Область изобретения

Изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2 (прамлинтида), к фармацевтическим композициям, содержащим эти полипептиды, и к применению этих полипептидов в качестве лекарственных средств.

Уровень техники

Большое и все увеличивающееся число людей страдает от сахарного диабета и ожирения. Сахарный диабет является нарушением обмена веществ, при котором способность утилизировать глюкозу частично или полностью утрачена.

Ряд режимов лечения нацелены на избыточный уровень глюкозы в крови, в то время как другие сосредоточены главным образом на снижении веса. Наиболее эффективным антидиабетическим агентом, используемым для снижения уровня глюкозы в крови, является инсулин и его аналог(и). Уже долгое время известно, что использование традиционного инсулина для лечения диабета связано с увеличением массы тела. Инсулин нужно вводить подкожно до нескольких раз в день.

Диабет 2 типа обычно лечат на ранних стадиях диетой и физическими упражнениями. Когда состояние прогрессирует, добавляются различные пероральные антидиабетические агенты. Инъекционные агенты, такие как аналоги GLP-1, также могут быть использованы на этой стадии. В целом, эти агенты являются наиболее эффективными у пациентов с функционирующими бета-клетками, способными высвобождать инсулин и амилин.

Человеческий амилин (SEQ ID №1) является полипептидом длиной в 37 аминокислот, который имеет физико-химические свойства, которые делают трудным его применение в качестве лекарственного препарата. В частности, он имеет тенденцию к фибриллогенезу, т.е. формированию фибрилл, in vitro и/или ex vivo и становится неэффективным из-за образования осадка. Кроме того, амилин трудно собрать в состав, так как он химически нестабилен и осаждается при физиологическом рН. Поэтому его собирают в состав в кислом растворе.

Человеческий амилин связывается с двумя различными рецепторными комплексами. Эти два комплекса содержат рецептор кальцитонина плюс белки, модифицирующие активность рецептора, RAMP1 или RAMP3. Из тесной связи между рецептором кальцитонина и рецептором амилина от агониста рецептора амилина можно ожидать некоторой перекрестной реактивности к рецептору кальцитонина. Например, прамлинтид имеет некоторую аффинность к рецептору кальцитонина, но она в 14 раз более высокая к рецептору амилина.

Рецептор кальцитонина обнаруживается во многих тканях всего организма и, по-видимому, участвует в регуляции метаболизма костной ткани. Кальцитонин лосося в настоящее время продается под торговым названием Miacalcic®. Продукт используется при гиперкальциемии, остеопорозе (в том числе постменопаузальном остеопороза и остеопорозе, связанном с приемом глюкокортикоидом), деформирующем остите (болезни Педжета) и вводится один раз в день путем инъекции или интраназально. Кальцитонин связывается со специфическими рецепторами в мембране скелета, почек и центральной нервной системы (ЦНС). Время полужизни кальцитонина лосося в плазме составляет примерно 45 минут.

Полипептиды с активностью к рецептору кальцитонина могут использоваться в лечении гиперкальциемии, остеопороза, болезни Педжета, ожирения или связанных с ожирением заболеваний, а также в профилактике связанных с ожирением заболеваний. Недостаток лечения используемыми в настоящее время препаратами кальцитонина заключается в том, что в связи с коротким периодом полужизни кальцитонина лосося в плазме препарат нужно вводить несколько раз в день и непосредственно перед едой.

Полипептиды с двойной активностью к рецептору кальцитонина и рецептору амилина могут быть предпочтительными.

Прамлинтид (SEQ ID №2) является лекарственным продуктом, который продается компанией Amylin Pharmaceuticals как Симлин® для лечения сахарного диабета как дополнение к инсулину. Прамлинтид является агонистом рецептора амилина. Он примерно в 14 раз менее активен на рецепторе кальцитонина.

Химическая структура прамлинтида представлена ниже, а также на Фиг.1.

Прамлинтид химически нестабилен при нейтральном рН и поэтому представлен в кислом растворе. По сравнению с человеческим амилином аминокислоты в позициях 25, 28 и 29 в прамлинтиде замещены пролином. Эта модификация уменьшает склонность белка к образованию фибрилл. Прамлинтид имеет очень короткий период полужизни в плазме и, следовательно, должен вводиться два-три раза в день

WO2010046357 и WO2009034119 раскрывают полипептиды, содержащие амилиновые аналоги, имеющие альбуминсвязывающий остаток (называемые в данном документе амилиновыми производными). Даже при том, что эти полипептиды с альбуминсвязывающими группировками демонстрируют улучшенные фармакокинетические (PK) или фармакодинамические (PD) свойства по сравнению с прамлинтидом, они по-прежнему могут иметь плохую физическую стабильность в определенных условиях.

Сущность изобретения

Неожиданно было обнаружено, что полипептиды, содержащие аминокислоту, которая является аналогом SEQ ID №2 (прамлинтида), с аминокислотным остатком в позиции 37, который представляет собой пролин, может демонстрировать повышенную растворимость и/или физическую стабильность.

