СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАН Российский патент 2018 года по МПК A61K39/395 

ДАННЫЕ ПО РОДСТВЕННЫМ ЗАЯВКАМ

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с патентной заявкой Австралии № 2013904942, озаглавленной "Способ лечения ран", поданной 18 декабря 2013 г., и патентной заявкой Австралии № 2013904966, озаглавленной "Способ лечения ран", поданной 19 декабря 2013 г. Полное содержание обеих заявок включено таким образом в данное описание посредством ссылки.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка подана вместе со списком последовательностей в электронной форме. Полное содержание списка последовательностей включено таким образом в данное описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящая заявка относится к способу лечения или предотвращения ран.

ВВЕДЕНИЕ

Заживление раны является сложным процессом, включающим в себя фазу коагуляции, фазу воспаления, фазу образования грануляционной ткани и фазу обновления ткани. Эти события запускаются цитокинами и факторами роста, которые высвобождаются на участке повреждения. Многие факторы могут осложнять обычное адекватное заживление ран или препятствовать ему. Например, такие факторы включают возраст, инфекцию, плохое питание, иммуносупрессию, лекарственные препараты, излучение, диабет, заболевание периферических сосудов, системное заболевание, курение, стресс и т.д.

Хронические раны представляют собой раны, которые не проходят через упорядоченный и своевременный процесс репарации с получением анатомической и функциональной целостности. Хронические раны оцениваются, как поражающие 5,7 миллионов пациентов, и ежегодные затраты на их лечение составляют приблизительно 20 миллиардов долларов только в Соединенных Штатах.

Для пациентов с диабетом, который является хроническим инвалидизирующим заболеванием, от которого в 2008 г. страдали приблизительно 347 миллионов людей в Соединенных Штатах, развитие язвы диабетической стопы (также называемой раной или, в некоторых случаях, хронической раной) является обычным осложнением. Поскольку кожа служит первичным барьером против окружающей среды, открытая незаживающая рана может быть катастрофической; в результате может наступить серьезная утрата трудоспособности (включающая потерю конечности) и даже смерть. Изъязвление стопы предшествует приблизительно 85% ампутаций нижней конечности у людей с диабетом.

При диабете может нарушаться любая из фаз заживления раны. Однако главным признаком диабетических ран является дисбаланс между синтезом и разрушением белков внеклеточного матрикса. Более того, хроническое воспаление вызывает задержку образования зрелой грануляционной ткани и снижение прочности раны на разрыв.

Принятые в настоящее время стандарты лечения ран включают хирургические и медицинские подходы. Лечение лекарственными препаратами нацелено на борьбу с инфекциями или их предотвращение, предотвращение ишемии и отеков, уменьшение боли и улучшение метаболического статуса. Местные терапии включают местное применение, например, факторов роста и обогащенной тромбоцитами плазмы, и перевязочные средства для раны, например, гидроколлоиды и гидрогели. Хирургические вмешательства включают ангиопластику, кожные трансплантаты и механическую подложку для уменьшения давления. Каждая терапия имеет собственные недостатки, такие как острая необходимасть во вмешательстве именно на фазе заживления, неудовлетворительная эффективность действия и высокие затраты. Таким образом, в данной области существует потребность в усовершенствованных терапиях ран.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

При создании настоящего изобретения, авторы исследовали эффекты ингибирования сигнального пути фактора роста сосудистого эндотелия B (VEGF-B) на принятой мышиной модели ранения, например, диабетических ранах. Авторы изобретения исследовали эффект этого фактора роста при введении антагониста VEGF-B (например, антагонистического антитела) диабетическим мышам, у которых индуцировали рану. Авторы изобретения обнаружили, что ингибирование VEGF-B приводило в результате к значительно более быстрому закрытию и заживлению раны. Авторы изобретения также обнаружили, что это улучшенное заживление ран было особенно заметным на ранних фазах закрытия раны, например, когда рана является самой обширной и открытой). В некоторых случаях, (например, в эксперименте, описанном в настоящем документе) изменения при заживлении ран происходили, несмотря на умеренный эффект на уровни глюкозы в крови у диабетических субъектов, указывая на то, что ингибирование VEGF-B обеспечивает благоприятный эффект по заживлению ран через путь, дополнительный к пути гликемического контроля, или отличающийся от него.

Результаты исследования, полученные авторами изобретения, обеспечивают основу для способов индуцирования или стимулирования заживления раны или при лечении ран или при замедлении или предотвращении осложнений ран у субъекта, посредством ингибирования сигнального пути VEGF-B. Например, настоящее раскрытие предоставляет способ лечения ран у субъекта, способ, включающий введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B.

В еще одном примере, раскрытие обеспечивает способ индуцирования или стимулирования заживления раны у субъекта, способ, включающий введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B.

