированный в синтетическом примере 6, и гуанидин (216 мг) растворяют в дистиллированной воде (240 мкл) и к полученному раствору в следующем порядке добавляют: водный раствор ТСЕР (100 мМ, 100 мкл), бромацетамидилдисиалоолигосахарид (а) (10 мг/мл, 100 мкл, 4,2 мкмоль) и инкубируют в 500 мМ фосфатном буфере (рН 7,4, 100 мкл). Смесь инкубируют при 37°С в течение 2 часов. Реакционный раствор тотчас же подвергают очистке ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4.6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ вода, раствор В: 0,09% ТФУ/10% воды/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 1,9 мг конъюгата пептида BIM51077 с олигосахаридной цепью, в котором 26Lys в BIM51077 замещен конъюгатом Cys (26Cys в BIM51077-дисиало) с дисиалоолигосахаридной цепью (MALDI TOF Mass, рассчитанная для [М (средней)+Н]⁺, равна 5578,72, определенная равна 5578,74).

Пример 16

Синтез конъюгата эксендина-4 с 30Cys-M5 олигосахаридной цепью

39-членный пептид, в котором 30Glu в Ех-4, замещенный Cys (1,2 мг), синтезированный в синтетическом примере 5, и бромацетамидил М5 олигосахаридная цепь (b), синтезированная в примере 12 (3,9 мг), инкубируют в 35 мМ фосфатном буфере (рН 7,4) и 1 мМ трис(карбоксиэтил)фосфин (0,17 мл) при 37°С в течение 3 часов. Реакционный раствор тотчас же подвергают очистке ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4.6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ вода, раствор В: 0,09% ТФУ/10% воды/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин линейный градиент] и получают 0,5 мг конъюгата пептида Ех-4 с олигосахаридной цепью, в котором 30Glu в Ех-4 замещен конъюгатом Cys (30Cys в Ех-4-MS) с дисиалоолигосахаридной цепью на основе маннозы высшего типа М5 (MALDI TOF Mass, рассчитанная для [М (средней)+Н]⁺, равна 5504,74, определенная равна 5506,85).

В таблице 5, приведенной ниже, представлены MS спектральные данные (MALDI-TOF mass) пептидов GLP-1, модифицированных олигосахаридной цепью, полученные в следующих примерах 1-16.

Таблица 5 Пример 1 26,34Cys GLP-1-дисиало рассчитанная для C₃₁₇H₄₉₂N₅₂O₁₇₁S₂ [M+H]⁺ 7828,1 определенная 7828,8 Пример 2 18,36CysGLP-1-дисиало рассчитанная для C₃₂₀H₄₄₉N₅₁O₁₇₀S₂ [М+Н]⁺ 7841,1 определенная 7845,3 Пример 3 22,30Cys GLP-1-дисиало рассчитанная для C₃₂₄H₅₀₈N₅₄O₁₇₁S₂ [M+H]⁺ 7960,9 определенная 7960,6 Пример 4 22,36Cys GLP-1-дисиало рассчитанная для C₃₂₁H₅₀₁N₅₁O₁₇₁S₂ [M+H]⁺ 7875,8 определенная 7876,6 Пример 5 30,36Cys GLP-1-дисиало рассчитанная для C₃₂₀H₄₉₉N₅₁O₁₇₁S₂ [M+H]⁺ 7861,8 определенная 7860,4 Пример 6 30Cys GLP-1-HA-4 рассчитанная для C₁₈₁H₂₇₄N₄₃O₇₀S [M+H]⁺ 4201,9 определенная 4203,5 Пример 7 30Cys GLP-1-HA-8 рассчитанная для C₂₀₉H₃₁₆N₄₅O₉₂S [M+H]⁺ 4960,1 определенная 4961,9 Пример 8 36Cys GLP-1-HA-4 рассчитанная для C₁₇₈H₂₆₇N₄₀O₇₀S [M+H]⁺ 4116,8 определенная 4118,3 Пример 9 36Cys GLP-1-HA-8 рассчитанная для C₂₀₆H₃₀₉N₄₂O₉₂S [M+H]⁺ 4875,1 определенная 4876,9 Пример 10 30Cys GTP-1-HA-16 рассчитанная для C₂₆₅H₃₉₉N₄₉O₁₃₆S [M+H]⁺ 6476,6 определенная 6477,8 Пример 11 36Cys GLP-1-HA-16 рассчитанная для C₂₆₂H₃₉₂N₄₆O₁₃₆S [М+Н]⁺ 6391,5 определенная 6394,1 Пример 12 36Gys GLP-1-M5 рассчитанная для C₁₉₆H₃₀₀N₄₀O₈₃S [M+H]⁺ 4575,0 определенная 4576,2 Пример 13 26Lys асиало-Asn-линкер рассчитанная для C₂₂₂H₃₄₂N₄₈O₉₇ [M+H]⁺ 5236,35 определенная 5236,1 Пример 14 30Cys Ех-4-дисиало рассчитанная для C₂₇₁H₄₂₂N₅₈O₁₂₃S [M+H]⁺ 6493,63 определенная 6494,33 Пример 15 26Cys-BIM51077-дисиало рассчитанная для C₂₈₅H₃₆₄N₄₈O₁₀₇S [M+H]⁺ 5578,72 определенная 5578,74 Пример 16 30Cys Ex-4-M5 рассчитанная для C₂₃₃H₃₆₂N₅₄O₉₇S [М+Н]⁺ 5504,74 определенная 5506,85

