ПРИМЕНЕНИЕ БИСФОСФОНАТОВ В КАЧЕСТВЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО ЛЕЧЕНИЯ ВИЧ/СПИД Российский патент 2018 года по МПК A61K31/663 A61K9/127 A61P31/18 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[001] Настоящее изобретение относится к применению композиций, разработанных для лечения или контроля ВИЧ/СПИД. Способ по настоящему изобретению включает введение состава, содержащего эффективное количество бисфосфоната, для ингибирования активности моноцитов и/или макрофагов и/или для уменьшения воспаления и/или для уменьшения резервуаров вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Применение заявленных композиций может дополнять антиретровирусную терапию, такую как высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[002] ВИЧ-инфекция/синдром приобретенного иммунодефицита (ВИЧ/СПИД) представляет собой заболевание иммунной системы человека, вызванное инфицированием вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). С момента своего открытия в начале 1980-х годов СПИД приобрел характер пандемии и явился причиной летального исхода у более 25 миллионов человек. В настоящее время приблизительно 35 миллионов человек по всему миру живут с ВИЧ/СПИД и остро нуждаются в эффективном, доступном, длительном лечении и контроле данного заболевания.

[003] ВИЧ может инфицировать различные иммунные клетки, при этом CD4⁺ Т-клетки и моноциты/макрофаги являются основными мишенями. ВИЧ сначала атакует клетку-мишень путем слияния оболочки вируса с мембраной клетки и высвобождения капсида ВИЧ в клетку. Внутри инфицированной клетки геном ВИЧ, представленный одноцепочечной РНК, подвергается обратной транскрипции в двухцепочечную вирусную ДНК, и вирусная ДНК встраивается в геном инфицированной клетки. Далее вирус задействует клеточные механизмы инфицированной клетки, чтобы образовать РНК геном, а также белковые компоненты вируса, которые собираются в незрелые вирионы ВИЧ внутри инфицированной клетки. После окончательной сборки на клеточной поверхности, незрелые ВИЧ-вирионы отпочковываются от клеточной мембраны инфицированной клетки и после конечной стадии расщепления протеазами полученные в результате зрелые вирионы высвобождаются, завершая цикл репликации. ВИЧ быстро реплицируется в течение первых 2-4 недель после инфицирования, что приводит к заметному снижению числа циркулирующих CD4⁺ Т-клеток. После мобилизации до сих пор в значительной степени неповрежденной иммунной системы для борьбы с репликацией ВИЧ, уровень вируса находится под контролем и количество CD4⁺ Т-клеток стабилизируется таким образом, что ВИЧ-инфекция переходит в клинически латентное состояние, которое может длиться от трех лет до более чем 20 лет. Так как ВИЧ разрушает иммунную систему, в конечном итоге уровень CD4⁺ Т-клеток падает до критического уровня, и ВИЧ-инфекция прогрессирует в СПИД. Пациенты со СПИД часто умирают от оппортунистических инфекций в результате разрушения их иммунной системы. ВИЧ также может повреждать нервную систему, проникая в мозг посредством инфицированных иммунных клеток на ранних стадиях инфекции и далее распространяясь на резидентные иммунные клетки центральной нервной системы, такие как клетки микроглии и астроциты. Данные инфекции могут повреждать головной и спинной мозг и вызывать такие симптомы, как помрачение сознания и забывчивость, поведенческие изменения, головные боли, прогрессирующую слабость и потерю чувствительности в руках и ногах.

[004] Наиболее распространенное лечение ВИЧ/СПИД представляет собой высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ), в которой применяют комбинации (или «коктейли») соединений, которые содержат несколько классов противовирусных агентов. Образование вирусных частиц у инфицированных индивидуумов в значительной степени является результатом динамического процесса, включающего непрерывные циклы первичного инфицирования и репликации в активированных CD4⁺ Т-клетках с быстрым оборотом как свободного вируса, так и вирус-продуцирующих клеток. Данные противовирусные коктейли ингибируют стадии цикла репликации ВИЧ, включающие проникновение, обратную транскрипцию, встраивание, сборку и высвобождение. Таким образом, ВААРТ приостанавливает цикл репликации ВИЧ, что приводит к снижению числа незрелых вирионов ВИЧ и клеток-хозяев, что приводит к сдерживанию ВИЧ-инфекции.

[005] Тем не менее современная противовирусная терапия не избавляет от ВИЧ-инфекции, так как другие ВИЧ-инфицированные клетки, включая CD4⁺ Т-клети памяти в состоянии покоя и моноциты/макрофаги, имеют продолжительное время полужизни, и, таким образом, служат в качестве резервуаров вируса. ВААРТ также обладает такими недостатками как высокая стоимость, побочные токсические эффекты, взаимодействие между препаратами и лекарственная устойчивость. Иногда данные побочные эффекты вызывают необходимость проведения структурированных перерывов в терапии ("СПТ" или лекарственных каникул) или прекращения лечения в целом. Устойчивость к лекарственным препаратам является серьезной проблемой при ВААРТ: обратная транскрипция РНК ВИЧ обладает предрасположенностью к ошибкам, что приводит к введению мутации в геном вируса. Продолжительное введение противовирусного лекарственного средства обеспечивает естественный отбор в отношении устойчивых к лекарствам мутантных штаммов вируса. Существует теория, что СПТ может позволить более «приспособленным» чувствительным к лекарствам вирусам дикого типа опередить рост менее «приспособленных» устойчивых к лекарствам мутантных штаммов. По этой дополнительной причине часто рекомендуют делать перерывы в противовирусной терапии структурированным образом. Тем не менее, восстановление плазматических вирусных нагрузок (ВН) и снижение количества CD4⁺ Т-клеток является распространенным во время СПТ, что тем самым нивелирует эффект от лечения ВААРТ. Вирионы, в частности, устойчивые к лекарствам вирионы, секвестрированные в резервуарах ВИЧ, более не супрессируются во время СПТ и могут созревать и высвобождаться. Считается, что это является причиной неудачи в терапии во время СПТ и менее эффективная супрессия часто достигается при помощи ВААРТ, когда ее впоследствии назначают повторно.

[006] Инфицированные CD4⁺ Т-клетки памяти в состоянии покоя, моноциты и макрофаги представляют собой резервуары для ВИЧ, включая устойчивые к лекарствам штаммы. Кроме того, моноциты продуцируют цитокины, например, ФНОα, которые вызывают репликацию ВИЧ в других инфицированных клетках, к примеру, CD4⁺ Т-клетках. Инфицированные активированные макрофаги способны запускать апоптоз неинфицированных Т-клеток и защищать ВИЧ-инфицированные Т-клетки от апоптоза. Таким образом, моноциты и макрофаги обеспечивают пул вирусов, готовых к репликации во время СПТ, и их физиологическая активность также усиливает поражение иммунной системы ВИЧ-инфекцией. В некоторых исследованиях моноциты и макрофаги были задействованы при терапии ВИЧ/СПИД, однако терапевтическая эффективность данных подходов была ограничена.

[007] В результате клинических исследований, изучающих эффект выделенных при помощи селективного афереза циркулирующих моноцитов, были получены неоднозначные результаты. Селективный аферез включает пропускание крови от ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих ВААРТ, через экстракорпоральное устройство для удаления циркулирующих моноцитов и гранулоцитов. В одном исследовании аферез во время ВААРТ не повлиял на нагрузку РНК ВИЧ-1 в плазме по сравнению с контрольной группой, однако понизил уровень ФНО-α и увеличил количество CD4⁺ Т-клеток после 3-4 сеансов афереза (Beretta, А. и др., J. Biol. Regulators and Homeostatic Agents 14, 27-31 (2000).) В другом исследовании селективный аферез моноцитов и гранулоцитов проводили в течение первых 5 недель СПТ. При повторном назначении ВААРТ группа, в которой проводили аферез, продемонстрировала увеличение количества CD4⁺ Т-клеток. При повторном назначении ВААРТ не удалось подавить восстановление количества вируса у большинства, но не у всех, в контрольной группе, в то время как большая часть группы, в которой проводили аферез, продемонстрировала супрессию вируса. В некоторых случаях в группе, в которой проводили аферез, наблюдали снижение вирусной нагрузки ВИЧ в моноцитах до 52%, однако улучшение, сравнимое с контрольной группой, наблюдали у других (Hasson Н. и др., J. Med. Virol. 79, 1640-49 (2007).) Данные немногочисленные результаты могут быть объяснены тем фактом, что аферез в результате приводит к среднему снижению лишь 30% циркулирующих моноцитов, а циркулирующие моноциты представляют небольшую часть от общего пула моноцитов/макрофагов в теле. Другим ограничением таких подходов является то, что аферез представляет собой инвазивную и продолжительную процедуру в условиях стационара, которая может значимо обременять пациентов.

[008] Другие исследователи также изучали лекарственные средства, ингибирующие макрофаги, на моделях ВИЧ у животных и обнаружили положительный эффект на контроль вирусной нагрузки и CD4⁺ Т-клеточное восстановление после прекращения ВААРТ. Для того, чтобы достичь специфичного и эффективного нацеливания макрофагов, лекарственные средства включали в «тени эритроцитов» (лопнувшие красные кровяные тельца) (см. Cervasi, В. и др., J. Viol. 80, 10335-45 (2006); Serafini, S. и др., Antirivial Res. 81, 93-102 (2009).). Тем не менее, тени эритроцитов трудно получить и хранить, что делает их совсем не идеальным выбором для доставки лекарственных средств при значительном спросе. Более того, тени эритроцитов быстро высвобождают их содержимое из-за присущего протекания и нормального физиологического процесса, который элиминирует красные кровяные тельца. Полученная в результате повышенная концентрация лекарственного средства в плазме приводит к токсикологическим проблемам. (See Lanao, J. М. и др., J. Drug Targeting 15(1), 21-36 (2007).)

[009] Поскольку надежного лечения или эффективной вакцины против ВИЧ учеными до сих пор не обнаружено, жизненно важно замедлить прогрессирование ВИЧ-инфекции и поддерживать клиническое латентное состояние как можно дольше. Соответственно существует потребность в данной области техники для безопасного и эффективного подхода к супрессии репликации вируса у пациентов с ВИЧ/СПИД в дополнение к ВААРТ, в частности, во время СПТ. Более того желательно, чтобы такой подход был легко управляем и обладал потенциалом для массового производства, чтобы удовлетворить спрос большого числа людей с ВИЧ/СПИД.

[010] В настоящем изобретении использовано преимущество специфичного нацеливания на моноциты и макрофаги, латентные резервуары ВИЧ, и тем самым предотвращение или замедление восстановления вирусных нагрузок ВИЧ. Ожидается, что состав будет улучшать безопасность СПТ и увеличивать продолжительность СПТ. Принимая во внимание физическое и финансовое бремя ВААРТ у пациентов с ВИЧ/СПИД и систему общественного здравоохранения, более безопасные и более продолжительные СПТ являются весьма желательными для долгосрочного контроля данного заболевания. По сравнению с предшествующим уровнем техники, в качестве дополнительной терапии к антивирусному лечению ВИЧ/СПИД состав согласно настоящему изобретению легко вводить, он является неинвазивным, его легко хранить и распространять, и может быть приспособлен для массового производства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[011] Настоящее изобретение относится к применению лекарственных композиций для лечения или контроля ВИЧ/СПИД, в частности, к дополнению и поддержанию эффекта противовирусной терапии во время СПТ или после прекращения противовирусной терапии. Способы согласно настоящему изобретению включают введение эффективного количества одного или более терапевтических агентов в составе композиции, разработанной для ингибирования активности и/или уменьшения числа фагоцитарных клеток. Такие фагоцитарные клетки включают, но не ограничиваются ими, макрофаги и моноциты. Терапевтические агенты предпочтительно включают бисфосфонаты. Такое введение согласно настоящему изобретению ориентировано на супрессирование или деплецию резервуаров ВИЧ (включая латентные резервуары) во время противовирусной терапии и СПТ, также как и на помощь в повышении уровня периферических CD4⁺ Т-клеток, чтобы предотвратить или замедлить восстановление вирусов, в частности когда речь идет о СПТ.

[012] В частности, настоящее изобретение относится к способу уменьшения числа (деплеции) резервуаров ВИЧ (т.е., моноцитов/макрофагов) и/или ингибирования их функции для лечения или контроля ВИЧ/СПИД путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества состава, содержащего бисфосфонат, необязательно в комбинации с другими терапевтическими агентами.

[013] Бисфосфонаты (ранее называемые дифосфонаты) представляют собой соединения, характеризующиеся двумя углерод-фосфатными (С-Р) связями. Они являются аналогами эндогенного неорганического пирофосфата, который участвует в регуляции образования и резорбции костной ткани. Если две связи образованы одним и тем же углеродным атомом (Р-С-Р), их называют геминальными бисфосфонатами, при этом термин бисфосфонаты, в целом, применяют для геминальных и негеминальных бисфосфонатов. Бисфосфонаты и пирофосфаты временами могут совместно образовывать полимерные цепочки. В клинических условиях бисфосфонаты в основном применяют в качестве сильнодействующих ингибиторов резорбции кости и эктопической кальцификации; в последнее время показания к их применению изучаются в других областях, и инкапсулированные в липосомы бисфосфонаты были предложены для лечения сердечнососудистых заболеваний, включая рестеноз. См., к примеру, патент США №6719998.

[014] Состав, применяемый в заявленном способе, может содержать инкапсулированный, бисфосфонат в виде включений или бисфосфонат в виде частиц. Составы содержат частицы, обладающие свойствами, которые позволяют составу проникать в клетку в основном или исключительно посредством фагоцитоза и, следовательно, предполагается, что состав специфически нацелен на фагоцитарные клетки. Без связи с какой-либо теорией, после поглощения с помощью фагоцитоза целевыми фагоцитарными клетками, макрофагами и моноцитами, бисфосфонат высвобождается в этих фагоцитарных клетках и ингибирует их функцию и/или приводит к уменьшению их числа.

[015] В одном варианте реализации состав, применяемый в способе, содержит бисфосфонат, инкапсулированный в липосомы подходящего размера. Инкапсулированный в липосомы бисфосфонат специфически нацелен на моноциты и/или макрофаги в силу своих свойств, таких как размер, заряд, проводимость и липидный состав липосом, которые позволяют составу быть поглощенным в основном или исключительно посредством фагоцитоза. Поглощенный фагоцитарной клеткой, инкапсулированный в липосомы бисфосфонат высвобождается внутри клетки, что приводит к ингибированию активности и/или смерти моноцитов и/или макрофагов.

[016] В другом варианте реализации в способе применяют состав, содержащий бисфосфонат в виде включения в носитель, имеющий размер частиц, подходящий для поглощения фагоцитами. Носитель с включениями может также обладать зарядом или структурой поверхности, которая делает его мишенью для фагоцитоза макрофагами и/или моноцитами.

[017] В еще одном варианте реализации в способе применяют состав, содержащий бисфосфонат в форме частицы, имеющей размер, подходящий для фагоцитарного и поглощения.

[018] В одном варианте реализации состав вводят во время противовирусной терапии. В другом варианте реализации состав вводят во время СПТ. В еще одном варианте реализации состав вводят как во время противовирусной терапии, так и во время СПТ. В еще одном варианте реализации состав вводят непосредственно перед прекращением противовирусной терапии. Противовирусная терапия может представлять собой ВААРТ.