Оценка заживления раны может быть определена, например, по процентному снижению области раны или полному закрытию раны. Область раны может быть определена посредством количественного анализа, например, измерений области раны, построения планиметрических кривых раны и т.д. Полное закрытие раны может быть определено посредством, например, кожного закрытия без дренажа или требований к наложению повязки. Фотографии раны, физические исследования раны, и т.д. могут также использоваться для оценки заживления раны. Ускорение заживления раны может быть выражено в значениях процента ускорения или выражено в значениях отношения рисков как времени для заживления.

В еще одном примере, раскрытие предоставляет способ предотвращения или замедления прогрессирования раны или осложнения раны, способ, включающий введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B.

В одном примере, рана является острой или обычной, например, термическим повреждением (например, ожогом), травмой, хирургическим вмешательством, иссечением обширного рака кожи, глубокой грибковой и бактериальной инфекциями, васкулитом или склеродермой.

В еще одном примере, рана является хронической. Например, рана представляет собой артериальную язву, диабетическую рану, диабетическую язву, пролежневую язву или венозную язву.

В одном примере, рана является кожной раной.

В одном примере, субъект страдает от ожирения и/или диабета.

Например, субъект страдает от диабета, например, диабета типа 1 или типа 2. В таком случае рана может называться диабетической раной (т.е., раной у диабетического субъекта) или диабетической язвой (т.е., язвой у диабетического субъекта). Например, рана является язвой диабетической стопы или язвой диабетической нижней конечности.

В одном примере, рана является пролежневой язвой.

В одном примере, субъект страдает от одной или нескольких нейропатий (например, диабетической нейропатии), заболевания периферических сосудов, слабого гликемического контроля, прежних изъязвлений стопы или ампутаций, нефропатии (или диабетической нефропатии), ишемии мелких и крупных кровеносных сосудов или слабой остроты зрения.

В одном примере, субъект имеет рану.

В еще одном примере, субъект имеет риск развития раны (например, хронической раны), и ему вводят соединение перед, например, хирургическим вмешательством (когда рана будет индуцирована). Например, раскрытие предоставляет способ уменьшения тяжести раны, например, индуцированной раны, например, индуцированной хирургическим вмешательством.

Как продемонстрировано примерами в данном описании, ингибирование сигнального пути VEGF-B является эффективным при лечении диабетических ран. Таким образом, в одном примере, раскрытие предоставляет способ лечения раны у диабетического субъекта, способ, включающий введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B.

Настоящее раскрытие также предоставляет способ стимулирования или индуцирования заживления раны у диабетического субъекта, страдающего от раны, способ, включающий введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B.

В одном примере, субъект имеет риск прогрессирования раны. Например, субъект страдает от диабета. Например, субъект страдает от диабета и одного или нескольких из диабетической нейропатии, заболевания периферических сосудов, слабого гликемического контроля, прежних изъязвлений стопы или ампутаций, нефропатии (или диабетической нефропатии), ишемии мелких и крупных кровеносных сосудов или слабой остроты зрения.

В одном примере, настоящее раскрытие предоставляет способ снижения или предотвращения прогрессирования раны у диабетического субъекта, способ, включающий введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B.

В еще одном примере, настоящее раскрытие предоставляет способ уменьшения риска того, что субъекту (например, диабетическому субъекту), страдающему от раны, потребуется ампутация, способ, включающий введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B.

В одном примере, соединение вводят в количестве, эффективном для оказания одного или нескольких из следующих эффектов:

увеличение скорости закрытия раны по сравнению со скоростью у субъекта (например, у субъекта, страдающего от диабета и раны), которому соединение не вводили; и/или

увеличение количественного показателя закрытия раны в конкретный момент времени (например, после начала лечения) по сравнению со скоростью у субъекта (например, у субъекта, страдающего от диабета и раны), которому соединение не вводили; и/или

ускорение созревания кровеносных сосудов у субъекта по сравнению с субъектом (например, субъектом, страдающим от диабета и раны), которому соединение не вводили.

Настоящее раскрытие также предоставляет способ оказания одного или нескольких из следующих эффектов у субъекта, способ, включающий в себя введение субъекту, который страдал от раны (и, необязательно страдает от диабета), соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B:

Увеличение скорости закрытия раны по сравнению со скоростью у субъекта, которому соединение не вводили; и/или

Увеличение количественного показателя закрытия раны в конкретный момент времени по сравнению со скоростью у субъекта, которому соединение не вводили; и/или

ускорение созревания кровеносных сосудов у субъекта по сравнению с субъектом, которому соединение не вводили.