Сравнительный пример 1

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу Amino-PEGA (100 мкмоль), тщательно промывают ДХМ и ДМФ и дают смоле полностью набухнуть в ДМФ. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в ДМФ (2 мл), помещают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают ДМФ и ДХМ и получают смолу HMPB-PEGA, которую используют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Glu (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в ДХМ (2 мл), помещают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3 часов.

После перемешивания смолу промывают ДХМ и ДМФ. Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. После промывания ДМФ аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанном ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту, содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в NMP (1 мл). Добавляют 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль) и помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем в колонку для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно с использованием аминокислоты, защищенной Fmoc-группой (0,5 ммоль) для дальнейшей конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой для получения 31-членного пептида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:74) на твердофазной смоле.

После промывания ДХМ и ДМФ смолу, эквивалентную 5 мкмоль 31-членного пептида, переносят в пробирку Эппендорф.

Часть полученной смолы, содержащей образовавшийся на ней пептид, переносят в колонку для твердофазного синтеза. Добавляют смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2,5:2,5) так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Образующийся осадок очищают ВЭЖХ (Cadenza колонка С18 100×10 мм, элюирующий раствор А: 0,1% водный раствор ТФУ, В: 0,1%ТФУ ацетонитрил:вода = 90:10, градиент А:В=95:5→5:95, 15 мин, скорость потока: 3,0 мл/мин) и получают GLP-1.

Синтетический пример 1

Синтез олигосахаридных цепей фракций олигогиалуроновой кислоты

К 500 мг гиалуроновой кислоты (продукт Shiseido Co., Ltd., средняя молекулярная масса: 1,200,000), добавляют 100 мл ацетатного буфера (рН 4) и смесь хорошо перемешивают до растворения. Добавляют гуалуронидазу (2500 межд. ед.; продукт CALBIOCHEM, Bovine Testes-derived) и инкубируют при 37°С в течение 2 дней. Раствор концентрируют и затем растворяют вновь в 45 мл ацетатного буфера (рН 4). Добавляют гуалуронидазу (4500 межд. ед.; продукт CALBIOCHEM, Bovine Testes-derived) и инкубируют при 37°С в течение еще 2 дней. Реакционный раствор фракционируют с помощью ультрафильтрационных мембран, отсекающих молекулярные массы, равные 3 кДа и 1 кДа (продукты Millipore). После лиофильного высушивания получают 268,4 мг фракций гуалуроновой кислоты молекулярной массы от 1 до 3 кДа.

Поскольку полученные фракции гуалуроновой кислоты молекулярной массы от 1 до 3 кДа содержат несколько фракций олигогуалуроновых кислот, для их разделения была использована препаративная ВЭЖХ. Фракции олигогуалуроновой кислоты молекулярной массы от 1 до 3 кДа растворяют в небольшом количестве воды и фракционируют на несколько частей при очистке ВЭЖХ [колонка: Shodex Asahipak NH₂P-90 20F 9 мкм, ϕ 20.0×300 мм, мобильная фаза: 180 мМ NaH₂PO₄ вод.] каждого пика элюции. Затем полученные фракции обессоливают гель-фильтрацией, лиофильно высушивают и получают олигогуалуроновые кислоты (от тетрасахарида до октадекасахарида). Выход каждой олигогуалуроновой кислоты представлен ниже.

