НОВЫЙ ПРОНИКАЮЩИЙ В КЛЕТКИ ПЕПТИД, ЕГО КОНЪЮГАТ С БОТУЛОТОКСИНОМ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2018 года по МПК C07K7/08 C07K19/00 A61K39/08 A61P17/00 C12N15/63 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к новому проникающему в клетки пептиду, проникающему в клетки рекомбинантному белку ботулотоксина, в котором проникающий в клетки пептид конъюгирован с одним концом легкой цепи ботулотоксина, и их применению.

Уровень техники

Ботулотоксин является нейротоксином, продуцируемым грамположительной анаэробной бактерией Clostridium botulinum, которая растет в испорченных консервах или испорченном мясе. Ботулотоксин подразделяют на 8 типов нейротоксинов, из которых семь типов (А, В, С, D, Е, F, G) могут вызывать нейропаралич. Ботулотоксин имеет размер примерно в 150 кДа и образует комплексы белка ботулотоксина с другими белками, не токсинами. Размер каждого из образующихся комплексов составляет вплоть до 900 кД в зависимости от типа нейротоксина. Тип действия и мишень, а также продолжительность действия может меняться в зависимости от типа ботулотоксина, причем ботулотоксин типа А известен как одно из смертельных биологических веществ.

Ботулотоксин вызывает паралич путем блокировки сигнала, вызывающего подергивание или сокращение мышц, и благодаря этому действию он применяется для медицинского лечения или в косметических целях после его одобрения FDA в 1989 г. Для медицинского лечения ботулотоксин применяется в виде инъекций в медицинских целях для лечения таких нервно-мышечных заболеваний, как косоглазие, кривошея или блефароспазм, в косметологических целях для уменьшения морщин, сдвинутых бровей или складок над переносицей и квадратной челюсти, а также для других целей - лечения потливости или мигрени. Хотя отмечалось, что ботулотоксин имеет побочные эффекты, в том числе дисфагию, изменение голоса, сухость во рту и нечеткость зрения, но, поскольку до сих пор не отмечалось случаев смерти, вызванных непосредственно ботулотоксином, то при надлежащем применении ботулотоксин считается очень безопасным препаратом. Однако применение ботулотоксина ограничено в случае лиц с повышенной чувствительностью к препарату или страдающих заболеваниями опорно-двигательного аппарата, либо беременных или кормящих женщин.

В текущих применениях ботулотоксина, продолжительность действия ботулотоксина при введении в кожную ткань составляет от 3 до 6 месяцев, а когда передача сигналов между нервом и мышцей блокируется ботулотоксином, то образуется новый дендрит и снижается эффект нейропаралича, вызванного ботулотоксином, поэтому необходимо регулярное лечение. К тому же при неоднократном введении ботулотоксина вырабатываются антитела к ботулотоксину in vivo, поэтому его действие уменьшается.

Кроме того, поскольку паралич мышц, вызванный ботулиновым токсином, по большей части вызывают инъекции, то проводились различные исследования для того, чтобы найти другие эффективные средства доставки, способные обеспечить удобство для пользователя, которые, однако, все еще недостаточны.

В то же время та структура организма, которая всегда находится в контакте с внешней средой, то есть кожа, играет важную роль в качестве защитного барьера, который предотвращает вытекание жидкой среды организма и инфекции, а также потерю воды, и состоит из эпидермиса, дермы и подкожной клетчатки. Ороговевший слой эпидермиса находится в самой наружной части кожи и предотвращает высыхание кожи, препятствуя потере воды и электролитов из кожи, и создает условия, способствующие нормальному биохимическому метаболизму кожи. Кроме того, ороговевший слой кожи играет важную роль в защите организма от внешних физических повреждений и химических веществ, а также предотвращает внедрение в кожу бактерий, грибков или вирусов.

Существуют три пути проникновения через кожу, в их числе абсорбция через роговой слой, абсорбция через фолликулы и сальные железы и абсорбция через потовые железы, причем введение активных веществ через кожу имеет множество ограничений с точки зрения структурных и физических характеристик кожи. В частности, роговой слой кожи имеет компактную структуру в наружном слое кожи из-за естественной гибели кератиноцитов, которые являются главным компонентом клеток кожи и проявляют кислотность порядка рН 5 из-за пота и различных липидных компонентов. Считается, что для прохождения через такой барьер рогового слоя активные вещества в общем должны иметь небольшую молекулярную массу, как-то 1000 или меньше, и обладать липофильными характеристиками.

Хотя низкомолекулярные синтетические соединения или природные материалы, которые часто применяются в качестве косметических и лекарственных ингредиентов, как известно, легко проходят в клетки, тогда как такие макромолекулы, как белки, пептиды и нуклеиновые кислоты, с трудом проникают через клеточную мембрану со структурой бислойной липидной мембраны из-за большой молекулярной массы и гидрофильности, однако известно, что, вследствие внутренних характеристик рогового слоя, который по существу и составляет защитный барьер кожи, низкомолекулярные вещества обладают чрезвычайно низкой эффективностью проникновения, а высокомолекулярные вещества обладают еще более низкой эффективностью проникновения.

Таким образом, для трансдермального введения ботулотоксина нужен носитель, который может доставить ботулотоксин через кожный барьер. В качестве способа усиления эффективности переноса небольших молекул и макромолекул через плазматическую мембрану клетки можно использовать домены трансдукции белков (PTD). Во-первых, широко известны такие PTDs, как HIV-Tat, antennapedia (гомеозисный ген) и др., которые известны как положительно заряженные короткие пептиды для доставки ДНК, РНК, липидов, углеводов, соединений или вирусов, а также белков в клетки. Сообщалось, что PTDs не зависят от рецепторов и проникают через плазматическую мембрану по таким механизмам, как эндоцитоз или фагоцитоз. В долгой истории таких PTD предпринимались попытки различного применения PTD, но, как известно, до сих пор не было ни одного случая успешной разработки. У PTDs, полученных из HIV-Tat, пептид происходит из вируса, поэтому существует проблема безопасности, а также, особенно, когда такие домены трансдукции из семейства PTD применяются независимо друг от друга, скорость внутриклеточной трансдукции быстро снижается при низкой концентрации в 2-5 мкМ или меньше, в зависимости от типа домена трансдукции. Кроме того, также сообщалось, что, когда белок с молекулярной массой в 30000 Да или больше конъюгируют с PTD для трансдукции в клетки, то большинство конъюгатов PTD-белок обычно трансдуцируются в клетки в виде эндосом посредством эндоцитоза, а поскольку эндосомы объединяются с лизосомами в цитоплазме, то при этом большинство конъюгатов PTD-белок деградируют под действием гидролаз, находящихся в лизосомах, и лишь немногие неповрежденные конъюгаты PTD-белок высвобождаются в цитоплазму. Соответственно, при дермальной трансдукции функционального белка с помощью PTD требуется большое количество конъюгатов PTD-белок для достижения требуемой эффективности, что приводит к нежелательным результатам в плане экономической целесообразности.

Для решения такой проблемы с PTD и повышения фармакологической ценности был разработан гидрофобный или амфипатический пептид, имеющий другие характеристики, чем обычные PTD - домен трансдукции макромолекул (MTD; Korean Patent No. 10-1258279). MTD является новым проникающим в клетки пептидом, который обладает повышенной эффективностью при доставке веществ в клетки и имеет другую структуру и другие электростатические свойства, чем PTD. В отличие от PTD, в процессе внутриклеточной трансдукции MTD не требуется эндоцитоз и энергия, а важными факторами являются жесткость и целостность клеточной мембраны. Поэтому предполагается, что прямое взаимодействие с клеточной мембраной имеет решающее значение для процесса внутриклеточной трансдукции MTD. Такой феномен проникающего через клеточную мембрану пептида может повысить ценность его разработки в качестве нового лекарственного средства путем внутриклеточной трансдукции терапевтического белка или материала нуклеиновой кислоты типа ДНК или киРНК, которые трудно использовать в качестве лекарственного средства вследствие короткого времени полураспада in vivo или трудностей с проникновением через клеточную мембрану. Кроме того, по сравнению с обычным проникающим в клетку пептидом, то есть пептидом из HIV-Tat, установлено, что MTD имеет высокую степень пригодности при разработке ботулотоксина в качестве наружного средства вследствие высокой эффективности доставки таких переносимых им веществ, как соединения, пептиды или белки.

Кроме того, поскольку количество легкой цепи или производного легкой цепи проникающего через кожу и в нервные окончания ботулотоксина, который является целью настоящего изобретения, должно ограничиваться концентрациями от 1 до 10 ppm (частей на миллион) для обеспечения безопасности даже через процесс ослабления токсичности, то будет неуместным использовать PTD в качестве проникающего через кожу и в нервные клетки средства, и для преодоления этой проблемы существует потребность в использовании такого MTD, который обладает способностью к проникновению и через кожный барьер, и в нервные клетки, и проникает через кожный барьер зависимым от концентрации образом даже при низких концентрациях, или в разработке новых MTD, обладающих вышеуказанными характеристиками.

Сущность изобретения

Техническая проблема

Настоящее изобретение направлено на получение нового проникающего в клетки пептида, происходящего из домена транслокации тяжелой цепи ботулотоксина и способного опосредовать внутриклеточную доставку биологически активных молекул, причем проникающий в клетки пептид предназначен для эффективного переноса белка ботулинового токсина, который с трудом переносится через кожу вследствие молекулярной массы и собственных характеристик рогового слоя кожи, как описано выше, и для доставки переносимого белка ботулинового токсина в нервные клетки, присутствующие в кожной ткани.

Настоящее изобретение также направлено на получение проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина, в котором проникающий в клетки пептид конъюгирован с одним или обоими концами легкой цепи ботулотоксина.

Настоящее изобретение также направлено на получение композиции, содержащей рекомбинантный белок ботулотоксина в качестве активного ингредиента, более предпочтительного такой композиции, которая способствует трансдермальной доставке проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина и может применяться топически для различных дерматологических обработок и в косметологических целях.

Однако технологические проблемы, которые решаются настоящим изобретением, не ограничиваются вышеописанными проблемами и другими проблемами, которые не упомянуты, и станут более понятными рядовым специалистам в данной области при обращении к дальнейшему описанию.

Техническое решение

Настоящим изобретением предусмотрен пептид, опосредующий внутриклеточную доставку биологически активных молекул, которым является проникающий в клетки пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Настоящим изобретением предусмотрен полинуклеотид, кодирующий этот пептид.

В одном типичном воплощении настоящего изобретения полинуклеотид может состоять из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2.

Настоящим изобретением предусмотрен проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина, в котором проникающий в клетки пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, конъюгирован с одним или обоими концами легкой цепи ботулотоксина.

В одном типичном воплощении настоящего изобретения рекомбинантный белок ботулотоксина может состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31 - SEQ ID NO: 58.

В другом типичном воплощении настоящего изобретения легкая цепь ботулотоксина может состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 9.

В следующем типичном воплощении настоящего изобретения легкая цепь ботулотоксина может дополнительно содержать гексагистидиновую метку-тег на одном конце.

В следующем типичном воплощении настоящего изобретения легкая цепь ботулотоксина может быть выбрана из группы, состоящей из серотипов А, В, С, D, Е, F и G ботулотоксина.

В следующем типичном воплощении настоящего изобретения конъюгирование может представлять собой конъюгирование проникающего в клетки пептида с С-концом или N-концом легкой цепи ботулотоксина или с обоими концами.

В следующем типичном воплощении настоящего изобретения конъюгирование может осуществляться при помощи пептидной связи или ковалентной связи.

Настоящим изобретением предусмотрен полинуклеотид, кодирующий проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина.

В одном типичном воплощении настоящего изобретения полинуклеотид может состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59 - SEQ ID NO: 86.