В одном примере, соединение, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, специфически ингибирует сигнальный путь VEGF-B. Данное утверждение не означает, что способ настоящего раскрытия изобретения не охватывает ингибирование сигнального пути с множеством белков VEGF, а только то, что соединение (или его часть), которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, является специфичным к VEGF-B, например, не является общим ингибитором белков VEGF. Данный термин также не исключает, например, биспецифическое антитело или белок, содержащие их домены связывания, которые могут специфически ингибировать сигнальный путь VEGF-B, с одним (или более) доменами связывания, и могут специфически ингибировать сигнальный путь еще одного белка с еще одним доменом связывания.

В одном примере, соединение, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, связывается с VEGF-B.

Например, соединение представляет собой белок, содержащий вариабельную область антитела, которая связывается или специфически связывается с VEGF-B и нейтрализует сигнальный путь VEGF-B.

В одном примере, соединение представляет собой миметик антитела. Например, соединение является белком, содержащим антигенный домен связывания иммуноглобулина, например, IgNAR, антитело верблюдовых или T-клеточный рецептор.

В одном примере, соединение представляет собой домен антитела (например, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи или только вариабельную область легкой цепи, которая связывается с VEGF-B) или антитело только с тяжелой цепью (например, антитело верблюдовых или IgNAR) или его вариабельную область.

В одном примере, соединение является белком, содержащим Fv. Например, белок выбирают из группы, состоящей из:

(i) одноцепочечного фрагмента Fv (scFv);

(ii) димерного scFv (di-scFv); или

(iv) диатела;

(v) триатела;

(vi) тетратела;

(vii) Fab;

(viii) F(ab')₂;

(ix) Fv; или

(x) одного из (i) - (ix), связанного с константной областью антитела, Fc или константным доменом тяжелой цепи (C_H)2 и/или C_H3.

В еще одном примере, соединение представляет собой антитело. Иллюстративные антитела представляют собой непроцессированные антитела и/или нативные антитела.

В одном примере, соединение является белком, который является рекомбинантным, химерным, CDR-привитым, гуманизированным, сингуманизированным, приматизированным, деиммунизированным или человеческим.

В одном примере, соединение является белком, содержащим вариабельную область антитела, которая конкурентно ингибирует связывание антитела 2H10 с VEGF-B. В одном примере, белок содержит вариабельную область тяжелой цепи (V_H), содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (V_L), содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4.

В одном примере, соединение является белком, содержащим гуманизированную вариабельную область антитела 2H10. Например, белок содержит вариабельную область, содержащую области, определяющие комплементарность (CDR) V_H и/или V_L антитела 2H10. Например, белок содержит:

(i) V_H, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 25-34 из SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 49-65 из SEQ ID NO: 3; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 98-108 из SEQ ID NO: 3; и/или

(ii) V_L,содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 23-33 из SEQ ID NO: 4;

(b) CDR2, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 49-55 из SEQ ID NO: 4; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 88-96 из SEQ ID NO: 4.

В одном примере, соединение является белком, содержащим V_H и V_L, причем V_H и V_L являются гуманизированными вариабельными областями антитела 2H10. Например, белок содержит:

(i) V_H, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 25-34 из SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 49-65 из SEQ ID NO: 3; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 98-108 из SEQ ID NO: 3; и

(ii) V_L, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 23-33 из SEQ ID NO: 4;

(b) CDR2, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 49-55 из SEQ ID NO: 4; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 88-96 из SEQ ID NO: 4.

В одном примере, вариабельная область или V_H в любом из приведенных выше параграфах содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5.

В одном примере, вариабельная область или V_L в любом из приведенных выше параграфах содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6.

В одном примере, соединение представляет собой антитело.

В одном примере, соединение представляет собой антитело, содержащее V_H, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, и V_L, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6.

В одном примере, белок или антитело представляет собой любую форму белка или антитела, кодируемых нуклеиновой кислотой, кодирующей приведенные выше белки или антитела или клетку, экспрессирующую белок или антитело (например, включающую посттрансляционно модифицированный белок или антитело).

В одном примере, белок или антитело содержит:

(i) V_H,содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 11, или содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 17;

(b) CDR2, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 12, или содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 18; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 13, или содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 19; и/или

(ii) V_L, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 14, или содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;

(b) CDR2, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 15, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 21; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 16, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 22.

В одном примере, белок или антитело содержит:

(i) V_H, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 23, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 29;

(b) CDR2, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 24, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 30; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 25 или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 31; и/или

(ii) V_L, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 26, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 32;

(b) CDR2, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 27, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 33; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 28, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 34.

В одном примере, белок или антитело содержит:

(i) V_H, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 35, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 41;

(b) CDR2, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 36, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 42; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 37, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 43; и/или

(ii) V_L, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 38, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 44;

(b) CDR2, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 39, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 45; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 40, или содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 46.