[019] Преимущества настоящего изобретения включают специфичное нацеливание на моноциты и макрофаги, резервуары ВИЧ, и предотвращение или замедление восстановления вирусных нагрузок ВИЧ. Ожидается, что состав будет улучшать безопасность СПТ и увеличивать период СПТ. Принимая во внимание физическое и финансовое бремя ВААРТ у пациентов как с ВИЧ, так и СПИД, и систему общественного здравоохранения, более безопасные и более продолжительные СПТ являются весьма желательными для долгосрочного контроля данного заболевания. По сравнению с предшествующим уровнем техники в качестве дополнительной терапии к противовирусному лечению ВИЧ/СПИД состав согласно настоящему изобретению легко вводить, он является неинвазивным, его легко хранить и распространять, и он может быть применим для массового производства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[020] На Фигурах 1А-1В представлен эффект от введения яванским макакам однократной дозы 0,1 мг/кг липосомального алендроната на количество периферических CD4⁺ в течение 7 дней в сравнении с контролем, представляющим собой среду-носитель. Фиг. 1А иллюстрирует абсолютную частоту моноцитов; Фиг. 1В иллюстрирует относительную частоту моноцитов.

[021] На Фигурах 2A-2D представлен биохимический анализ сыворотки макак-резусов в разное время после различных дозовых режимов липосомального алендроната. Фиг. 2А показывает концентрации сывороточного альбумина; Фиг. 2В показывает концентрацию аланинаминотрансферазы; Фиг. 2С показывает концентрации щелочной фосфатазы; Фиг. 2D показывает общий билирубин.

[022] На Фигурах 3А-3В представлен эффект от введения однократной 1 мг/кг дозы липосомального алендроната в сравнении с контролем, представляющим собой среду-носитель, на частоту моноцитов (Фиг. 3А) и частоту субпопуляции моноцитов (Фиг. 3В) у макак-резусов, измеренные при помощи окрашивающей панели проточного цитометра.

[023] На Фигурах 4A-4D представлен эффект от введения однократной 1 мг/кг дозы липосомального алендроната в сравнении с контролем, представляющим собой среду-носитель, на абсолютные количества и частоты моноцитов и трех субпопуляций моноцитов в цельной крови макак-резусов в течение 7 дней. Фиг. 4А: цельная кровь; Фиг. 4В: CD14⁺CD16^-; Фиг. 4С: CD14⁺CD16⁺; Фиг. 4D: CD14^-CD16⁺.

[024] На Фигурах 5А-5Е представлена стратегия гейтирования для идентификации макрофагов в тканях и костном мозге.

[025] На Фигурах 6А-6С представлен типичный тканевый резидентный макрофаг и окрашивание миелоидного предшественника костного мозга в различных тканях у макак-резусов.

[026] На Фигурах 7А-7С представлена частота макрофагов и миелоидных предшественников в ткани и костном мозге макак-резусов до и после лечения липосомальным алендронатом. Фиг. 7А: костный мозг; Фиг. 7В: печень; Фиг. 1С: толстая кишка.

[027] На Фигурах 8А-8С представлен эффект от лечения липосомальным алендронатом на моделях у приматов, не являющихся человеком. Фиг.8А показывает частоту моноцитов в цельной крови, оцененную при помощи окрашивания CD45 в зависимости от профиля бокового светорассеяния; Фиг. 8В показывает абсолютное количество моноцитов; Фиг. 8С показывает оборот моноцитов с последующим применением БДУ.

[028] На Фигуре 9 представлен эффект от введения липосомального бисфосфоната, алендроната 1 мг/кг, в сравнении с контролем, представляющим собой среду-носитель, на вирусную нагрузку у SHIV-инфицированных макак-резусов.

[029] На Фигуре 10 представлен эффект от введения 1 мг/кг липосомального алендроната в сравнении с контролем, представляющим собой среду-носитель, на количество периферических CD4⁺ у SHIV-инфицированных макак-резусов.

[030] Следует обратить внимание, на то, что чертежи представлены в качестве примера для понимания настоящего изобретения и схематично иллюстрируют конкретные варианты реализации настоящего изобретения. Специалисту в данной области техники сможет без труда определить аналогичные примеры, которые входят в объем настоящего изобретения. Чертежи не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, которое определено в прилагаемой формуле изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[031] Моноциты и макрофаги восприимчивы к ВИЧ-инфекции, и инфицированные моноциты и макрофаги содержат вирусную ДНК, встроенную в их геномы. Так как моноциты и макрофаги имеют продолжительный срок жизни и не циркулируют часто, во время противовирусной терапии они выступают в качестве резервуаров ВИЧ, накапливая незрелые вирионы ВИЧ, которые могут высвобождаться при перерывах противовирусной терапии. Моноциты и макрофаги также секретируют ряд хемокинов, которые способствуют дальнейшему распространению ВИЧ-инфекции.

[032] Настоящее изобретение относится к лекарственному составу для применения для лечения ВИЧ-инфекции за счет снижения или ингибирования активности моноцитов/макрофагов и/или устранения или уменьшения количества моноцитов/макрофагов в течение периода во время и/или после противовирусной терапии. Способ согласно настоящему изобретению включает введение эффективного количества бисфосфоната в составе, который селективно поглощается моноцитами и/или макрофагами. Предполагается, что введение дополняет противовирусную терапию, такую как ВААРТ, предотвращает или задерживает восстановление вирусной нагрузки и увеличивает количество CD4⁺ Т-клеток во время перерывов противовирусной терапии. Ожидается, что это может позволить продлить период СПТ, тем самым задерживая необходимость повторного проведения противовирусной терапии.

[033] В одном варианте реализации состав вводят во время противовирусной терапии для инициирования ингибирующего воздействия моноцитов/макрофагов, который продолжается до прекращения терапии и во время СПТ. Желательно, чтобы ВИЧ-ингибирующее воздействие состава продолжалось во время СПТ, и, следовательно, состав можно вводить в течение короткого периода времени до перерыва в противовирусной терапии, к примеру, приблизительно 3 дней или приблизительно 5 дней, или приблизительно 7 дней или приблизительно 10 дней до прерывания противовирусной терапии. В другом варианте реализации состав вводят во время СПТ. В еще одном варианте реализации состав вводят как во время противовирусной терапии, так и во время СПТ. Многократные введения состава во время противовирусной терапии и/или во время СПТ для того, чтобы достичь эффективного количества и поддерживать ВИЧ-ингибирующее воздействие в течение желаемого периода времени, находятся в пределах объема настоящего изобретения.

[034] Применение состава по настоящему изобретению, к примеру, инкапсулированного, бисфосфоната в виде включения или бисфосфоната в виде частиц, избирательно инактивирует и/или приводит к снижению числа моноцитов и/или макрофагов, которые являются важными резервуарами ВИЧ. Из-за своего определенного размера и/или других физико-химических свойств состав будет проникать в клетки в основном или исключительно посредством фагоцитоза. Таким образом, состав по изобретению специфично нацеливается на фагоциты, такие как моноциты и макрофаги. Оказавшись внутри фагоцитарных клеток, бисфосфонат высвобождается и ингибирует, инактивирует, блокирует, убивает и/или приводит к снижению числа моноцитов и/или макрофагов.

[035] В контексте настоящего описания термин "фагоцитоз" относится к предпочтительным способам проникновения в фагоцитарную клетку и хорошо известен в данной области техники. Тем не менее, следует понимать, что термин также охватывает другие формы эндоцитоза, которые также могут достигать того же эффекта. В частности, следует понимать, что способы и составы по настоящему изобретению также охватывают пиноцитоз, опосредованный репепторами эндоцитоз и другие клеточные способы для адсорбирования/интернализации материала из внешней среды клетки.

[036] Бисфосфонаты

[037] Применяемый в составе терапевтический агент представляет собой бисфосфонат или его аналог. В контексте настоящего описания термин бисфосфонат обозначает как терминальные, так и нетерминальные бисфосфонаты. Терапевтический агент также охватывает полимерные цепочки бисфосфонатов или пирофосфатов, в частности, такие цепочки, состоящие из не более чем 40 мономеров бисфосфоната. В одном из вариантов реализации бисфосфонат обладает следующей формулой (I):

где R₁ представляет собой Н, ОН или атом галогена; и R₂ представляет собой галоген; линейный или разветвленный С₁-С₁₀-алкил или С₂-С₁₀-алкенил, необязательно замещенный на гетероарил или гетероциклил C₁-С₁₀-алкиламино или С₃-С₈-циклоалкиламино, где амино может быть первичным, вторичным или третичным; -NHY, где Y представляет собой водород, С₃-С₈-циклоалкил, арил или гетероарил; или R₂ представляет собой -SZ, где Z представляет собой хлорзамещенный фенил или пиридинил.

[038] Другие бисфосфонаты, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются ими, клодронат, тилудронат, 3-(N,N-диметиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту, т.е., диметил-APD; 1-гидрокси-этилиден-1,1-бисфосфоновую кислоту, т.е., этидронат; 1-гидрокси-3(метилпентиламино)-пропилиден-бисфосфоновую кислоту (ибандроновую кислоту), т.е., ибандронат; 6-амино-1-гидроксигексан-1,1-дифосфоновую кислоту, т.е., амино-гексил-ВР; 3-(N-метил-N-пентиламино)-1-гидроксипропан-1,1-дифосфоновую кислоту, т.е., метил-пентил-APD; 1-гидрокси-2-(имидазол-1-ил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту, т.е., золедроновую кислоту; 1-гидрокси-2-(3-пиридил)этан-1,1-дифосфоновую кислоту (ризедроновую кислоту), т.е., ризедронат; 3-[N-(2-фенилтиоэтил)-N-метиламино]-1-гидроксипропан-1, 1-бисфосфоновую кислоту; 1-гидрокси-3-(пирролидин-1-ил)пропан-1,1-бисфосфоновую кислоту, 1-(N-фениламинотиокарбонил)метан-1,1-дифосфоновую кислоту, т.е., FR 78844 (Fujisawa); тетраэтиловый эфир 5-бензоил-3,4-дигидро-2Н-пиразол-3,3-дифосфоновой кислоты, т.е., U81581 (Upjohn) и 1-гидрокси-2-(имидазо[1,2-а]пиридин-3-ил)итан-1,1-дифосфоновую кислоту, т.е., YM 529 или их аналоги. Формулы некоторых из указанных выше бисфосфонатов описаны в патенте США №6719998, который включен в настоящее описание посредством ссылки.

[039] В конкретном варианте реализации бисфосфонат представляет собой алендронат или его аналог. В таком варианте реализации формула I содержит R1=ОН и R2=(CH₂)₃-NH₃.

[040] Алендронат представляет собой азотсодержащий бисфосфонат второго поколения, который обеспечивает хорошее терапевтическое окно [17, 21, 22]. В целом азотсодержащие бисфосфонаты включают предпочтительный подкласс бисфосфонатов, чрезвычайно подходящих в данном изобретении. Такие бисфосфонаты могут быть выбраны на основе их способности имитировать биологическую активность алендроната. К примеру, это включает: активность in vitro в отношении ингибирования активности фагоцитарных клеток, к примеру, макрофагов и фибробластов при нахождении внутри такой клетки; ингибирование секреции ИЛ-1 и/или ИЛ-6 и/или ФНО-альфа макрофагами и активность in vivo, к примеру, способность исследуемых составов приводить к деплеции или блокировать моноциты крови в животной модели или в организме человека или лечить ВИЧ/СПИД.

[041] Состав, фармацевтическая композиция и способ введения

[042] Состав по настоящему изобретению можно получить, чтобы размер частиц был подходящим для клеточной интернализации только или в основном посредством фагоцитоза, придавая тем самым специфичность по отношению к фагоцитарным клеткам, таким как макрофаги и моноциты. Состав, содержащий бисфосфонат согласно настоящему изобретению, предпочтительно получают таким образом, что состав имел размер частиц, интернализация которых будет осуществляться только или в основном посредством фагоцитоза, т.е. предпочтительно больший, чем 0,03 мкм. К примеру, такой состав может иметь диаметр частиц, к примеру, средний диаметром, приблизительно 0,03-1,0 микрон или приблизительно 0,1-0,3 микрон, или приблизительно 0,1-0,18 микрон, или приблизительно 0,07-0,5 микрон, или приблизительно 0,07-0,15 микрон. Любой способ, известный в данной области техники, можно применять для определения размера частиц состава перед введением пациенту, нуждающемуся в этом. К примеру, можно применять измеритель субмикронных частиц Nicomp (модель 370, Nicomp, Санта-Барбара, штат Калифорния), использующий рассеяние лазерного излучения.

[043] Любой способ, известный в данной области техники, можно применять, чтобы включить бисфосфонат в состав, который может быть поглощен внутрь клеток только или в основном посредством фагоцитоза. Состав может секвестировать бисфосфонат в течение достаточного времени, чтобы улучшить доставку к целевому участку. Состав может обладать зарядом или структурой поверхности, которая воздействует на фагоцитоз или улучшает его. Кроме того, состав может высвобождать бисфосфонат при нахождении внутри клеток-мишеней (например, моноцитов и/или макрофагов) на целевой участок.

[044] В одном варианте реализации бисфосфонат инкапсулирован. Предполагается, что инкапсулированные формы представляют замкнутые оболочки, имеющие структуру, которая служит в качестве барьера для терапевтического агента, таких как, к примеру, полимерных или липоидных систем доставки. В одном варианте реализации инкапсулирующий агент представляет собой липосому. Липосома содержит липидные ингредиенты, которые инкапсулируют бисфосфонат, и может представлять собой один липидный слой или может быть мультиламеллярной. Липосомы могут быть положительно, нейтрально или отрицательно заряженными. В предпочтительном варианте реализации липосомы заряжены отрицательно. Подходящие в соответствии с настоящим изобретением липосомы предпочтительно представляют собой нетоксичные липосомы, такие как, к примеру, полученные из фосфатидил-холина, фосфоглицерола и холестерина. В одном варианте реализации липидные ингредиенты могут содержать, к примеру, дистеароилфосфатидилхолин (ДСФХ), дистеароилфосфатидилглицерин (ДСФГ) и холестерин (хол). К примеру, липосома может содержать ДСФХ:ДСФГ:хол в молярном соотношении 3:1:2. Соотношение массы бисфосфоната к липидному ингредиенту, называемому соотношением лекарственное средство:липид, может составлять приблизительно 1:5 до 1:8 по массе или приблизительно 1:6 до 1:7 по массе. В конкретных вариантах реализации, таких как, к примеру, с алендронатом натрия, инкапсулированным в ДСФХ, ДСФГ и холестерин, можно применять соотношение масс лекарственное средство:липид 1:5,7 - приблизительно эквивалентное молярному соотношению 1:3 для алендроната натрия. В качестве другого примера при инкапсуляции клодроната динатрия в тот же липидный ингредиент можно применять массовое соотношение приблизительно 1:5,4, которое эквивалентно молярному соотношению 1:3. Определение молярного соотношения для других бисфосфонатов и других липидных комбинаций находится в компетенции специалиста в данной области техники.