Настоящим изобретением предусмотрен рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий данный полинуклеотид.

В одном типичном воплощении настоящего изобретения рекомбинантный экспрессирующий вектор может содержать аффинную метку-тег, выбранную из группы, состоящей из His, HAT, FLAG, c-myc, SBP, связывающего хитин домена, глутатион-S-трансферазы и связывающего мальтозу белка.

Настоящим изобретением предусмотрены бактерии, трансформированные рекомбинантным экспрессирующим вектором.

Настоящим изобретением предусмотрена фармацевтическая композиция, которая включает проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из лицевых спазмов, спазмов век, кривошеи, блефароспазма, шейной дистонии, дистонии ротоглотки, спастической дисфонии, мигрени, анального зуда и потливости.

В одном типичном воплощении настоящего изобретения фармацевтическая композиция может применяться для трансдермального введения.

Настоящим изобретением предусмотрена композиция для наружного кожного средства, которая включает проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина в качестве активного ингредиента.

Настоящим изобретением предусмотрена косметическая композиция, которая включает проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина в качестве активного ингредиента.

В одном типичном воплощении настоящего изобретения композиция может применяться для исправления морщин, квадратной челюсти и острой челюсти, травм, размягчения кожи, шрамов, прыщей, пор, эластичности или келоидов.

Настоящим изобретением предусмотрен способ лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из лицевых спазмов, спазмов век, кривошеи, блефароспазма, шейной дистонии, дистонии ротоглотки, спастической дисфонии, мигрени, анального зуда и потливости, который включает трансдермальное введение субъекту проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина.

Настоящим изобретением предусмотрен способ исправления морщин, квадратной челюсти и острой челюсти, травм, размягчения кожи, шрамов, прыщей, пор, эластичности или келоидов, который включает трансдермальное введение субъекту проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина.

Настоящим изобретением предусмотрено применение проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из лицевых спазмов, спазмов век, кривошеи, блефароспазма, шейной дистонии, дистонии ротоглотки, спастической дисфонии, мигрени, анального зуда и потливости.

Настоящим изобретением предусмотрено применение проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина для исправления морщин, квадратной челюсти и острой челюсти, травм, размягчения кожи, шрамов, прыщей, пор, эластичности или келоидов.

Настоящим изобретением предусмотрен способ получения проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина, который включает культивирование трансформированных бактерий.

Преимущества

Ботулотоксин вызывает паралич путем блокировки сигнала, вызывающего подергивание или сокращение мышц. Сейчас вследствие такого вызванного ботулотоксином мышечного паралича ботулотоксин применяется при медицинском лечении блефароспазма, спастичности, мигрени, височно-нижнечелюстного синдрома, потливости и т.д., а также в эстетических и косметологических целях для исправления морщин, уменьшения пор, прыщей, эластичности и квадратной челюсти. Однако, поскольку до сих пор не существует эффективных средств для трансдермальной доставки, то обычно люди, которые хотят получить такие эффекты, полагаются только на инъекции. По этой причине неинъекционное топическое применение ботулотоксина должно быть более безопасной и предпочтительной терапевтической альтернативой. Соответственно, рекомбинантный белок ботулотоксина с проникающим в клетки пептидом по настоящему изобретению может проходить через несколько слоев кожи и нервных клеток и расщеплять белок SNARE в нервных клетках и тем самым проявлять свою активность, а поскольку рекомбинантный белок значительно меньше, чем обычный ботулотоксин, то вероятность выработки антител может существенно уменьшиться, при этом может уменьшиться снижение эффективности в связи с образованием нейтрализующих антител.

К тому же, поскольку рекомбинантный белок ботулотоксина с проникающим в клетки пептидом по настоящему изобретению можно вводить трансдермально, то рекомбинантный белок ботулотоксина с проникающим в клетки пептидом обладает присущей ботулотоксину эффективностью и еще большей доступностью, поэтому он может эффективно применяться в качестве топического средства для лечения различных заболеваний, а также в эстетических и/или косметологических целях.

Кроме того, хотя даже несколько пикограмм (пг) ботулотоксина типа А вызывают серьезную токсичность, проникающий в клетки ботулотоксин настоящего изобретения подвергается ослаблению токсичности, которая проявляется на уровне микрограмм (мкг), что может гарантировать достаточную безопасность от токсичности ботулотоксина.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена таблица, в которой приведены характеристики проникающего в клетки пептида TD1.

На фиг. 2 представлена структура проникающего в клетки пептида TD1.

На фиг. 3а и 3b представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки пептида TD1 в отношении кератиноцитов (клетки НаСаТ) при оценке методом проточной цитометрии.

На фиг. 3с представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки пептида TD1 в отношении клеток нейробластомы (клетки SiMa) при оценке методом проточной цитометрии.

На фиг. 3d представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки пептида TD1 в отношении нервных клеток (клетки U-87MG) при оценке методом проточной цитометрии.

На фиг. 3е представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки пептида TD1 в отношении клеток HeLa при оценке методом проточной цитометрии.

На фиг. 4а представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки пептида TD1 в отношении кератиноцитов (клетки НаСаТ) при оценке методом конфокальной микроскопии.

На фиг. 4b представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки пептида TD1 в отношении клеток нейробластомы (клетки SiMa) при оценке методом конфокальной микроскопии.

На фиг. 4с представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки пептида TD1 в отношении нервных клеток (клетки U-87MG) при оценке методом конфокальной микроскопии.

На фиг. 4d представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки пептида TD1 в отношении клеток HeLa при оценке методом конфокальной микроскопии.

На фиг. 5 представлена схема процесса очистки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc, конъюгированного с проникающим в клетки пептидом TD1.

На фиг. 6 представлена чистота и молекулярная масса очищенного проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc при оценке методом SDS-PAGE.

На фиг. 7а представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в отношении клеток нейробластомы (клетки SiMa) при оценке методом проточной цитометрии.

На фиг. 7b представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в отношении клеток нейробластомы (клетки SiMa) при оценке методом конфокальной микроскопии.

На фиг. 7 с представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в отношении кератиноцитов (клетки НаСаТ) при оценке методом конфокальной микроскопии.

На фиг. 8 представлена проникающая способность in vitro проникающего в клетки. рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в отношении синтетического заменителя кожи.

На фиг. 9 представлена активность расщепления SNAP-25 in vitro у очищенного проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc при оценке методом SDS-PAGE.

На фиг. 10а представлена активность расщепления SNAP-25 in vitro у проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в отношении кератиноцитов (клетки НаСаТ).

На фиг. 10b представлена активность расщепления SNAP-25 in vitro у проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в отношении клеток нейробластомы (клетки SiMa).

На фиг. 11а представлена цитотоксичность проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc на кератиноцитах (клетки НаСаТ).

На фиг. 11b представлена цитотоксичность проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc на клетках нейробластомы (клетки SiMa).

На фиг. 12 представлена стабильность очищенного проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в зависимости от срока хранения при оценке методом SDS-PAGE.

На фиг. 13 представлены результаты испытаний на безопасность и раздражение кожи у проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в составе косметического средства при оценке контрактной исследовательской организацией.

На фиг. 14а, 14b и 14с представлена клиническая эффективность проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в составе косметического средства при оценке контрактной исследовательской организацией.

На фиг. 15 представлена клиническая эффективность проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в составе косметического средства в отношении носогубных складок при оценке контрактной исследовательской организацией.

Осуществление изобретения

Настоящим изобретением предусмотрен новый проникающий в клетки пептид, а также композиции и способ трансдермальной доставки легкой цепи ботулотоксина с его помощью. В соответствии с настоящим изобретением установлено, что разработанный новый проникающий в клетки пептид TD1 подходит в качестве системы трансдукции, пригодной для трансдермальной доставки легких цепей ботулотоксина при топическом применении подходящего средства.

Хотя ботулотоксин экспрессируется в виде единого полипептида, однако после экспрессии он разделяется посредством реконфигурации на тяжелую (Н) цепь примерно в 100 кДа и легкую (L) цепь примерно в 50 кДа, которые связаны дисульфидной связью. Н-цепь связывается с рецептором в нервных клетках, что вызывает проникновение ботулотоксина в клетки посредством эндоцитоза. Легкая цепь ботулотоксина, проникшая в клетку, высвобождается из эндосомы, а затем переходит в цитоплазму. Ботулотоксин расщепляет белок SNARE в цитоплазме, ингибируя высвобождение ацетилхолина, что приводит к параличу мышц. Таким образом, высвобождение ацетилхолина из нервных клеток может ингибироваться только L-цепью, а Н-цепь и L-цепь могут функционировать независимо друг от друга. Исходя из этого, предпринимались попытки разработать систему трансдермальной доставки только с использованием L-цепи, обладающей парализующим действием на мышцы.

Однако отделенная легкая цепь ботулотоксина, имеющая молекулярную массу 50 кДа, не может проникать через клеточную мембрану, поэтому она не может функционировать должным образом сама по себе. В общем, для проявления специфической активности ботулотоксина при доставке легкой цепи ботулотоксина в цитоплазму нервной клетки определенно необходимо содействие тяжелой цепи ботулотоксина примерно в 100 кДа. Тяжелая цепь ботулотоксина состоит из двух доменов, а именно, домена связывания с рецептором на мембране нервных клеток и домена транслокации, который встраивается в клеточную мембрану, способствуя транслокации легкой цепи.

В настоящем изобретении, в результате изучения способа эффективной доставки ботулотоксина, более предпочтительно легкой цепи ботулотоксина, в кожу и в нервные клетки, был разработан новый проникающий в клетки пептид, способствующий внутриклеточной трансдукции, путем структурного анализа тяжелой цепи ботулотоксина.

Во-первых, была получена и отобрана последовательность сайта связывания с белком, которая имеет шансы на разработку в качестве проникающего в клетки пептида, путем анализа трехмерной структуры домена транслокации тяжелой цепи ботулотоксина in silico. После этого несколько раз проводили процесс моделирования, включающий удаление или замену аминокислот, чтобы придать проникающую способность выбранной последовательности, путем сравнения с последовательностью пептида, происходящего из сигнального белка, участвующего в высвобождении нескольких белков или вирусных белков, и стандартного домена трансдукции макромолекул (MTD; Korean Patent No. 10-1258279), проходящего через клеточную мембрану и опосредующего перенос в клетки таких макромолекул, как белки. У пептида была повышена доступность для клеточной мембраны путем размещения амфипатических, полярных аминокислот, были улучшены физические свойства и растворимость, и он приобрел соответствующую гидрофобность для проникновения через клеточную мембрану путем добавления неполярных аминокислот, тем самым был разработан новый проникающий в клетки пептид и было установлено, что новый проникающий в клетки пептид обладает проникающей способностью в отношении кератиноцитов и нервных клеток человека, и тем самым было совершено настоящее изобретение.

Итак, настоящим изобретением предусмотрен новый проникающий в клетки пептид, более предпочтительно пептид, способный опосредовать внутриклеточную доставку биологически активных молекул, которым является проникающий в клетки пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

В настоящем изобретении новый проникающий в клетки пептид представляет собой пептид, который способен опосредовать внутриклеточную доставку биологически активных молекул и называется "TD1".

Проникающий в клетки пептид TD1 по настоящему изобретению:

1) состоит из 13 аминокислот;

2) имеет молекулярную массу примерно в 1537 Да;

3) имеет теоретическое значение pI 9,31;

4) является амфипатическим пептидом с содержанием гидрофобных аминокислот во фрагментах в 60% или больше;

5) имеет индекс нестабильности 49,65 при анализе с помощью программы ProtParam (см. http://web.expacy.org/protparam) для оценки стабильности последовательности;

6) имеет алифатический индекс 97,69 в пересчете на общий объем молекулы;

7) обладает улучшенными свойствами агрегации, так как общая средняя гидропатичность (GRAVY) составляет 0; и

8) его последовательность имеет значение SVM -0,15 согласно анализу для прогнозирования проникающих в клетки пептидов на основе алгоритма классификации методом опорных векторов (SVM).