По меньшей мере в некоторых воплощениях полипептиды данного изобретения обладают повышенной растворимостью.

По меньшей мере в некоторых воплощениях полипептиды данного изобретения обладают повышенной физической стабильностью.

По меньшей мере в некоторых воплощениях полипептиды данного изобретения обладают повышенной растворимостью и физической стабильностью.

По меньшей мере в некоторых воплощениях полипептиды данного изобретения демонстрируют выгодный фармакокинетический профиль и/или выгодный фармакологический профиль. Примером выгодного фармакокинетического профиля является профиль длительного действия.

В одном широком аспекте данное изобретение относится к полипептиду, содержащему аминосилотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, содержащим остаток пролина в позиции 37, где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2. Возможно, в анализе активности человеческого рецептора амилина, описанном в данном документе, полипептид обладает EC₅₀ примерно 1800 пМ или менее. Возможно, в анализе активности человеческого рецептора кальцитонина, описанном в данном документе, полипептид обладает ЕС₅₀ примерно 1800 пМ или менее. Возможно, в анализе растворимости, описанном в данном документе, полипептид обладает растворимостью при рН 4 примерно 100 мкМ или более. Возможно, в анализе растворимости, описанном в данном документе, полипептид обладает растворимостью при рН 7 примерно 100 мкМ или более. Возможно, в анализе образования фибрилл (также называемом анализом фибрилляции), описанном в данном документе, полипептид обладает стабильностью примерно 25 часов или более. Возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному из его аминокислотных остатков. Данное изобретение также относится к фармацевтическим составам, содержащим его. Данное изобретение также относится к его фармакологическим применениям. Данное изобретение также относится к доставке (например, введению) его пациентам, нуждающимся в таком лечении.

В другом широком аспекте данное изобретение относится к полипептиду, содержащему аминосилотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, содержащим остаток пролина в позиции 37 и остаток глутаминовой кислоты в позиции 14, где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2. Возможно, в анализе активности рецептора амилина (описанном в данном документе) полипептид обладает EC₅₀ примерно 1800 пМ или менее. Возможно, в анализе активности рецептора кальцитонина, описанном в данном документе, полипептид обладает EC₅₀ примерно 1800 пМ или менее. Возможно, в анализе растворимости, описанном в данном документе, полипептид обладает растворимостью при рН 4 примерно 100 мкМ или более. Возможно, в анализе растворимости, описанном в данном документе, полипептид обладает растворимостью при рН 7 примерно 100 мкМ или более. Возможно, в анализе образования фибрилл (также называемом анализом фибрилляции), описанном в данном документе, полипептид обладает стабильностью примерно 25 часов или более. Возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному из его аминокислотных остатков. Данное изобретение также относится к фармацевтическим составам, содержащим его. Данное изобретение также относится к его фармацевтическим применениям. Данное изобретение также относится к доставке (например, введению) его пациентам, нуждающимся в таком лечении.

В другом широком аспекте данное изобретение относится к полипептиду, содержащему аминосилотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, содержащим остаток пролина в позиции 37, остаток гистидина или аргинина в позиции 17 и остаток глутаминовой кислоты в позиции 14, где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2. Возможно, в анализе активности рецептора амилина (описанном в данном документе) полипептид обладает EC₅₀ примерно 1800 пМ или менее. Возможно, в анализе активности рецептора кальцитонина, описанном в данном документе, полипептид обладает ЕС₅₀ примерно 1800 пМ или менее. Возможно, в анализе растворимости, описанном в данном документе, полипептид обладает растворимостью при рН 4 примерно 100 мкМ или более. Возможно, в анализе растворимости, описанном в данном документе, полипептид обладает растворимостью при рН 7 примерно 100 мкМ или более. Возможно, в анализе образования фибрилл (также называемом анализом фибрилляции), описанном в данном документе, полипептид обладает стабильностью примерно 25 часов или более. Возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному из его аминокислотных остатков. Данное изобретение также относится к фармацевтическим составам, содержащим его. Данное изобретение также относится к его фармацевтическим применениям. Данное изобретение также относится к доставке (например, введению) его пациентам, нуждающимся в таком лечении.

В другом широком аспекте данное изобретение относится к полипептиду, содержащему аминосилотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2 формулы (I):

где

Xaa₁ удален или независимо выбран среди Ala, Cys, Glu, Gly, His, Arg, Ser и Lys;

Хаа₃ независимо выбран среди Gly, His, Arg, Ser и Asn;

Xaa₁₄ независимо выбран среди Glu и Asn;

Xaa₁₇ независимо выбран среди His, Arg, Lys и Val;

Xaa₁₈ независимо выбран среди Arg, Lys и His;

Xaa₂₁ независимо выбран среди Ala, Lys, Gln, Ser и Asn;

Xaa₂₂ независимо выбран среди Glu, Gln, Ser, Thr и Asn;

Хаа₂₆ независимо выбран среди Pro, Arg и Ile;

Хаа₃₁ независимо выбран среди Ser, Glu, Asp и Asn;

Хаа₃₅ независимо выбран среди His, Arg, Lys, Asp, Gln и Glu;

и где C-конец, возможно, может присутствовать в виде производного;

возможно, в анализе активности рецептора амилина, описанном в данном документе, полипептид обладает ЕС₅₀ примерно 1800 пМ или менее;

возможно, в анализе активности рецептора кальцитонина, описанном в данном документе, полипептид обладает EC₅₀ примерно 1800 пМ или менее.

