Способ определения жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в нитрагине Советский патент 1982 года по МПК C12N1/00 C05F11/00 

Изобретение относится к сельскохозяйствен ной микробиологии и может быть использова. но в сельском хозяйстве. Известен способ определения количества жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий, который заключается в том, что водную суспензию препарата высевают на элективную огаризованную питательнуто среду 1. , Однако способ требует для осуществления значительного времени (8-10 дней) из-за мед ленного роста клубеньковых бактерий на питательной среде. Известен также способ определения микроорганизмов с помощью флуорогенных субстратов эстераз, по которому клетки микроорганизмов инкубируют при 37-40 С в течение 10-15 мин с флуорогенными субстратами эстераз, имеющими конечную концентрацию 0,5 2,0 , после чего суспензию просматривают в люминисцеитом микроскопе и регистрируют флюоресцирующие клетки 2. При использовании данного способа в суспе зии нитрагин он не дает возможности проводить такое определение, так как применяемые в способе концентрации флуорегенных субстратов эстераз (флуоресцендинацетата и флуоресцеиндибутирата 2,0-0,5 мкг/мл) практически не окрашивают клетки клубеньковых бактерий. Целью изобретения является сокращение времени определения и повышение его точности. Поставленная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу водную суспензию нитрагина инкубируют с флуорогенным субстратом - эфиром низшей жирной кислоты (например, с флуоресцеиндибутиратом), в конечной концентрации 50-100 мкг/мл, причем для усиления флуоресцентной окраски клеток инкубацию проводят при 50-55°С. При инкубации клеток с флуорогенным субстратом, не обладающим флуоресценцией, эстеразы жизнеспособных клеток гидролизуют его и освобождающийся флуорохром накапливается в клетках, придавая им яркую флуоресценцию. При использовании в качестве флуорогенных субстратов эфиров низцшх жирных кислот клетки мертвых микроорганизмов и частицы наполнителей (торфа,мела и т. д.), соизмеримые с размером клеток, при подобной окраске обладают слабой флуоресценцией или не имеют ее.

В качестве флуорогенных субстратов могут использоваться сложные эфиры флуорохромов, содержащих гидроксильнуго группу, и низших жирных кислот. Наиболее доступными являются флуоресцеиндиааетат и флуоресцеиндибутират. Так как флуоресцеиндибутират более устойчив при хранении , имеет значительно меньигую степень спонтанного гидролиза, более дешев, чем флуоресцеиндиаиетат и дает практически такую же картину при окраске клеток, то его использование предпочтительнее В зависимости от задач анализа могут использоваться и другие эфиры, вызывающие свечение жизнеснособ|тых клеток в других областях спектра.

Лучшее окрашивание клеток в суспензии нитрагина достигается при примененли субстратов в ко1шентра11иях от 5 О до 100 мкг/мл. При окраске субстратами в концентрации ниже 50 мкг/мл наблюдается слабое окрашивание жизнеспособных клеток, при котором визуальный счет клеток затруднен и сопровож дается болыними оил1бками. Низкие концент-. рации субстратов (меньше 1,3 мкг/мл), используемые в известном способе, практически не окрашивают клетки клубеньковых бактерий

Повышение температуры инкубации с 3740 С до 50-55 С приводит к увеличению сигнала флуоресценции клеток при окраске большими концентрациями флуоресцеиндиацетата в среднем на 407л. Подобная картина отмечается и в случае применения флуоресцеиндибутирата.

Визуальный подсчет клеток удобно проводить под люминесцентным микроскопом в клеточных препаратах, приготовленных по Виноградарскому-Шульгиной. Способ в визуальном варианте счета может использоваться и для предварителыюй оценки содержания в образце жизнеспособных клеток посторонней

микрофлоры, отличающихся морфологически от клеток клубеньковых бактерий. Общая длительность анализа при применении данного способа составляет 1,5-2 ч: получение водной суспензии нитрагина 1 ч (по ТУ), инкубация суспензии с субстратом 15 мин, счет клеток в клеточном препарате визуально 30-40 мин, счет в суспензии автоматически 5 10 мин.

На чертеже показана зависимость величины сигнала люминесценции отдельных клеток клубеньковых бактерий в ризоторфи1ге от концентрации флуоресцеинднанетата и температуры инкубации.

Ось абсцисс-температура инкубании; ось ор;щ1ит-величина сигнала люминесценции;

кривая 1 - 100 мкг/мл флуоресцеиндиацетата в растворе;

кривая 2-50- кривая 3-2- кривая 4-0,5- Сигналы люминесценции сняты на микроскопе Люмам И-1 с помон1ью фотометрической насадки.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Пример I. К 0,9 мл водной суспензии ризобина, приготовленной известным способом, добавляют 0,1 мл раствора флуорссцеиндиацетата в ацетоне (1 мг/мл), инкубируют при 55 С в течение 15 мин, затем добавляют 1 мл 0,06%-ного агара, перемащивают, наносят 0,02 мл на участок предметного стекла площадью 6 см, равномерно распределяют суспензию по площади, подсущивают и сштают флуоресцирующие клетки известным способом.

Пример 2. К 0,8 мл водной суспензии ризоторфина приготовленной известным способом, добавляют 0,1 мл раствора флуоресцеиндибутирата в ацетоне (1 мг/мл) и обрабатывают как указано в примере 1.

Данные зкспериментов приведены в табл. L

Таблица 1

Ризобин + флуоресцеиндиацетат 100 мкг/мл

Рнзоторфин -нфлуоресцеиндибутират 100 мкг/мл

45+3

52+2

59355296

Сравнительные данные по определениюспособами: предлагаемым и контрольным почисла жизнеспособных клубеньковых бактерийсева на питательную среду представлены в

п одних и тех же партиях нитрагина двумятабл. 2.

Рнзобин Ризоторфин Из табл. 2 видно, чта.предлагаемым способом определяется практически такое же количество жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в нитрагине, как и контроль ным посева на питательные , применяющимся на производстве. Применение предлагаемого способа дает положительный эффект, так как способ позволяет практически фазу же лосле получения продукта проводить анализ и отправлять его потребителю, а не хранить 8-10 дней на складе, пока проводится анализ способом, пр меняемым в промышленности, в результате чего часть клеток в продукте погибает. Способ может использоваться для определения числа жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в культуральной жидкости, взятой из ферментера на разных стадиях ферментации, т. е. может использоваться для контроля процесса ферментации. Способ был успешно испытан при анализе ризобина на Лотошинском биохимическом заводе, кроме того, ои может применяться

Таблица 2

95 98

100 100 и для определения жизнеспособных клеток других видов микроорганизмов, используеллгх в микробиологической промышле1шости. Формула изобретения Способ определения жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в нитрапше, включающий инкубирование суспензии нитрагина с флуорогенным субстратом эсгераззфиром инзшей жирной кислоты и регистрацию флуоресцирующих клеток, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения и повышения его точности, обработку проводят концентращфми субстрата в интервале 50- 100 мкг/мл, причем для усиления флуоресцентной скорости клеток инкубацию клеток проводят при 50-55 С. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.ТУ 59-91-76. 2.Myfepathologia, 66, N 3, p. 175. 1979 (прототип).

50..