[045] Липосомы в составе обладают специфичными характеристиками, включающими размер, заряд, pH, проводимость и осмоляльность, которые позволяют осуществлять поглощение в основном посредством фагоцитоза. Диаметр применяемых липосом, может находиться в диапазоне размера, подходящего для фагоцитоза моноцитами или макрофагами, к примеру, диапазоне 0,03-1,0 микрон, или диаметр может иметь размер или диапазон размеров в пределах этого диапазона, как описано в настоящем описании. К примеру, в одном варианте реализации липосомы могут иметь диаметр приблизительно 0,08±0,005 микрон. Проводимость липосомы может составлять, к примеру, приблизительно 13,5-17,5 мс/см. Внешняя осмоляльность липосомы может совпадать с осмоляльностью человеческого тела и внутренняя осмоляльность может быть ниже, а пониженная осмоляльность может улучшать стабильность состава. Таким образом, к примеру, внутренняя осмоляльность может составлять приблизительно 340-440 мО/кг. Внутренний рН липосом и/или липосомального состава может составлять приблизительно 6,9.

[046] Липосомы можно получить любым из способов, известных в данной области техники (см., к примеру, Mönkkönen, J. и др., J. Drug Target, 2:299-308 (1994); Mönkkönen, J. и др., Calcif. Tissue Int., 53:139-145 (1993); Lasic, D., Liposomes Technology Inc., Elsevier, Chapter 3, pp. 63-105 (1993); Winterhalter, M, Lasic, D.D., Chem. Phys. Lipids, 54(1-3):35-43 (September 1993); Epstein-Barash, H. и др., J. Controlled Release, 146:182-195 (2010); Epstein, H. и др., AAPS J, 10:505-515 (2008); Патент США № 7008645; патентная публикация США № 2010/0015213; патентная публикация США № 2004/0266734; заявка на патент США № 13/804707); все из которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). В одном из таких способов из липосом образуют стопки жидкокристаллических бислоёв, которые гидратируют в гидратные липидные листы, которые во время перемешивания отрываются и самостоятельно замыкаются с образованием больших мультиламеллярных везикул (МЛВ), что известно под методом гидратации тонкой липидной пленки. После того, как образуются данные частицы, размер частиц можно уменьшать, применяя звуковую энергию (обработку ультразвуком) или механическую энергию (экструзию). При соникации обычно получают маленькие униламеллярные везикулы (УЛВ); при липидной экструзии, при которой липидную суспензию

продавливают через серию поликарбонатных фильтров - как правило, мембран в 0,8, 0,4, 0,2 и 0,1 микрон - при высоком давлении (не более 500 psi), получают частицы, имеющие диаметр близкий к размеру пор применяемого фильтра.

[047] По существу однородные липосомы можно получать при помощи способа с низким давлением, как описано в патентной публикации США №2004/0266734 и одновременно рассматриваемой заявке на патент США №13/804707, обе из которых включены в настоящее описание посредством ссылки. Вкратце, к примеру, терапевтический агент можно смешивать с предварительно выбранными липидами, чтобы образовать везикулы, можно осуществлять одноступенчатую экструзию везикул через фильтр, имеющий единый предварительно выбранный размер, с последующей ультрафильтрацией. При данном способе образуются липосомы, имеющие размер частиц приблизительно 0,03-0,5 микрон, приблизительно 0,07-0,12 микрон, приблизительно 0,07-0,15 микрон, приблизительно 0,1-0,18 микрон и приблизительно 0,1-0,3 микрон.

[048] В одном варианте реализации липосомы можно получить следующим образом: (1) смешиванием бисфосфоната и предварительно выбранных липидов с образованием мультиламеллярных везикулы (МЛВ), (2) образованием везикул конечного размера и (3) очисткой и отбором для бисфосфонат-нагруженных липосом. На стадии (1) бисфосфонат, как правило, растворяют в воде, в то время как тщательно взвешенные липидные ингредиенты растворяют в растворителе, таком как хлороформ : метанол (9:1), этанол:трет-бутанол (1:1) или этанол:трет-бутанол:вода (77:77:6 об./об./об.). Далее раствор бисфосфоната смешивают с раствором липидов и для того, чтобы облегчить смешивание, можно использовать умеренный нагрев. Данный способ приводит к эффективному инкапсулированию бисфосфонатов в МЛВ, которые не являются однородными по размеру и больше требуемого конечного размера. На стадии (2) применяют механический способ, чтобы уменьшить размер везикул и привести везикулы в однородное состояние по размеру и форме. Способы, известные в данной области техники, включают соникацию и экструзию. Можно осуществлять экструзию липосом, применяя давление и продавливая лекарственно-липидную смесь через серию фильтров с убывающим размером пор. В качестве альтернативы можно осуществлять экструзию липосом при помощи способа, описанного в одновременно рассматриваемой заявке на патент США №13/804707, применяя одноступенчатую фильтрацию и фильтр с единым размером пор под низким давлением. Данный способ может сократить эксплуатационные расходы и время и может увеличить выход при многоступенчатой экструзии под высоким давлением. На стадии (3) надлежащим образом инкапсулированный бисфосфонат отделяют от неинкапсулированного бисфосфоната, растворителей и липидов. Иллюстрирующие способы для данной стадии включают гель-фильтрацию через колонку с гелем и ультрафильтрацию через мембрану.

[049] В другом варианте реализации бисфосфонат включают в носитель, т.е., в агент с включениями, обладающий требуемыми свойствами, к примеру, имеющий диаметр частиц в диапазоне 0,03-1,0 микрон. Бисфосфонат, который включают, содержит бисфосфонаты, которые включены, заключены и/или адсорбированы в носитель, диспергированы в матрицу-носитель, адсорбированы или связаны на поверхности носителя или комбинации любой из данных форм. В конкретных вариантах реализации агент с включениями (или носитель) представляет собой микрочастицу, наночастицу, наносферу, микросферу, микрокапсулу или нанокапсулу (см., к примеру, М. Donbrow in: Microencapsulation and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy, CRC Press, Boca Raton, Fla., 347, 1991). Термин "носитель" включает как полимерные, так и неполимерные препараты. В конкретном варианте реализации агент представляет собой наночастицу. Наночастицы могут представлять собой сферические, несферические или полимерные частицы. Терапевтический агент можно включать в наночастицу, равномерно или неравномерно диспергированную в полимерной матрице, адсорбированную на поверхности или в комбинацию любой из данных форм. В предпочтительном варианте реализации применяемый для получения наночастиц полимер является биологически совместимым и биоразлагаемым, таким как полимер поли(DL-лактид-со-гликолид) (PLGA). Тем не менее, дополнительные полимеры, которые применяют для получения наночастиц, включают, но не ограничиваются ими, PLA (полимолочную кислоту) и ее сополимеры, полиангидриды, полиалкил-цианакрилаты (такие как полиизобутилцианакрилат), полиэтиленгликоли, полиэтиленоксиды и их производные, хитозан, альбумин, желатин и им подобные. Бисфосфонат в виде включений может иметь диаметр частиц в диапазоне размеров, к примеру, 0,03-1,0 микрон, или диаметр частиц может иметь размер или диапазон размеров в пределах данного диапазона, как описано в настоящем описании, подходящий для фагоцитоза моноцитами или макрофагами, к примеру, средний диаметр приблизительно 0,03-1,0 микрон или приблизительно 0,1-0,3 микрон, или приблизительно 0,1-0,18 микрон, или приблизительно 0,07-0,5 микрон, или приблизительно 0,07-0,15 микрон.

[050] В другом варианте реализации бисфосфонат находится в форме частицы, каждая частица обладает желаемыми свойствами. Форма в виде частиц включает любые нерастворимые суспендированные или диспергированные формы частиц, которые не инкапсулированы или включены. Бисфосфонат, который находится в форме частицы, может представлять собой форму суспендированных или диспергированных коллоидов, агрегатов, хлопьев, нерастворимых солей, нерастворимых комплексов и полимерных цепочек. Такие частицы не растворимы в жидкости, в которой их хранят/вводят (к примеру, физиологическом растворе или воде), также как и в жидкости, в которой они обеспечивают свой терапевтический эффект (к примеру, крови или сыворотке). Как правило, "нерастворимый" относится к растворимости одной (1) части соединения в виде частиц в более десяти тысячах (10000) частей растворителя. Можно применять любой известный в данной области техники способ для образования частиц или агрегатов. Бисфосфонат в виде частиц может иметь диаметр частиц в диапазоне размеров, к примеру, 0,03-1,0 микрон, или диаметр частиц может иметь размер или диапазон размеров в пределах данного диапазона, как описано в настоящем описании, подходящий для фагоцитоза моноцитами или макрофагами, к примеру, средний диаметр приблизительно 0,03-1,0 микрон или приблизительно 0,1-0,3 микрон, или приблизительно 0,1-0,18 микрон, или приблизительно 0,07-0,5 микрон, или приблизительно 0,07-0,15 микрон.

[051] В то время как каждый из составов по настоящему изобретению разработан в качестве мишени для фагоцитоза, иные фагоцитарные клетки, нежели чем моноциты и макрофаги, такие как, к примеру, нейтрофилы, могут поглощать частицы, однако будут либо не подвергаться воздействию, либо подвергаться слабо, так как активность бисфосфонатов является соответственно исключительной для моноцитов и макрофагов. Нефагоцитарные клетки соответственно неспособны поглощать состав из-за конкретных физико-химических свойств липосомального состава.

[052] Будучи поглощенным моноцитами/макрофагами, ожидается, что бисфосфонат обладает устойчивой ингибиторной активностью в отношении моноцитов/макрофагов. Данной устойчивой активности достаточно для того, чтобы модулировать противовоспалительное действие моноцитов/макрофагов. Таким образом для того, чтобы поддерживать ингибирование, не требуется длительное высвобождение агента. Соответственно способ лечения определенных заболеваний путем ингибирования моноцитов/ макрофагов, такой как, к примеру, при помощи применения инкапсулированного агента, предпочтительно является системной терапией в том, что состав нацеливается как на циркулирующие моноциты, так и тканевые резидентные макрофаги. В зависимости от специфичного бисфосфоната в составе, фагоцитарные моноциты и макрофаги могут реагировать по-разному. Например, липосомы с инкапсулированным алендронатом могут вызывать апоптоз, в то время как липосомы с инкапсулированным клодронатом могут вызывать некроз.

[053] Состав для применения в способах по настоящему изобретению может быть обеспечен в различных фармацевтических формах для введения в зависимости от различных факторов, специфичных для каждого пациента (к примеру, тяжесть и тип расстройства, возраст, масса тела, реакция и сведения о ранее перенесенных заболеваниях пациента), числа и типа терапевтических агентов в составе, типа состава (к примеру, инкапсулированный, в виде включений, в виде частиц и т.д.), формы композиции (к примеру, в жидкой, полужидкой или твердой форме) и/или способа введения (к примеру, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интрамедуллярный, интратекальный, внутрижелудочковый, трансдермальный, подкожный, внутрибрюшинный, интраназальный, энтеральный, местный, сублингвальный, вагинальный или ректальный способы). Фармацевтические носители, среды-носители, вспомогательные вещества или разбавители можно включать в композиции по настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, воду, солевые растворы, буферные солевые растворы, масла (к примеру, нефтяные, животные, растительные или синтетического масла), крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, этанол, декстрозу и им подобные. Композиция, если желательно, может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или рН-буферные агенты. Данные композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и им подобные.

[054] Составы, подходящие для парентерального введения, можно получить в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как растворе Хэнкса, растворе Рингера или забуференном физиологическом растворе. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлозу, сорбит или декстран. Кроме того, суспензии активных соединений можно получить в виде соответствующих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или среды-носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Суспензия необязательно может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений для того, чтобы обеспечить получение высококонцентрированных растворов.

[055] Бисфосфонат можно обеспечить в любой форме, к примеру, включая соли, солевые сольваты и их гидраты. Таким образом, к примеру, инкапсулировавшись, бисфосфонат может быть твердым или в растворе, и твердым может быть сольват или гидрат.

[056] Введение состава

[057] Настоящее изобретение предназначено для того, чтобы охватить введение состава, содержащего эффективное количество одного или более бисфосфонатов в режиме одной или нескольких доз для лечения или контроля ВИЧ/СПИД. Число применяемых доз, которые могут быть необходимы для того, чтобы достигнуть желаемого эффекта, будет, к примеру, 1, 3, 5, 8 или 10, раз в день, два раза в день, четыре раза в день или непрерывно в виде непрерывной инфузии в течение периода времени. Состав по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с другими лекарственными средствами. Термин "в комбинации" не ограничивается введением лекарственных средств точно единовременно, однако скорее это означает, что состав по настоящему изобретению и другое лекарственное средство вводят пациенту последовательно и в течение временного интервала, так что они могут действовать совместно, чтобы обеспечить повышенную эффективность, чем если бы их вводили иным образом. К примеру, состав по настоящему изобретению и другое лекарственное средство можно вводить единовременно или последовательно в любом порядке в различные моменты времени; тем не менее, если не вводить единовременно, их следует вводить достаточно близко по времени с тем, чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект. Каждое введение состава по настоящему изобретению, вне зависимости от комбинации с другими лекарственными средствами, можно проводить отдельно, в любой соответствующей форме и любым подходящим способом, который эффективно транспортирует терапевтический агент к соответствующему или желаемому участку действия. Предпочтительные способы введения состава по настоящему изобретению включают внутривенный (в.в.) и внутриартериальный (в.а.). Другие подходящие способы введения включают внутримышечный (в.м.), подкожный (п.к.), а также внутрибрюшинный (в.б.) и пероральный (через рот). Такое введение может представлять собой болюсные инъекции или инфузии. Другой способ введения может быть при помощи периваскулярной доставки. Комбинации любых из вышеперечисленных способов введения можно применять в соответствии с настоящим изобретением.

[058] При введении желательно, чтобы состав вводили в дозе и во времени, при котором ингибирующее действие в отношении моноцитов/макрофагов сохранялось на всем протяжении последующих СПТ. В одном варианте реализации состав вводят по меньшей мере один раз в течение периода незадолго до СПТ, к примеру, приблизительно от 3 до приблизительно 10 дней до окончания противовирусной терапии. В другом варианте реализации состав можно вводить многократно в течение противовирусной терапии. В еще одном варианте реализации состав можно вводить во время СПТ либо в дополнение к введению до СПТ, либо без введения в течение непосредственно предшествующей противовирусной терапии. Поскольку контроль ВИЧ/СПИД является долгосрочной задачей и может включать многократные противовирусные терапии, объединяемые СПТ, следовательно, это находится в соответствии с настоящим изобретением, чтобы охватить многократные циклы лечения, ингибирующего моноциты/макрофаги, в соответствии с настоящим изобретением в соответствующие моменты времени в сочетании с режимом противовирусной терапии и СПТ.