возможно, в анализе растворимости, описанном в данном документе, полипептид обладает растворимостью при рН 4 примерно 100 мкМ или более;

возможно, в анализе растворимости, описанном в данном документе, полипептид обладает растворимостью при рН 7 примерно 100 мкМ или более;

возможно, в анализе образования фибрилл (также называемом анализом фибрилляции), описанном в данном документе, полипептид обладает стабильностью примерно 25 часов или более; возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному из его аминокислотных остатков.

Данное изобретение также относится к фармацевтическим составам, содержащим его. Данное изобретение также относится к его фармацевтическим применениям. Данное изобретение также относится к доставке (например, введению) его пациентам, нуждающимся в таком лечении.

В другом аспекте изобретение также содержит фармацевтическую композицию, содержащую приведенный выше полипептид.

В другом аспекте изобретение также включает процесс изготовления фармацевтической композиции, содержащей приведенный выше полипептид.

В другом аспекте изобретение также включает приведенный выше полипептид для применения в качестве лекарственного средства.

Полипептиды данного изобретения являются выгодными, поскольку они обладают улучшенной растворимостью и/или физической стабильностью.

Подходящие анализы, используемые для определения активности на рецепторах амилина и кальцитонина, а также для определения растворимости и физической стабильности полипептидов, описаны в данном документе. Например, см. анализы (II), (IV) и (III), соответственно.

Фиг.1 представляет структуру.

Фиг.2 представляет структуру.

Фиг.3 представляет структуру.

Фиг.4 представляет структуру.

Определения

Термин «человеческий амилин», используемый в данном документе, относится к полипептиду человеческому амилину с последовательностью, изображенной в SEQ ID №1. Этот термин включает, но не ограничиваясь этим, человеческий полипептидный гормон из 37 аминокислот, известный как амилин, который в природе секретируется совместно с инсулином β-клетками поджелудочной железы. Человеческий амилин имеет следующую первичную аминокислотную последовательность:

Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr (SEQ ID №1)

Человеческий амилин имеет дисульфидный мостик между двумя остатками Cys и C-концевую амидную группу. Эта структура показана ниже, а также на Фиг.4.

В данном документе понятия «SEQ ID №1» и «человеческий амилин» могут быть использованы взаимозаменяемо.

Термин «прамлинтид», используемый в данном документе, относится к синтетическому полипептиду с последовательностью, изображенной на SEQ ID №2. Прамлинтид имеет следующую первичную аминокислотную последовательность:

Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr (SEQ ID №2)

Прамлинтид имеет дисульфидный мостик между двумя остатками Cys и C-концевую амидную группу. Эта структура показана ниже, а также на Фиг.1.

В данном документе понятия «SEQ ID №2» и «прамлинтид» могут быть использованы взаимозаменяемо.

Термин «кальцитонин» означает кальцитонин лосося или кальцитонин человека.

Термин «кальцитонин лосося» или «sCT» означает природную белковую последовательность кальцитонина лосося, описанную в Niall et al (1969), Biochemistry vol 64, Фиг.2. Кальцитонин лосося является полипептидом, который состоит из 32 аминокислот. Он имеет дисульфидный мостик между первой и седьмой аминокислотами на амино-конце полипептидной цепи, который имеет существенное значение для его биологической активности, а также пролинамидную группу на карбокси-концевой аминокислоте.

Термин «кальцитонин человека» означает природную белковую последовательность кальцитонина человека, описанную в Niall et al (1969), Biochemistry vol 64, Фиг.2. Кальцитонин человека является полипептидом, который состоит из 32 аминокислот. Он имеет дисульфидный мостик между первой и седьмой аминокислотами на амино-конце полипептидной цепи, который имеет существенное значение для его биологической активности, а также пролинамидную группу на карбокси-концевой аминокислоте.

Термины «аналог амилина» или «амилиновый аналог» используются в данном документе по отношению к варианту SEQ ID №1.

Термины «аналог прамлинтида» или «прамлинтидный аналог» используются в данном документе по отношению к варианту SEQ ID №2.

Например, указанные варианты включают, но не ограничиваясь этим, одну или более чем одну замену, и/или одно или более чем одно удаление, и/или одно или более чем одно добавление любого из аминокислотных остатков любой природной или неприродной аминокислоты, синтетической аминокислоты или пептидомиметика, и/или прикрепление заместителя к любой природной или неприродной аминокислоте, синтетической аминокислоте или пептидомиметику в любой доступной позиции.

