ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM SP. - ПРОДУЦЕНТ L-ЛИЗИНА Российский патент 1995 года по МПК C12N1/20 C12P13/08 C12N1/20 C12R1/13 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма-продуцента L-лизина, незаменимой аминокислоты, которую используют в качестве кормовой добавки.

В известных микробиологических способах получения лизина главным образом используются ауксотрофные по гомосерину мутанты бактерий Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum (патенты ФРГ 2321461, 2531999; США 4275157, 4411997 [1] авт. свидетельства СССР 671384, 869332, 1369301, 1453897, 1515702).

Известны также аналогорезистeнтные штаммы Brevibacterium lactofermentum, ауксотрофные по аланину (патент США 406650) и двойные ауксотрофы по серину и лейцину [2] Описанные штаммы на средах с мелассой (содержание сахаров 10-12% ) при выращивании в колбах на качалке накапливают лизин в количестве 38-50 г/л за 66-72 ч ферментации. При этом конверсия сахара в лизин составляет 32-41%
Задачей является получение штамма-продуцента с повышенным уровнем накопления лизина и обладающим устойчивостью к бактериофагу, лизирующему штамм-прототип Brevibacterium sp. 90.

Предлагаемый новый штамм-продуцент лизина Brevibacterium sp. 92 накапливает до 92 г/л лизина за 72 ч на мелассных средах и до 115 г/л на среде с сахаром. При этом коэффициент конверсии составляет 44-50%
Штамм Brevibacterium sp. 92 депонирован в коллекции микроорганизмов (ВНИИА) Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков Минмедбиопрома СССР (регистрационный номер RIA 2153).

Штамм Brevibacterium sp. 92 получен от штамма Brevibacterium sp. 90 путем отбора фагорезистентных мутантов, устойчивых к бактериофагу фBL2, который был выделен на производстве лизина, с последующим отбором продуктивных по лизину штаммов. Если эффективность высева фага фBL2 на штамм прототип Brevibacterium sp. 90 принята за 1, то эффективность высева этого фага на новый штамм 92 менее 2 х 10^-10.

Новый штамм Brevibacterium sp. 92 имеет следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки овальные, размеры 1,0-1,5 х 0,6-0,8 мкм, неподвижные, грамположительные, спор не образуют.

Через 3-5 сут роста при 30^оС на мясо-пептонном агаре (МПА) и на агаре Хоттингера колонии диаметром 1-5 мм, желтые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная тестообразная. При посеве штрихом через 2 сут рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая. При посеве уколом рост в глубине агара слабый, на поверхности умеренный.

Через 3-5 сут роста при 30^оС на глюкозо-минеральной среде Гловера, содержащей лейцин, биотин и тиамин, колонии размером 1-2 мм, край ровный, структура однородная, консистенция тестообразная, поверхность гладкая, цвет колоний лимонно-желтый. Рост штриха на этой среде через 2 сут умеренный.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Желатину не разжижает.

Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе. этаноле, уксусной кислоте. Не растет на ксилозе, арабинозе, лактозе, раффинозе.

Усваивает азот в форме солей аммония и мочевины. Не усваивает нитратный азот.

Растет при 24-42^оС. Оптимальная температура 31^оС.

Растет на средах с рН 6,0-8,5. Оптимальное значение рН 6,8-7,2.

Для роста в минимальной среде нуждается в биотине, тиамине и L-лейцине.

Устойчив к бактериофагам, лизирующим штамм-прототип Brevibacterium sp. 90 и промышленный штамм Brevibacterium sp. Е531.

Устойчив к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-цистеину (АЭЦ).

Штамм хранится при 4^оС на косяках с агаром Хоттингера в течение 6 мес или в лиофильно высушенных ампулах в течение 1 года.

Получение лизина с использованием штамма Brevibacterium sp. 92 осуществляется следующим образом. Клетки штамма выращивают на агаризованной полноценной среде, затем засевают колбы с посевной средой. Колбы устанавливают на круговую качалку (220-240 об./мин) и инкубируют в течение 18-24 ч при 31^оС. Выращенный посевной материал вносят в ферментеры с ферментационной средой, содержащей источник углерода, минеральные соли и ростовые факторы. Ферментацию проводят при 30-32^оС в течение 60-75 ч. В ходе ферментации производят подпитку.

Новый штамм Brevibacterium sp. 92 позволяет получать высокий уровень накопления лизина с различными источниками углерода: на мелассе до 92 г/л за 72 ч; на глюкозе до 95 г/л за 72 ч; на сахаре до 115 г/л за 72 ч. Коэффициент конверсии сахаров в лизин составляет 44-50%
Достигаемый с помощью нового штамма уровень накопления лизина существенно превышает максимальные результаты, достигнутые при использовании штамма-прототипа. Новый штамм устойчив к бактериофагам, лизирующим штамм-прототип и промышленный штамм Brevibacterium sp. Е531.