[059] Термин "эффективное количество" обозначает количество бисфосфоната в составе, которое эффективно в отношении ингибирования или уменьшения активности моноцитов/макрофагов, чтобы продлить возрождение активных вирионов и/или эффективно в устранении или снижении числа циркулирующих моноцитов/макрофаги. Предполагается, что эффективное количество бисфосфоната в составе обеспечивает долговременное лечение таким образом, чтобы дополнить противовирусную терапию при контроле ВИЧ/СПИД. Предпочтительно, чтобы эффективное количество бисфосфоната в составе ингибировало и/или приводило к деплеции моноцитов/макрофагов в течение периода, который составляет приблизительно одну неделю, приблизительно две недели, предпочтительно ≥ одного месяца, более предпочтительно ≥ двух месяцев, еще более предпочтительно ≥ три месяца, наиболее предпочтительно не более или более шести месяцев. Специалист смог бы определить период эффективности эмпирически путем при помощи введения состава индивидууму, нуждающемуся в этом (или животной модели такого индивидуума) и мониторинга уровня ингибирования/деплеции в различные моменты времени. Специалист может также коррелировать время ингибирования с соответствующим желаемым клиническим эффектом, к примеру, ингибированием вирусной нагрузки ВИЧ и/или увеличением уровня CD4⁺ Т-клеток.

[060] Эффективное количество бисфосфоната в составе может зависеть от нескольких факторов, включая, но не ограничиваясь ими: пол, возраст и массу пациента; способ введения состава; тип носителя, применяемого для того, чтобы инкапсулировать или включить бисфосфонат (к примеру, если это носитель, который быстро высвобождает бисфосфоната или носитель, который его высвобождает в течение периода времени); режим лечения (к примеру, если состав вводят один раз в несколько дней, один раз в несколько недель или один раз при противовирусной терапии); статус ВИЧ/СПИД, включая штамм вируса, вирусную нагрузку и количество CD4⁺ Т-клеток у индивидуума, получающего лечение, до и после введения состава; тип и количество лекарственных средств, применяемых в противовирусном коктейле; лекарственную устойчивость пациента; генотип пациента, так как это относится к восприимчивости ВИЧ/СПИД; продолжительность противовирусной терапии; продолжительность СПТ. Опытный специалист при помощи обычных экспериментов может определить эффективное количество на основе указанных выше факторов или других соответствующих факторов и описания в настоящем документе.

[061] Иллюстрирующие, и неограничивающие, дозы бисфосфоната для состава по настоящему изобретению для применения в организме человека, подразумеваются, к примеру, приблизительно от 1,5 нг/кг до приблизительно 10 мг/кг массы тела или приблизительно от 15 нг/кг до приблизительно 15 микрограмм/кг массы тела, или приблизительно от 0,15 мг/кг до приблизительно 15 микрограмм/кг массы тела, или приблизительно от 0,15 мг/кг до приблизительно 1,5 микрограмм/кг массы тела. Так, к примеру, пациент может получить дозу в пределах приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 1 мг, к примеру, приблизительно 0,1 микрограмм или приблизительно 1 мкг, или приблизительно 10 микрограмм, или приблизительно 100 микрограмм, или приблизительно 1 мг. Можно также применять другие дозы в зависимости от применяемого конкретного бисфосфоната, конкретного состава и режима дозирования, что может легко определить специалист в данной области техники.

[062] Данные, полученные из анализов клеточных культур и исследований на животных, можно применять для того, чтобы определить диапазона дозирования состава для применения в организме человека. Доза бисфосфонатов в составе предпочтительно приводит в результате к диапазону циркулирующей концентрации, который включает ED₅₀ с небольшой токсичностью или ее отсутствием. Дозировка для конкретного пациента будет зависеть от конкретного применяемого состава, используемого способа введения и состояния или характеристик пациента. Для любого состава, применяемого в способе по настоящему изобретению, эффективную дозу можно первоначально оценить из анализов клеточных культур. Дозу можно приготовить на моделях животных, чтобы достичь диапазона концентраций циркулирующей плазмы, который включает IC₅₀ (т.е. концентрацию исследуемого соединения, при которой достигается половина от максимального ингибирования симптомов), что определено на клеточной культуре. Такую информацию можно применять, чтобы более точно определить подходящие дозы для организма человека. Уровни в плазме можно измерить, к примеру, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии. Эффективные дозы для организма человека можно также определить при помощи клинических испытаний.

[063] Характеристика терапевтической полезности

[064] В одном варианте реализации желаемый терапевтический результат ингибирования или уменьшения активности моноцитов/макрофагов и/или устранения или уменьшение числа моноцитов/макрофагов представляет собой супрессию вирусной нагрузки ВИЧ и/или увеличение CD4⁺ Т-клеток в течение достаточного периода времени. Достаточным периодом времени может выступать все протяжение СПТ. В определенных случаях достаточный период может быть длиннее или короче всего протяжения СПТ.

[065] Токсичность и эффективность терапевтических способов по настоящему изобретению можно определить при помощи стандартных фармацевтических процедур на клеточных культурах или экспериментальных животных, к примеру, для определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции), уровня, не вызывающего видимых нежелательных явлений (УНВНЯ), и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной у 50% популяции). Соотношение дозы между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс и он может быть выражен как отношение LD₅₀/ED₅₀ или УНВНЯ/ED₅₀. Составы, которые демонстрируют высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Пока можно применять составы, которые демонстрируют токсические побочные эффекты, следует позаботиться о том, чтобы разработать систему доставки, которая нацеливает агентов таких составов на участок клеток-мишеней, с тем, чтобы свести к минимуму возможное повреждение незатронутых клеток и, тем самым, снизить побочные эффекты. Кроме того, следует разрабатывать лекарственные носители таких составов, чтобы контролировать высвобождение лекарственного средства таким образом, чтобы уровень высвобождаемого лекарственного средства не превышало любой предел токсичности.

[066] Протоколы и композиции способа согласно настоящему изобретению предпочтительно исследуют in vitro и далее in vivo для желаемой терапевтической активности перед применением в организме человека. Одним из примеров такого анализа in vitro является анализ клеточной культуры моноцитов и/или макрофагов in vitro, которые выращивают в культуре и подвергают воздействию или иным образом вводят в клетки и наблюдают за воздействием данного анализа на клетки, к примеру, ингибированной или пониженной активностью и/или полной или частичной гибелью клеток. Моноциты/макрофаги можно получить из установленной клеточной линии или недавно выделенной у индивидуума в качестве первичной клеточной линии. Для того, чтобы измерить активность состава на моноцитах/макрофагах, можно применять многие стандарты проведения испытаний в данной области техники, к примеру, при помощи количественного определения уровней хемотаксических факторов, таких как макрофагального хемоаттрактантного белка-1 (МХБ-1), интерлейкина-1 бета (ИЛ-1β), фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α) и макрофагального воспалительного белка-1 альфа (МВБ-1 альфа). Многие стандарты проведения испытаний в данной области техники можно применять, чтобы оценить выживаемость и/или рост моноцитов/макрофагов; к примеру, анализ клеточной пролиферации можно произвести при помощи измерения инкорпорирования 3Н-тимидина, при помощи прямого подсчета клеток, при помощи обнаружения изменений в транскрипционной активности известных генов, таких как протоонкогенов (например, fos, myc) или маркеров клеточного цикла; жизнеспособность клеток можно оценить при помощи окрашивания трипановым синим.

[067] Содержание всех опубликованных статей, книг, справочников и рефератов, цитируемых в настоящем описании, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки, чтобы более полно описать уровень техники, к которой относится настоящее изобретение.

[068] ПРИМЕРЫ

[069] Следующие примеры, как это указано в настоящем описании, предназначены для иллюстрации и представления различных аспектов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для того, чтобы ограничить настоящие изобретения каким-либо образом.

[070] Липосомальный алендронат (ЛА) можно получить, к примеру, в соответствии с протоколами, описанными в Epstein-Barash, Н. и др., J. Controlled Release, 146:182-195 (2010); Epstein, Н. и др., AAPS J, 10:505-515 (2008); и патентной заявке США №13/804707. Более конкретно, для целей примеров 2-7, ЛА получают в соответствии с патентной заявкой США №13/804707, воспроизведенной в настоящем описании в качестве Примера 1.

[071] ПРИМЕР 1 - ПОЛУЧЕНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНОГО АЛЕНДРОНАТА

[072] Получали один литр серии липосомального алендроната, инкапсулированного в липосомы, содержащие холестерин, ДСФХ и ДСФГ, и диспергированного в фосфатно-солевом буферном растворе. Липосомальный алендронат можно обеспечить в двух концентрациях для клинического удобства: 5 мг/мл и 0,5 мг/мл в виде стерильной беловатой липосомальной взвеси. Данные концентрации можно дополнительно приготавливать, чтобы получить желаемое количество терапевтического агента в любом специфичном объеме. Липидные ингредиенты состояли из холестерина, ДСФХ и ДСФГ. Взвесь также содержала фосфатно-солевой буферный раствор для контроля pH, инфузионной пригодности и для сохранения изотоничности. По меньшей мере 96% лекарственного средства в конечном продукте было инкапсулировано в липосомы. Для введения содержимое флакона (или его части в случае необходимости) разбавляли физиологическим раствором среды-носителя и далее вводили посредством инфузии. В одном конкретном доклиническом Примере, соответствующую массу ЛА (определенная по массе тела) разбавляли при комнатной температуре 1х ФСБ до конечного объема 20 мл и вводили 4 мл/мин посредством внутривенной (в подкожную вену) или внутрибрюшинной инъекции.

[073] Производственная рецептура, которая содержит количество и качество компонентов, применяемых для получения, и их количества в расчете на основу 1 литра серии представлена ниже в Таблице 1.

[074] Содержание и количественный состав липосомального алендроната для внутривенной инфузии, полученного в 1-литровой серии по Таблице 1, приведен ниже в Таблице 2. Следует отметить, что в данной серии молярное отношение ДСФХ:ДСФГ:холестерин составляло 3:1:2. Кроме того вычислили, что соотношение лекарственное средство:липид составляло приблизительно 1:5,7±1,5 масс.:масс.

[075] Состав липосомального алендроната для внутривенной инфузии, фактически полученного при помощи способа получения, описанного в настоящем описании, представлен ниже в Таблице 3.

[076] Дозировку 0,5 мг/мл можно получить таким же способом, как и дозировку 5 мг/мл, описанным выше. Отличается только стадия окончательный стандартизации (описанная ниже) при формировании иного конечного состава для введения. Для нижеследующих Примеров применяли концентрацию 0,5 мг/мл. Специалист в данной области техники понимает, что другие дозировки можно получить в соответствии с данным способом.

[077] Раствор терапевтического агента (раствор алендроната) и липидный раствор получали следующим образом:

[078] Раствор алендроната. NaOH (6,8-8,0 г) взвешивали и растворяли в 850 мл воды для инъекций (ВДИ) при температуре в 70±3 °С, 600 ± 150 оборотах в минуту. Полное растворение проверяли при помощи визуального осмотра. Алендронат натрия (68 до 80,75 г) растворяли в растворе NaOH при температуре в 70±3 °С, перемешивая при 600±150 оборотах в минуту. Полное растворение проверяли при помощи визуального осмотра (т.е. прозрачный раствор), проверяли измерения электропроводности и рН (рН=6,8±0,3. Проводимость = 18,0±1 мс/см).

[079] Липидный раствор. Липиды, содержащие 30 г ДСФХ (37,9 ммоль), 10 г ДСФГ (12,5 ммоль) и 10 г холестерина (25,8 ммоль) (ДСФХ/ДСФГ/холестерин; 3/1/2 моль/моль/моль), взвешивали и растворяли в 250 мл химическом стакане на нагретой магнитной мешалке в 160 мл трет-бутанол/этанол/H₂O (77/77/6, об./об./об) при температуре 70±3°C с образованием липидного раствора с концентрацией 312 мг/мл. Когда температура находилась в пределах, образовался прозрачный желтый раствор.

[080] Состав МЛВ. Липидный раствор добавляли к раствору алендроната (1 часть лекарственного средства; 5,3 частей липидов) при перемешивании при 600+150 оборотах в минуту и поддержании температуры 70±3°C. По меньшей мере после 5 минут добавляли 100 мл ВДИ (10% от общего объема) для того, чтобы понизить концентрацию растворителя перед экструзией. Состав перемешивали в течение дополнительных 10 минут.

[081] Экструзия. Состав подвергали экструзии при помощи нагретого 1,2 л экструдера из нержавеющей стали в сборке с одной 0,14 мкм керамической мембраной или с двумя поликарбонатными мембранами (к примеру, 0,2 мкм префильтр и 0,1 мкм мембранный фильтр), чтобы уменьшить размер везикул и улучшить гомогенность везикул при давлении = 90±15 psi и температуре = 68±5°C. В способе требовалось 12-18 продавливаний для получения везикул 80-100 нм. Экструдированные образцы отбирали в режиме реального времени для того, чтобы проверить размер везикул перед ультрафильтрацией. Размер липосом состава анализировали при помощи анализатора Malvern Nano ZS (допустимые пределы: 95±20 нм). Образец экструзии также анализировали на количество аэробных бактерий (контроль бионагрузки). Допустимый предел составлял <100 КОЕ/мл.

[082] Ультрафильтрация и диафильтрация. Первоначально перед проведением ультрафильтрации составу давали остыть до < 45°C. Ультрафильтрацию осуществляли на системе Amersham QuixStand с 500K половолоконной мембраной. Состав концентрировали, применяя давление на входе, не превышающее 25 psi. При достижении минимального объема состав диализовали с 10 начальными объемами (~ 7 л) фосфатно-солевого буферного (ФСБ) раствора. ФСБ раствор получали путем растворения 145 мМ NaCl, 13 мМ Na₂HPO₄ и 7 мМ NaH₂PO₄ в 10 л ВДИ. ФСБ имел pH приблизительно 6,9 и проводимость приблизительно 16,9 мс/см. ФСБ фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Отмечали окончание диафильтрации путем измерения pH и проводимости диализированного состава. Состав сливали из системы ультрафильтрации, не превышая 120% первоначального объема (~ 1,2 л). Образец брали для общего анализа и количества аэробных бактерий (контроль бионагрузки). Допустимый предел составлял <1000 КОЕ/мл.

[083] В конце диализа состав фильтровали через 0,2 мкм фильтр для сохранения контроля бионагрузки. Сосуд высокого давления, содержащий состав, соединяли со стерильным 0,2 мкм фильтром (Sartorius Sartobran Р). Фильтр предварительно собрали в стерильном приемном резервуаре. Фильтрацию осуществляли путем приложения давления в 5-30 psi к сосуду высокого давления. Образец брали для общего анализа и количества аэробных бактерий (контроль бионагрузки). Допустимый предел составлял <100 КОЕ/мл.

[084] Конечная стандартизация. Состав анализировали на размер, композицию липид/терапевтический агент в липосоме, содержание лекарственного средства и свободного терапевтического агента при помощи ВЭЖХ. Ожидаемый выход в данном примере состалял один литр состава, содержащего приблизительно 6 мг/мл инкапсулированного алендроната и 35 мг/мл липидов. На основании результатов концентрации алендроната, вычисляли требуемое разбавление, чтобы достигнуть приблизительно одного литра конечной концентрации состава 5 мг/мл или 0,5 мг/мл. Для получения 5 мг/мл состава приблизительно 900 мл липосомального алендроната после ультрафильтрации разбавляли с приблизительно 100 мл ФСБ, полученного как описано выше. Кроме того, для того, чтобы получить 0,5 мг/мл состава приблизительно 100 мл липосомального алендроната после ультрафильтрации разбавляли с приблизительно 900 мл ФСБ для 0,5 мг/мл концентрации. Образец брали, чтобы определить достигнутую концентрацию алендроната.