В настоящем изобретении проникающий в клетку пептид сам по себе не может обладать определенной ферментативной или биологической терапевтической активностью, но служит носителем, способствующим внутриклеточной трансдукции через клеточную мембрану. Пептид может присоединяться к N- или С-концу или обоим концам переносимого в клетки груза, причем он может прикрепляться по каждому концу в прямом или обратном направлении. Кроме того, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является мономером, но настоящее изобретение не ограничивается этим, и он может быть димером или полимером. Кроме того, пептид настоящего изобретения может представлять собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 в качестве минимального звена. Доступность для клеточной мембраны, проникающую способность и физические свойства можно изменять путем добавления одной или нескольких аминокислот к одному или обоим концам последовательности пептида TD1 по настоящему изобретению. Предпочтительно аминокислоты выбирают так, чтобы гидрофобность у них составляла от 25% до 75%, а также может быть добавлена последовательность, обладающая гидрофильностью, если в процессе очистки рекомбинантного белка происходит агрегация.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен полинуклеотид, кодирующий пептид. А именно, полинуклеотид может кодировать проникающий в клетки пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, а сам он может состоять из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, но настоящее изобретение не ограничивается этим.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может представлять собой РНК или ДНК, а ДНК охватывает кДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть одно- или двухцепочечной. Одноцепочечная ДНК может представлять собой кодирующую нить или некодирующую (антисмысловую) нить. Кодирующая последовательность может быть такой же, как нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2, или отличаться от нее. Кодирующая последовательность создается при вырожденности или избыточности генетического кода, но может кодировать один и тот же полипептид.

В одном типичном воплощении настоящего изобретения было установлено, что на клетках кератиноцитов (клетки НаСаТ), клетках нейробластомы (клетки SiMa и клетки U-87 MG) и клетках HeLa вполне проявляется отличная проникающая способность проникающего в клетки пептида TD1 по настоящему изобретению (см. примеры 2 и 3).

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина, в котором проникающий в клетки пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, конъюгирован с одним или обоими концами легкой цепи ботулотоксина.

В настоящем изобретении термин "проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина" относится к конъюгату, содержащему новый проникающий в клетки пептид TD1 и легкую цепь ботулотоксина, которые соединяются химически пептидной связью или ковалентной связью. То есть, проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина доставляет легкую цепь ботулотоксина в клетки с высокой эффективностью при конъюгировании определенного проникающего в клетки пептида с легкой цепью ботулотоксина, при этом данная макромолекула, которая с трудом вводится в клетки, приобретает возможность проникновения в клетки. Причем конъюгация может происходить между проникающим в клетки пептидом и С-концом, N-концом или обоими концами легкой цепи ботулотоксина.

В настоящем изобретении термин "ботулотоксин" относится к известным типам ботулотоксина независимо от того, вырабатывается он бактериями или получен методом рекомбинации или содержит переделанные варианты или конъюгированный белок.

В настоящем изобретении легкая цепь ботулотоксина может быть выбрана из группы, состоящей из серотипов А, В, С, D, Е, F и G ботулотоксина. Причем легкая цепь ботулотоксина может состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 9. Кроме того, на одном конце может дополнительно содержаться гексагистидиновая метка.

В настоящем изобретении легкая цепь ботулотоксина в качестве альтернативы может быть производным ботулотоксина, то есть соединением, обладающим активностью ботулотоксина, но с одним или несколькими изменениями в какой-либо части или последовательности. Например, по сравнению с легкой цепью белков из семи серотипов ботулотоксина, легкая цепь ботулотоксина может быть изменена посредством делеции, модификации, замены или химерного слияния в аминокислотной последовательности с тем, чтобы сохранить эндопептидазную активность легкой цепи, усилить характеристики или уменьшить побочный эффект. Кроме того, можно использовать легкую цепь ботулотоксина, полученную путем рекомбинации или химического синтеза, или же ее часть.

В настоящем изобретении проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина может состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31 - SEQ ID NO: 58, а полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный белок, может состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59 - SEQ ID NO: 86, но настоящее изобретение не ограничивается этим.

В другом типичном воплощении настоящего изобретения было установлено, что проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина по настоящему изобретению обладает отличной способностью проникновения в клетки в отношении кератиноцитов (клетки НаСаТ), клеток нейробластомы (клетки SiMa и клетки U-87 MG) и синтетического заменителя кожи (Strat-M™) (см. примеры 6 и 7).

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина.

В настоящем изобретении термин "рекомбинантный экспрессирующий вектор" относится к векторам, способным экспрессировать заданный белок или заданную ДНК в подходящих клетках хозяина, которые представляют собой генные конструкции, содержащие необходимые регуляторные факторы, функционально связанные для экспрессии генной вставки.

В настоящем изобретении термин "функционально связанный" обозначает функциональную связь последовательности, регулирующей экспрессию нуклеиновой кислоты, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок или РНК, для выполнения общей функции. Например, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или РНК, может быть функционально связан промотор, влияющий на экспрессию кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты. Функциональная связь с рекомбинантным экспрессирующим вектором может осуществляться методом генной рекомбинации, хорошо известным в данной области, и сайт-специфичного расщепления и лигирования ДНК с использованием ферментов, общеизвестных в данной области.

Экспрессирующие векторы, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают плазмиды, космиды, векторы-бактериофаги или вирусные векторы, но настоящее изобретение не ограничивается этим. Можно получить различные подходящие экспрессирующие векторы, включающие сигнальную или лидерную последовательность для наведения на мембрану или для высвобождения, наряду с такими регулирующими экспрессию последовательностями, как промоторы, операторы, старт-кодоны, стоп-кодоны, сигналы полиаденилирования или энхансеры, в зависимости от цели. Промотор экспрессирующего вектора может быть конститутивным или индуцибельным. Кроме того, экспрессирующий вектор может содержать селективный маркер для отбора клеток хозяина, содержащих вектор, а также начало репликации в случае реплицирующихся экспрессирующих векторов. Кроме того, экспрессирующий вектор также может содержать аффинную метку, выбранную из группы, состоящей из His, HAT, FLAG, c-myc, SBP, связывающего хитин домена, глутатион-S-трансферазы и связывающего мальтозу белка.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрены трансформированные бактерии, трансформированные рекомбинантным экспрессирующим вектором.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ получения проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина, который включает культивирование трансформированных бактерий.

Способ получения заключается в культивировании трансформированных бактерий в соответствующей среде в подходящих условиях для экспрессирования полинуклеотида, кодирующего проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина по настоящему изобретению, в рекомбинантном экспрессирующем векторе, введенном в трансформированные бактерии настоящего изобретения. Способ экспрессирования рекомбинантного белка путем культивирования трансформированных бактерий известен в данной области, к примеру, способ может включать запуск экспрессии белка путем инокуляции трансформированными бактериями подходящей среды для выращивания трансформированных бактерий для получения посевного материала, а затем культивирование посевной культуры в культуральной среде в подходящих условиях, например, в присутствии такого индуктора экспрессии генов, как изопропил-β-D-тиогалактозид (IPTG). После культивирования из культивируемого продукта можно извлечь практически чистый рекомбинантный белок. В настоящем изобретении термин "практически чистый" означает, что последовательности рекомбинантного белка настоящего изобретения и полинуклеотида, кодирующего рекомбинантный белок, практически не содержат других белков, происходящих из клеток хозяина.

Получение рекомбинантных белков, экспрессированных из трансформированных бактерий, может осуществляться различными методами выделения и очистки, известными в данной области, а именно, после центрифугирования клеточного лизата, обычно для удаления клеточных остатков, примесей из культуры и т.д., может проводиться осаждение, например, высаливание (осаждение сульфатом аммония и осаждение сульфатом натрия), осаждение растворителем (осаждение белковой фракции с помощью ацетона, этанола или изопропилового спирта), диализ, электрофорез или различные способы колоночной хроматографии. При хроматографии может применяться ионообменная хроматография, гель-фильтрация, HPLC, обратнофазовая HPLC, адсорбционная хроматография, аффинная колоночная хроматография и ультрафильтрация, по отдельности или в сочетании.

В то же время рекомбинантный белок, экспрессируемый в бактериях, трансформированных рекомбинантным экспрессирующим вектором, при его выделении может разделяться на растворимую фракцию и нерастворимую фракцию в соответствии с характеристиками белка. Когда большая часть экспрессированного белка находится в растворимой фракции, его можно легко выделить и очистить вышеописанным способом, но когда большая часть экспрессированного белка находится в нерастворимой фракции, то есть в тельцах включения, то белок можно растворить в растворе, содержащем вещество, денатурирующее белки, например, мочевину или поверхностно-активное вещество, насколько это возможно, центрифугировать, а затем очистить при помощи диализа, электрофореза и хроматографии на колонках, заполненных смолами различного типа. При этом, поскольку структура белка изменяется под действием раствора, содержащего денатурирующее вещество, и он теряет свою активность, то в процессе очистки белка из нерастворимой фракции необходимы операции обессоливания и ренатурации. А именно, на стадиях обессоливания и ренатурации могут проводиться операции диализа и разбавления раствором без денатурирующего вещества или стадия центрифугирования с использованием фильтра. Кроме того, даже в процессе очистки белка из растворимой фракции, если концентрация соли в растворе для очистки высока, могут выполняться такие операции обессоливания и ренатурации.

Тем временем, в следующем типичном воплощении настоящего изобретения, в результате оценки эффективности проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина по настоящему изобретению было установлено, что даже проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина (TD1-Lc) по настоящему изобретению обладает активностью ботулотоксина и той же функцией, что и сам ботулотоксин (см. фиг. 8 и 9). Кроме того, было установлено, что кератиноциты (клетки НаСаТ) и клетки нейробластомы (клетки SiMa) человека не проявляют цитотоксичности (см. пример 10), а к тому же проявляют высокую стабильность (см. пример 11). Следовательно, проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина (TD1-Lc) по настоящему изобретению может более эффективно применяться в качестве топического средства для лечения различных заболеваний, а также в эстетических и/или косметологических целях.

Так, в следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из лицевых спазмов, спазмов век, кривошеи, блефароспазма, шейной дистонии, дистонии ротоглотки, спастической дисфонии, мигрени, анального зуда и потливости, которая содержит проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина в качестве активного ингредиента. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения также может содержать фармацевтически приемлемый носитель, наряду с проникающим в клетки рекомбинантным белком ботулотоксина в качестве активного ингредиента. При этом фармацевтически приемлемым носителем, входящим в фармацевтическую композицию настоящего изобретения, может быть солевой раствор, буферно-солевой раствор, вода, глицерин или этанол, но настоящее изобретение не ограничивается этим, и можно использовать все подходящие средства, известные в данной области.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрена композиция для наружного кожного средства или косметическая композиция, которая включает рекомбинантный белок ботулотоксина в качестве активного ингредиента. Композиция может применяться для уменьшения морщин, квадратной челюсти и острого подбородка, для лечения травм, для смягчения кожи, для лечения рубцов, угрей и пор, для повышения эластичности или для лечения келоидных симптомов, но настоящее изобретение не ограничивается этим. Эффективное количество композиции по настоящему изобретению может вводиться для того, чтобы вызвать паралич мышц или подкожных структур для уменьшения или ослабления сморщивания или для получения различных желательных косметологических эффектов.