Препарат L-лизина из ферментационного раствора готовят в виде кормового концентрата или выделяют как кристаллический продукт известными способами.

П р и м е р 1. Клетки штамма Brevibacterium sp. 92, выращенные при 30^оС в течение 1-2 сут на МПА, петлей засевают колбы объемом 750 мл с 50 мл посевной среды следующего состава, меласса 4; гидролизат кукурузного экстракта 2,0 (в расчете на технический вес кукурузного экстракта); KH₂PO₄ 0,1, мел 1,0. Все компоненты посевной среды стерилизуются совместно. Колбы помещают на круговую качалку (240 об./мин) и выращивают в течение 18 ч при 32^оС. Готовым посевным материалом в количестве 8% засевают ферментационную среду следующего состава, меласса 22,0; (NH₄)₂SO₄ 1,0; KH₂PO₄ 0,14; MnSO₄ x 7H₂O 0,002; FeSO₄ x 7H₂O 0,002; гидролизат рыбной муки 1,5 (в расчете на технический вес муки). Меласса стерилизуется отдельно от остальных компонентов среды. 1,3 л ферментационной среды помещают в лабораторный ферментер марки Anglicon объемом 3 л. Ферментацию проводят при 32^оС с перемешиванием (1200 оборотов мешалки в мин). Стерильный воздух в первые 8 ч ферментации подается со скоростью 0,6 л/мин, а далее 1,3 л/мин. Значение рН среды в пределах 7,0-7,2 поддерживают путем автоматической подачи 12%-ного водного раствора аммиака. Через 22 ч после начала ферментации производят подачу подпитки следующего состава, меласса 60; NH₄Cl 4,5; гидролизат рыбной муки 0,5 (на технический вес муки). Подпитку подают со скоростью, обеспечивающей концентрацию сахаров в среде в пределах 0,5-1,5% Через 72 ч после начала ферментации содержание лизина в среде достигает 92 г/л (в расчете на монохлоргидрат лизина). Коэффициент конверсии сахара в лизин составляет 45%
П р и м е р 2. Выращивание посевного материала и условия ферментации по примеру 1, но в состав ферментационной среды и подпитки вместо гидролизата рыбной муки добавляют гидролизат кукурузного экстракта в количестве соответственно 3,0 и 1,5% (по техническому весу). Через 60 ч ферментации содержание лизина в среде достигает 78 г/л, а через 72 ч 84,5 г/л. Коэффициент конверсии сахара в лизин составляет 45,3%
П р и м е р 3. Выращивание посевного материала и условия ферментации по примеру 1, но в состав ферментационной среды вместо гидролизата рыбной муки добавляют гидролизат рапсовой муки в концентрации 3,0% (по техническому весу рапсовой муки). Состав подпитки, сахар-сырец 60; гидролизат рапсовой муки 3,0 (по техническому весу рапсовой муки). Через 60 ч ферментации содержание лизина в культуральной жидкости 84 г/л, а через 72 ч 96 г/л. Коэффициент конверсии сахара в лизин составляет 49%
П р и м е р 4. Выращивание посевного материала по примеру 1. Состав ферментационной среды, глюкоза 11,0; гидролизат соевого шрота 2,0 (на технический вес соевого шрота); L-лейцин 0,04; KH₂PO₄ 0,2; MgSO₄ x 7H₂O 0,1; MnSO₄ x 7H₂O 0,002; FeSO₄ x 7H₂O 0,002; дестиобиотин 0,00002; тиамин 0,00001. Ферментацию проводят в лабораторных ферментерах емкостью 3 л с начальным объемом среды 1,3 л. Скорость вращения мешалки 1000 об./мин, скорость подачи воздуха в первые 8 ч 0,6 л/мин, далее до конца ферментации 1,5 л/мин. рН среды поддерживается автоматически в пределах 7,0-7,2 путем добавления по сигналу датчика рН водного раствора аммиака. Через 24 ч после начала ферментации производят автоматическую подачу подпитки со скоростью, обеспечивающей поддержание концентрации сахаров в среде в пределах 1-2% Состав подпитки, глюкоза 55; гидролизат соевого шрота 3,0 (на технический вес соевого шрота); (NH₄)₂SO₄ 1,2; L-лейцин 0,04; KH₂PO₄ 0,2; дестиобиотин 0,00002; тиамин 0,00001. Через 72 ч ферментации содержание лизина в культуральной жидкости составляет 95 г/л, конверсия углеводов в лизин 45,1%