[085] После получения стандартной концентрации состава бутыль, содержащую состав, соединяли с двумя последовательными стерильным 0,2 мкм фильтрами (Sartorius Sartobran P), расположенными в помещении класса 100 комнаты или стерильном биологическом шкафу. Фильтр предварительно собирали в предварительно стерилизованный одноразовый приемный мешок или бутыль. Фильтрацию проводили при помощи перистальтического насоса или азота под давлением. Давление не должно превышать 10 psi. Когда фильтрацию закончили, фильтр исследовали на целостность.

[086] Липосомальный алендронат для внутривенной инфузии, полученный в приведенном выше примере, обладал рядом желаемых свойств, к примеру (i) тремя годами стабильности по меньшей мере алендроната и липидов при 5º (диапазон 2-8 °С); (ii) средним диаметром везикул 80±5 без механических включений; (iii) концентрацией алендроната натрия не более 5 мг/мл (диапазон 0,1-5,0 мг/мл); (iv) инкапсуляцией алендроната более или равной 96%; (v) липидной композицией дистеароилфосфатидилхолин/дистеароилфосфатидилглицерин/холестерин (ДСФХ/ДСФГ/хол) 3/1/2 моль/моль/моль; (vi) физиологической осмоляльностью 270-340 мО/кг; (vi) вязкостью к воде, т.е., динамической вязкостью, приблизительно 1,0 мПа ·с при 20 °C; (viii) рН 6,8 (диапазон 6,8-7,0); (ix) мировой приемлемостью качества вспомогательного вещества в соответствии с фармакопеей США (USP) или европейской фармакопеей; (x) соответствием требованиям фармокопеи США на стерильность и пирогены, как опубликовано в USP 24-NF 19; (xi) совместимостью (при применении) с физиологическим раствором, наборами для инфузии и шприцами; и (xii) совместимостью (при способе) с фильтрами, трубками из нержавеющей стали и стеклом.

[087] ПРИМЕР 2

[088] Липосомальным алендронат приводит к деплеции моноцитов у приматов. Способность ЛА приводить к деплеции моноцитов исследовали на яванских макаках. В частности, два яванских макака получали лечение с однократной дозой 0,1 мг/кг ЛА в.в. (ЛА 1 и ЛА 2). Абсолютные и относительные частоты CD14⁺ моноцитов в цельной крови далее оценивали через 7 дней после инъекции (д.п.и.) при помощи проточной цитометрии. Результаты представлены на ФИГ. 1А-1В. Яванские макаки, получавшие 0,1 мг/кг ЛА в.в., показали ~ 50% снижение частоты CD 14+моноцитов на 1 д.п.и. Тем не менее, как показано на ФИГ. 1А-1В, такое снижение количества было кратковременным, частоты CD14⁺ моноцитов возвращались к исходному уровню на 2 д.п.и. Таким образом было показано, что ЛА был эффективен для деплеции моноцитов у приматов, не являющихся человеком.

[089] Обработка крови. Цельную кровь собирали в пробирки, обработанные ЭДТА (BD Biosciences, Сан Хосе, штат Калифорния). Применяли 500 мкл аликвоты для того, чтобы произвести оценку клинического анализа крови (КАК) с применением Horiba/ABX Pentra 60С+ (Horiba, Ирвайн, штат Калифорния).

[090] Проточный цитометрический анализ моноцитов/макрофагов. Разработали и оптимизировали 11-цветную проточную цитометрическую окрашивающую панель для анализа моноцитов/макрофагов в крови и тканях макак-резусов, как указано в Таблице 4.

[091] Либо 100 мкл цельной крови, либо 1×10⁶ суммарных тканевых клеток дважды промывали в 1х ФСБ и далее окрашивали поверхность в течение 30 минут при комнатной температуре. Цельную кровь и селезенку далее инкубировали в 1 мл лизирующего раствора FACSLyse в течение 10 минут, центрифугировали при 830 × g в течение 4-х минут и промывали три раза в 1х ФСБ с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FACS буфер). Другие тканевые клетки однократно промывали в 1х ФСБ и фиксировали в 2% параформальдегиде. Для внутриклеточных пятен фиксированные клетки дважды промывали буфером FACS, содержащим 1 мг/мл сапонина (буфер сапонина) и окрашивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Для внутриядерных пятен (БДУ и Ki-67) фиксированные клетки дважды промывали в смеси 1:1 буфера сапонина и 2х BD FACSPerm, далее однократно промывали в буфере сапонина и окрашивали в течение 1 часа при комнатной температуре в присутствии 0,5 мг/мл ДНКазы I. После окрашивания образцы дважды промывали в буфере сапонина и далее осуществляли запуск на BD-LSRII (Becton Dickinson, Франкин Лейке, штат Нью Джерси). Данные проточной цитометрии анализировали, применяя FlowJo версии 9.6.4 (TreeStar, Ашленд, штан Орегон). Все положительные гейты были установлены с применением контрольных трубок с комбинацией нескольких антител без одного (FMO) для соответствующего флуорофора.

[092] ПРИМЕР 3

[093] Липосомальный алендронат хорошо переносится приматами, не являющимися человеком. Безопасность лечения ЛА рассматривали на модели примата, не являющегося человеком. У четырех макак-резусов отслеживали сывороточные концентрации четырех ключевых показателей функции печени (альбумина, аланинтрансаминазы, щелочной фосфатазы и билирубина), каждый из которых получал один из двух различных режимов лечения ЛА. На ФИГ. 2A-2D представлен биохимический анализ сыворотки макак-резусов, получавших многократную низкую дозу (0,1 мг/кг в.в. каждый день в течение одной недели; Rh22618 и Rh28450) или однократную высокую дозу (10 мг/кг в.в.; Rh28438 и Rh29054) ЛА. Пунктирные линии обозначают ожидаемые диапазоны сывороточных концентраций альбумина, аланинтрансаминазы, щелочной фосфатазы и общего билирубина, основанные на статистике численности макак-резусов в Национальном исследовательском центре приматов в штате Орегон. Биохимический анализ сыворотки животных, получавших многократные инъекций низкой дозы ЛА, проводили на 0, 3 и 7 день. Биохимический анализ сыворотки животных, получавших однократную инъекцию высокой дозы ЛА, следовал за два дня до аутопсии.

[094] Как представлено на ФИГ. 2A-D, многократные введения низкой дозы ЛА не выявили никаких изменений в функции печени, в то время как однократная высокая доза приводила к нарушениям функции печени. В частности, сравнение между измерениями исходного уровня и измерениями после ЛА не выявили никаких неблагоприятных изменений в биохимическом анализе сыворотки у животных, получавших многократные низкие дозы ЛА (Rh22618 и Rh28450). Все значения снижались в пределах ожидаемых диапазонов за исключением щелочной фосфатазы у Rh28450, который был высоким на исходном уровне (ФИГ. 2С). В отличие от животных, ежедневно получавших низкие дозы ЛА, животные, получавшие однократную высокую дозу ЛА (Rh28438 и Rh29054) демонстрировали пониженные сывороточные концентрации альбумина (ФИГ. 2А), совпадающие с повышенными концентрациями аланинтрансаминазы (ФИГ. 2В), хотя концентрации аланинтрансаминазы находились в пределах ожидаемых значений. Данные изменения в сывороточных концентрациях альбумина и аланинаминотрансфераза свидетельствуют о физической нагрузке на печень, вероятно, вследствие снижения числа клеток Купфера в печени (см. ниже). Несмотря на данные выводы, не было обнаружено неблагоприятных клинических побочных эффектов от лечения ЛА у животных с высокой дозой, ни у каких-либо животных, получавших ЛА, независимо от дозы или частоты. Важно отметить, что 0,1 мг/кг ЛА в.в. было достаточно для того, чтобы уменьшать количество моноцитов (ФИГ. 1А-В) и данная доза ЛА была безопасна для макак-резусов даже при многократных ежедневных инъекциях (ФИГ. 2A-D). В связи с этим ЛА хорошо переносится в эффективных дозах и представляет собой новую жизнеспособную методику для деплеции моноцитов у приматов, не являющихся человеком.

[095] Макак-резусов размещали в Национальном исследовательском центре приматов в штате Орегон. Институциональный комитет по уходу и использованию животных Орегонского университета здравоохранения и науки рассмотрел и утвердил все исследовательские протоколы, которые находились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных департамента здравоохранения и социальных служб США.

[096] ПРИМЕР 4

[097] Лечение ЛА при альтернативной дозе и способе приводит к деплеции моноцитов в другой модели примата, не являющегося человеком. Наблюдали различные дозы и способы введения ЛА для того, чтобы осуществить более значительную деплецию моноцитов у макак-резусов по сравнению с контрольной группой как показано на ФИГ. 3А-В. Трем макакам-резусам (Rh24937, Rh28034 и Rh28099) вводили 1 мг/кг ЛА как в.в., так и внутрибрюшинно (в.б.), и отслеживали частоту моноцитов на 1 д.п.и., применяя проточную цитометрическую окрашивающую панель, описанную выше. Два контрольных макака-резуса (Rh26118 и Rh26144) получали инъекции фосфатно-солевого буфера тех же объемов и способов, как животные, получавшие лечение ЛА. Популяция моноцитов была отличима от лимфоцитов и гранулоцитов посредством явных средних интенсивностях флуоресценции (СИФ) CD45 в зависимости от профиля бокового светорассеяния (ФИГ. 3А).

[098] На ФИГ. 3А представлена частота моноцитов через день после однократной 1 мг/кг дозы ЛА макакам-резусам по сравнению с контролем, измеренная с применением проточной цитометрической окрашивающей панели, как указано в Таблице 4. В частности, на ФИГ. 3А представлена частота моноцитов в цельной крови до и после лечения ЛА, определяемая проточным цитометрическим анализом СИФ CD45 в зависимости от профиля бокового светорассеяния. После лечения ЛА наблюдали значительные снижения частоты моноцитов на 1 д.п.и. с особенно выраженной деплецией у Rh28034 (исходный уровень: 8,22%; 1 д.п.и.: 1,78%). В отличие от этого, частоты моноцитов у контрольных животных оставались стабильными на 1 д.п.и. (ФИГ. 3А).

[099] Для того, что произвести дальнейшую оценку деплеции моноцитов, наблюдаемую у макак-резусов, получавших лечение ЛА, оценивали субпопуляции моноцитов, чтобы определить, какие подверглись наибольшему воздействию. Частоту трех описанных выше субпопуляций моноцитов (классическую CD14⁺CD16^-, промежуточную CD14⁺CD16⁺ и неклассическую CD14^-CD16⁺) [24] сравнивали в пределах общего пула моноцитов до и после лечения ЛА. Результаты представлены на ФИГ. 3В. В частности, на ФИГ. 3В представлена частота субпопуляций моноцитов через день после однократной 1 мг/кг дозы ЛА макакам-резусам по сравнению с контролем, измеренная с применением проточной цитометрической окрашивающей панели, как указано в Таблице 4. В частности, на ФИГ. 3В представлена частота субпопуляций моноцитов в цельной крови до и после лечения ЛА, определяемая проточным цитометрическим анализом CD14⁺ в зависимости от CD16⁺ окрашивания. Значимую изменчивость от животного к животному наблюдали при сравнении частот субпопуляций моноцитов до и после лечения. Важно отметить, что макаки-резусы, получавшие лечение ЛА, продемонстрировали почти полное исчезновение CD14^-CD16⁺ моноцитов на 1 д.п.и., в то время как контрольные макаки-резусы сохраняли близкие частоты субпопуляций моноцитов на 1 д.п.и., подтверждая наблюдаемое отсутствие общей деплеции моноцитов (ФИГ. 3А-В).

[0100] Для того, чтобы определить длительность деплеции, абсолютное количество и частоты моноцитов отслеживали на протяжении 7 д.п.и. Результаты представлены на ФИГ. 4A-D, на которой незакрашенные изображения обозначают животных, получавших лечение ЛА, а закрашенные изображения обозначают контрольных животных. Верхний ряд на ФИГ. 4A-D обозначает абсолютное количество моноцитов в цельной крови до и лечения ЛА. Абсолютное количество моноцитов подсчитывали при помощи проведения оценки частоты CD14⁺ и/или CD16⁺ моноцитов и сравнения данного значения с общим количеством лейкоцитов (CD45⁺ клетки). Нижний ряд на ФИГ. 4A-D обозначает частоту моноцитов в цельной крови до и после лечения ЛА, оцененную при помощи проточной цитометрии. В соответствии с данными, показывающими значительные снижения частоты моноцитов после лечения ЛА, абсолютное количество моноцитов на микролитр крови также показало значительное снижение на 1 д.п.и. (ФИГ. 4А, внизу). Это было наиболее ярко выражено у Rh28034 и Rh28099, где абсолютное количество моноцитов уменьшилось на 87% и 84% соответственно. Неожиданно абсолютное количество моноцитов также обнаружило сохранность CD14⁺CD16⁺ моноцитов после лечения ЛА. Это находилось в резком контрасте со значительным снижением количества моноцитов, наблюдаемым в CD14⁺CD16^- и CD14^-CD16⁺ популяциях (ФИГ. 4A-D, верхний ряд). Снижение числа моноцитов, наблюдаемоя у данных макак-резусов, получавших лечение ЛА, было крайне кратковременным, подобно тому, что наблюдали у яванских макак, получавших лечение однократной 0,1 мг/кг дозой ЛА в.в. (ФИГ. 1А-В; ФИГ. 4A-D, нижний ряд). Таким образом, лечение ЛА может безопасно индуцировать значительную, но крайне кратковременную, деплецию моноцитов у макак-резусов.

[0101] ПРИМЕР 5

[0102] Лечение ЛА снижает частоту тканевых резидентных макрофагов и увеличивает частоту моноцитов костного мозга. Как было показано выше, липосомальный алендронат последовательно осуществляет деплецию тканевых резидентных макрофагов и индуцирует выработку моноцитов костного мозга в модели приматов, не являющихся человеком. Для того, чтобы определить, является ли последовательная деплеция моноцитов в когорте приматов, не являющихся человеком, наблюдаемая после введения ЛА (ФИГ. 1А-В; ФИГ. 4A-D), параллельной к снижению частоты тканевых резидентных макрофагов и моноцитов костного мозга, различные ткани собирали и проводили оценку частот макрофагов/моноцитов с применением 11-цветной проточной цитометрической окрашивающей панели (Пример 2, Таблица 4), применяя процедуру гейтирования. Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), биопсии толстой кишки, биопсии печени и пунктат костного мозга собирали до и после лечения ЛА у шести макак-резусов при помощи метода обработки ткани, описанного ниже. На ФИГ. 5А-Е представлена стратегия гейтирования для идентификации макрофагов в тканях (определяемые как МАС387⁺ и/или CD163⁺) и костном мозге (определяемые как CD163⁺), как представлено для ткани толстой кишки.