В следующем типичном воплощении настоящего изобретения, в результате оценки эффективности исправления морщин у проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина по настоящему изобретению, было установлено, что проникающий в клетки рекомбинантный белок ботулотоксина способствует исправлению носогубных складок и эластичности кожи при непрерывном применении в течение 4-х недель (см. пример 13).

Косметическая композиция настоящего изобретения может быть получена в любой. лекарственной форме, которую обычно получают в данной области, к примеру, в виде раствора, суспензии, эмульсии, пасты, геля, крема, лосьона, порошка, мыла, моющего средства с поверхностно-активным веществом, масла, основы порошка, основы эмульсии или основы воска, но настоящее изобретение не ограничивается этим. Более конкретно, косметическая композиция может быть получена в виде смягчающего средства, питательного тонера, питательного крема, массажного крема, эссенции, крема для глаз, очищающего крема, очищающей пены, очищающей воды, маски или порошка.

Косметологически эффективным носителем, содержащимся в косметической композиции настоящего изобретения, может быть носитель, обычно использующийся в данной области. Когда лекарственная форма по настоящему изобретению представляет собой пасту, крем или гель, то в качестве носителя можно использовать животный жир, растительное масло, воск, парафин, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоль, силикон, бентонит, силикагель, тальк или оксид цинка.

Когда лекарственная форма по настоящему изобретению представляет собой раствор или эмульсию, то в качестве носителя используется растворитель, солюбилизатор или эмульгатор, к примеру, вода, этанол, изопропанол, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутилгликолевое масло, алифатические эфиры глицерина, полиэтиленгликоль или алифатические эфиры сорбитана.

Когда лекарственная форма по настоящему изобретению представляет собой суспензию, то в качестве носителя можно использовать жидкий разбавитель типа воды, этанола или пропиленгликоля, суспензии типа этоксилированного изостеарилового спирта, полиоксиэтиленовых эфиров сорбита или полиоксиэтиленовых эфиров сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар или трагакант.

Когда лекарственная форма по настоящему изобретению представляет собой очищающий продукт, содержащий поверхностно-активное вещество, то в качестве носителя можно использовать сульфат алифатического спирта, сульфат эфира алифатического спирта, моноэфир сульфоянтарной кислоты, изетионат, производные имидазолина, метилтаурат, саркозинат, сульфат эфира алифатического амида, алкиламидобетаин, алифатический спирт, алифатический глицерид, алифатический диэтаноламид, растительное масло, производные ланолина или этоксилированные сложные эфиры глицерина и жирных кислот.

Косметическая композиция настоящего изобретения может включать в себя компоненты, обычно используемые в косметических композициях, в дополнение к активному ингредиенту и носителю, и такими ингредиентами могут быть, к примеру, увлажнители, антиоксиданты, отдушки, наполнители, загустители, красители, окрашивающие вещества, поверхностно-активные вещества, природные или синтетические масла, консерванты, пропиточные средства, смачивающиеся порошки, противогрибковые средства, эмульгаторы, размягчающие средства, дезодоранты и воск. Косметическая композиция настоящего изобретения может выборочно содержать и другие ингредиенты, в том числе растительные экстракты, кондиционеры, пигменты или отбеливатели, УФ-протекторы, смачивающие средства, витамины и их производные, которые обычно используются в продуктах в таком качестве.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний, выбранных из группы, состоящей из лицевых спазмов, спазмов век, кривошеи, блефароспазма, шейной дистонии, дистонии ротоглотки, спастической дисфонии, мигрени, анального зуда и потливости, или же способ исправления морщин, квадратной челюсти и острой челюсти, травм, размягчения кожи, шрамов, прыщей, пор, эластичности или келоидов, который включает локальное введение субъекту проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина. В настоящем изобретении термин "субъект" обозначает объекты, нуждающиеся в лечении заболевания или улучшении кожи, более предпочтительно млекопитающие типа человека или других приматов, мыши, крысы, собаки, кошки, лошади или коровы.

Термин "местное введение" в настоящем изобретении означает прямое нанесение препарата на тело животного или на тело, которому требуется биологический эффект препарата, или же на участок. Местное введение исключает системное введение типа внутривенного введения или перорального введения. "Топическое введение" включено как подтип местного введения для нанесения фармацевтического средства на кожу человека. Композиции настоящего изобретения можно вводить трансдермально для получения требуемых дерматологических и косметологических эффектов.

В композициях настоящего изобретения общее эффективное количество рекомбинантного белка по настоящему изобретению может вводиться пациенту в виде однократной дозы или же в виде нескольких доз по методике дробного лечения, а содержание активного ингредиента может колебаться в зависимости от тяжести симптомов. Этого достаточно для получения требуемого мышечного паралича либо биологических или эстетических эффектов, но относится к действительно безопасному количеству. Тем не менее, эффективное вводимое количество рекомбинантного белка можно определить с учетом различных факторов, таких как возраст, вес, состояние здоровья, пол пациента, тяжесть заболевания, режим питания и скорость выведения, а также способа введения препарата и количества обработок.

Далее для облегчения понимания настоящего изобретения будут представлены типичные примеры. Однако нижеследующие примеры приводятся только для облегчения понимания настоящего изобретения, а объем настоящего изобретения не ограничивается следующими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Конструирование нового проникающего в клетки пептида

Были разработаны новые проникающие в кожу и проникающие в клетки пептиды, способные осуществлять трансдермальную доставку легкой цепи ботулотоксина. Сначала анализировали структуру и функцию тяжелой цепи и легкой цепи ботулотоксина, а затем выбирали последовательность, исходя из того, что тяжелая цепь играет важную роль в проникновении ботулотоксина типа А в нервные клетки. Кроме того, по сравнению с обычной последовательностью MTD, был разработан новый проникающий в клетки пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, на основе процесса повышения доступности для клеточной мембраны путем размещения амфипатической, полярной аминокислоты, улучшения физических свойств и растворимости и обеспечения подходящей гидрофобности для проникновения через клеточную мембрану путем добавления неполярной аминокислоты. Проникающий в клетки пептид, разработанный так, как описано выше, был назван TD1, а его характеристики и структуру анализировали с помощью программы ProtParam (http://web.expacy.org/protparam) и результаты представлены на фиг. 1 и фиг. 2.

Пример 2. Проверка клеткопроникающей способности in vitro у проникающего в клетки пептида TD1 методом проточной цитометрии

Для проверки проникающей способности нового проникающего в клетки пептида TD1, сконструированного в соответствии с примером 1, в отношении клеток кожи и нервных клеток, проводили эксперимент методом проточной цитометрии. При сравнении клеткопроникающей способности проникающего в клетки пептида TD1 в качестве контрольных MTDs использовали разработанный ранее проникающий в клетки пептид kFGF4 и репрезентативный домен транслокации белка (PTD) - HIV-Tat, причем образцы каждого пептида, которые синтезировала организация, специализирующаяся на синтезе пептидов (GL Biochem Ltd., Shanghai, Китай), метили флуоресцентно с помощью FITC.

2-1. Количественный анализ клеткопроникающей способности на кератиноцитах (клетки НаСаТ)

Для проверки клеткопроникающей способности на клетках кератиноцитов НаСаТ культивировали клетки НаСаТ в полной среде DMEM (10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина). Для проточной цитометрии клетки переносили в 12-луночный планшет и культивировали еще от 16 до 24 часов. Каждый образец добавляли к клеткам в лишенной сыворотки среде, в которую не добавляли FBS (в дальнейшем именуется как среда без FBS), на 1 час (рабочие концентрации: 5 мкМ, 10 мкМ) и на 3 часа (рабочие концентрации: 2,5 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ). После инкубации клетки дважды промывали DPBS, чтобы удалить остатки образца, добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА и проводили реакцию в течение 10 мин при погашенном свете, а затем инактивировали трипсин-ЭДТА полной средой. После этого собирали клетки в подготовленную пробирку, добавляли 3 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин. После удаления надосадочной жидкости в каждую пробирку для FACS добавляли 200 мкл PBS и тщательно ресуспендировали клетки для проведения проточной цитометрии. В качестве экспериментальных использовали следующие группы: только клетки и только FITC, пептид Scramble, HIV-Tat, и полученный из kfGF4 пептид, которые сравнивали с пептидом Scramble, который не должен обладать клеткопроникающей способностью, которую определяли как способность к трансдукции у HIV-Tat, полученного из kFGF4 пептида и проникающего в клетки пептида TD1. В результате, как видно из фиг. 3а и фиг. 3b, было установлено, что, по сравнению с контролями, проникающий в клетки пептид TD1 проявляет превосходную способность к проникновению в кератиноциты.

2-2. Количественный анализ клеткопроникающей способности на клетках нейробластомы (клетки SiMa)

Проверяли клеткопроникающую способность в отношении клеток SiMa, которые представляют собой линию клеток нейробластомы. Для клеток SiMa из-за низкой адгезии клеток при культивировании на чашках использовали культуральные чашки, покрытые желатином (Sigma-Aldrich, G2500), которые готовили путем нанесения на них 0,1% раствора желатина, удаления раствора через 1 час при комнатной температуре и последующего высушивания чашек. Клетки SiMa субкультивировали до конфлюентности 80% или выше в полной среде RPMI 1640 (10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина). Клетки стабилизировали путем многократного пересева, высеивали на чашки диаметром 100 мм при 5×10⁵ клеток на лунку и культивировали в течение ночи при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в инкубаторе, после чего проводили эксперимент.

К клеткам в среде без FBS добавляли каждый из образцов (контрольные: только клетки, только FITC; сравнительные: HIV-Tat и полученный из kFGF4 пептид; опытный материал: TD1) при 5 мкМ и инкубировали клетки в течение 1 часа и 6 часов. После инкубации клетки дважды промывали DPBS, чтобы удалить остатки образца, добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировали в течение 10 мин при погашенном свете, а затем инактивировали трипсин-ЭДТА полной средой. После этого собирали клетки в подготовленную пробирку, добавляли 3 мл PBS и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин. После удаления надосадочной жидкости в каждую пробирку для FACS добавляли 200 мкл PBS и тщательно ресуспендировали клетки для проведения проточной цитометрии. По измеренным средним геометрическим (geo.mean) значениям F1-1 по сравнению с полученным из kFGF4 пептидом определяли способность к трансдукции у HIV-Tat, полученного из kFGF4 пептида и проникающего в клетки пептида TD1. В результате, как видно из фиг. 3с, было установлено, что, по сравнению с контролем, проникающий в клетки пептид TD1 также проявляет отличную способность к проникновению в нервные клетки.