П р и м е р 5. Выращивание посевного материала по примеру 1. Состав ферментационной среды, сахар технический 11,0; гидролизат соевого шрота 1,0; L-лейцин 0,06; (NH₄)₂SO₄ 0,5; KH₂PO₄ 0,2; MgSO₄ x х7H₂O 0,1; дестиобиотин 0,00001; тиамин 0,00001. Ферментацию проводят в лабораторных ферментерах емкостью 3 л с начальным объемом среды 1,3 л. Скорость вращения мешалки 1000 об./мин, скорость подачи воздуха первые 8 ч 0,5 л/мин, далее до конца ферментации 1,5 л/мин. рН среды поддерживается автоматически в пределах 7,0-7,2 путем добавления по сигналу датчика рН водного раствора аммиака. Через 20 ч после начала ферментации производят автоматическую подачу подпитки со скоростью, обеспечивающей поддержание концентрации сахаров в среде в пределах 1-2% Состав подпитки, сахар технический 50; гидролизат соевого шрота 3,0; (NH₄)2SO₄ 2,0; KH₂PO₄ 0,1; дестиобиотин 0,00001; тиамин 0,00001. Через 72 ч ферментации содержание лизина в культуральной жидкости составляет 115 г/л, конверсия углеводов в лизин 50%
П р и м е р 6. Клетки штамма Brevibacterium sp. 92, выращенные при 30^оС в течение 1-2 сут на МПА, петлей засевают в колбы объемом 750 мл с 50 мл посевной среды следующего состава, меласса 4; гидролизат кукурузного экстракта 1,5 (в расчете на технический вес кукурузного экстракта); L-лейцин 0,2; мел 1,0. Все компоненты посевной среды стерилизуются совместно. Колбы помещают на круговую качалку (240 об./мин) и выращивают в течение 20 ч при 32^оС. Готовым посевным материалом в количестве 5% засевают ферментационную среду следующего состава, сахар технический 11; L-лейцин (в виде культуральной жидкости с концентрацией лейцина 20 г/л) 0,05; (NH₄)₂SO₄ 0,7; KH₂PO₄ 0,2; MnSO₄ x 7H₂O 0,001; FeSO₄ x х7H₂O 0,001; гидролизат БВК 1,5 (в расчете на технический вес БВК); дестиобиотин 0,00002; тиамин 0,00001. 1,3 л ферментационной среды помещают в лабораторный ферментер марки Anglicon объемом 3 л. Ферментацию проводят при 32^оС с перемешиванием (1200 оборотов мешалки в мин). Скорость подачи воздуха 1,3 л/ч. Через 20 ч после начала ферментации производят автоматическую подачу подпитки следующего состава (%): сахар 60; (NH₄)₂SO₄ 10,0; гидролизат БВК 2,0 (на технический вес БВК); L-лейцин 0,06. Подача подпитки производится со скоростью, обеспечивающей концентрацию сахаров в среде в пределах 0,5-2,0% Через 72 ч ферментации содержание лизина в культуральной жидкости достигает 93 г/л. Коэффициент конверсии сахара в лизин составляет 48%
П р и м е р 7. Выращивание посевного материала по примеру 1. Состав ферментационной среды, меласса 2,0; NH₄CH₃COO 1,5; гидролизат БВК 2,0 (на технический вес БВК); L-лейцин 0,05; (NH₄)₂SO₄ 0,2; KH2PO₄ 0,2; MgSO₄ x 7H₂O 0,04; MnSO₄ x 7H₂O 0,002; FeSO₄ x 7H₂O 0,002; дестиобиотин 0,00001; тиамин 0,00001. Ферментацию проводят в лабораторных ферментерах емкостью 3 л с начальным объемом среды 1,3 л. Скорость вращения мешалки 1000 об./мин, скорость подачи воздуха 1,5 л/мин. рН среды поддерживается автоматически в пределах 7,0-7,2 путем добавления по сигналу датчика рН ацетатно-мелассной подпитки следующего состава, меласса 26; уксусная кислота 35; гидролизат БВК 0,8 (по техническому весу БВК). Через 67 ч ферментации содержание лизина в культуральной жидкости составляет 85 г/л, конверсия углеводов в лизин 39%

Использоване: микробиология, биотехнология, кормопроизводство. Сущность изобретения: новый штамм бактерий Brevibacterium sp. RIA 2153 - продуцент L-лизина. Получен путем отбора фагорезистентных мутантов продуцента лизина Brevibacterium sp. 90 с последующим отбором продуктивных по лизину штаммов. Новый штамм Brevibacterium sp. RIA 2153 позволяет получить 90 - 115 г/л лизина на средах с различными источниками углерода.

Штамм бактерий Brevibacterium sp. RIA 2153 продуцент L-лизина.