Вариант может иметь такое же количество аминокислотных остатков, как и прамлинтид (т.е. 37). Альтернативно, вариант может содержать меньше аминокислотных остатков, чем прамлинтид. Альтернативно, вариант может содержат больше аминокислотных остатков, чем прамлинтид. В некоторых воплощениях вариант имеет такое же число аминокислотных остатков, что и прамлинтид (т.е. 37). В некоторых воплощениях вариант включает замены любого из аминокислотных остатков на любую природную или неприродную аминокислоту, синтетическую аминокислоту или пептидомиметик, и/или присоединение заместителя к любой из природных или неприродных аминокислот, синтетических аминокислот или пептидомиметиков в любой доступной позиции.

Полипептид может содержать одну или более чем одну аминокислотную замену. Таким образом, для некоторых воплощений число аминокислотных замен в аналоге амилина может составлять по меньшей мере одну. Предпочтительно, число аминокислотных замен составляет от одной до пятнадцати, более предпочтительно от одной до двенадцати, более предпочтительно от одной до десяти, более предпочтительно от одной до пяти, более предпочтительно от одной до трех.

Число аминокислотных вставок, добавлений, делеций или замещений может составлять по меньшей мере 1, но может присутствовать до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных вставок, добавлений, делеций или замен. Замена или добавление могут быть сделаны с любой природной или неприродной аминокислотой, синтетической аминокислотой, пептидомиметиком или другим химическим соединением. Добавление или удаление аминокислотных остатков может происходить на N-конце пептида и/или на С-конце пептида.

Используемый здесь термин «природная аминокислота» относится к аминокислоте (с обычным трехбуквенным кодом и однобуквенным кодом в скобках) выбранной из группы, включающей: глицин (Gly и G), пролин (Pro и Р), аланин (Ala и А), валин (Val и V), лейцин (Leu и L), изолейцин (Ile и I), метионин (Met и М), цистеин (Cys и С), фенилаланин (Phe и F), тирозин (Tyr и Y), триптофан (Trp и W), гистидин (His и Н), лизин (Lys и K), аргинин (Arg и R), глутамин (Gln и Q), аспарагин (Asn и N), глутаминовую кислоту (Glu и Е), аспарагиновую кислоту (Asp и D), серин (Ser и S) и треонин (Thr и Т). Если из-за опечаток имеются отклонения от общеиспользуемых кодов, то применяются общеиспользуемые коды. Аминокислоты, присутствующие в полипептидах данного изобретения, предпочтительно являются аминокислотами, которые могут быть закодированы нуклеиновой кислотой.

Если аналог содержит более 37 аминокислотных остатков или менее 37 аминокислотных остатков, специалист все равно может выровнять эту последовательность с последовательностью прамлинтида (SEQ ID NO 2) для определения числа замещений соответствующих аминокислотных остатков. Подходящей программой для выравнивания является "needle", которая представляет собой выравнивание по Нидлману-Вуншу. Алгоритм для этой программы выравнивания описан в Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48:443-453.

В нумерации последовательности SEQ ID №2 и в соответствии с установившейся практикой в данной области аминокислотному остатку на N-конце (Lys) присваивается №1, и последующие аминокислотные остатки нумеруются последовательно, заканчивая на C-конце тирозином, обозначенным №37. Поэтому, в целом, любая ссылка в данном документе на номер позиции аминокислотного остатка предусматривает его расположение в 37-аминокислотной последовательности; при этом указанная 37-аминокислотная последовательность является аналогом прамлинтида. Например, ссылка на аналог, модифицированный в позиции 14, может относиться к аналогу, в котором 14-й аминокислотный остаток из 37 аминокислот в аналоге был изменен.

Другими словами, нумерация аминокислотной последовательности аналога предусматривает позицию каждого аналога по отношению к 37-аминокислотной последовательности, где нумерация является последовательной и возрастает в направлении от N-конца к C-концу.

Аналоги могут быть описаны со ссылкой на номер аминокислотного остатка в прамлинтиде или человеческом амилине, который модифицирован, т.е. по его позиции и характеру изменения. Далее следуют неограничивающие примеры соответствующей номенклатуры аналогов.

Например:

[Pro37]-прамлинтид обозначает аналог SEQ ID №2 (прамлинтида), где изменением в прамлинтиде является замена Tyr в позиции 37 на Pro.

[Glu14,Arg17,Pro37]-прамлинтид обозначает аналог SEQ ID №2 (прамлинтида), в котором Asn в позиции 14 заменен на Glu, Val в позиции 17 заменен на Arg, а Tyr в позиции 37 заменен на Pro.

В еще одном примере des1 (или Des¹) в отношении аналога прамлинтида относится к аналогу, в котором N-концевая аминокислота, лизин, удалена. Аналог прамлинтида, в котором N-концевая аминокислота удалена, также может быть обозначен как des1-прамлинтид.