2-3. Количественный анализ клеткопроникающей способности на нервных клетках (клетки U-87 MG)

Для проверки клеткопроникающей способности на нервных клетках (клетках U-87 MG) культивировали клетки в полной среде MEM (10% FBS, 1% пенициллина/стреп-томицина). Для проточной цитометрии клетки высеивали в 12-луночный планшет и культивировали от 16 до 24 часов, а затем к клеткам в среде без FBS добавляли каждый из образцов (контрольные: только клетки, только FITC, пептид Scramble; сравнительные: полученный из kFGF4 пептид; опытный материал: TD1) при 5 мкМ и 10 мкМ и инкубировали клетки в течение 1 часа и 6 часов, соответственно. После инкубации клетки дважды промывали DPBS, чтобы удалить остатки образца, добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировали в течение 10 мин при погашенном свете, а затем инактивировали трипсин-ЭДТА полной средой. После этого собирали клетки в подготовленную пробирку, добавляли 3 мл PBS и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин. После удаления надосадочной жидкости в каждую пробирку для FACS добавляли 200 мкл PBS и тщательно ресуспендировали клетки для проведения проточной цитометрии. При измерении уровня FITC, проникшего в клетки, при длине волны F1-1 из измеренной величины geo.mean для F1-1 вычитали значение флуоресценции образца и определяли способность к трансдукции относительно этой величины у пептида Scramble. В результате, как видно из фиг. 3d, было установлено, что, по сравнению с полученным из kFGF4 пептидом, который является общеизвестным проникающим в клетки пептидом, проникающий в клетки пептид TD1 проявляет отличное проникновение в нервные клетки (клетки U-87 MG). 2-4. Количественный анализ клеткопроникающей способности на клетках HeLa Для проверки клеткопроникающей способности на клетках аденокарциномы шейки матки человека (клетках HeLa) культивировали клетки в полной среде MEM (10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина). Для проточной цитометрии клетки высеивали в 12-луночный планшет и культивировали от 16 до 24 часов, а затем к клеткам в среде без FBS добавляли каждый из образцов (контрольные: только клетки, только FITC, пептид Scramble; сравнительные: полученный из kFGF4 пептид; опытный материал: TD1) при 5 мкМ и 10 мкМ и инкубировали клетки в течение 1 часа и 6 часов, соответственно. После инкубации клетки дважды промывали DPBS, чтобы удалить остатки образца, добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировали в течение 10 мин при погашенном свете, а затем инактивировали трипсин-ЭДТА полной средой. После этого собирали клетки в подготовленную пробирку, добавляли 3 мл PBS и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин. После удаления надосадочной жидкости в каждую пробирку для FACS добавляли 200 мкл PBS и тщательно ресуспендировали клетки для проведения проточной цитометрии. В качестве экспериментальных групп использовали TD1, HIV-Tat и полученный из kFGF4 пептид, и по измеренным значениям geo.mean для F1-1 определяли способность к трансдукции по времени и концентрации. В результате, как видно из фиг. 3е, происходило поглощение TD1 в клетках HeLa в зависимости от концентрации в пределах 12 часов, а когда концентрации HIV-Tat и полученного из kFGF4 пептида составляли 5 мкМ или выше, то происходило значительно поглощение HIV-Tat и полученного из kFGF4 пептида в клетках HeLa, но степень проникновения у HIV-Tat и полученного из kFGF4 пептида была значительно меньше, чем у TD1. Таким образом, было установлено, что, по сравнению с контролями, TD1 проявляет превосходное проникновение в клетки HeLa.

Пример 3. Проверка клеткопроникающей способности in vitro у проникающего в клетки пептида TD1 методом конфокальной микроскопии

3-1. Количественный анализ клеткопроникающей способности на кератиноцитах (клетки НаСаТ)

Для проверки клеткопроникающей способности на клетках НаСаТ, которые представляют собой линию клеток кератиноцитов, культивировали клетки в полной среде DMEM (10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина). Для микроскопии стерилизовали в пламени покровные стекла на 12 мм и вносили в каждую лунку 24-луночного планшета, в который высеивали клетки НаСаТ и культивировали от 16 до 24 часов. К клеткам в среде без FBS добавляли каждый из образцов (контрольные: носитель; сравнительные: HIV-Tat и полученный из kFGF4 пептид; опытный материал: TD1) при 3 мкМ и 5 мкМ и инкубировали клетки в течение 1 часа и 3 часов, соответственно. После инкубации среду полностью удаляли отсасыванием и дважды повторяли добавление PBS в лунки и осторожное встряхивание планшета для промывания клеток, а затем в каждую лунку добавляли 200 мкл 10% раствора формалина и осторожно встряхивали при выключенном свете в течение 10 мин, чтобы фиксировать клетки. После фиксации клеток удаляли фиксирующий раствор и дважды промывали клетки PBS в течение 10 мин. Затем проводили контрастное окрашивание с помощью растворов красителей Hoechst и DAPI при комнатной температуре в течение 10 мин при выключенном свете, а после инкубации удаляли раствор красителей и дважды промывали клетки PBS. После этого вынимали покровные стекла, а затем медленно укладывали и монтировали без пузырей на предметные стекла, на которые по каплям наносили заливочный раствор. При выключенном свете предметные стекла тщательно высушивали для наблюдения клеток под конфокальным микроскопом (Zeiss LSM700). В результате, как видно из фиг. 4а, было установлено, что, по сравнению с HIV-Tat и полученным из kFGF4 пептидом, TD1-1 проявляет отличное проникновение в кератиноциты.

3-2. Количественный анализ клеткопроникающей способности на клетках нейробластомы (клетки SiMa)

Для проверки клеткопроникающей способности в отношении клеток SiMa - линии клеток нейробластомы - культивировали клетки до конфлюентности 80% или выше в полной среде RPMI 1640 (10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина). Клетки стабилизировали путем многократного пересева, а для микроскопии стерилизовали в пламени покровные стекла на 12 мм и вносили в каждую лунку 24-луночного планшета, в который высеивали клетки SiMa и культивировали от 16 до 24 часов. К клеткам в среде без FBS добавляли каждый из образцов (HIV-Tat, полученный из kFGF4 пептид, TD1) при 5 мкМ, а затем инкубировали в течение 6 часов. После инкубации среду полностью удаляли отсасыванием, клетки осторожно встряхивали и дважды промывали PBS, а затем в каждую лунку добавляли 200 мкл 10% раствора формалина и фиксировали клетки при выключенном свете в течение 10 мин. После фиксации клеток удаляли фиксирующий раствор и дважды промывали клетки PBS в течение 10 мин. Затем проводили контрастное окрашивание при выключенном свете при комнатной температуре в течение 10 мин. После инкубации удаляли раствор красителей и дважды промывали клетки PBS. Затем вынимали покровные стекла и медленно укладывали их и монтировали без пузырей на предметные стекла, на которые по каплям наносили заливочный раствор. После тщательного высушивания предметных стекол при выключенном свете рассматривали клетки под конфокальным микроскопом (Zeiss LSM700). В результате, как видно из фиг. 4b, было установлено, что, по сравнению с полученным из kFGF4 пептидом, TD1 также проявляет отличное проникновение и в нервные клетки.

3-3. Количественный анализ клеткопроникающей способности на нервных клетках (клетки U-87 MG)

Для проверки клеткопроникающей способности на клетках U-87 MG - линии нервных клеток - культивировали клетки U-87 MG в полной среде DMEM (10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина). Для конфокальной микроскопии покровные стекла на 12 мм стерилизовали в пламени и вносили в каждую лунку 24-луночного планшета, в который высеивали клетки U-87 MG и культивировали от 16 до 24 часов. К клеткам в среде без FBS добавляли каждый из образцов (полученный из kFGF4 пептид, TD1) при 5 мкМ, а затем инкубировали в течение 6 часов. После инкубации среду с образцами удаляли, клетки дважды промывали PBS, а затем в каждую лунку добавляли 200 мкл 10% раствора формалина и фиксировали клетки при выключенном свете в течение 10 мин. После этого удаляли фиксирующий раствор и дважды промывали клетки PBS в течение 10 мин, а затем проводили контрастное окрашивание с помощью растворов красителей Hoechst и DAPI при комнатной температуре в течение 10 мин при выключенном свете. После окрашивания удаляли раствор красителей и дважды промывали клетки PBS. Затем вынимали покровные стекла и монтировали их без пузырей на предметные стекла, на которые по каплям наносили заливочный раствор. При выключенном свете предметные стекла тщательно высушивали для наблюдения клеток под конфокальным микроскопом (Zeiss LSM700). В результате, как видно из фиг. 4с, было установлено, что, по сравнению с полученным из kFGF4 пептидом, TD1 проявляет отличное проникновение в клетки U-87 MG.

3-4. Количественный анализ клеткопроникающей способности на клетках HeLa

Для проверки клеткопроникающей способности на клетках аденокарциномы шейки матки человека (клетках HeLa) культивировали клетки в полной среде MEM (10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина). Для конфокальной микроскопии покровные стекла на 12 мм стерилизовали в пламени и вносили в каждую лунку 24-луночного планшета, в который высеивали клетки и культивировали от 16 до 24 часов. К клеткам в среде без FBS добавляли каждый из образцов (HIV-Tat, полученный из kFGF4 пептид, TD1) при 5 мкМ а инкубировали в течение 6-24 часов. После инкубации среду с образцами удаляли, клетки дважды промывали PBS, а затем в каждую лунку добавляли 200 мкл 10% раствора формалина и фиксировали клетки при выключенном свете в течение 10 мин. После этого удаляли фиксирующий раствор и дважды промывали клетки PBS в течение 10 мин, а затем проводили контрастное окрашивание с помощью растворов красителей Hoechst и DAPI при комнатной температуре в течение 10 мин при выключенном свете. После окрашивания удаляли растворы и дважды промывали клетки PBS. Затем вынимали покровные стекла и монтировали их без пузырей на предметные стекла, на которые по каплям наносили заливочный раствор. При выключенном свете предметные стекла тщательно высушивали для наблюдения клеток под конфокальным микроскопом (Zeiss LSM700). В результате, как видно из фиг. 4d, было установлено, что, по сравнению с контролем, TD1 проявляет отличное проникновение в клетки HeLa.

Пример 4. Конструирование экспрессионных конструкций для белка легкой цепи (Lc) ботулотоксина (BoNT/A) и рекомбинантного белка (TD1-Lc), в котором конъюгированы MTD (TD1) и белок легкой цепи ботулотоксина (Lc)

Конструировали экспрессирующие конструкции для белка легкой цепи ботулотоксина типа A (Lc) и рекомбинантного белка, в котором конъюгированы MTD (TD1) и белок легкой цепи ботулотоксина типа A (Lc). Сначала оптимизированную по ко донам последовательность легкой цепи (Lc) нейротоксина ботулина типа А, которая была синтезирована на фирме Bioneer, использовали в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью пары праймеров, специально разработанных для этой матрицы. Информация о последовательностях праймеров приведена в табл. 1.

Проводили ПЦР в реакционной смеси, содержащей 100 нг оптимизированной по кодонам Lc в качестве матрицы, смесь dNTP при конечной концентрации 0,4 мМ, по 1 мкМ каждого из праймеров, 5 мкл буферного раствора 10 × EX Taq и 0,25 мкл раствора полимеразы EX Taq (Takara) в конечном объеме 50 мкл. Условия ПЦР: сначала тепловая денатурация 5 мин при 95°С, затем 30 циклов реакций по 30 сек при 95°С, 1 мин при 58°С и 1 мин при 72°С и, наконец, амплификация 8 мин при 72°С. По завершении реакции проводили электрофорез в 1% агарозном геле для проверки амплифицированных продуктов, после чего амплифицированные рекомбинантные фрагменты извлекали из агарозного геля, а затем экстрагировали и очищали с помощью коммерчески доступного набора для экстракции из геля (Intron, Корея). Каждый из очищенных продуктов ПЦР обрабатывали ферментами NdeI и XhoI при 37°С в течение 2 часов с последующим электрофорезом опять же в агарозном геле. Затем каждый рекомбинантный фрагмент расщепляли и при этом очищали с помощью набора для экстракции геля (Intron, Корея). В то же время при тех же условиях, как описано выше, расщепляли рестрикционными ферментами NdeI и XhoI экспрессирующий вектор pET-21b(+) (Novagen, США), который содержит гистидиновый тег и промотор Т7, а затем смешивали вместе очищенный рекомбинантный фрагмент и расщепленный вектор рЕТ-21b(+) и проводили лигирование добавлением ДНК-лигазы Т4 (Intron, Корея) при 16°С в течение 16 часов. Полученные продукты трансфецировали в чувствительные клетки Е. coli DH5α, получая при этом рекомбинантные векторы для экспрессии белков. Посредством расщепления рестрикционными ферментами NdeI и XhoI, как описано выше, и электрофореза в 1% агарозном геле было установлено, что каждый рекомбинантный фрагмент был правильно вставлен в вектор рЕТ-21b(+). Полученные рекомбинантные векторы для экспрессии белков были названы pET21b(+)-Lc и pET21b(+)-TD1-Lc.

