Способ активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 C12Q1/06 C12M1/42 C12R1/125 

Описание патента на изобретение RU2668180C1

Область техники

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и может быть использовано для уменьшения времени активации и повышения эффективности и безопасности метода количественного определения жизнеспособных клеток Bacillus subtilis ВКПМ В-12079.

Препараты на основе Bacillus subtilis используются для получения пробиотических средств, биоконсервантов, биологических фунгицидов, биологических дезинфектанов и. т.д. Штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 составляет основу кормовой добавки «Энзимспорин». Поскольку, количество жизнеспособных микроорганизмов в готовом продукте, является одним из важных показателем его качества, искажение этих результатов недопустимо.

Известен способ определения количества живых микроорганизмов (метод Коха), заключающийся в высеве микробных суспензий на плотную питательную среду. Данный способ включает в себя последовательные десятикратные разведения микробной суспензии, высев конечного разведения на плотную питательную среду, инкубацию в условиях, определяемых видом микроорганизма, подсчет выросших колоний и определение количества живых клеток в единице объема исследуемой микробной суспензии [1].

Недостатком является то, что не учитывается специфика спорообразующих микроорганизмов, так как спорообразующим бактериям (в. т.ч. Bacillus subtilis ВКПМ В-12079) для прорастания споры необходимо 2-3 часа в обычных условия или активация перед приготовлением суспензии [2].

В качестве прототипа выбран метод определения количества жизнеспособных споровых бактерий, указанный в СТО 40092868-0003-2016 (стандарт ООО «Алтбиотех» Фермасил, технические условия СТО 33976740-0001-2017) кормовая добавка «Энзимспорин».

Определение количества жизнеспособных клеток бактерий проводят путем высева соответствующего разведения пробы на агаризованную среду. Для этого от каждой партии биопрепарата отбирают навеску массой 1,0 г. Отобранные пробы в асептических условиях разводят стерильным физиологическим раствором в пробирках объема 10 мл. Содержимое пробирок перемешивают до гомогенной суспензии на водяной бане при температуре 80 С°, в течение 15 минут. Из полученной взвеси готовят серию десятикратных разведений. Из двух последних разведений делают высевы на чашки Петри. Чашки с посевом помещают в термостат на 24 часа, при температуре 37 С°.

Недостатками данного метода являются:

- трудоемкость;

- работа с горячей водяной баней является опасной;

- затраты времени, для подготовки водяной бани, прогрева пробирок и охлаждение пробирок до комнатной температуры;

- если для приготовления суспензии использовали споры, которые были активированы кратковременным прогреванием, это может привести к увеличению процента проросших спор [2]. Что в свою очередь, может исказить результат анализа готового биологического продукта.

Метод определения количества жизнеспособных клеток Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 является основным в процессе технологического контроля и контроля качества готовой продукции биологических препаратов. Искажение его результатов негативно скажется на технологическом процессе и качестве готового биопрепарата.

Цель изобретения - разработка быстрого, безопасного, эффективного метода активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 в процессе определения количества жизнеспособных клеток бактерий споровых микроорганизмов Bacillus subtilis ВКПМ В-12079.

В предложенном способе технический результат достигается тем, что сухие лиофилизированные споры Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 активируют ультразвуком в течение 15-20 секунд при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт перед приготовлением микробной суспензии. Затем проводят стандартный метод последовательных десятикратных разведений с высевом в чашки Петри с агаризованной средой. Таким образом, время активации снижается с 15 минут до 15-20 секунд, устраняется стадия прогрева на водяной бане, что повышает безопасность работ, после разведения на твердую среду будут высеяны вегетативных клеток, а не спор, что повышает точность результатов и соответствует методу Коха.

Описание изобретения

Способ осуществляется следующим образом.