[0103] Никаких изменений частоты альвеолярных макрофагов не наблюдали в БАЛ после лечения ЛА (данные не показаны). На ФИГ. 6А-С представлен типичный тканевый резидентный макрофаг и окрашивание миелоидного предшественника костного мозга от Rh28450 и Rh29724. Более конкретно на ФИГ. 6А-С (Фигура 4В) представлены сравнительные примеры окрашивания МАС387 в зависимости от CD163 до и после лечения ЛА из пунктата костного мозга, печени и толстой кишки. МАС387 представляет собой антитело, которое распознает кальций-связывающий миелоид-связанный белок MRP14, который экспрессируется в тканевых резидентных макрофагах [25-27]. Данная окрашивающая панель идентифицирует три различных популяции макрофагов в данных тканях: MAC387⁺CD163^-, MAC387⁺CD163⁺ и MAC387-CD163⁺. В целом, как представлено на ФИГ. 6А-В, МАС387^-CD163⁺ макрофаги обнаружили при более низкой частоте, чем MAC387⁺CD163^- и MAC387⁺CD163⁺ макрофаги. Для того, чтобы также произвести дальнейшую оценку трех данных популяций тканевых макрофагов, исследовали их экспрессию CD68, гликопротеина, также экспрессируемого в тканевых резидентных макрофагах [26, 28, 29]. В частности, экспрессию CD68 в популяциях MAC387⁺CD163^- и MAC387⁺CD163⁺ из толстой кишки Rh29724 до и после лечения ЛА сравнивали с экспрессией MAC387^-CD163⁺ (заштриховано). На ФИГ. 6С представлено, что экспрессия CD68 тремя популяциями из толстой кишки Rh29724 до и после лечения ЛА обладала сходными профилями окрашивания в обоих моментах времени. На ФИГ. 6С также представлено, что оба MAC387+CD163- и MAC387+CD163+ макрофага экспрессируют CD68, причем последняя популяция демонстрирует самую высокую экспрессию, подтверждая, что применяемая проточная цитометрическая панель была в состоянии идентифицировать тканевые макрофаги. Таким образом, деплеция тканевых резидентных макрофагов после лечения ЛА у приматов, не являющихся человеком, с применением трех ранее описанных маркеров макрофагов, впервые представлена в настоящем описании.

[0104] Анализ расширяли для того, чтобы определить эффективность лечения ЛА в отношении деплеции моноцитов в костном мозге. Поскольку моноциты крови экспрессируют как МАС387, так и CD 163 с последующей эмиграцией из костного мозга, частоту клеток, экспрессирующих данные маркеры в костном мозге, исследовали до и после лечения ЛА у шести макак-резусов. Аналогичным образом проводили оценку деплеции тканевых макрофагов в печени и толстой кишке. ФИГ. 7А отображает частоту CD163⁺ клеток в костном мозге до и после лечения ЛА. ФИГ. 7В отображает частоту тканевых резидентных макрофагов (процентное изменение от исходного уровня) в печени до и после лечения ЛА. ФИГ. 7С изображает частоту тканевых резидентных макрофагов в толстой кишке до и после лечения ЛА.

[0105] Окрашивание пунктата костного мозга обнаружило небольшое изменение в общей частоте моноцитов, определенных как МАС387⁺ и/или CD163^- (данные не показаны). Однако учитывая, что гранулоциты в костном мозге могут также экспрессировать МАС387, провели отдельный анализ для того, чтобы определить моноциты костного мозга как CD163⁺ [25]. Наблюдали значимое увеличение образования предшественника моноцитов в костном мозге, как представлено на ФИГ. 7А. В частности, данный анализ обнаружил значимые увеличения частоты моноцитов костного мозга после введения ЛА (p=0,031) (ФИГ. 7А). Несмотря на первоначальную гипотезу о том, что лечение ЛА будет приводить к снижению числа моноцитов костного мозга, данный обнаруженный факт не является неожиданным, поскольку было показано, что связанная с ВИЧ деплеция тканевых макрофагов увеличивает миелоидный оборот, начиная с высвобождения моноцитов из костного мозга [30]. Тем не менее вероятность того, что деплеция моноцитов происходит в костном мозге до самого раннего исследуемого момента времени (1 д.п.и.), не может быть упущена из виду.

[0106] Как представлено на ФИГ. 7В-С, частоты тканевых резидентных макрофагов снижали путем лечения ЛА. ФИГ. 7В обнаруживает значимое снижение в печени. На ФИГ. 1С представлено, что у четырех из пяти макак-резус происходило снижение макрофагов толстой кишки, хотя это не было статистически значимым вследствие одного животного, проявляющего увеличение частоты макрофагов толстой кишки. В частности, частоты макрофагов в печени были снижены на >45% после лечения ЛА у пяти из шести исследуемых животных (p=0,031; ФИГ 4D, левая панель). Все значимые критерии для ФИГ. 7А-С представляли собой знаковые ранговые критерии Уилкоксона. Учитывая, что клетки Купфера составляют 80-90% тканевых макрофагов в организме человека, данный результат указывает на эффективность ЛА в отношении деплеции тканевых макрофагов [31]. Важно отметить, что большинство деплецированных макрофагов в печени представляли собой MAC387⁺CD163^- (ФИГ. 7В и данные не показаны). Такую же тенденцию наблюдали и в толстой кишке, где общая частота макрофагов была снижена на >45% у четырех из пяти животных (Rh22618 исключили из анализа вследствие необнаруживаемой частоты макрофагов до ЛА) (p=0,625). В толстой кишке, тем не менее, деплеция была более равномерно распределена среди трех популяций макрофагов (ФИГ. 1С и данные не показаны). Неожиданно одно из животных (Rh27508) показало значительное увеличение частоты макрофагов в толстой кишке. Тем не менее, данное животное также продемонстрировало описанную выше экспансию CD163⁺ моноцитов в костный мозг, > 80%) снижение абсолютного количества моноцитов и > 50% снижение частоты макрофагов в печени, обеспечивая достаточно доказательств непосредственного воздействия лечения ЛА (ФИГ. 7В-С). Таким образом, нельзя исключать возможность того, что увеличение частоты макрофагов в толстой кишке является результатом динамики дифференциального миелоидного клеточного оборота после ЛА-ассоциированной деплеции у данного животного.

[0107] Обработка ткани. Бронхоальвеолярный лаваж фильтровали через 70 мкм фильтровальные сетки. Костный мозг осаждали при помощи центрифугирования при 830 × g в течение 4 минут, далее снова суспендировали и энергично встряхивали в 1х ФСБ, содержащем 2 мМ ЭДТА, чтобы разъединить большие комки клеток. Клетки дважды промывали в RPMI-1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (R10) (Hyclone Laboratories, Логан, штат Юта). Лимфатические узлы и селезенку нарезали кубиками при помощи скальпеля и далее продавливали через 70 мкм клеточную фильтровальную сетку. Фильтровальную сетку промывали несколько раз с R10, чтобы получить суспензии отдельных клеток. Толстую кишку и печень нарезали кубиками по 5 мм³ и приблизительно 25-30 данных кусочков помещали в 50 мл коническую емкость, содержащую 25 мл среды RPMI-1640 с добавлением 3% фетальной сыворотки теленка (R3). Добавляли дитиотреитол при конечной концентрации 200 мкМ и встряхивали ткани при 225 оборотах в минуту в течение 15 минут при комнатной температуре. Тканям позволяли осесть, a R3 с ДТТ отсасывали при помощи аспиратора и заменяли R3, содержащей 5 мМ ЭДТА. Ткани встряхивали при 225 оборотах в минуту в течение 30 минут при 37°C, а клетки, содержащие супернатант, собирали и пропускали через клеточную фильтровальную сетку. Снова добавляли R3, содержащую ЭДТА, встряхивали ткани и собирали клетки. Ткани два раза промывали в 1х сбалансированном солевом растворе Хэнкса для того, чтобы удалить избыток ЭДТА, и далее суспендировали в R3, содержащей 0,1 мг/мл коллагеназы (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури) и 0,1 мг/мл ДНКазы I (Roche, Индианаполис, штат Индиана). Ткани встряхивали при 225 оборотах в минуту в течение 45 минут при 37°C, а клетки, содержащие супернатант, собирали и пропускали через 70 мкм клеточную фильтровальную сетку. Снова добавляли R3, содержащую коллагеназу и ДНКазу I, встряхивали ткани и собирали клетки. Клеточные фракции, собранные со стадий расщепления ЭДТА и коллагеназы, комбинировали (общая ткань) и ресуспендировали в 30% изотоническом перколле (GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания). Далее клетки наслаивали на 60%/40%-ный градиент перколла и центрифугировали при 500 × g при выключенном тормозе. Мононуклеарные клетки из нижней границы раздела собирали и промывали в R10.

[0108] ПРИМЕР 6

[0109] 5'-бром-2'-деоксиуридин (БДУ) обнаруживает оборот моноцитов после лечения ЛА. Как показано приведенными выше данными, моноциты последовательно обнаруживали после лечения ЛА, однако данные не дифференцируют, являются ли моноциты вновь эмигрировавшими клетками из костного мозга или просто остатком из изначального клеточного пула. Увеличенные частоты CD163⁺ моноцитов костного мозга давали предположение, что оборот моноцитов усиливался после лечения ЛА. Для того, чтобы обеспечить более подробную характеристику возобновления моноцитов, подтвердить результаты деплеции и позволить произвести лучший расчет общей деплеции моноцитов крови, разработали и выполнили лечение ЛА совместно с введением БДУ, чтобы установить уровень возобновление моноцитов в данной модели у примата, не являющегося человеком.

[0110] БДУ представляет собой синтетический аналог тимидина, который встраивают в ДНК делящихся клеток во время фазы S и который можно обнаружить при помощи внутриклеточного окрашивания антител [32, 33]. Делящиеся предшественники моноцитов в костном мозге интегрируют БДУ перед высвобождением в кровь как моноциты. После высвобождения из костного мозга, моноциты и тканевые резидентные макрофаги делятся редко, что делает БДУ надежным маркером миелоидного клеточного оборота [30].

[0111] Для того, чтобы оценить оборот моноцитов, два макака-резуса, Rh28438 и Rh29054, получали 10 мг/кг ЛА в.в. наряду с 60 мг/кг БДУ в.в. Контрольное животное Rh31577 получало фосфатно-солевой буфер наряду с аналогичной 60 мг/кг дозой БДУ. БДУ суспендировали при 10 мг/мл в HBSS (сбалансированном солевом растворе Хэнкса) (Hyclone Laboratories, Логан, штат Юта). 60 мг/кг БДУ при помощи инъекций вводили внутривенно (в подкожную вену) со скоростью 2-3 мл/мин. ФИГ. 8А-С обнаруживают как деплецию моноцитов, так и высокий оборот моноцитов после лечения ЛА. Лечение ЛА осуществляло деплецию большинства моноцитов крови на основании: частоты, оцененной при помощи CD45 окрашивания в зависимости от профиля бокового светорассеяния (ФИГ. 8А) и абсолютного количества моноцитов (ФИГ. 8В). Окрашивание БДУ (ФИГ. 8С) обнаружило высокие уровни оборота моноцитов после лечения ЛА в обоих CD14⁺CD16^- (классическая) и CD14⁺CD16^- (промежуточная) популяциях моноцитов. Представленные значения указывают процент от общего числа CD14^-CD16^- (классическая) и CD14⁺CD16⁺ (промежуточная) популяций, окрашивающихся положительно для БДУ. Для того, чтобы определить уровень оборота моноцитов после лечения ЛА, двум макакам-резусам (Rh28438 и Rh29054) при помощи инъекции вводили 10 мг/кг ЛА в.в. наряду с 60 мг/кг БДУ и отслеживали частоту БДУ⁺ и БДУ^- моноцитов через 2 д.п.и. Контрольное животное Rh31577 получало фосфатно-солевой буфер наряду с аналогичной 60 мг/кг дозой БДУ. Как представлено на ФИГ. 8А, лечение ЛА у Rh28438 и Rh29054 и в этом же случае привело к глубокому снижению частоты моноцитов на 1 д.п.и. Неожиданно контрольное животное Rh31577 также показало снижение частоты моноцитов, хотя и в меньшей степени.

[0112] Для того, чтобы подтвердить, что Rh31577 действительно представлял собой соответствующий контроль с учетом наблюдаемого снижения частоты моноцитов у данного животного (ФИГ. 8А), абсолютное количество моноцитов оценивали до и после лечения ЛА у всех трех макак-резусов. Как и ожидалось, наблюдали значительное снижение количества моноцитов у животных, получавших лечение ЛА, в то время как количество моноцитов у Rh31577 оставалось неизменным после инъекции фосфатно-солевого буфера, как представлено на ФИГ. 8В.

[0113] В конечном итоге эмиграцию моноцитов из костного мозга (БДУ⁺) отслеживали посредством сравнения животных, получавших лечение ЛА, с контрольным (ФИГ. 8С). Неожиданно наблюдали более высокую частоту CD14⁺CD16^-БДУ⁺ моноцитов у животных, получавших лечение ЛА, по сравнению с контрольным животным на 1 д.п.и. с более чем половиной CD14⁺CD16^- моноцитов, окрашивающихся положительно для БДУ у Rh28438 (ФИГ. 8С, левая панель). На ФИГ. 8С также представлено, что ≥10% от CD14⁺CD16⁺ моноцитов окрасились положительно для БДУ у животных, получавших лечение ЛА, на 1 д.п.и. с резким контрастом к контрольному животному Rh31577, которое не имело СD14⁺СD16⁺БДУ⁺ моноцитов на 1 д.п.и. Острое воспаление приводит к увеличению оборота моноцитов, так как моноциты проникают в пораженные ткани для того, чтобы дифференцироваться в макрофаги [34]. В случае с макака-резусами, инфицированными вирусом иммунодефицита обезьян (ВИО), оборот моноцитов является сильным прогностическим фактором развития СПИД [30]. Аналогичным образом высокий уровень оборота моноцитов коррелирует с тяжестью индуцируемого ВИО энцефалита у макак-резусов [35]. Примечательно, что уровни оборота моноцитов, которые авторы настоящего изобретения наблюдали у животных, получавших лечение ЛА, на 1 д.п.и. были аналогичны или значительнее наблюдаемых у ВИО-инфицированных макак-резусов, включая быстрых прогрессоров с тяжелым энцефалитом [30, 35]. Таким образом, лечение ЛА увеличивает оборот моноцитов крови, обнаруженный факт в подтверждение увеличенной выработки моноцитов костного мозга и данных о деплеции моноцитов крови. Кроме того, данные уровни оборота моноцитов крови сопоставимы с развившейся ВИО-инфекцией, при которой наблюдается отмечаемый оборот моноцитов.

[0114] КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЛА НА МОНОЦИТЫ И МАКРОФАГИ

[0115] Таким образом впервые было показано, что ЛА является безопасным и эффективным способом деплеции моноцитов и тканевых макрофагов в модели примата, не являющегося человеком. Важно, что селективная деплеция субпопуляций моноцитов в настоящем описании демонстрируется впервые на CD14⁺CD16^- и CD14^-CD16⁺ моноцитах, проявляющих число которых сильно уменьшается по сравнению с субпопуляцией CD14⁺CD16⁺. Введение ЛА последовательно понижало абсолютное количество моноцитов и частоты тканевых макрофагов в печени и толстой кишке. Данную деплецию ассоциировали со значимым увеличением выработки моноцитов в костном мозге, обнаруженным фактом, подтверждающим увеличенный оборот моноцитов в крови, как измерено при помощи инкорпорации БДУ в ДНК.

