СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК МОЛОЧНОКИСЛЫХ МИКРОБОВ В ИСПРАЖНЕНИЯХ ЛЮДЕЙ Российский патент 1999 года по МПК C12Q1/06 C12N1/20 C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/225 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии.

Содержание живых клеток молочнокислых микробов (МКМ) в испражнениях является важным показателем состояния микробиоценоза кишечника людей, поэтому определение этого показателя при диагностике дисбактериоза кишечника является обязательным.

Аналогами изобретения являются известные методики определения численности жизнеспособных клеток МКМ в испражнениях людей при диагностике дисбактериоза кишечника [1, 2]. В этих методиках определение живых МКМ в испражнениях рекомендуется проводить на поверхности твердых питательных сред типа МРС-4 и Хенеля с ингибиторами роста посторонних анаэробов в анаэробных условиях. Ошибка определения составляет при этом десятые, сотые доли lg. Однако элективность применяемых ингибиторов посторонних анаэробов относительна, рекомендуемые питательные среды малодоступны, для создания анаэробных условий рекомендуется дорогая аппаратура (анаэростаты) или ненадежные приемы [1]. Вследствие перечисленных причин, обуславливающих малую доступность методики выращивания анаэробов на твердых питательных средах, она редко применяется в практической работе в настоящее время.

В силу этих затруднений вместо твердых питательных сред обычно применяют жидкие питательные среды типа МРС [1, 2] и глубинный способ выращивания МКМ в них без анаэростата. Однако точность исследования при этом снижается в 10-100 раз. При разведении испражнений с шагом десять ошибка определения составляет I lg, с шагом сто - 2 lg. Такая низкая точность для диагностики дисбактериоза неприемлема, необходимо ее повышение путем возврата к твердым средам.

Прототипом изобретения является способ определения количества МКМ в биопрепаратах, состоящих только из этих микробов (биоконсерванты кормов, пробиотики и др. ), с использованием твердой питательной среды на основе неохмеленного пивного сусла и глубинного выращивания в ней МКМ [3] без применения анаэробной аппаратуры. Этот способ значительно точнее, т.к. позволяет определять содержание МКМ в их биопрепаратах с точностью до сотых долей lg при шаге разведений 10 и десятых долей lg при шаге разведений 100. Однако в присутствии посторонних анаэробов определение числа МКМ в культуре только по форме колоний может оказаться завышенным, так как они могут иметь колонии, сходные с колониями МКМ.

Целью изобретения является повышение точности определения количества жизнеспособных клеток МКМ в испражнениях людей в присутствии других анаэробов без применения сложной анаэробной техники.

Цель достигается тем, что для определения численности МКМ в испражнениях людей применяют глубинный способ выращивания МКМ в твердой среде с питательной основой из неохмеленного пивного сусла, в которое добавляют лактозу, смесь микроэлементов, ацетат натрия и природный мел, как источник CO₂ для анаэробов и как индикатор колоний МКМ по зоне просветления среды вокруг колоний.

Способ осуществляют следующим образом: пробу испражнений массой 2-3 г анаэробно и асептично отбирают из последней порции испражнений лопаточкой в стерильную емкость вместимостью 5-10 мл под пробку так, чтобы аэрация пробы была минимальной, и закрывают ее резиновой (лучше навинчивающейся) пробкой. Пробу немедленно доставляют в лабораторию, где анализируют ее не позже двух часов после отбора, чтобы сохранить анаэробы.

Навеску испражнений массой ≈0,5 г помещают в стерильную пробирку, тщательно растирают стерильной палочкой по стенке у дна при постепенном (сначала по каплям) асептическом добавлении 4,5 мл стерильного изотонического (0,85%) раствора натрия хлорида для получения гомогенной суспензии испражнения (разведение в 10 раз). Затем эту суспензию разводят изотоническим раствором с шагом 10 в 10² - 10⁹ раз. В зоне ожидаемой концентрации МКМ по 0,5 мл разведенных суспензий разливают в стерильные чашки диаметром 160 мм (или по 0,2 мл в чашки диаметром 90 мм). В каждую чашку с суспензией соответствующего разведения наливают 10-12 мл расплавленной и охлажденной до 45^oC питательной среды, чашку закрывают крышкой, смесь суспензии и расплавленной среды тщательно перемешивают круговыми движениями так, чтобы не произошло вспенивания, охлаждают до затвердения среды, после чего инкубируют в течение 2-3 суток при температуре 37^oC и подсчитывают количество выросших колоний с ореолом просветления.