Тетрасахарид олигогуалуроновой кислоты 22,5 мг (t_R=10,0 мин)

Гексасахарид олигогуалуроновой кислоты 51,1 мг (t_R=11,8 мин)

Октасахарид олигогуалуроновой кислоты 52,7 мг (t_R=14,0 мин)

Декасахарид олигогуалуроновой кислоты 27,0 мг (t_R=17,0 мин)

Додекасахарид олигогуалуроновой кислоты 9,6 мг (t_R=21,4 мин)

Тетрадекасахарид олигогуалуроновой кислоты 7,8 мг (t_R=27,6 мин)

Гексадекасахарид олигогуалуроновой кислоты 4,1 мг (t_R=36.0 мин)

Октадекасахарид олигогуалуроновой кислоты 2,0 мг (t_R=47,4 мин)

Синтетический пример 2

Синтез пептида, в котором положение 30 в GLP-1 замещено Cys

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу Amino-PEGA (100 мкмоль) (продукт Merck), тщательно промывают ДХМ и ДМФ и дают смоле полностью набухнуть в ДМФ. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в ДМФ (2 мл), помещают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают ДМФ и ДХМ и получают смолу HMPB-PEGA, которую используют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Glu (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в ДХМ (2 мл), помещают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3 часов.

После перемешивания смолу промывают ДХМ и ДМФ. Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. После промывания ДМФ аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанным ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту, содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в NMP (1 мл). Добавляют 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), образующуюся смесь помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем в колонку для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно с использованием аминокислоты, защищенной Fmoc-группой (0,5 ммоль), для дальнейшей конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой для получения 31-членного пептида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:75) на твердофазной смоле.

Часть полученной смолы, содержащей образовавшийся на ней пептид, переносят в колонку для твердофазного синтеза. Добавляют смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2,5:2,5) так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Образующийся осадок очищают ВЭЖХ [колонка SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ вода, раствор В: 0,09%ТФУ/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60% В, 20 мин линейный градиент] и получают 31-членного пептида, в котором 30Ala в GLP-1 замещен Cys (SEQ ID №:76).

Синтетический пример 3

Синтез пептида, в котором положение 36 в GLP-1 замещено Cys

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу Amino-PEGA (100 мкмоль) (продукт Merck), тщательно промывают дихлорметаном (ДХМ) и ДМФ и дают смоле полностью набухнуть в ДМФ. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в ДМФ (2 мл), помещают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают ДМФ и ДХМ, для получения смолы HMPB-PEGA, которую используют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Glu (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в ДХМ (2 мл), помещают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3 часов.

После перемешивания смолу промывают ДХМ и ДМФ. Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. После промывания ДМФ аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанным ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту, содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). Добавляют 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), образующуюся смесь помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем в колонку для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно с использованием аминокислоты, защищенной Fmoc-группой (0,5 ммоль) для дальнейшей конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой для получения 31-членного пептида Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:77) на твердофазной смоле.

Часть полученной смолы, содержащей образовавшийся на ней пептид, переносят в колонку для твердофазного синтеза. Добавляют смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2,5:2,5) так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Образующийся осадок очищают ВЭЖХ [колонка SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ вода, раствор В: 0,09%ТФУ/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60% В, 20 мин линейный градиент] и получают 31-членного пептида, в котором 36Arg в GLP-1 замещен Cys (SEQ ID №:78).

Синтетический пример 4

Синтез пептида, в котором положение 34 в GLP-1 замещено Arg

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу Amino-PEGA (100 мкмоль), тщательно промывают ДХМ и ДМФ и дают смоле полностью набухнуть в ДМФ. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в ДМФ (2 мл), помещают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают ДМФ и ДХМ и получают смолу HMPB-PEGA, которую используют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Glu (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в ДХМ (2 мл), помещают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3 часов.

После перемешивания смолу промывают ДХМ и ДМФ. Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. После промывания ДМФ аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанным ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту, содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). Добавляют 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), образующуюся смесь помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем в колонку для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно с помощью аминокислоты, защищенной Fmoc-группой (0,5 ммоль) для дальнейшей конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc- Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой для получения 31-членного пептида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID №:79) на твердофазной смоле.

Часть полученной смолы, содержащей образовавшийся на ней пептид, переносят в колонку для твердофазного синтеза. Добавляют смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2,5:2,5) так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Образующийся осадок очищают ВЭЖХ [колонка SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ вода, раствор В: 0,09%ТФУ/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60% В, 20 мин линейный градиент] и получают 31-членного пептида, в котором 34Lys в GLP-1 замещен Arg (SEQ ID №:80).

Синтетический пример 5

Синтез пептида, в котором положение 30 в эксендине-4 замещено Cys

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу Amino-PEGA (100 мкмоль) (продукт Merck) и промывают ДМФ. Затем аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанным ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту (0,5 ммоль), содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (2,5 ммоль) и образующуюся смесь помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем туда добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (2,5 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Pro, Fmoc-Pro, Fmoc-Pro, Fmoc-Ala, Fmoc-Gly, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Pro, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Val, Fmoc-Ala, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Met, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Gly и Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой для получения 39-членного пептида Ser(tBu)-Pro-Pro-Pro-Ala-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Cys(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Ile-Phe-Leu-Arg(Pbf)-Val-Ala-Glu(OtBu)- Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-His(Trt) (SEQ ID NO:81) на твердофазной смоле.