[0116] LA-опосредованная деплеция моноцитов была крайне кратковременной у всех исследуемых приматов, не являющихся человеком, и данный обнаруженный факт является полным подтверждением предыдущего исследования на кроликах, крысах и людях, у которых деплеция моноцитов ЛА также является кратковременной. Важно отметить, что было показано, что кратковременная деплеция моноцитов оказывает сильное и устойчивое противовоспалительноедействие, иллюстрируемое пониженной частотой заболеваемости рестенозом и эндометриозом после лечения ЛА [23, 36, 37]. Следовательно, предпочтительность введения ЛА приматам, не являющимся человеком, может распространяться далеко за пределы временных рамок деплеции моноцитов.

[0117] В отличие от печени и толстой кишки, деплецию альвеолярных макрофагов обнаружили в легких после лечения ЛА. Причина для данного различия остается неясной, однако, не будучи ограниченной теорией, она может зависеть от биораспределения или нацеливания ЛА на макрофаги в легких. С учетом большого числа макрофагов в легких (~ 70% от легочных иммунных клеток), возможно, что масса ЛА, достигающая легких после в.в. или в.б. инъекции является недостаточной для того, чтобы привести к снижению обнаруживаемого числа клеток [38]. Кроме того, системное введение ЛА (в.в. и в.б.) может ингибировать деплецию альвеолярных макрофагов на поверхности слизистой оболочки легких с учетом того, что небольшие количества ЛА, покидающие печень, будет разноситься через кровь. Данный ЛА натолкнется и потенциально нацелится на альтернативные макрофаги легочной ткани, такие как интерстициальные макрофаги.

[0118] Две основные популяции макрофагов наблюдали в тканях макак-резусов: MAC387⁺CD163⁺ и MAC387⁺CD163^-. Тем не менее, у людей МАС387⁺ макрофаги характеризовались как M1-подобные и CD163⁺ макрофаги как М2-подобные с практически отсутствием коэкспрессии данных маркеров на одних и тех же клетках. Подтверждая данную идентификацию MAC387⁺CD163⁺ тканевых макрофагов, недавнее исследование на макаках-резусах всесторонне охарактеризовало маркеры, экспрессированные различными популяциями легочных резидентных макрофагов, демонстрируя, что как моноциты крови, так и интерстициальные макрофаги коэкспрессируют высокие уровни МАС387 и CD163 [38]. Функциональный анализ данной клеточной популяции обнаружил, что MAC387⁺CD163⁺ интерстициальные макрофаги реагируют на классические сигналы активации макрофагов (ИФН-γ и липополисахариды (LPS)). Таким образом предполагается, что MAC387⁺CD163⁺ определяют M1-подобную популяцию макрофагов, хотя анатомическое местоположение может влиять на экспрессию данных маркеров, тогда как MAC387⁺CD163⁺ макрофаги редки в ткани головного мозга макак-резуса [26].

[0119] Анализам, проведенным в настоящем исследовании, содействовала разработка 11-цветной проточной цитометрической окрашивающей панели, которая применяется повсеместно в отношении крови и тканям для идентификации моноцитов и макрофагов соответственно. См. Пример 2, Таблицу 4 выше. Исследования сильно зависели от клеточных линий макрофагов, таких как U937, и макрофагов, полученных из моноцитов in vitro, которые не могут по-настоящему воспроизвести сложность тканевых резидентных макрофагов [42-44]. Оценка тканевых резидентных макрофагов при помощи проточной цитометрии обеспечивает преимущество сортировки живых клеток, процедуры, которой не достичь традиционными методами иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания. Учитывая многочисленные роли макрофагов в физиологических процессах, способность проводить функциональные анализы на макрофагах непосредственно ex vivo оказывает влияние на множественные области исследования.

[0120] Приматы, не являющиеся человеком, обеспечивают мощную модель биологии человека. В настоящем описании модель примата, не являющегося человеком, является продвинутой, впервые показывая, что можно экспериментально осуществить деплецию моноцитов и макрофагов посредством введения ЛА. Учитывая научный факт, получаемый посредством деплеции Т-клеток, В-клеток и NK-клеток у приматов, не являющихся человеком [8-13], считается, что метод, описанный в настоящем описании, также усиливает модель примата, не являющегося человеком, и обеспечивает уникальное направление для исследования многих физиологических процессов моноцитов крови и тканевых макрофагов.

[0121] ПРИМЕР 7 - ПРОТОКОЛ ЛЕЧЕНИЯ ВИЧ/СПИД

[0122] Воздействие липосомального алендроната на плазматические вирусные нагрузки и количество периферических CD4⁺ Т-клеток после прекращения ВААРТ оценивали на животной модели. В частности, способность ЛА уменьшать или осуществлять деплецию резервуаров ВИЧ испытывали на модели СПИД индийского макака-резуса. Макаку-резус широко применяют при исследованиях СПИД, и вид является одной из наиболее хорошо охарактеризованной модели приматов, не являющихся человеком, для ВИЧ/СПИД. (см. Pereira, L.E. и др., Immunodeficiency, Ch. 15, доступно по адресу http://dx.doi.org/10.5772/53556) Два макака инфицировали гибридным обезьяньим вирусом иммунодефицита человека (SHIV) и плазматическая вирусная нагрузка и количество периферических CD4⁺ Т-клеток исследовали неоднократно в течение промежутка времени. SHIV, применяемый в данном исследовании, SHIV DH12 клон 7, системно приводит к снижению числа CD4⁺ Т-клеток и далее начинает реплицироваться в макрофагах, аналогично поздней хронической стадии ВИЧ-инфекции в организме человека. Как представлено на ФИГ. 9 и 10, животные получали ВААРТ, чтобы подавить репликацию вируса, начиная близко к 8 неделе после SHIV инфекции, когда вирус начинал реплицироваться в макрофагах.

[0123] ЛА получали согласно протокола, описанного в Примере 1.

[0124] Для того, чтобы исследовать воздействие состава согласно настоящему изобретения во время ВААРТ, одно животное получало ЛА в дозе 1 мг/кг массы тела, введенное внутривенно, в то время как другое животное в качестве контроля получало в.в. инъекции фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Время данного введения указано стрелкой на ФИГ. 9 и 10. После данного введения ВААРТ продолжали в течение полутора дополнительных недель почти до 15-ой недели после инфекции, чтобы защитить клетки-мишени во время циркуляции макрофагального компартмента вследствие ЛА-опосредованной деплеции данных клеток. Плазматические вирусные нагрузки и количество периферических CD4⁺ Т-клеток у двух животных регулярно отслеживали от инфекции до приблизительно 20 недели после инфекции.

[0125] Плазматические вирусные нагрузки ("ВН"), т.е., количество репликаций ВИЧ в крови, оценивали путем измерения числа копий вирусной РНК на мл плазмы крови. Измерение представляет собой общепринятый анализ в исследовании ВИЧ/СПИД и его проводили в соответствии с протоколом, описанным у Friedrich, Т.С. и др. "Subdominant CD8+ T-cell responses are involved in durable control of AIDS virus replication." J. Virology, 81(7):3465-76 (2007).

[0126] На ФИГ. 9 представлено воздействие внутривенно введенного при помощи инъекции ЛА на ВН SHIV-инфицированного макака по сравнению с SHIV-инфицированным макаком, получавшим плацебо-контроль (в.в. ФСБ). ВН обозначают как копии вирусной РНК на мл плазмы крови. Заштрихованная область обозначает длительность ВААРТ терапии, а стрелка указывает на момент времени, когда вводят липосомальный алендронат. В частности, на ФИГ. 9 представлена динамика и интенсивность проявления вирусной нагрузки в течение всего периода исследования. У обоих животных наблюдали увеличение репликации вируса в течение первой недели после прекращения ВААРТ, однако животные, получавшие лечение ЛА, демонстрировали стойкое 1-2 логарифмическое снижение плазматических вирусных нагрузок по сравнению с контрольным животным до по меньшей мере 20 недели после инфекции.

[0127] Число периферических CD4⁺ Т-клеток отражает тяжесть ВИЧ/СПИД, с меньшим количеством соответствуя повышенной репликации ВИЧ и более сильному повреждению иммунной системы. Количество периферических CD4⁺ Т-клеток можно измерить при общепринятом анализе в исследовании ВИЧ/СПИД, и в данном примере его измеряли в соответствии с протоколом, описанным у Friedrich, Т.С. и др., "Subdominant CD8+ T-cell responses are involved in durable control of AIDS virus replication." J. Virology, 81(7):3465-76 (2007).

[0128] На ФИГ. 10 представлено воздействие внутривенно введенного при помощи инъекции ЛА на количество периферических CD4⁺ Т-клеток у SHIV-инфицированного макака по сравнению с SHIV-инфицированным макаком, получавшим в.в. плацебо ФСБ (контроль). Количество CD4⁺ Т-клеток обозначает число CD4⁺ Т-клеток на микро-л крови. Заштрихованная область обозначает длительность ВААРТ терапии, а стрелка указывает на момент времени, когда вводят липосомальный алендронат. В частности, на ФИГ. 10 представлено изменение количества CD4⁺ Т-клеток в течение всего периода исследования. Количествл CD4⁺ Т-клеток у обоих животных быстро снижалось после инфекции SHIV и они почти почти полностью исчезли через две недели. Оба животных обладали ограниченным увеличением количества периферических CD4⁺ Т-клеток после начала противовирусной терапии. Как представлено на ФИГ. 10, у животных, получавших лечение ЛА, произошло заметное восстановление количества периферических CD4⁺ Т-клеток после введения ЛА, и восстановление продолжалось по меньшей мере приблизительно 5 недель. Контрольное животное, которое не получало ЛА, поддерживало минимальный уровень периферических CD4⁺ Т-клеток на протяжении всего исследования.

[0129] Специалистам среднего уровня в данной области техники следует понимать, что многие вариации, дополнения, модификации и другие применения можно осуществить по отношению к тому, что было конкретно представлено и описано в настоящем описании посредством направлений вариантов реализаций, не выходя за пределы сущности или объема настоящего изобретения. Таким образом предполагается, что объем настоящего изобретения, как определено в приведенной ниже формуле изобретения, включает в себя все прогнозируемые вариации, дополнения, модификации или применения.

[0130] ССЫЛКИ

[0131] 1. Pollard, J. W. (2009) Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol 9, 259-270.

[0132] 2. Schneemann, M., Schoeden, G. (2007) Macrophage biology and immunology: man is not a mouse. J Leukoc Biol 81, 579; discussion 580.

[0133] 3. Murray, P. J., Wynn, T. A. (2011) Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. J Leukoc Biol 89, 557-563.

[0134] 4. Haigwood, N. L. (2009) Update on animal models for HIV research. Eur J Immunol 39, 1994-1999.

[0135] 5. Yang, S. H., Cheng, P. H., Banta, H., Piotrowska-Nitsche, K., Yang, J. J., Cheng, E. C, Snyder, В., Larkin, K., Liu, J., Orkin, J., Fang, Z. H., Smith, Y., Bachevalier, J., Zola, S. M., Li, S. H., Li, X. J., Chan, A. W. (2008) Towards a transgenic model of Huntington's disease in a non-human primate. Nature 453, 921-924.

[0136] 6. Sacha, J. В., Kim, I. J., Chen, L., Ullah, J. H., Goodwin, D. A., Simmons, H. A., Schenkman, D. I., von Pelchrzim, F., Gifford, R. J., Nimityongskul, F. A., Newman, L. P., Wildeboer, S., Lappin, P. В., Hammond, D., Castrovinci, P., Piaskowski, S. M., Reed, J. S., Beheler, K. A., Tharmanathan, Т., Zhang, N., Muscat-King, S., Rieger, M., Fernandes, C, Rumpel, K., Gardner, J. P., Gebhard, D. H., Janies, J., Shoieb, A., Pierce, B. G., Trajkovic, D., Rakasz, E., Rong, S., McCluskie, M., Christy, C, Merson, J. R., Jones, R. В., Nixon, D. F., Ostrowski, M. A., Loudon, P. Т., Pruimboom-Brees, I. M., Sheppard, N. C. (2012) Vaccination with Cancer- and HIV Infection-Associated Endogenous Retrotransposable Elements Is Safe and Immunogenic. J Immunol 189, 1467-1479.

[0137] 7. Tachibana, M., Sparman, M., Sritanaudomchai, H., Ma, H., Clepper, L., Woodward, J., Li, Y., Ramsey, C, Kolotushkina, O., Mitalipov, S. (2009) Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature 461, 367-372.

[0138] 8. Choi, E. I., Reimann, K. A., Letvin, N. L. (2008) In vivo natural killer cell depletion during primary simian immunodeficiency virus infection in rhesus monkeys. J Virol 82, 6758-6761.

[0139] 9. Friedrich, Т. C., Valentine, L. E., Yant, L. J., Rakasz, E. G., Piaskowski, S. M., Furlott, J. R., Weisgrau, K. L., Burwitz, В., May, G. E., Leon, E. J., Soma, Т., Napoe, G., Capuano, S. V., Wilson, N. A., Watkins, D. I. (2007) Subdominant CD8+ T-cell responses are involved in durable control of AIDS virus replication. J Virol 81, 3465-3476.

[0140] 10. Ortiz, A. M., Klatt, N. R., Li, В., Yi, Y., Tabb, В., Нао, X. P., Sternberg, L., Lawson, В., Carnathan, P. M., Cramer, E. M., Engram, J. C., Little, D. M., Ryzhova, E., Gonzalez-Scarano, F., Paiardini, M., Ansari, A. A., Ratcliffe, S., Else, J. G., Brenchley, J. M., Collman, R. G., Estes, J. D., Derdeyn, C. A., Silvestri, G. (2011) Depletion of CD4(+) T cells abrogates post-peak decline of viremia in SIV-infected rhesus macaques. J Clin Invest 121, 4433-4445.

[0141] 11. Haberthur, K., Engelmann, F., Park, В., Barron, A., Legasse, A., Dewane, J., Fischer, M., Kerns, A., Brown, M., Messaoudi, I. (2011) CD4 T cell immunity is critical for the control of simian varicella virus infection in a nonhuman primate model of VZV infection. PLoS Pathog 7, e1002367.

[0142] 12. Hansen, S. G., Powers, C. J., Richards, R., Ventura, А. В., Ford, J. C., Siess, D., Axthelm, M. K., Nelson, J. A., Jarvis, M. A., Picker, L. J., Fruh, K. (2010) Evasion of CD8+ T cells is critical for superinfection by cytomegalovirus. Science 328, 102-106.

[0143] 13. Gordon, S. N., Cecchinato, V., Andresen, V., Heraud, J. M, Hryniewicz, A., Parks, R. W., Venzon, D., Chung, H. K., Karpova, Т., McNally, J., Silvera, P., Reimann, K. A., Matsui, H., Kanehara, Т., Shinmura, Y., Yokote, H., Franchini, G. (2011) Smallpox vaccine safety is dependent on T cells and not В cells. J Infect Dis 203, 1043-1053.