0,1 г сухих спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 помещают в асептических условиях в стерильную микропробирку на 1,5 мл, которую плотно закрывают. Затем производят активацию спор ультразвуком при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт определенное время (пример). Для обработки спор может быть использована любая ультразвуковая установка, соответствующая заявленным выше параметрам. Затем, в микропробирку добавляют 1 мл питательной среды, которую предварительно готовят, при следующем соотношении компонентов (г/л): пептон ферментативный - 15, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 5, остальное - дистиллированная вода. Значение рН 7,0-7,2. Стерилизуют при 1,1 атм. в течение 40 мин.

Затем 1 мл суспензии из микропробирки переносят в пробирку с 9 мл раствора хлорида натрия с массовой долей хлорида натрия 8,5 г/л и далее производят разбавление стандартным метод последовательных десятикратных разведений с высевом в чашки Петри со стандартной агаризованной средой. Чашки помещают в термостат на 24 часа, температура 37 С°. Затем осуществляют подсчет колоний, с учетом разведений и навески сухих спор.

Пример 1.

0,1 г сухих спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 помещают в асептических условиях в стерильную микропробирку на 1,5 мл, которую плотно закрывают. Затем производят активацию спор ультразвуком при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт определенное время от 5 до 60 сек. После этого в микропробирку добавляют 1 мл питательной среды, которую предварительно готовят, при следующем соотношении компонентов (г/л): пептон ферментативный - 15, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 5, остальное - дистиллированная вода. Значение рН 7,0-7,2. Стерилизация при 1,1 атм. в течение 40 мин.

Далее, методом микрокопирования, оценивалось, какое количество спор и вегетативных клеток, вышедших из спор, в процессе активации ультразвуком, находится в пробе, в зависимости от времени воздействия ультразвука на споры. Количество микроорганизмов Bacillus subtilis ВКПМ- В-12079 определялось для каждой пробы стандартным методом десятикратных разведений (метод Коха) после проведения активации. Все опыты проводились в семикратном повторении.

Из приведенных данных видно, что активация ультразвуком в течение 15-20 сек. способствует ускоренному выходу Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 из спор за счет механического повреждения споры, т.е. через 40 минут, к окончанию процесса десятикратных разбавлений, 95-99% спор перейдет в вегетативное состояние. Без активации, процесс выхода из спор занимает 2-3 часа [2]. В этом случае, на твердую агаризованную среду происходит высев спор, а не вегетативных клеток, что может исказить результат.

При активации более 20 сек. начинается рост численности микроорганизмов, за счет стимулирующего действия ультразвука со 100 до 151% [3]. Это приводит к искажению данных об исходном количестве спор в пробе.

Таким образом, оптимальное время активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 ультразвуком при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт составляет 15-20 сек. Предложенный способ позволяет:

- уменьшить время активации с 15 минут до 15-20 секунд;

- устраняется стадия прогрева на водяной бане, что повышает безопасность работ;

- после разведения на твердую агаризованную среду высевают вегетативные клетки, а не споры, что повышает точность результатов.

Литература

1. Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов. Пущино, 1990. - 187 с.

2. Ноздрин Г.А. Научные основы применения пробиотиков в птицеводстве. - Новосиб. гос. аграр. ун-т. - Новосибирск, 2005. - 224 с.

3. Бойко С.С., Яценко Е.С. Влияние ультразвука на Bacillus subtilis в процессе стационарного культивирования // Технологии и оборудование химической, биотехнологический и пищевой промышленности. Материалы X Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием. - Бийск, 2017. - С. 321-324.