Часть полученной смолы, содержащей образовавшийся на ней пептид, переносят в колонку для твердофазного синтеза. Добавляют смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2,5:2,5) так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Образующийся осадок очищают ВЭЖХ [колонка SHISEIDO UG-120 (С 18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ вода, раствор В: 0,09%ТФУ/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60% В, 20 мин линейный градиент] и получают 39-членного пептида, в котором 30Glu в Ех-4 замещен Cys (MALDI TOF Mass, рассчитанная для [М+Н]⁺, равна 4230,60, определенная равна 4231,27). (SEQ ID №:82).

Синтетический пример 6

Синтез пептида, в котором положение 26 в GLP-1 замещено Cys

В колонку для твердофазного синтеза помещают смолу амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт Merck) и промывают ДМФ. Затем аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии со способом, описанным ниже для наращивания пептидной цепи.

Аминокислоту (0,5 ммоль), содержащую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (2,5 ммоль) и образующуюся смесь помещают в колонку для твердофазного синтеза. Затем в колонку для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (2,5 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают ДХМ и ДМФ и Fmoc-группу удаляют 20% раствором пиперидин/ДМФ (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Aminoisobutyric Acid(Aib), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Aib и Fmoc-His(Trt) используют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой для получения 30-членного пептида Arg(Pbf)-Aib-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Aib-His(Trt) (SEQ ID NO:83) на твердофазной смоле.

Часть полученной смолы, содержащей образовавшийся на ней пептид, переносят в колонку для твердофазного синтеза. Добавляют смесь трифторуксусная кислота:вода:TIPS (= 95:2,5:2,5) так, чтобы смола тщательно набухла, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу удаляют фильтрованием и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Образующийся осадок очищают ВЭЖХ [колонка SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% ТФУ вода, раствор В: 0,09%ТФУ/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60% В, 20 мин линейный градиент] и получают 12 мг 30-членного пептида, в котором 26Lys в BIM51077 замещен Cys (MALDI TOF Mass, рассчитанная для [М (средняя)-+H]⁺, равна 3315.69, определенная равна 3314,72). (SEQ ID №:84).

Пептиды GLP-1, модифицированные олигосахаридной цепью, полученные в каждом из приведенных выше примеров, представляют собой пептиды GLP-1, модифицированные олигосахаридной цепью, имеющие последовательность His₇-Ala₈-Glu₉-Gly₁₀-Thr₁₁-Phe₁₂-Thr₁₃-Ser₁₄-Asp₁₅-Val₁₆-Ser₁₇-Ser₁₈-Tyr₁₉-Leu₂₀-Glu₂₁-Gly₂₂-Gln₂₃-Ala₂₄-Ala₂₅-Lys₂₆-Glu₂₇-Phe₂₈-Ile₂₉-Ala₃₀-Trp₃₁-Leu₃₂-Val₃₃-Lys₃₄-Gly₃₅-Arg₃₆-Gly₃₇ (SEQ ID №:2, GLP-1), где:

(b1) каждый из 26Lys и 34Lys замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 1) (SEQ ID №:54);

(b2) каждый из 18Ser и 36Arg замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 2) (SEQ ID №:55);

(b3) каждый из 22Gly и 30Ala замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 3) (SEQ ID №:56);

(b4) каждый из 22Gly и 36Arg замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 4) (SEQ ID №:57);

(b5) каждый из 30Ala и 36Arg замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 5) (SEQ ID №:58);

(b6) 30Ala замещен конъюгатом Cys с тетрасахаридом гиалуроновой кислоты (НА-4) (пример 6) (SEQ ID №:59);

(b7) 30Ala замещен конъюгатом Cys с октасахаридом гиалуроновой кислоты (НА-8) (пример 7) (SEQ ID №:60);

(b8) 36Arg замещен конъюгатом Cys с тетрасахаридом гиалуроновой кислоты (НА-4) (пример 8) (SEQ ID №:61);

(b9) 36Arg замещен конъюгатом Cys с октасахаридом гиалуроновой кислоты (НА-8) (пример 9) (SEQ ID №:62);

(b10) 30Ala замещен конъюгатом Cys с гексадекасахаридом гиалуроновой кислоты (НА-16) (пример 10) (SEQ ID №:63);