[Pro25, Pro28, Pro29]-амилин человека обозначает аналог SEQ ID №1 (человеческого амилина), где модификациями в человеческом амилине были замены Ala в позиции 25 и Cys в позицииях 28 и 29 на Pro. Этот полипептид представляет собой прамлинтид. Соответственно, понятно, что прамлинтид является аналогом человеческого амилина. Таким образом, понятия «аналоги прамлинтида» и «аналоги амилина» могут быть использованы взаимозаменяемо.

Как видно из приведенных выше примеров, аминокислотные остатки могут быть идентифицированы по их полному названию, их одинбуквенному коду и/или трехбуквенному коду. Эти три способа полностью эквивалентны.

Выражения «соответствует», «эквивалентная позиция» или «соответствующая позиция», используемые в данном документе, могут использоваться для характеризации участка модификации в аналоге прамлинтида со ссылкой на SEQ ID №2. Эквивалентные или соответствующие позиции легко выводятся, например, простым написанием и визульным контролем; и/или может быть использована стандартная программа для выравнивания белков или полипептидов, например, "needle", которая представляет собой выравнивание Нидлмана-Вунша. Алгоритм описан в Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, и программа выравнивания Майерса и Миллера в "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17. Для выравнивания могут быть использованы матрица весов выравнивания по умолчанию BLOSUM62 и матрица идентичности по умолчанию, а штраф за первый остаток в делеции может быть установлен на -10, и штрафы за дополнительные остатки в делеции на -0,5.

Полипептид может содержать один или более чем один заместитель на одном или более чем одном аминокислотном остатке. Такие полипептиды также могут быть названы производными прамлинтида или производными амилина.

Термин «заместитель», используемый в данном документе, означает любую подходящую группировку, связанную, в частности ковалентно связанную, с аминокислотным остатком, в частности в любой доступной позиции на аминокислотном остатке. Как правило, подходящая группировка представляет собой химическую группировку.

В некоторых воплощениях заместитель содержит линкер.

В некоторых воплощениях полипептид имеет заместитель на одном аминокислотном остатке, где аминокислотный остаток является аминокислотным остатком на N-концевом остатке, либо аминокислотный остаток является лизином.

В некоторых воплощениях полипептид имеет на N-концевом аминокислотном остатке заместитель, связанный через α(альфа)-аминогруппу N-концевого аминокислотного остатка.

В некоторых воплощениях N-концевой аминокислотный остаток представляет собой лизин, и полипептид на N-концевом аминокислотном остатке имеет заместитель, связанный через ε (эпсилон)-аминогруппу аминокислотного остатка лизина.

В некоторых воплощениях полипептид удлинен за счет добавления остатка лизина на N-конце, и полипептид имеет заместитель на N-концевом аминокислотном остатке, связанный через ε-аминогруппу аминокислотного остатка лизина.

В некоторых воплощениях полипептид удлинен за счет добавления аминокислотного остатка на N-конце, и полипептид имеет на N-концевом аминокислотном остатке заместитель, связанный через α-аминогруппу N-концевого аминокислотного остатка.

Используемый в данном документе термин «гидрокарбил» (углеводородный остаток) относится к группе, содержащей по меньшей мере углерод и водород, которая, возможно, содержит один или более чем один подходящий заместитель. Примеры таких заместителей могут включать гидрокси-, алкил-, гало-, алкокси-, галоалкил-, галоалкокси-, амино-, аминоалкил- или циклическую группу. Помимо того, что заместители могут быть циклической группой, комбинация заместителей может формировать циклическую группу. Если гидрокарбил-группа содержит более чем один атом углерода, то эти атомы углерода не обязательно должны быть связаны друг с другом. Например, по меньшей мере два атома углерода могут быть связаны через подходящий атом или группу. Таким образом, гидрокарбил-группа может содержать гетероатомы. Подходящие гетероатомы будут очевидны специалистам в данной области и включают, например, серу, азот, кислород, фосфор и кремний. В одном воплощении гидрокарбил-группа выбрана из группы, состоящей из алкил-группы, алкенил-группы, алкинил-группы, арил-группы, гетероарил-группа или циклоалкил-группы, каждая из которых, возможно, может быть замещена. Примеры таких заместителей могут включать гидрокси-, алкил-, гало-, алкокси-, галоалкил-, галоалкокси-, амино-, аминоалкил- или циклоалкил-группу.

Используемый в данном документе термин «алкил» включает как насыщенную прямую цепь, так и разветвленные алкил-группы, которые могут быть замещенными (моно- или поли-) или незамещенными. Предпочтительно, алкил-группа представляет собой C_1-20-алкильную группу, более предпочтительно C_1-15, более предпочтительно C_1-10-алкильную группу, более предпочтительно C_1-8-алкильную группу, более предпочтительно C_1-6-алкильную группу. Особенно предпочтительные алкильные группы включают, например, метил, этил, п-пропил, изо-пропил, п-бутил, сек-бутил, изо-бутил, трет-бутил, п-пентил, п-гексил, п-гептил и п-октил. Подходящие заместители включают, например, гидрокси-, алкил-, гало-, алкокси-, галоалкил-, галоалкокси-, амино-, аминоалкил- или циклоалкил-группы.