[0144] 14. Van Rooijen, N., Sanders, A. (1994) Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J Immunol Methods 174, 83-93.

[0145] 15. Gutman, D., Golomb, G. (2012) Liposomal alendronate for the treatment of restenosis. J Control Release 161, 619-627.

[0146] 16. van Rooijen, N., Hendrikx, E. (2010) Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol Biol 605, 189-203.

[0147] 17. Epstein-Barash, H., Gutman, D., Markovsky, E., Mishan-Eisenberg, G., Koroukhov, N., Szebeni, J., Golomb, G. (2010) Physicochemical parameters affecting liposomal bisphosphonates bioactivity for restenosis therapy: internalization, cell inhibition, activation of cytokines and complement, and mechanism of cell death. J Control Release 146, 182-195.

[0148] 18. Epstein, H., Gutman, D., Cohen-Sela, E., Haber, E., Elmalak, O., Koroukhov, N., Danenberg, H. D., Golomb, G. (2008) Preparation of alendronate liposomes for enhanced stability and bioactivity: in vitro and in vivo characterization. AAPS J 10, 505-515.

[0149] 19. Kim, W. K., Sun, Y., Do, H., Autissier, P., Halpern, E. F., Piatak, M. J., Lifson, J. D., Burdo, Т. H., McGrath, M. S., Williams, K. (2010) Monocyte heterogeneity underlying phenotypic changes in monocytes according to SIV disease stage. J Leukoc Biol 87, 557-567.

[0150] 21. Danenberg, H. D., Fishbein, I., Epstein, H., Waltenberger, J., Moerman, E., Monkkonen, J., Gao, J., Gathi, I., Reichi, R., Golomb, G. (2003) Systemic depletion of macrophages by liposomal bisphosphonates reduces neointimal formation following balloon-injury in the rat carotid artery. J Cardiovasc Pharmacol 42, 671-679.

[0151] 22. van Веек, E. R., Cohen, L. H., Leroy, I. M., Ebetino, F. H., Lowik, C. W., Papapoulos, S. E. (2003) Differentiating the mechanisms of antiresorptive action of nitrogen containing bisphosphonates. Bone 33, 805-811.

[0152] 23. Banai, S., Finkelstein, A., Almagor, Y., Assali, A., Hasin, Y., Rosenschein, U., Apruzzese, P., Lansky, A. J., Kume, Т., Edelman, E. R. (2013) Targeted antiinflammatory systemic therapy for restenosis: the Biorest Liposomal Alendronate with Stenting sTudy (BLAST)-a double blind, randomized clinical trial. Am Heart J 165, 234-40.el.

[0153] 24. Ziegler-Heitbrock, L., Ancuta, P., Crowe, S., Dalod, M., Grau, V., Hart, D. N., Leenen, P. J., Liu, Y. J., MacPherson, G., Randolph, G. J., Scherberich, J., Schmitz, J., Shortman, K., Sozzani, S., Strobl, H., Zembala, M., Austyn, J. M., Lutz, M. B. (2010) Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood 116, e74-e80.

[0154] 25. Goebeler, M., Roth, J., Teigelkamp, S., Sorg, C. (1994) The monoclonal antibody MAC387 detects an epitope on the calcium-binding protein MRP14. J Leukoc Biol 55, 259-261.

[0155] 26. Soulas, C., Conerly, C/, Kim, W. K., Burdo, Т. H., Alvarez, X., Lackner, A. A., Williams, К. C. (2011) Recently infiltrating MAC387(+) monocytes/macrophages a third macrophage population involved in SIV and HIV encephalitic lesion formation. Am J Pathol 178, 2121-2135.

[0156] 27. Williams, D. W., Eugenin, E. A., Calderon, Т. M., Berman, J. W. (2012) Monocyte maturation, HIV susceptibility, and transmigration across the blood brain barrier are critical in HIV neuropathogenesis. J Leukoc Biol 91, 401-415.

[0157] 28. Mansfield, K., Lang, S. M., Gauduin, M. C, Sanford, H. В., Lifson, J. D., Johnson, R. P., Desrosiers, R. C. (2008) Vaccine protection by live, attenuated simian immunodeficiency virus in the absence of high-titer antibody responses and high-frequency cellular immune responses measurable in the periphery. J Virol 82, 4135-4148.

[0158] 29. Rogler, G., Hausmann, M., Vogl, D., Aschenbrenner, E., Andus, Т., Falk, W., Andreesen, R., Scholmerich, J., Gross, V. (1998) Isolation and phenotypic characterization of colonic macrophages. Clin Exp Immunol 112, 205-215.

[0159] 30. Hasegawa, A., Liu, H., Ling, В., Borda, J. Т., Alvarez, X., Sugimoto, C., Vinet-Oliphant, H., Kim, W. K., Williams, К. C, Ribeiro, R. M., Lackner, A. A., Veazey, R. S., Kuroda, M. J. (2009) The level of monocyte turnover predicts disease progression in the macaque model of AIDS. Blood 114, 2917-2925.

[0160] 31. Bilzer, M., Roggel, F., Gerbes, A. L. (2006) Role of Kupffer cells in host defense and liver disease. Liver Int 26, 1175-1186.

[0161] 32. Bischoff, R., Holtzer, H. (1970) Inhibition of myoblast fusion after one round of DNA synthesis in 5-bromodeoxyuridine. J Cell Biol 44, 134-150.

[0162] 33. Gunduz, N. (1985) The use of FITC-conjugated monoclonal antibodies for determination of S-phase cells with fluorescence microscopy. Cytometry 6, 597-601.

[0163] 34. Van Furth, R., Diesselhoff-den Dulk, M. C., Mattie, H. (1973) Quantitative study on the production and kinetics of mononuclear phagocytes during an acute inflammatory reaction. J Exp Med 138, 1314-1330.

[0164] 35. Burdo, Т. H., Soulas, C, Orzechowski, K., Button, J., Krishnan, A., Sugimoto, C., Alvarez, X., Kuroda, M. J., Williams, К. C. (2010) Increased monocyte turnover from bone marrow correlates with severity of SIV encephalitis and CD163 levels in plasma. PLoS Pathog 6, e1000842.

[0165] 36. Danenberg, H. D., Golomb, G., Groothuis, A., Gao, J., Epstein, H., Swaminathan, R. V., Seifert, P., Edelman, E. R. (2003) Liposomal alendronate inhibits systemic innate immunity and reduces in-stent neointimal hyperplasia in rabbits. Circulation 108, 2798-2804.

[0166] 37. Haber, E., Afergan, E., Epstein, H., Gutman, D., Koroukhov, N., Ben-David, M., Schachter, M., Golomb, G. (2010) Route of administration-dependent anti-inflammatory effect of liposomal alendronate. J Control Release 148, 226-233.

[0167] 38. Cai, Y., Sugimoto, C., Arainga, M., Alvarez, X., Didier, E. S., Kuroda, M. J. (2014) In vivo characterization of alveolar and interstitial lung macrophages in rhesus macaques: implications for understanding lung disease in humans. J Immunol 192, 2821-2829.

[0168] 39. Harker, J. A., Yamaguchi, Y., Culley, F. J., Tregoning, J. S., Openshaw, P. J. (2014) Delayed sequelae of neonatal respiratory syncytial virus infection are dependent on cells of the innate immune system. J Virol 88, 604-611.

[0169] 40. Hartwig, S. M., Holman, К. M., Varga, S. M. (2014) Depletion of Alveolar Macrophages Ameliorates Virus-Induced Disease following a Pulmonary Coronavirus Infection. PLoS One 9, e90720.

[0170] 41. Zaynagetdinov, R., Sherrill, Т. P., Kendall, P. L., Segal, В. H., Weller, K. P., Tighe, R. M., Blackwell, T. S. (2013) Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. Am J Respir Cell Mol Biol 49, 180-189.

[0171] 42. Berger, G., Durand, S., Fargier, G., Nguyen, X.N., Cordeil, S., Bouaziz, S., Muriaux, D., Darlix, J. L., Cimarelli, A. (2011) APOBEC3A Is a Specific Inhibitor of the Early Phases of HIV-1 Infection in Myeloid Cells. PLoS Pathog 7, e1002221.

[0172] 43. Sacha, J. В., Giraldo-Vela, J. P., Buechler, M. В., Martins, M. A., Maness, N. J., Chung, C., Wallace, L. Т., Leon, E. J., Friedrich, Т. C., Wilson, N. A., Hiraoka, A., Watkins, D. I. (2009) Gag- and Nef-specific CD4+ T cells recognize and inhibit SIV replication in infected macrophages early after infection. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 9791-9796.

[0173] 44. Song, E., Lee, S. K., Dykxhoora, D. M., Novina, C, Zhang, D., Crawford, K., Cerny, J., Sharp, P. A., Lieberman, J., Manjunath, N., Shankar, P. (2003) Sustained small interfering RNA-mediated human immunodeficiency virus type 1 inhibition in primary macrophages. J Virol 77, 7174-7181.

Группа изобретений относится к медицине, а именно инфекционным болезням, и может быть использована для лечения ВИЧ/СПИД. Способ и применение по изобретению включают введение эффективного количества бисфосфоната в составе, имеющем размер диаметра частиц в диапазоне 0,03-1,0 микрон. Использование изобретений позволяет улучшить клинические результаты лечения за счет эффективного захвата частиц указанного диаметра макрофагами и моноцитами. 2 н. и 42 з.п. ф-лы, 10 ил., 4 табл., 7 пр.

1. Способ лечения ВИЧ/СПИД, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества бисфосфоната в составе, имеющем размер диаметра частиц в диапазоне 0,03-1,0 микрон.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный бисфосфонат инкапсулирован в частице указанного состава.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанный бисфосфонат инкапсулирован в липосоме.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный бисфосфонат включен в указанную частицу состава.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанная частица состава с включением выбрана из группы, состоящей из микрочастиц, наночастиц, микросфер и наносфер.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная частица состава представляет собой бисфосфонат в форме частиц.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанный бисфосфонат в форме частиц выбран из группы, состоящей из агрегатов, хлопьев, коллоидов, полимерных цепочек, нерастворимых солей и нерастворимых комплексов.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный бисфосфонат включает соединение, имеющее Формулу (I):

в которой R₁ представляет H, OH или галогеновую группу; и

R₂ представляет собой галоген; линейный или разветвленный С₁-С₁₀-алкил или С₂-С₁₀-алкенил, необязательно замещенный на гетероарил или гетероциклил С₁-С₁₀-алкиламино или С₃-C₈-циклоалкиламино; -NHY, где Y представляет собой водород, С₃-С₈-циклоалкил, арил или гетероарил; или -SZ, где Z представляет собой хлорзамещенный фенил или пиридинил.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный бисфосфонат выбран из группы, состоящей из клодроната, этидроната, тилудроната, памидроната, алендроната и ризедроната.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный бисфосфонат представляет собой азотсодержащий бисфосфонат.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанный бисфосфонат представляет собой алендронат.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная частица состава имеет диаметр 0,07-0,15 микрон.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный состав, содержащий бисфосфонат, вводят во время противовирусной терапии.

14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный состав, содержащий бисфосфонат, вводят в течение короткого периода времени до перерыва в противовирусной терапии, указанный короткий период выбран из группы, состоящей из: 3 дней, 5 дней, 7 дней и 10 дней.

15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный состав, содержащий бисфосфонат, вводят во время перерыва в противовирусной терапии.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный состав, содержащий бисфосфонат, вводят как во время противовирусной терапии, так и во время перерыва в противовирусной терапии.

17. Способ по п. 13, отличающийся тем, что противовирусная терапия представляет собой высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ).

18. Способ по п. 14, отличающийся тем, что противовирусная терапия представляет собой высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ).

19. Способ по п. 15, отличающийся тем, что противовирусная терапия представляет собой высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ).

20. Способ по п. 16, отличающийся тем, что противовирусная терапия представляет собой высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ).

21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что введение выбрано из группы, состоящей из: внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, подкожного или перорального введения.

22. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный состав дополнительно содержит терапевтический агент, не являющийся бисфосфонатом.

23. Применение эффективного количества бисфосфоната в составе, имеющем размер диаметра частиц в диапазоне 0,03-1,0 микрон, для лечения или контроля ВИЧ/СПИД.

24. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанный бисфосфонат инкапсулирован в указанной частице состава.

25. Применение по п. 24, отличающееся тем, что указанный бисфосфонат инкапсулирован в липосоме.

26. Применение по п. 23, отличающееся тем, указанный бисфосфонат включен в указанную частицу состава.

27. Применение по п. 26, отличающееся тем, что указанная частица состава с включением выбрана из группы, состоящей из микрочастиц, наночастиц, микросфер и наносфер.

28. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанная частица состава представляет собой бисфосфонат в форме частиц.

29. Применение по п. 28, отличающееся тем, что указанный бисфосфонат в форме частиц выбран из группы, состоящей из агрегатов, хлопьев, коллоидов, полимерных цепочек, нерастворимых солей и нерастворимых комплексов.

30. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанный бисфосфонат включает соединение, имеющее Формулу (I):

в которой R₁ представляет H, OH или галогеновую группу; и

R₂ представляет собой галоген; линейный или разветвленный С₁-С₁₀-алкил или С₂-С₁₀-алкенил, необязательно замещенный на гетероарил или гетероциклил С₁-С₁₀-алкиламино или С₃-C₈-циклоалкиламино; -NHY, где Y представляет собой водород, С₃-С₈-циклоалкил, арил или гетероарил; или -SZ, где Z представляет собой хлорзамещенный фенил или пиридинил.

31. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанный бисфосфонат выбран из группы, состоящей из клодроната, этидроната, тилудроната, памидроната, алендроната и ризедроната.

32. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанный бисфосфонат представляет собой азотсодержащий бисфосфонат.

33. Применение по п. 32, отличающееся тем, что указанный бисфосфонат представляет собой алендронат.

34. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанная частица состава имеет диаметр 0,07-0,15 микрон.

35. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанный состав, содержащий бисфосфонат, вводят во время противовирусной терапии.

36. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанный состав, содержащий бисфосфонат, вводят в течение короткого периода времени до перерыва в противовирусной терапии, указанный короткий период выбран из группы, состоящей из: 3 дней, 5 дней, 7 дней и 10 дней.

37. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанный состав, содержащий бисфосфонат, вводят во время перерыва в противовирусной терапии.

38. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанный состав, содержащий бисфосфонат, вводят как во время противовирусной терапии, так и во время перерыва в противовирусной терапии.

39. Применение по п. 35, отличающееся тем, что противовирусная терапия представляет собой высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ).

40. Применение по п. 36, отличающееся тем, что противовирусная терапия представляет собой высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ).

41. Применение по п. 37, отличающееся тем, что противовирусная терапия представляет собой высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ).

42. Применение по п. 38, отличающееся тем, что противовирусная терапия представляет собой высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ).

43. Применение по п. 23, отличающееся тем, что введение выбрано из группы, состоящей из: внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, подкожного или перорального введения.

44. Применение по п. 23, отличающееся тем, что указанный состав дополнительно содержит терапевтический агент, не являющийся бисфосфонатом.