(b11) 36Arg замещен конъюгатом Cys с гексадекасахаридом гиалуроновой кислоты (НА-16) (пример 11) (SEQ ID №:64);

(b12) 36Arg замещен конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью на основе высшей маннозы (М5) (пример 12) (SEQ ID №:65); и

(b13) конъюгат Asn с асиалоолигосахаридной цепью связан с 26Lys через линкер (пример 13) (SEQ ID №:66), и

представляют собой также

(b14) пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий последовательность

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂ (SEQ ID №:50, эксендин-4), где

30Gly замещен конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 14) (SEQ ID №:67);

(b15) пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий последовательность His-R₂-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-R₂-Arg-NH₂, где R² представляет собой α-метилаланин (SEQ ID №:52, BIM51077), в которой

26Lys замещен конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью (пример 15) (SEQ ID №:68); и

(b16) пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, имеющий последовательность эксендина-4 (SEQ ID №:50), в которой 30Gly замещен конъюгатом Cys с олигосахаридной цепью на основе высшей маннозы (М5) (пример 16).

Несколько пептидов из примеров 1-15 представлены ниже в тестовых примерах 1 и/или 2.

Тестовый пример 1 (Тест на устойчивость к дипептидилпептидазе IV (DPP-IV))

17,7 нмоль пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, полученного в каждом примере, или пептида GLP-1, полученного в сравнительном примере 1, добавляют вместе с 2,2 mU DPP-IV (дипептидилпептидазой IV из почек свиньи, продукт SIGMA) в пробирку Эппендорф на 0,5 мл. Каждую смесь доводят в 100 мМ фосфатном буфере до общего объема, равного 100 мкл, и инкубируют при 37°С. Аликвоту реакционного раствора в 10 мкл смешивают с 15 мкл 10% трифторуксусной кислоты, заранее полученной в другой пробирке Эппендорф. 20 мкл смеси инжектируют в колонку ВЭЖХ для наблюдения за полнотой расходования реагентов (условия ВЭЖХ: колонка: SHISEIDO CAPCELPAK С18 UG120, ϕ 4.6×250 мм, элюирующий растворитель А: 0.1% водный раствор TFA, элюирующий растворитель В: 0.09% TFA ацетонитрил/вода = 90/10, градиент А/В=65/30→30/60, 20 мин, скорость потока: 0,7 мл/мин). Полупериод (t_1/2), который служит индикатором на устойчивость к DPP-IV пептида GLP-1, не содержащего присоединенных олигосахаридных цепей в сравнительном примере 1, принимают за стандарт (=1). Среднестатистические значения, определенные для пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью в каждом из примеров, представлены в таблице 6.

Таблица 6   Соединение Относительная устойчивость Пример 1 26,34 Cys GLP-1-дисиало 23,6 Пример 2 18,36 Cys GLP-1-дисиало 128,6 Пример 3 22,30 Cys GLP-1-дисиало 32,5 Пример 4 22,36 Cys GLP-1-дисиало 22,5 Пример 5 30,36 Gys GLP-1-дисиало 7,5 Пример 6 30 Cys GLP-1-HA-4 2,1 Пример 7 30 Cys GLP-1-HA-8 3,4 Пример 8 36 Cys GLP-1-HA-4 2,2 Пример 9 36 Cys GLP-1-HA-8 3 Пример 10 30 Cys GLP-1-HA-16 3,9 Пример 11 36 Cys GLP-1-HA-16 3 Пример 12 26 Lys GLP-1-линкер-асиало 5,7

Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью каждого примера, устойчив от 2,1 до 128 раз по сравнению с устойчивостью GLP-1 сравнительного примера 1.

Тестовый пример 2 (оральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT)

Раствор пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью в PBS, полученного в каждом из примеров или GLP-1, полученного в сравнительном примере 1, вводят внутрибрюшинно в дозе 10 мл/кг мышам C57BL/6JJcl (10-недельным, самцам) натощак на ночь. Через 30 минут перорально вводят раствор глюкозы в дозе 1 мг/г. Отбирают кровь из глазной орбиты перед введением глюкозы и через 30 минут, 60 минут и 120 минут после введения глюкозы. Измеряют уровень сахара в крови с помощью ACCU-CHEK Aviva (Roche Diagnostics). Среднестатистические результаты представлены на фиг.1-4. Например, на рисунках, представленных внизу, "26,34Cys GLP-1-дисиало", который представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, в котором аминокислоты в каждом из положений 26 и 34 в GLP-1 замещены конъюгатом Cys с дисиалоолигосахаридной цепью, при необходимости обозначают как "С26,С34". То же самое справедливо и для других олигосахаридных цепей и аминокислотных центров.