Используемый в данном документе термин «циклоалкил» относится к циклической алкильной группе, которая может быть замещенной (моно- или поли-) или незамещенной. Подходящие заместители включают, например, гидрокси-, алкил-, гало-, алкокси-, галоалкил-, галоалкокси-, амино-, аминоалкил- или циклоалкил-группы.

Используемый в данном документе термин «алкенил» относится к углеродной цепи, содержащей одну или более чем одну углерод-углеродную двойную связь, которая может быть разветвленной или неразветвленной, и замещенной (моно- или поли-) или незамещенной. Предпочтительно алкенил-группа представляет собой С_2-20-алкенил-группу, более предпочтительно C_2-15-алкенил-группу, более предпочтительно С_2-10-алкенил-группу, более предпочтительно С_2-8-алкенил-группу, или более предпочтительно С_2-6-алкенил-группу. Подходящие заместители включают, например, гидрокси-, алкил-, гало-, алкокси-, галоалкил-, галоалкокси-, амино-, аминоалкил- или циклоалкил-группы.

Используемый в данном документе термин «алкинил» относится к углеродной цепи, содержащей одну или более чем одну углерод-углеродную тройную связь, которая может быть разветвленной или неразветвленной, и замещенной (моно- или поли-) или незамещенной. Предпочтительно алкинил-группа представляет собой С_2-20-алкинил-группу, более предпочтительно С_2-15-алкинил-группу, более предпочтительно С_2-10-алкинил-группу, более предпочтительно С_2-8-алкинил-группу, или более предпочтительно С_2-6-алкинил-группу. Подходящие заместители включают, например, гидрокси-, алкил-, гало-, алкокси-, галоалкил-, галоалкокси-, амино-, аминоалкил- или циклоалкил-группы.

Используемый в данном документе термин «арил» относится к ароматической С_6-10-группе, которая может быть замещенной (моно- или поли-) или незамещенной. Типичные примеры включают фенил и нафтил и т.д. Подходящие заместители включают, например, гидрокси-, алкил-, гало-, алкокси-, галоалкил-, галоалкокси-, амино-, аминоалкил- или циклоалкил-группы.

Используемый в данном документе термин «гетероарил» относится к арильной группы, определенной выше, которая содержит один или более чем один гетероатом. Подходящие гетероатомы будут очевидны специалистам в данной области и включают, например, серу, азот, кислород, фосфор и кремний. Подходящие заместители включают, например, гидрокси-, алкил-, гало-, алкокси-, галоалкил-, галоалкокси-, амино-, аминоалкил- или циклоалкил-группы.

Термин «линкер», используемый в данном документе, включает подходящие заместители, которые могут присоединяться к группировке, такой как химическая группировка, к полипептиду, такому как полипептидный остов. Таким образом, линкер и химическая группировка становятся заместителем вместе. Группировка, присоединенная к линкеру, может быть любой подходящей группировкой. Примеры включают альбуминсвязывающую группировку.

В одном воплощении альбуминсвязывающая группировка содержит от 6 до 40 атомов углерода, от 8 до 26 атомов углерода или от 14 до 22 атомов углерода, например, 16, 17, 18, 19, 20 атомов углерода.

В другом воплощении альбуминсвязывающая группировка является ацильной группой, выбранной из группы, содержащей СН₃(СН₂)_rCO-, где r является целым числом от 4 до 38, предпочтительно целым числом от 4 до 24, более предпочтительно выбранной из группы, включающей СН₃(СН₂)₆СО-, СН₃(СН₂)₈СО-, СН₃(СН₂)₁₀СО-, СН₃(СН₂)₁₂СО-, СН₃(СН₂)₁₄СО-, СН₃(СН₂)₁₆СО-, СН₃(СН₂)₁₈СО-, СН₃(СН₂)₂₀СО- и СН₃(СН₂)₂₂СО-.

В одном воплощении альбуминсвязывающая группировка содержит группу, которая может быть отрицательно заряженной при рН 7,4.

В одном воплощении альбуминсвязывающая группировка содержит карбоксильную группу, такую как HOOC(CH₂)_sCO-, где s является целым числом от 12 до 22. Предпочтительно s составляет 16 или 18.

В одном воплощении группировка, присоединенная к линкеру, является альбуминсвязывающей группировкой.

Например, линкер может содержать одну или две аминокислоты, которые на одном конце связаны с группировкой - такой как альбуминсвязывающая группировка - и на другом конце связаны с любой доступной позицией на полипептидном остове.

В некоторых воплощениях линкер обеспечивает мостик или связь между аминогруппой на полипептидном остове и ацильной группой на группировке - такой как альбуминсвязывающая группировка. Линкер может быть связан с N-концевым аминокислотным остатком или с остатком рядом с ним. Предпочтительно линкер связан с аминокислотой в позиции 1 прамлинтидного аналога.

Другим примером линкера является комбинация по меньшей мере одной аминокислоты и амина.