Пример 5. Культивирование и очистка штаммов для экспрессии белка легкой цепи (Lc) ботулотоксина и рекомбинантного белка (TD1-Lc), в котором MTD (TD1) конъюгирован с белком легкой цепи ботулотоксина (Lc)

Процесс культивирования и очистки штаммов для экспрессии рекомбинантного белка по настоящему изобретению проводили следующим образом, а блок-схема процесса представлена на фиг. 5.

5-1. Культивирование бактериальных штаммов

Клетки Е. coli BL21 (DE3) RIL-CodonPlus трансформировали каждым из рекомбинантных экспрессирующих векторов pET21b(+)-Lc и pET21b(+)-TD1-Lc методом теплового шока и культивировали в среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Затем клетки Е. coli, в которые вводили ген рекомбинантного белка, инокулировали в 25 мл среды LB и культивировали в течение ночи при 37°С, получая при этом первичную культуру. Первичную культуру снова инокулировали в 9 л среды LB и культивировали при 37°С до достижения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀) от 0,4 до 0,8. После этого в культуральную среду добавляли 1 мМ IPTG, который является индуктором экспрессии белка, и культивировали клетки еще в течение ночи при 18°С, а затем центрифугировали при 4°С и 8000 об/мин в течение 10 минут. Затем удаляли надосадочную жидкость, получая при этом клеточный осадок. Собранный осадок клеток суспендировали в PBS и обрабатывали лизоцимом, а затем разрушали клетки обработкой ультразвуком и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 30 минут, получая при этом растворимую, фракцию.

5-2. Очистка белка и определение чистоты (SDS-PAGE)

Растворимую фракцию, полученную в примере 5-1, подвергали очистке методом быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC, Bio-Rad). Растворимую фракцию наносили на колонку FPLC для связывания с носителем для аффинной хроматографии, а затем промывали отмывающим буфером. После этого постепенно повышали концентрацию имидазола до получения очищенного образца, а затем образец подвергали диализу с использованием PBS или диализной мембраны в PBS с перемешиванием при 4°С в течение 16-20 часов.

Очищенный образец подвергали электрофорезу в 12% геле для SDS-PAGE для определения чистоты. Гель окрашивали Кумасси бриллиантовым синим R с осторожным перемешиванием, а затем отмывали буфером без красителя до тех пор, пока не становилась четкой полоса нужного белка. В результате, как видно из фиг. 6, было установлено, что очищенный белок имеет чистоту 95% или выше по SDS-PAGE.

Пример 6. Оценка клеткопроникающей способности проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина (TD1-Lc)

6-1. Конструирование флуоресцентно-меченного белка

Для оценки клеткопроникающей способности in vitro у проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина (TD1-Lc) получали помеченный FITC белок. Готовили 10 мл суспензии белка путем смешивания 50 мМ борной кислоты и 0,1 нг/мл FITC с 0,5 мкг/мл белка при выключенном свете и подвергали реакции при 4°С в течение 8 часов. По завершении реакции проводили диализ путем внесения суспензии белка в диализную пробирку, а затем меняли среду на DPBS при 4°С в течение 3-х дней с интервалами в 4 часа - 4 часа - 16 часов при выключенном свете. По завершении диализа FITC-меченный белок фильтровали через шприц-фильтр на 0,2 мкм, а полученный при этом белок количественно определяли по методу Брэдфорда и избирательно концентрировали до требуемой концентрации. Белок разводили до самой низкой из измеренных концентраций для измерения интенсивности флуоресценции (RFU). Исходя из измеренного значения RFU, определяли интенсивность флуоресценции конъюгированного с FITC белка, используемого при проверке.

6-2. Проверка способности к проникновению в нервные клетки методом проточной цитометрии

Оценивали клеткопроникающую способность проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина (TD1-Lc) в отношении клеток SiMa - линии клеток нейробластомы. Поскольку клетки SiMa проявляли низкую адгезию при культивировании на чашках, то использовали культуральные чашки, покрытые желатином (Sigma-Aldrich, G2500), при этом чашки покрывали 0,1% раствором желатина. Через 1 час при комнатной температуре раствор удаляли, а чашки высушивали. Клетки субкультивировали до конфлюентности 80% или выше в полной среде RPMI 1640 (10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина). Клетки стабилизировали путем многократного пересева, высеивали на чашки диаметром 100 мм при 5×10⁵ клеток на лунку и культивировали при 37°С в инкубаторе с 5% СО₂ в течение 16-20 часов для использования в эксперименте.

К клеткам в среде без FBS добавляли каждый из образцов (носитель, только FITC, Lc-FITC, TD1-Lc-FITC) на 6 часов при концентрации в 1,5 мкг/мл и 7,5 мкг/мл. После инкубации клетки дважды промывали DPBS, чтобы удалить остатки образца, добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА на 10 мин при погашенном свете, а затем обрабатывали полной средой для инактивации трипсина-ЭДТА. После этого собирали клетки в подготовленные пробирки, добавляли 3 мл PBS и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин. После удаления надосадочной жидкости в каждую пробирку для FACS добавляли 200 мкл PBS и тщательно ресуспендировали клетки для проведения проточной цитометрии. Из измеренной величины geo.mean для F1-1 вычитали значение флуоресценции образца с носителем и определяли способность к трансдукции у легкой цепи ботулотоксина типа А (Lc) и проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина (TD1-Lc) относительно этой величины у носителя. В результате, как видно из фиг. 7а, было количественно установлено, что, по сравнению с белком Lc, не конъюгированным с проникающим в клетки пептидом, конъюгированный с проникающим в клетки пептидом рекомбинантный белок TD1-Lc проявляет отличное проникновение в нервные клетки. Этот результат подтверждает способность TD1 служить носителем таких макромолекул, как белки, на клеточном уровне.

6-3. Проверка способности к проникновению в нервные клетки методом конфокальной микроскопии

Для проверки клеткопроникающей способности проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина (TD1-Lc) в отношении клеток SiMa - линии клеток нейробластомы - культивировали клетки SiMa до конфлюентности 80% или выше в полной среде RPMI 1640 (10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина). Клетки стабилизировали путем многократного пересева, а для микроскопии стерилизовали в пламени покровные стекла на 12 мм и вносили в каждую лунку 24-луночного планшета, в который высеивали клетки SiMa и культивировали от 16 до 24 часов. К клеткам в среде без FBS добавляли каждый из образцов (носитель, Lc, TD1-Lc) в концентрации 5 мкг/мл, а затем инкубировали в течение 3 часов. После инкубации среду полностью удаляли отсасыванием, клетки дважды промывали PBS, а затем в каждую лунку добавляли 200 мкл 10% раствора формалина и фиксировали клетки при выключенном свете в течение 10 минут. После фиксации клеток удаляли фиксирующий раствор и дважды промывали клетки PBS в течение 10 мин. Затем проводили контрастное окрашивание при выключенном свете при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего удаляли раствор красителей и дважды промывали клетки PBS. Для наблюдения клеток вынимали покровные стекла и медленно укладывали их и монтировали без пузырей на предметные стекла, на которые по каплям наносили заливочный раствор. Предметные стекла тщательно высушивали при выключенном свете и рассматривали клетки под конфокальным микроскопом (Zeiss LSM700). В результате, как видно из фиг. 7b, было установлено, что, по сравнению с белком Lc, конъюгированный с проникающим в клетки пептидом рекомбинантный белок TD1-Lc проявляет отличное проникновение в нервные клетки.

6-4. Проверка способности к проникновению в кератиноциты методом конфокальной микроскопии

Для проверки клеткопроникающей способности проникающего в клетки рекомбинантного белка ботулотоксина (TD1-Lc) в отношении клеток НаСаТ - линии клеток кератиноцитов - культивировали клетки в полной среде DMEM (10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина). Для микроскопии стерилизовали в пламени покровные стекла на 12 мм и вносили в каждую лунку 24-луночного планшета, в который высеивали клетки НаСаТ и культивировали от 16 до 24 часов. К клеткам в среде без FBS добавляли каждый из образцов (носитель, Lc, TD1-Lc) в концентрации 5 мкМ, а затем инкубировали их в течение 1 часа, 3 часов и 6 часов. После инкубации среду из каждой лунки удаляли и дважды промывали клетки PBS, а затем в каждую лунку добавляли 200 мкл 10% раствора формалина для фиксации клеток в течение 10 мин при выключенном свете. После фиксации клеток удаляли фиксирующий раствор, дважды промывали клетки PBS в течение 10 мин и проводили контрастное окрашивание с помощью растворов красителей Hoechst и DAPI при комнатной температуре в течение 10 мин при выключенном свете. После окрашивания удаляли раствор красителей и дважды промывали клетки PBS. Для наблюдения клеток вынимали покровные стекла и медленно укладывали их и монтировали без пузырей на предметные стекла, на которые по каплям наносили заливочный раствор. Предметные стекла тщательно высушивали при выключенном свете и рассматривали клетки под конфокальным микроскопом (Zeiss LSM700). В результате, как видно из фиг. 7с, было установлено, что, по сравнению с белком Lc, конъюгированный с проникающим в клетки пептидом рекомбинантный белок TD1-Lc проявляет отличное проникновение в клетки кератиноцитов.

Пример 7. Оценка проникающей способности конъюгированного с проникающим в клетки пептидом TD1 рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc в отношении синтетического заменителя кожи

Для оценки способности к проникновению через кожный барьер у рекомбинантного белка TD1-Lc, в котором проникающий в клетки пептид (TD1) конъюгирован с белком легкой цепи ботулотоксина (Lc), проверяли кожепроникающую способность на синтетическом заменителе кожи (Strat-M™) с помощью автоматизированной камерной системы трансдермальной диффузии (MicroettePlus). Синтетический заменитель кожи состоит из верхнего слоя полиэфирсульфона (PES) для подавления абсорбции и нижнего слоя полиолефина, который может создавать разность поглощения вследствие пористой структуры, легко хранится и может применяться в системе без предварительной обработки. Кроме того, он широко применяется, так как проникающее количество, которое трудно измерить в настоящей коже, можно количественно определить в близких коже условиях. Для оценки проникающей способности на подготовленном синтетическом заменителе кожи вносили PBS в нижнюю часть вертикальной камеры таким образом, чтобы буферный раствор контактировал с синтетическим заменителем кожи без пустого пространства, а затем вносили образец в верхнюю часть вертикальной камеры. Во время опыта периодически отбирали 10% буферного раствора из нижней части вертикальной камеры, а в свободное пространство добавляли такое же количество буферного раствора. После опыта определяли количество образца в пробах методом ELISA. В результате, как видно из фиг. 8, оказалось, что проникающая способность у конъюгированного с новым проникающим в клетки MTD-пептидом TD1-Lc была примерно на 20% выше, чем у белка Lc легкой цепи ботулотоксина на синтетическом заменителе кожи. Видно, что степень проникновения через синтетический заменитель кожи по времени оказалась близкой вплоть до 6 часов после начала опыта, но через 12-24 часа после начала опыта проникающая способность у белка TD1-Lc была выше.