Похожие патенты RU2668180C1

название год авторы номер документа
Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 2019
  • Яценко Елена Сергеевна
  • Затонская Лина Викторовна
  • Лыков Павел Викторович
  • Петухов Виктор Анатольевич
RU2722071C1
Нереагентный способ подавления развития бактерий Bacillus subtilis 2020
  • Шипунов Борис Павлович
  • Яценко Елена Сергеевна
RU2755615C1
Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 2017
  • Питайкина Анна Олеговна
  • Яценко Елена Сергеевна
  • Ильина Елена Георгиевна
  • Ширманов Максим Вячеславович
  • Евдокимов Иван Юрьевич
RU2680702C1
КОМБИНИРОВАННЫЙ ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS (ВАРИАНТЫ) ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ, СПОСОБ ЕГО ПРОИЗВОДСТВА (ВАРИАНТЫ) И ШТАММ BACILLUS SUBTILIS (NATTO), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ К ПРЕПАРАТУ 2017
  • Джавахия Вахтанг Витальевич
  • Глаголева Елена Викторовна
  • Воинова Татьяна Михайловна
  • Карташов Максим Игоревич
  • Овчинников Александр Игоревич
RU2675934C2
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS, ОБЛАДАЮЩИЙ ФУНГИЦИДНЫМ И БАКТЕРИЦИДНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОВОЩНЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ГРИБНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 2023
  • Кузнецова Наталия Ивановна
  • Козловский Юрий Евгеньевич
RU2808722C1
Способ увеличения численности Bacillus subtilis фотостимуляцией 2021
  • Яценко Елена Сергеевна
  • Затонская Лина Викторовна
  • Соломатин Константин Васильевич
  • Лыков Павел Викторович
  • Петухов Виктор Анатольевич
  • Соловьева Вера Владимировна
  • Евдокимов Иван Юрьевич
RU2763791C1
СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ ШТАММОВ Bac. subtilis И Bac. licheniformis 2010
  • Иваненко Алексей Александрович
RU2432392C1
Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis 2018
  • Рыженков Никита Сергеевич
  • Яценко Елена Сергеевна
  • Микушина Ирина Владимировна
  • Ширманов Максим Вячеславович
  • Евдокимов Иван Юрьевич
RU2668178C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus thuringiensis, НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ ИНФЕКЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ ВИРУСА ГРИППА ЧЕЛОВЕКА А/Н3N2 (ВАРИАНТЫ) 2013
  • Андреева Ирина Сергеевна
  • Мокрушина Ольга Сергеевна
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
RU2551236C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ И АНТИКАНДИДОЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (ВАРИАНТЫ) 2009
  • Андреева Ирина Сергеевна
  • Печуркина Наталья Ивановна
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Булычев Леонид Егорович
  • Шишкина Лариса Николаевна
  • Сергеев Александр Николаевич
RU2405035C1

Реферат патента 2018 года Способ активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток. Способ включает активацию сухих спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 ультразвуком в течение 15-20 секунд при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт. Изобретение обеспечивает уменьшение времени активации, повышение безопасности работ и точности результатов. 1 табл., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 668 180 C1

Способ активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток споровых бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079, отличающийся тем, что сухие споры Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 активируют ультразвуком в течение 15-20 секунд при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2018 года RU2668180C1

БОЙКО С.С., Инициация прорастания спор Bacillus subtilis ультразвуком // XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Томск, 25-28 апреля 2017, стр
Видоизменение пишущей машины для тюркско-арабского шрифта 1923
  • Мадьяров А.
  • Туганов Т.
SU25A1
Способ определения жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в нитрагине 1980
  • Калинин Юрий Тихонович
  • Мезенцев Александр Николаевич
  • Тихонов Владимир Харлампьевич
  • Земляков Владимир Леонидович
  • Голод Борис Иосифович
  • Чекасина Елизавета Васильевна
SU935529A1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК МОЛОЧНОКИСЛЫХ МИКРОБОВ В ИСПРАЖНЕНИЯХ ЛЮДЕЙ 1997
  • Ребров А.Я.
RU2137837C1
Приспособление для предупреждения обрыва шнура и рассыпания жемчужин 1931
  • Косенко А.А.
SU22180A1

RU 2 668 180 C1

Авторы

Бойко Светлана Сергеевна

Яценко Елена Сергеевна

Евдокимов Иван Юрьевич

Ширманов Максим Вячеславович

Даты

2018-09-26Публикация

2017-12-18Подача