В одном воплощении предпочтительно амин является группой OEG, где формула OEG показана ниже:

В некоторых воплощениях предпочтительно линкер выбран из группы, состоящей из γGlu, γGlu-γGlu, γGlu-γGlu-γGlu, γGlu-γGlu-γGlu-γGlu, Glu, Glu-Glu, Glu-γGlu, Glu-Arg, Glu-Glu-Arg, His, His-His, His-γGlu, His-His-γGlu, Gly, Gly-γGlu, Ser, Ser-γGlu, D-Arg-D-Arg, Arg, Arg-Arg, Arg-Arg-γGlu, Ser-Ser,-Gly-Ser-Ser, Ser-Ser,-Gly-Ser-Ser-γGlu, Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly и Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-γGlu, γGlu-OEG, γGlu-2xOEG и OEG, предпочтительно линкер выбран среди γGlu, γGlu-γGlu, γGlu-OEG, γGlu-2xOEG и OEG, более предпочтительно линкер представляет собой γGlu-γGlu.

Линкер может усиливать и/или вносить вклад в связывающий эффект группировки (например, альбуминсвязывающей группировки), например, линкер, содержащий γGlu, может усиливать альбуминсвязывающий эффект полипептида.

Под терминами «γGlu», или «gGlu», или гаммаGlu, или гамма-L-Glu понимается аминокислота со следующей структурой (также показана на Фиг.2):

Под термином «γGlu-γGlu» понимается группировка со следующей структурой:

Под термином «γGlu-OEG» понимается группировка со следующей структурой:

Под термином «γGlu-OEG-OEG» понимается группировка со следующей структурой:

Термин «эпсилон-аминогруппа» или «ε-аминогруппа», используемый в данном докумете в отношении лизина, относится к аминогруппе в позиции 6, используя стандартную нумерацию IUPAC. Термин «альфа-аминогруппа» или «α-аминогруппа» относится к аминогруппе в позиции 2, используя стандартную нумерацию IUPAC. Мы ссылаемся на следующую структуру (также показана на Фиг.3).

Термин «альбуминсвязывающая группировка», используемый в данном докумете, относится к любой химической группе, способной связываться с альбумином, т.е. обладающей аффинностью связывания с альбумином. В одном воплощении альбуминсвязывающая группировка является ацильной группой.

В некоторых воплощениях предпочтительно альбуминсвязывающая группировка является ацильной группой, выбранной среди:

(a) СН₃(СН₂)_rCO-, где r является целым числом от 4 до 24;

(b) HOOC(CH₂)_sCO-, где s является целым числом от 14 до 20, например 16 или 18.

«Аффинность связывания с альбумином» может быть определена несколькими способами, известными в данной области. В одном способе соединение для измерения метится радиоактивным изотопом, например, ¹²⁵I или ³H, и инкубируется с иммобилизованным альбумином (Kurtzhals et. al., Biochem. J., 312, 725-731 (1995)). Связывание соединения рассчитывается относительно стандарта. В другом способе радиоактивным изотопом метится родственное соединение, и его связывание с альбумином, иммобилизованным, например, на SPA-бусинах, конкурирует в серии разведении измеряемого соединения. Значение ЕС₅₀ при конкуренции является мерой аффинности соединения. В третьем способе аффинность к рецептору или активность соединения измеряется при различных концентрациях альбумина, и сдвиг в относительной аффинности или активности соединения в зависимости от концентрации альбумина отражает его аффинность к альбумину.

Полипептиды данного изобретения проявляют хорошую активность. Термин «активность» используется для описания эффекта данного соединения в анализах, в которых было установлено сигмоидальное отношение между логарифмом концентрации и влиянием соединения. Кроме того, реакция должна варьировать в пределах от 0 до 100%. ЕС (эффективная концентрация)₅₀ может быть использована для описания концентрации данного соединения, дающей 50% ответ в анализе, таком как функциональный анализ.

Полипептиды данного изобретения проявляют хорошую активность. Термин «активность» относится к способности снижать аппетит и/или повышать насыщаемомть. Активность может быть измерена по способности снижать аппетит как, например, описано в Анализе (I) в данном документе.

Полипептиды данного изобретения демонстрируют хорошую физическую стабильность. Термин «физическая стабильность» полипептида в соответствии с изобретением или его состава относится к тенденции полипептида не формировать биологически неактивные и/или нерастворимые агрегаты белка в результате воздействия термо-механической нагрузки и/или взаимодействия с дестабилизирующими границами раздела и поверхностями, такими как гидрофобные поверхности и границы раздела. Физическую стабильность водных составов полипептида можно оценить путем визуального осмотра, анализа образования фибрилл ThT (также называемого анализом фибрилляции), и/или измерения мутности, как описано в данном документе. Визуальный осмотр составов выполняется в резком сфокусированном свете на темном фоне. Мутность состава характеризуется ранжированной визуальной оценкой степени мутности, например, по шкале от 0 до 3 (состав, демонстрирующий отсутствие мутности, соответствует визуальной оценке 0, а состав, демонстрирующий визуальную мутность при дневном свете, соответствует визуальной оценке 3). Состав классифицируется как физически неустойчивый в связи с агрегацией белка, когда он демонстрирует визуальную мутность при дневном свете. Альтернативно, мутность состава может быть оценена путем простых способов измерения мутности, известных специалистам в данной области.