Пример 8. Оценка эффективности конъюгированного с проникающим в клетки пептидом TD1 рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc (анализ расщепления SNAP25 in vitro)

Белок SNAP25 является одним из белков SNARE, который расщепляется легкой цепью ботулотоксина типа А. Как правило, для проверки активности ботулотоксина применяется анализ расщепления SNAP25 in vitro. В одном типичном воплощении, для проверки активности легкой цепи (Lc) ботулотоксина (BoNT/A) использовали метод расщепления. К 2 мкг конъюгированного белка GST-SNAP25-EGFP добавляли 2 мкл буфера для анализа расщепления (10 мМ DTT, 10 мМ HEPES, 10 мМ NaCl и 20 мкМ ZnCl₂), а затем добавляли рекомбинантный белок TD1-Lc в различных концентрациях: 10, 30, 90, 270 и 810 нг и проводили реакцию при 37°С в течение 4 часов. В качестве положительного контроля добавляли 270 нг ботулотоксинового комплекса (комплекса BoNT/A), а затем добавляли тридистиллированную воду до общего объема 20 мкл и проводили реакцию при тех же условиях, как описано выше. В эту смесь по завершении реакции добавляли восстановительный буфер 5Х, нагревали при 100°С в течение 10 мин и подвергали электрофорезу в 12% геле для SDS-PAGE при 80 В в течение 20 мин и при 120 В в течение 1 часа. Гель после SDS-PAGE окрашивали с помощью красящего буфера (0,25% Кумасси бриллиантовый синий, 45% метанола, 10% уксусной кислоты), а затем удаляли краситель обесцвечивающим буфером (30% метанола, 10% уксусной кислоты), чтобы проверить белковый паттерн. В результате, как видно из фиг. 8, было установлено, что активность ботулотоксина сохраняется даже в рекомбинантном белке TD1-Lc. Из этого результата можно ожидать, что рекомбинантный белок TD1-Lc будет обладать той же функцией, что и ботулотоксин.

Пример 9. Оценка эффективности конъюгированного с проникающим в клетки пептидом TD1 рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc

9-1. Проверка расщепления SNAP25 на кератиноцитах человека (клетках НаСаТ)

Для оценки проникновения через кожу и эффективности рекомбинантного белка TD1-Lc в кератиноцитах (клетках НаСаТ) проводили анализ расщепления SNAP25 методом вестерн-блоттинга, которым можно проверить эффективность по расщеплению белка SNAP25. Кератиноциты (клетки НаСаТ) культивировали в 24-луночном планшете до плотности 1×10⁴ клеток на лунку в течение 24 часов, трансфецировали плазмидой pcDNA3.1-SNAP25 и котрансфецировали плазмидой pcDNA3.1-Lc в качестве положительного контроля. После гиперэкспрессии SNAP25 при 15-часовом культивировании меняли среду на среду без FBS, которую удаляли через 48 часов после обработки белком TD1-Lc, а затем промывали клетки PBS. После этого в каждую лунку добавляли 200 мкл буфера PJPA (Intron), чтобы лизировать клетки, а затем центрифугировали клетки при 4°С и 8000 об/мин в течение 10 минут, получая при этом надосадочную жидкость. Полученный супернатант смешивали с восстанавливающим буфером для образца 5Х, нагревали при 100°С в течение 10 минут и подвергали электрофорезу в 15% геле для SDS-PAGE при 80 В в течение 20 мин и при 120 В в течение 1 часа. После электрофореза гель переносили на мембрану PVDF (Millipore, IPVH00010) при 90 В в течение 1 часа и 10 минут, а после переноса мембрану блокировали 5% BSA в течение 2 часов. После этого добавляли первичное антитело (SMI-81, Covance), разведенное 5% BSA в соотношении 1:1000, и инкубировали при 4°С в течение 16 часов. После инкубации мембрану промывали PBST три раза или больше с интервалами в 10 минут, добавляли второе антитело (АР192Р, Millipore), разведенное 5% BSA в соотношении 1:2500, и инкубировали еще 1 час при комнатной температуре. После второй инкубации мембрану промывали PBST три раза или больше с интервалами в 10 минут, добавляли раствор ECL для следующей реакции, переносили на кассету и экспонировали на рентгеновской пленке в темной комнате. В результате, как видно из фиг. 10а, когда Lc экспрессируется в плазмиде или клетки снаружи обрабатываются белком, то во всех случаях отмечается расщепление SNAP25. Это означает, что добавленный извне белок TD1-Lc проникает в клетки кожи и расщепляет экспрессированный в них SNAP25. Таким образом, было установлено, что рекомбинантный белок TD1-Lc отлично проникает в клетки кожи и обладает активностью.

9-2. Проверка расщепления SNAP25 на клетках нейробластомы человека (клетках SiMa)

Для оценки проникновения через кожу и эффективности рекомбинантного белка TD1-Lc в клетках нейробластомы человека - клетках SiMa проводили анализ расщепления SNAP25 методом вестерн-блоттинга, которым можно проверить эффективность по расщеплению белка SNAP25.

Сначала клетки SiMa высеивали в 24-луночный планшет со средой RPMI, содержащей 10% FBS и 1% P/S, при плотности 5×10⁵ клеток на лунку. Клетки культивировали в течение ночи при 37°С, в инкубаторе с 5% СО₂, затем меняли среду на 1 мл среды для дифференцировки (10% FBS, RPMI, Glutamax, 1×NEAA, 1×В27, 1×N2, 5 мкМ RA, 2,5 мкМ PUR) и культивировали клетки в течение 24 часов. В среду для дифференцировки (10% FBS, RPMI, Glutamax, 1×NEAA, 1×В27, 1×N2, 5 мкМ RA, 2,5 мкМ PUR) добавляли GT1b в концентрации 25 мкг/мл, а затем меняли среду на 1 мл среды для дифференцировки. После 24 часов культивирования среду заменяли на 1 мл среды для дифференцировки (10% FBS, RPMI, Glutamax, 1×NEAA, 1×В27, 1×N2, 5 мкМ RA, 2,5 мкМ PUR), чтобы индуцировать дифференцировку. Клетки нейробластомы человека (клетки SiMa) культивировали в 24-луночном планшете при плотности 5×10⁵ клеток на лунку, подвергали дифференцировке в соответствии с методом дифференцировки нейронов, затем среду заменяли окончательной средой для дифференцировки, а через 4 часа клетки обрабатывали рекомбинантным белком TD1-Lc. После 48 часов обработки белком среду удаляли и промывали клетки PBS, лизировали добавлением в каждую лунку 200 мкл буфера RIP A (Intron) и центрифугировали при 4°С и 8000 об/мин в течение 10 минут, получая при этом надосадочную жидкость. Полученный супернатант смешивали с восстанавливающим буфером для образца 5Х, нагревали при 100°С в течение 10 минут и подвергали электрофорезу в 15% геле для SDS-PAGE при 80 В в течение 20 мин и при 120 В в течение 1 часа. После электрофореза гель переносили на мембрану PVDF. (Millipore, IPVH00010) при 90 В в течение 1 часа и 10 минут и блокировали 5% BSA в течение 2 часов. После этого добавляли первичное антитело (SMI-81, Covance), разведенное 5% BSA в соотношении 1:1000, и инкубировали при 4°С в течение 16 часов. После инкубации мембрану промывали PBST три раза или больше с интервалами в 10 минут, добавляли второе антитело (АР192Р, Millipore), разведенное 5% BSA в соотношении 1:2500, и инкубировали еще 1 час при комнатной температуре. После второй инкубации мембрану промывали PBST три раза или больше с интервалами в 10 минут, добавляли раствор ECL для следующей реакции, переносили на кассету и экспонировали на рентгеновской пленке в темной комнате. В результате, как видно из фиг. 10b, было установлено, что только белок TD1-Lc смог эффективно проникать в клетки нейробластомы человека. Таким образом, было установлено, что белок TD1-Lc может так же эффективно проникать через нервные клетки, как и клетки кожи.

Пример 10. Оценка цитотоксичности для клеток кожи конъюгированного с проникающим в клетки пептидом TD1 рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc

10-1. Оценка цитотоксичности на кератиноцитах человека (клетках НаСаТ)

Для оценки цитотоксичности рекомбинантного белка TD1-Lc в отношении клеток кожи человека проводили анализ методом МТТ для измерения жизнеспособности клеток. Сначала культивировали кератиноциты (клетки НаСаТ) в 24-луночном планшете при плотности 1×10⁴ клеток на лунку, а затем меняли среду на среду без FBS за 4 часа до обработки рекомбинантным белком TD1-Lc. Клетки обрабатывали белком при концентрациях от 0,625 мкг/мл до 40 мкг/мл в течение 48 ч, а затем еще 4 часа после добавления 10 мкл 5 мг/мл МТТ (Sigma-Aldrich). По завершении реакции культуральную среду отбрасывали, а в каждый образец добавляли 100 мкл DMSO и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего измеряли оптическую плотность (OD₅₇₀). В качестве контроля для эксперимента использовали белок легкой цепи ботулотоксина (Lc), не конъюгированный с TD1. В результате, как видно из фиг. 11а, было установлено, что рекомбинантный белок TD1-Lc не нарушает жизнеспособность кератиноцитов (клеток НаСаТ) даже при высокой концентрации в 40 мкг/мл, таким образом, он не проявляет цитотоксичности.

10-2. Оценка цитотоксичности на клетках нейробластомы человека (клетках SiMa)

Для оценки цитотоксичности рекомбинантного белка TD1-Lc в отношении клеток нейробластомы человека (клеток SiMa) проводили анализ методом МТТ для измерения жизнеспособности клеток. Клетки нейробластомы человека (клетки SiMa) культивировали в 24-луночном планшете при плотности 5×10⁵ клеток на лунку и подвергали дифференцировке в соответствии с методом дифференцировки нейронов. Через 4 часа после замены на окончательную среду для дифференцировки добавляли рекомбинантный белок TD1-Lc. Клетки обрабатывали белком при концентрациях от 0,625 мкг/мл до 40 мкг/мл в течение 48 часов, а затем еще 4 часа после добавления 10 мкл 5 мг/мл МТТ (Sigma-Aldrich). По завершении реакции культуральную среду отбрасывали, а в каждый образец добавляли 100 мкл DMSO и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего измеряли оптическую плотность (OD₅₇₀). В качестве контроля для эксперимента использовали белок легкой цепи ботулотоксина (Lc), не конъюгированный с TD1. В результате, как видно из фиг. 11b, было установлено, что обработанные рекомбинантным белком TD1-Lc клетки нейробластомы человека (клетки SiMa) сохраняют жизнеспособность, а цитотоксичность не проявляется даже при высоких концентрациях рекомбинантного белка TD1-Lc.

Пример 11. Оценка стабильности конъюгированного с проникающим в клетки пептидом TD1 рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc

В случае легкой цепи ботулотоксина, белки двух легких цепей после очистки образуют димер, причем образовавшийся димер из легких цепей обладает активностью саморасщепления и проявляет различную активность саморасщепления в зависимости от условий хранения. Поэтому, чтобы проверить устойчивость в зависимости от срока хранения рекомбинантного белка TD1-Lc, проверяли изменение паттерна белка по времени методом электрофореза SDS-PAGE. Определяли содержание рекомбинантного белка TD1-Lc и вносили по 10 мкг в каждую пробирку, а затем хранили при -80°С в ультранизкотемпературной морозильной камере. После 1, 3 и 6 месяцев хранения, по прошествии каждого срока, наносили каждый образец рекомбинантного белка TD1-Lc на 12%-й гель для проведения электрофореза SDS-PAGE, проверяя при этом изменения в чистоте и паттерне белка. В результате, как видно из фиг. 12, было установлено, что даже через 6 месяцев рекомбинантный белок стабильно сохраняется без изменения в паттерне белка.

Пример 12. Получение косметической композиции конъюгированного с проникающим в клетки пептидом TD1 рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc и оценка устойчивости к стимуляции кожи

Для клинического испытания рекомбинантного белка TD1-Lc была изготовлена косметическая композиция путем обработки рекомбинантного белка TD1-Lc по методу липосом на фирме Н&А Pharmachem, а затем обработки заключенного в липосомы белка вместе с косметическими ингредиентами.