Далее, 18,36Cys GLP-1-дисиало и GLP-1 определяют по OGTT, используя дозы, равные 1/10 (0,9 нмоль/кг) и 9 нмоль/кг, соответственно, и проводят сравнение.

Результаты представлены на фиг.5.

18,36Cys GLP-1-дисиало, введенный в дозе, равной 0,9 нмоль/кг, проявляет почти такой же эффект снижения уровня сахара в крови, что и GLP-1, введенный в дозе, равной 9 нмоль/кг. 18,36Cys GLP-1-дисиало проявляет приблизительно 10-кратный эффект снижения уровня сахара в крови по сравнению с GLP-1.

Перечень последовательностей произвольным текстом

SEQ ID №:1 пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный общей формулой (1).

SEQ ID №:2 представляет собой GLP-1 (7-37).

SEQ ID №:3 представляет собой GLP-1 (7-36) NH₂.

SEQ ID №:4 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а1).

SEQ ID №:5 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а2).

SEQ ID №:6 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а3).

SEQ ID №:7 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а4).

SEQ ID №:8 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а5).

SEQ ID №:9 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а6).

SEQ ID №:10 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а7).

SEQ ID №:11 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а8).

SEQ ID №:12 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а9).

SEQ ID №:13 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а10).

SEQ ID №:14 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (a11).

SEQ ID №:15 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а12).

SEQ ID №:16 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а13).

SEQ ID №:17 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а14).

SEQ ID №:18 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а15).

SEQ ID №:19 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а16).

SEQ ID №:20 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а17).

SEQ ID №:21 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а18).

SEQ ID №:22 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а19).

SEQ ID №:23 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а20).

SEQ ID №:24 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а21).

SEQ ID №:25 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а22).

SEQ ID №:26 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а23).

SEQ ID №:27 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а24).

SEQ ID №:28 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а25).

SEQ ID №:29 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а26).

SEQ ID №:30 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а27).

SEQ ID №:31 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а28).

SEQ ID №:32 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а29).

SEQ ID №:33 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а30).

SEQ ID №:34 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а31).

SEQ ID №:35 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а32).

SEQ ID №:36 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (a33).

SEQ ID №:37 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а34).

SEQ ID №:38 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а35).

SEQ ID №:39 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а36).

SEQ ID №:40 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а37).

SEQ ID №:41 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а38).

SEQ ID №:42 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а39).

SEQ ID №:43 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а40).

SEQ ID №:44 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а41).

SEQ ID №:45 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а42).

SEQ ID №:46 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а43).

SEQ ID №:47 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а44).

SEQ ID №:48 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а45).

SEQ ID №:49 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (а46).

SEQ ID №:50 представляет собой эксендин-4.

SEQ ID №:51 представляет собой конъюгат эксендина-4 с олигосахаридной цепью, представленный общей формулой (2).

SEQ ID №:52 представляет собой BIM51077.

SEQ ID №:53 представляет собой конъюгат BIM51077 с олигосахаридной цепью, представленный общей формулой (3).

SEQ ID №:54 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b1).

SEQ ID №:55 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b2).

SEQ ID №:56 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b3).

SEQ ID №:57 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b4).

SEQ ID №:58 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b5).

SEQ ID №:59 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b6).

SEQ ID №:60 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b7).

SEQ ID №:61 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b8).

SEQ ID №:62 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b9).

SEQ ID №:63 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b10).

SEQ ID №:64 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b11).

SEQ ID №:65 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b12).

SEQ ID №:66 представляет собой пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, представленный (b13).

SEQ ID №:67 представляет собой конъюгат эксендина-4 с олигосахаридной цепью, представленный (b14).

SEQ ID №:68 представляет собой конъюгат BIM51077 с олигосахаридной цепью, представленный (b15).

SEQ ID №:69 представляет собой 31-членный пептид с защитной группой, синтезированный в примере 1.

SEQ ID №:70 представляет собой 31-членный пептид с защитной группой, синтезированный в примере 2.

SEQ ID №:71 представляет собой 31-членный пептид с защитной группой, синтезированный в примере 3.

SEQ ID №:72 представляет собой 31-членный пептид с защитной группой, синтезированный в примере 4.

SEQ ID №:73 представляет собой 31-членный пептид с защитной группой, синтезированный в примере 5.

SEQ ID №:74 представляет собой 31-членный пептид с защитной группой, синтезированный в сравнительном примере 1.

SEQ ID №:75 представляет собой 31-членный пептид с защитной группой, синтезированный в синтетическом примере 2.

SEQ ID №:76 представляет собой 31-членный пептид с защитной группой, синтезированный в синтетическом примере 2.