Для приготовления 100 мл твердой питательной среды для МКМ в колбу вместимостью 250 мл вносят натрия ацетат - 0,5 г, дрожжевой экстракт сухой - 0,5 г (жидкий - 5 мл), агар - 1,5 г, лактозу - 0,5 г, смесь микроэлементов - 1 мл (MgSO₄•7H₂O - 4 г, FeSO₄•7H₂O = 0,2 г, MnCl₂•4H₂O - 0,72 г, NaCl - 0,5 г растворяют в дистиллированной воде, объем которой доводят до 100 мл); неохмеленное пивное сусло крепостью 14-18^o Б в таком объеме, чтобы его конечная концентрация в среде соответствовала 8^o Б, смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Объем суспензии доводят дистиллированной водой до 100 мл. Суспензию стерилизуют при температуре 115^oC 20 мин.

Природный мел, растертый до частиц диаметром 0,2-0,3 мм, в количестве 0,5 г стерилизуют в стеклянной пробирке с ватной пробкой горячим воздухом (160^oC) 30 мин, асептически вносят в расплавленную среду с температурой 45-50^oC перед разливом и тщательно перемешивают круговыми движениями (без аэрации среды).

Расплавленную среду с мелом разливают по чашкам, в которые до этого были разлиты суспензии испражнений различного разведения, как указано ранее.

В процессе инкубации культур на поверхности твердой питательной среды вырастают колонии аэробов (бактерии, грибы) без зон просветления, их не учитывают. В глубине среды вырастают колонии анаэробов: без зон просветления - не МКМ, с зоной просветления вокруг колоний - МКМ. Считают колонии только с зоной просветления. По их численности с учетом разведения испражнений рассчитывают содержание МКМ в 1 г испражнений. Результаты отражены в таблице.

Разработанный способ, имея более высокую точность, по продолжительности не отличается от известного.

Литература
1. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника. Метод, рекомендации МЗ РФ, Москва, 1986 г.

2. Бактериологическая диагностика дисбактериоза. Метод. рекомендации для врачей-курсантов. -Казань, 1989 г.

3. Способ определения количества жизнеспособных клеток лактобактерий в биопрепаратах. Ребров А. Я. , Нестерова С.В. ( SU A.c. 1601116 A1, 1990 г. Бюллетень N 39.

Изобретение предназначено для диагностики дисбактериоза кишечника людей, т.к. содержание живых клеток молочнокислых микробов (МКМ) в испражнениях людей является важным показателем состояния микробиоценоза кишечника. Численность жизнеспособных клеток определяют на твердой питательной среде на основе неохмеленного пивного сусла определенной концентрации. Среду обогащают лактозой, смесью микроэлементов, дрожжевым экстрактом, ацетатом натрия. Среда также содержит тонкоизмельченный природный мел, являющийся источником углекислого газа для создания анаэробиоза. Кроме того, мел выполняет функции индикатора для выделения колоний МКМ по зоне просветления вокруг них среди колоний других анаэробов в твердой среде. Изобретение позволяет определять содержание МКМ в испражнениях с точностью до сотен и десятков тысяч клеток (0,1-0,001 ед) в течение 2-3 суток без применения специальной анаэробной аппаратуры. Он доступен в любой лаборатории и достаточно точен и надежен для определения численности лактобактерий в испражнениях при диагностике дисбиоза кишечника людей. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ определения количества жизнеспособных клеток молочнокислых микробов (МКМ) в испражнениях людей путем использования твердой питательной среды и глубинного выращивания в ней МКМ, без анаэробной аппаратуры, отличающийся тем, что, с целью увеличения точности и надежности способа, в твердую среду на основе неохмеленного пивного сусла добавляют микроэлементы, природный мел и лактозу. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве питательной основы среды используют неохмеленное пивное сусло, разведенное дистиллированной водой до 8^o Б. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в питательную среду вносят натрий уксуснокислый (0,5%), дрожжевой экстракт (0,5%) как источник биоактивных веществ и раствор микроэлементов (1 мл). 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в питательную среду вносят лактозу (до 0,5%) - субстрат для лактобактерий и тонко измельченный стерильный порошок природного мела (до 0,5%).