Кроме того, для оценки безопасности от раздражения кожи для человека проводили испытания на фирме I.E.C. Korea (Корея), которая является предписанной контрактной исследовательской организацией (CRO). Испытания проводили путем внесения образцов для 32 здоровых мужчин и женщин в IQ-камеры и прикрепления пластыря с образцом на кожу спины у испытуемых, а через 48 часов определяли безопасность в отношении кожи человека по оценке и анализу степени раздражения кожи дерматологом. Накожные пробы ставили в виде одиночной окклюзионной кожной пробы, а степень раздражения кожи оценивали и анализировали по методике, разработанной Frosch & Kligman в соответствии с правилами CTFA, которые обычно применяются при оценке раздражения кожи. В качестве испытуемых добровольцев было отобрано 32 здоровых взрослых мужчин и женщин, подходящих по критериям отбора и исключения, согласно медицинским картам у дерматолога, который был менеджером испытания, а также по данным исследования, опроса и визуального осмотра, а при необходимости и пальпации, хотя один из них выбыл. Их возраст составлял от 20 до 36 лет, средний возраст составил 25,7±5,4, а соотношение мужчины : женщины было 13:18. После постановки одиночных кожных проб у 31 субъекта, прошедшего испытание, определяли степень раздражения кожи в соответствии с критериями оценки, и результаты представлены на фиг. 13. При определении степени раздражения по результатам раздражительной реакции кожи, общепринятые мировые стандарты, применимые в отношении раздражительной реакции кожи у человека, не были установлены. В норме, при испытании на 50 и более добровольцах, при оценке данных из одиночных кожных проб, появление раздражительных реакций с частотой более 20% от общего количества испытуемых (7 или больше, что составляет 20% из 31 добровольца в этом испытании) или появление раздражительных реакций на уровне +2 или выше по любым показателям у более чем 10% от общего числа испытуемых может рассматриваться как то, что данный материал способен вызывать значительное раздражение. В данном испытании, поскольку кожные реакции отслеживали в течение 48 часов после нанесения пластыря на кожу спины у 31 субъекта, было установлено, что данные образцы можно безопасно использовать в отношении кожи без раздражения.

Пример 13. Оценка эффективности исправления морщин у конъюгированного с проникающим в клетки пептидом TD1 рекомбинантного белка ботулотоксина TD1-Lc

Для оценки эффективности исправления морщин у рекомбинантного белка TD1-Lc проводили клиническое испытание на фирме I.E.C. Korea (Корея), которая является контрактной исследовательской организацией (CRO). Испытание проводилось на 22 корейских взрослых женщинах с носогубными складками в возрасте от 30 до 59 лет путем нанесения одного типа образца по два раза в день в течение 4-х недель самостоятельно в домашних условиях, измерения бугристости носогубных складок и эластичности кожи и оценки эффективности уменьшения складок кожи рекомбинантным белком TD1-Lc посредством клинической визуализации в сочетании с визуальной оценкой носогубных складок дерматологом. Бугристость носогубных складок измеряли с помощью системы Primos, а эластичность кожи - с помощью Cutometer МРА580.

При проведении испытания на людях первоочередной задачей было соблюдение прав, безопасности и благополучия испытуемых в духе Хельсинкской декларации и в соответствии с принципами GCP. Исследователи добросовестно выполняли следующие требования по обеспечению безопасности испытуемых:

- во время испытания менеджер испытания и персонал должны приложить все усилия для максимального обеспечения безопасности испытуемых и незамедлительно принимать соответствующие меры при всех необычных симптомах на коже для их уменьшения;

- во время испытания, если испытуемый сообщает о раздражении кожи или необычном симптоме, который вызван образцом, то используемый образец немедленно вытирается, а если этот симптом не исправляется, то менеджер испытания проводит дерматологическое обследование и назначает лечение;

- при появлении на коже необычного симптома, несмотря на нормальные процедуры испытаний, то проводится дерматологическое обследование и назначается лечение;

- при появлении других аномальных кожных реакций менеджер испытания и персонал должны принимать надлежащие меры наряду с дерматологическим обследованием, а также подробно записывать все случаи и ситуации;

- для измерения результата испытуемый посещает лабораторию, отдыхает в помещении с постоянной температурой и влажностью (22±2°С, 50±5%) в течение 15 минут или дольше, чтобы стабилизировать кожу, которая затем подвергается измерению и оценке.

В этом испытании, до и через 4 недели после применения образца, сканировали район носогубных складок и анализировали параметры бугристости кожи с помощью системы Primos. Бугристость кожи отражают следующие параметры:

- R_a: среднее арифметическое (средняя бугристость)

- R_max: максимальная бугристость от пика до впадины (максимальная бугристость)

- R_3z: среднее значение третьей высоты

- R_t: расстояние между самой высокой и самой низкой точками

- R_z: среднее значение максимальной высоты (по 10 точкам).

Эластичность кожи определяли по измерениям упругости (упругой восстанавливающей силы) в районе ямки на щеке с помощью Cutometer. Процесс, включающий всасывание при давлении 400 мбар в течение 2 секунд и отпускание в течение 2 секунд, повторяли три раза, а для повышения воспроизводимости результатов измерений время предварительного натяжения было установлено на 0,1 сек. При всасывании и отпускании кожи проводили измерения, из которых получали параметры, которые следует интерпретировать следующим образом:

- R₅: чистая эластичность кожи без вязкой деформации

- R₇: участок эластичности относительно полной кривой.

Визуальная оценка носогубных складок проводилась путем визуального осмотра состояния левой или правой носогубной складки у каждого субъекта дерматологом до (D+0) и через 4 недели (D+28) после применения образца в соответствии с фотографической шкалой.

До и после применения образца определяли статистическую значимость бугристости носогубных складок, эластичности кожи и визуальной оценки дерматологом, и если отмечались значительные изменения бугристости носогубных складок, параметров эластичности кожи и визуальной оценки носогубных складок дерматологом до и после применения образца, то делали вывод, что носогубные складки или эластичность улучшаются.

Для статистического анализа использовали программу SPSS 14.0, а по результатам измерений на приборах проводили проверку нормального распределения данных по критерию Shapiro-Wilk. Все 22 субъекта были определены как подходящие испытуемые, причем у всех испытания завершились при последних посещениях, при этом были получены эффективные данные по окончательным 22 испытуемым (средний возраст: 46,1).

В результате, как видно из фиг. 14а, после 4-недельного применения образца значительно снижались параметры R_a, R_max, R_3z, R_z и R_t, отражающие бугристость кожи в районе носогубных складок, что означает исправление носогубных складок. Кроме того, как видно из фиг. 14b, после 4-недельного применения образца оказалось, что параметры R₅ и R₇, отражающие эластичность кожи, значительно возрастали, что означает улучшение эластичности кожи. Визуальная оценка носогубных складок также показала, что носогубные складки значительно уменьшились после 4-недельного применения образца, как видно из фиг. 14с, и эффективность уменьшения морщин подтверждается визуально, как видно из фиг. 15.

Рядовым специалистам в данной области должно быть понятно, что приведенные выше описания настоящего изобретения приводятся для примера, а приведенные в нем типичные воплощения можно легко модифицировать в другие конкретные формы без изменения технического духа или существенных признаков настоящего изобретения. Таким образом, следует иметь в виду, что описанные выше примерные воплощения являются типичными во всех аспектах и не являются ограничительными.

Промышленная применимость

Поскольку рекомбинантный белок ботулотоксина с проникающим в клетки пептидом настоящего изобретения можно вводить трансдермально, то он может проявлять присущие ботулотоксину эффекты при максимальной легкости применения и поэтому может применяться в качестве более безопасной и предпочтительной терапевтической альтернативы. Таким образом, рекомбинантный белок ботулотоксина с проникающим в клетки пептидом настоящего изобретения может эффективно применяться в качестве местного средства для лечения различных заболеваний и в эстетических и/или косметологических целях.

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к проникающему в клетки пептиду. Указанный пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и обладает способностью опосредовать внутриклеточную доставку легкой цепи ботулотоксина. Изобретение также относится к конъюгату для внутриклеточной доставки легкой цепи ботулотоксина. В указанном конъюгате легкая цепь ботулотоксина конъюгирована одним или обоими концами с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Изобретение также относится к вектору и к бактерии, которые экспрессируют указанный конъюгат. Настоящее изобретение относится к косметическим и фармацевтическим композициям, которые содержат указанный конъюгат и предназначены для лечения дерматологических заболеваний. Изобретение позволяет получать композиции для лечения дерматологических заболеваний. 12 н. и 11 з.п. ф-лы, 15 ил., 1 табл., 13 пр.

1. Проникающий в клетки пептид, способный опосредовать внутриклеточную доставку легкой цепи ботулотоксина, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

2. Полинуклеотид, кодирующий пептид по п. 1.

3. Полинуклеотид по п. 2, который состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2.

4. Конъюгат для внутриклеточной доставки легкой цепи ботулотоксина, в котором легкая цепь ботулотоксина конъюгирована одним или обоими концами с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.

5. Конъюгат по п. 4, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31 – SEQ ID NO: 58.

6. Конъюгат по п. 4, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3 – SEQ ID NO: 9.

7. Конъюгат по п. 4, который дополнительно содержит гексагистидиновую метку-тег на одном конце.

8. Конъюгат по п. 4, в котором легкая цепь ботулотоксина выбрана из группы, состоящей из серотипов A, B, C, D, E, F и G ботулотоксина.

9. Конъюгат по п. 4, в котором конъюгирование представляет собой конъюгирование с C-концом или N-концом легкой цепи ботулотоксина или с обоими концами.

10. Конъюгат по п. 4, в котором конъюгирование осуществляется при помощи пептидной связи или ковалентной связи.

11. Полинуклеотид, кодирующий конъюгат по п. 4.

12. Полинуклеотид по п. 11, который состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59 – SEQ ID NO: 86.

13. Вектор, экспрессирующий конъюгат по п. 4, содержащий полинуклеотид по п. 11.

14. Вектор по п. 13, который содержит аффинную метку-тег, выбранную из группы, состоящей из His, HAT, FLAG, c-myc, SBP, связывающего хитин домена, глутатион-S-трансферазы и связывающего мальтозу белка.

15. Рекомбинантная бактерия, экспрессирующая конъюгат по п. 4, содержащая вектор по п. 13.

16. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из лицевых спазмов, спазмов век, кривошеи, блефароспазма, шейной дистонии, дистонии ротоглотки, спастической дисфонии, мигрени, анального зуда и потливости, включающая эффективное количество конъюгата по п. 4 в качестве активного ингредиента.

17. Фармацевтическая композиция по п. 16, которая предназначена для трансдермального введения.

18. Композиция наружного кожного средства для сокращения количества и глубины морщин, квадратной челюсти и острой челюсти, травм, размягчения кожи, шрамов, прыщей, пор, эластичности или келоидов, включающая эффективное количество конъюгата по п. 4 в качестве активного ингредиента.

19. Косметическая композиция, включающая эффективное количество конъюгата по п. 4 в качестве активного ингредиента.

20. Композиция по п. 19, которая применяется для сокращения количества и глубины морщин, квадратной челюсти и острой челюсти, травм, размягчения кожи, шрамов, прыщей, пор, эластичности или келоидов.

21. Способ лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из лицевых спазмов, спазмов век, кривошеи, блефароспазма, шейной дистонии, дистонии ротоглотки, спастической дисфонии, мигрени, анального зуда и потливости, который включает трансдермальное введение субъекту конъюгата по п. 4.

22. Способ сокращения количества и глубины морщин, квадратной челюсти и острой челюсти, травм, размягчения кожи, шрамов, прыщей, пор, эластичности или келоидов, который включает трансдермальное введение субъекту конъюгата по п. 4.

23. Способ получения конъюгата по п. 4, который включает культивирование трансформированной бактерии по п. 15.