SEQ ID №:77 представляет собой 31-членный пептид с защитной группой, синтезированный в синтетическом примере 3.

SEQ ID №:78 представляет собой 31-членный пептид, синтезированный в синтетическом примере 3.

SEQ ID №:79 представляет собой 31-членный пептид с защитной группой, синтезированный в синтетическом примере 4.

SEQ ID №:80 представляет собой 31-членный пептид, синтезированный в синтетическом примере 4.

SEQ ID №:81 представляет собой 39-членный пептид с защитной группой, синтезированный в синтетическом примере 5.

SEQ ID №:82 представляет собой 39-членный пептид, синтезированный в синтетическом примере 5.

SEQ ID №:83 представляет собой 30-членный пептид с защитной группой, синтезированный в синтетическом примере 6.

SEQ ID №:84 представляет собой 30-членный пептид, синтезированный в синтетическом примере 6.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение предоставляет пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, который имеет более высокую стабильность в кровотоке, чем GLP-1, и предпочтительно является более сильным регулятором уровня сахара в крови по сравнению с GLP-1. Настоящее изобретение особенно применимо в области фармацевтики.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, и может быть использовано в медицине для лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с GLP-1. В пептиде GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 две аминокислоты пептида замещены аминокислотой, модифицированной биантеннальной олигосахаридной цепью комплексного типа, и где каждый из центров замещения выбирается из группы, состоящей из положений 18, 22, 26, 30, 34 и 36 в пептиде GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Указанный модифицированный пептид GLP-1 может включать делецию, замещение или присоединение 1-5 аминокислот, за исключением аминокислот, модифицированных олигосахаридной цепью. Изобретение позволяет получить пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, который демонстрирует более сильную активность подавления глюкозы в крови и увеличенный, по меньшей мере, в 2 раза период полужизни, по сравнению с GLP-1 с SEQ ID NO: 3. 5 н. и 19 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл., 16 пр.

1. Пептид GLP-1, предназначенный для лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, который является
a) пептидом GLP-1, модифицированным олигосахаридной цепью, в котором две аминокислоты пептида GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 замещены, где каждая аминокислота замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, и где каждый из центров замещения выбирается из группы, состоящей из положений 18, 22, 26, 30, 34 и 36 в пептиде GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3; или
b) пептидом GLP-1, модифицированным олигосахаридной цепью, имеющим аминокислотную последовательность пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, определенного в (а) с делецией, замещением или присоединением 1-5 аминокислот, за исключением аминокислот, модифицированных олигосахаридной цепью;
в котором каждая из указанных олигосахаридных цепей представляет собой независимо биантеннальную олигосахаридную цепь комплексного типа; и указанный пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, демонстрирует более сильную активность подавления глюкозы в крови, чем у GLP-1 с SEQ ID NO: 3; а период полужизни указанного пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в растворе DPP-IV, по меньшей мере, в 2 раза выше, чем период полужизни GLP-1, где GLP-1 означает глюкагонподобный пептид-1; и
где каждая из аминокислот, модифицированных олигосахаридной цепью, независимо является Asn, модифицированным олигосахаридной цепью, или Cys, модифицированным олигосахаридной цепью; и
где указанные олигосахаридные цепи независимо представлены следующей формулой:
[Формула 1]

где
R1 и R2 могут быть одинаковыми или различными, и каждый представлен [Формула 2]

и
Ас означает ацетильную группу;
или его фармацевтически приемлемую соль.

2. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 1, в котором, по меньшей мере, один центр замещения находится в положении 18, 22, 30 и 36 пептида GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

3. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 1, в котором каждая из указанных олигосахаридных цепей выбрана из группы, состоящей из дисиало, моносиало, асиало, диGIcNAc и диманнозоолигосахаридных цепей.

4. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 1, в котором указанная олигосахаридная цепь имеет, по меньшей мере, 90% гомогенность.

5. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 1, в котором каждая из указанных олигосахаридных цепей является дисиалоолигосахаридной цепью.

6. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 1, в котором две аминокислоты GLP-1 замещены аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, в положениях 18 и 36, 26 и 34, 22 и 30, 22 и 36 или 30 и 36 пептида GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

7. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 1, в котором две аминокислоты GLP-1 замещены аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, в положениях 18 и 36, 22 и 30, 22 и 36 или 30 и 36 пептида GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

8. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 1, в котором аминокислота GLP-1 замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, в положениях 22 и 30 или 22 и 36 пептида GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

9. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 1, имеющий следующие свойства:
более высокая стабильность в кровяном русле, чем у GLP-1; активность контроля уровня сахара в крови, по меньшей мере, в 10 раз выше по сравнению с GLP-1 в тесте OGTT (Оральный Тест на Толерантность к Глюкозе); и
период полужизни в растворе DPP-IV, по меньшей мере, в 20 раз выше, чем период полужизни GLP-1.

10. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 1, имеющий период полужизни в растворе DPP-IV, по меньшей мере, в 30 раз выше, чем период полужизни GLP-1.

11. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по любому из пп. 1-10, в котором указанное заболевание, ассоциированное с GLP-1, является диабетом.

12. Пептид GLP-1, предназначенный для лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, где одна или две аминокислоты замещены аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, в
a) пептиде GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, где центры замещения выбирают из группы, состоящей из положений 18, 22, 30, и 36; или
b) пептиде, имеющем аминокислотную последовательность пептида GLP-1, определенного в (а) с делецией, замещением или присоединением 1-5 аминокислот;
и указанный пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью,
демонстрирует более сильную активность подавления глюкозы в крови, чем у GLP-1 с SEQ ID NO: 3; и период полужизни указанного пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в растворе DPP-IV, по меньшей мере, в 2 раза выше, чем период полужизни GLP-1;
и указанная олигосахаридная цепь представляет собой гиалуроновую кислоту;
и указанная олигогиалуроновая кислота представляет собой олигосахаридную цепь, содержащую 2 (тетрасахарид) или более и 8 (гексадекасахарид) или менее звеньев, каждое из которых состоит из N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты, где GLP-1 означает глюкагонподобный пептид-1;
где указанная аминокислота, модифицированная олигосахаридом, является Cys, модифицированным олигосахаридом; или его фармацевтически приемлемая соль.

13. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 12, в котором указанные две аминокислоты замещены на аминокислоту, модифицированную олигосахаридной цепью, в
a) пептиде GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3; или
b) пептиде, имеющем аминокислотную последовательность GLP-1,
определенную в (а) с делецией, замещением или присоединением одной или нескольких аминокислот;
или его фармацевтически приемлемой соли.

14. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 12, в котором указанная олигогиалуронованя кислота является олигосахаридной цепью, имеющей 2 (тетрасахарид) звена, каждое из которых состоит из N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты.

15. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по любому из пп. 12-14, в котором указанное заболевание, ассоциированное с GLP-1, является диабетом.

16. Пептид GLP-1, предназначенный для лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, где одна или две аминокислоты замещены аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, в
a) пептиде GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, где центры замещения выбирают из группы, состоящей из положений 18, 22, 30 и 36; или
b) пептиде, имеющем аминокислотную последовательность пептида GLP-1, определенного в (а), с делецией, замещением или присоединением 1-5 аминокислот,
и в указанной аминокислоте, модифицированной олигосахаридной цепью, олигосахаридная цепь связана с аминокислотой через линкер, и аминокислота, связанная с указанным линкером, является Lys; и указанный пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, демонстрирует более сильную активность подавления глюкозы в крови, чем у GLP-1 с SEQ ID NO:3; а период полужизни указанного пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, в растворе DPP-IV, по меньшей мере, в 2 раза выше, чем период полужизни GLP-1, где GLP-1 означает глюкагонподобный пептид - 1;
где аминокислота, содержащаяся в линкере, является Asn;
или его фармацевтически приемлемая соль.

17. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 16, в котором одна аминокислота замещена аминокислотой, модифицированной олигосахаридной цепью, в
a) пептиде GLP-1 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3; или
b) пептиде, имеющем аминокислотную последовательность GLP-1, определенную в (а) с делецией, замещением или присоединением 1-9 аминокислот,
или его фармацевтически приемлемой соли.

18. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по п. 16, в котором указанный линкер содержит аминокислоту в конце цепи, связанную с олигосахаридной цепью.

19. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью по п. 16, в котором олигосахаридная цепь имеет, по меньшей мере, 90% гомогенность.

20. Пептид GLP-1, модифицированный олигосахаридной цепью, по любому из пп. 16-19, в котором указанное заболевание, ассоциированное с GLP-1, является диабетом.

21. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с GLP-1, содержащая в качестве активного ингредиента эффективное количество пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, по любому из пп. 1-20, и фармацевтически приемлемый носитель.

22. Фармацевтическая композиция по п. 21, где указанное заболевание, ассоциированное с GLP-1, является диабетом.

23. Способ лечения или профилактики заболевания, ассоциированного с GLP-1, включающий введение эффективного количества пептида GLP-1, модифицированного олигосахаридной цепью, по любому из пп. 1-20.

24. Способ по п. 23, где указанное заболевание, ассоциированное с GLP-1, является диабетом.