Полипептиды данного изобретения демонстрируют хорошую химическую стабильность. Термин «химическая стабильность» полипептида в соответствии с изобретением или его состава относится к отсутствию химических ковалентных изменений в структуре полипептида, что позволяет избежать формирования продуктов химической деградации, потенциально имеющих сниженную активность и/или повышенные иммуногенные свойства по сравнению с родительской (нативной) структурой полипептида. В зависимости от типа и характера родительского полипептида и окружающей среды, в которой содержится полипептид, могут формироваться различные продукты химической деградации. Вероятно, можно не полностью избежать ликвидации химической деградации, и специалистам в данной области хорошо известно часто наблюдаемое увеличение количества продуктов химической деградации во время хранения и применения полипептидных составов. Большинство полипептидов склонны к дезамидированию, процессу, в котором амидная группа боковой цепи в остатках глутамина или аспарагина гидролизуется с образованием свободной карбоновой кислоты. Другие пути деградации включают формирование высокомолекулярных продуктов трансформации, в которых две или более двух полипептидных молекул ковалентно связаны друг с другом за счет трансамидирования и/или дисульфидных взаимодействий, приводящих к образованию ковалентно связанных димерных, олигомерных и полимерных продуктов деградации (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). Окисление (например, остатков метионина) может быть упомянуто в качестве другого варианта химической деградации. Химическую стабильность полипептидного состава можно оценить, измеряя количество продуктов химической деградации в различные временные точки после воздействия различных условий окружающей среды (образование продуктов деградации часто может ускоряться, например, при повышении температуры). Количество каждого отдельного продукта деградации часто определяют путем разделения продуктов деградации в зависимости от размера и/или заряда молекулы с использованием различных хроматографических методик (например, SEC-HPLC и/или RP-HPLC).

Термин «стабилизированный состав» относится к составу с повышенной физической стабильностью, повышенной химической стабильностью или повышенной физической и химической стабильностью по сравнению с водным раствором полипептида.

Описание изобретения

Общие аспекты

В одном аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

(b) указанный аналог обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 4;

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

(b) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 7,

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

(b) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 4; и

(с) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 7,

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

(b) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 4; и

(c) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 7; и

(d) указанный полипептид обладает физической стабильностью примерно 25 часов или более в анализе образования фибрилл;

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

(b) указанный аналог содержит остаток глутаминовой кислоты в позиции 14;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

(b) указанный аналог содержит остаток глутаминовой кислоты в позиции 14;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

(с) указанный аналог обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 4,

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

(b) указанный аналог содержит остаток глутаминовой кислоты в позиции 14;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

(c) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 7;

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

(b) указанный аналог содержит остаток глутаминовой кислоты в позиции 14;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2;

(c) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 4; и

(d) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 7;

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

(b) указанный аналог содержит остаток глутаминовой кислоты в позиции 14;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

(c) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 4;

(d) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 7; и

(e) указанный полипептид обладает физической стабильностью примерно 25 часов или более в анализе образования фибрилл;

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток пролина в позиции 37;

(b) указанный аналог содержит остаток глутаминовой кислоты в позиции 14;

(c) указанный аналог содержит остаток гистидина или аргинина в позиции 17;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2 формулы (I):

где

Xaa₁ удален или независимо выбран среди Ala, Cys, Glu, Gly, His, Arg, Ser и Lys;

Хаа₃ независимо выбран среди Gly, His, Arg, Ser и Asn;

Xaa₁₄ независимо выбран среди Glu и Asn;

Xaa₁₇ независимо выбран среди His, Arg, Lys и Val;

Xaa₁₈ независимо выбран среди Arg, Lys и His;

Xaa₂₁ независимо выбран среди Ala, Lys, Gln, Ser и Asn;

Хаа₂₂ независимо выбран среди Glu, Gln, Ser, Thr и Asn;

Хаа₂₆ независимо выбран среди Pro, Arg и Ile;

Хаа₃₁ независимо выбран среди Ser, Glu, Asp и Asn;

Хаа₃₅ независимо выбран среди His, Arg, Lys, Asp, Gln и Glu;

и где С-конец, возможно, присутствует в форме производного;

возможно, полипептид имеет по меньшей мере один заместитель, прикрепленный по меньшей мере к одному аминокислотному остатку.

В другом аспекте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая является аналогом SEQ ID №2, где:

(a) указанный аналог содержит остаток глутаминовой кислоты в позиции 14;

(b) указанный аналог содержит остаток гистидина или аргинина в позиции 17;

(c) указанный аналог содержит остаток гистидина в позиции 35;

где нумерация аминокислотной последовательности аналога соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID №2; и

(d) указанный полипептид обладает растворимостью примерно 100 мкМ или более при рН 4; и