В одном примере, соединение находится в составе композиции. Например, композиция содержит белок, содержащий вариабельную область антитела или V_H или V_L или антитело, описанные в настоящем документе. В одном примере, композиция дополнительно содержит один или несколько вариантов (например, посттрансляционно модифицированных вариантов) белка или антитела. Например, композиция содержит вариант с отсутствующим кодируемым остатком C-концевого лизина, деамидированный вариант и/или гликозилированный вариант и/или вариант, содержащий пироглутамат, например, по N-концу белка, и/или вариант с отсутствием N-концевого остатка, например, N-концевого глутамина в антителе или V-области, и/или вариант, содержащий весь сигнал секреции или его часть. Деамидированные варианты кодируемых аспарагиновых остатков могут приводить в результате к генерируемым изоформам изоаспарагиновой и аспарагиновой кислоты или даже сукцинамиду, включающему в себя примыкающий аминокислотный остаток. Деамидированные варианты кодируемых глутаминовых остатков могут приводить в результате к глутаминовой кислоте. Композиции, содержащие гетерогенную смесь таких последовательностей и вариантов, подразумевают включенными, когда приводится ссылка на конкретную аминокислотную последовательность.

В одном примере, соединение, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, ингибирует или предотвращает экспрессию VEGF-B. Например, соединение выбирают из группы антисмысловой последовательности, миРНК, РНКи, рибозима и ДНК-фермента.

В одном примере, VEGF-B является VEGF-B млекопитающих, например, VEGF-B человека.

В одном примере, субъект является млекопитающим, например приматом, таким как человек.

Способы лечения, описанные в настоящем документе, могут дополнительно включать в себя дополнительное лечение раны.

Способы лечения диабетических ран или язв, описанных в настоящем документе, могут дополнительно включать в себя дополнительное соединение для лечения или предотвращения (или задержку прогрессирования) диабета. Иллюстративные соединения описаны в настоящем документе.

В еще одном примере, раскрытие предоставляет соединение, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B для индуцирования или стимулирования заживления раны у субъекта и/или предотвращения или замедления прогрессирования раны или осложнения раны у субъекта.

В еще одном примере, раскрытие предоставляет применение соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, в производстве лекарственного средства для индуцирования или стимулирования заживления раны у субъекта и/или предотвращения или замедления прогрессирования раны или осложнения раны у субъекта.

Настоящее раскрытие также предоставляет набор, содержащий соединение, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, упакованный вместе с инструкциями по применению для лечения или предотвращению раны и/или способу раскрытия изобретения.

Иллюстративные раны и соединения описаны в настоящем документе и могут быть взяты для применения принципа mutatis mutandis (внесения необходимых изменений) к примерам раскрытия, изложенным в предшествующих трех параграфах.

Примеры настоящего раскрытия должны быть взяты для применения принципа mutatis mutandis к улучшению заживления ран или снижения рецидива или вероятности повторного проявления раны (например, диабетической язвы) или ускорения заживления раны.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1 представляет собой ряд графического представления, показывающий, что лечение антителами против VEGF-B с использованием 2H10 не оказывает значительного воздействия на уровни глюкозы в крови или потерю массы тела при ранении на животной модели с тяжелой формой диабета. Панель А показывает уровни глюкозы в крови при кормлении, а Панель B показывает массу тела при кормлении у диабетических db/db или недиабетических db/+ контрольных или обработанных антителами против VEGF-B мышей до и после нанесения раны животным (n=4-7/группу). Величины представляют собой значения±с.о.с.

ФИГ. 2 является графическим представлением, показывающим, что фармакологическое ингибирование VEGF-B с использованием 2H10 ускоряет закрытие раны на мышиной модели с тяжелой формой диабета. Улучшенное закрытие раны обнаруживается при фармакологическом ингибировании VEGF-B у диабетических db/db BKS животных. Никаких отличий по закрытию раны не было обнаружено у недиабетических db/+ BKS мышей при ингибировании VEGF-B (n=8-14/группу). Величины представляют собой значения±с.о.с. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 в сравнении с db/db мышами, обработанными контролем.

ФИГ. 3 включает ряд графических представлений показывающий, что лечение антителами против VEGF-B с использованием 2H10 ускоряет заживление раны, несмотря на отсутствие различий в уровнях глюкозы в крови, за короткие периоды времени. Анализ проводили для db/db животных, обработанных 2H10 или контрольными антителами, и db/+ животных. Панель А показывает уровни глюкозы в крови при кормлении (n=5-6/группу), а панель B показывает закрытие раны в течение первых четырех дней (n=10-12/группу). Величины представляют собой значения±с.о.с. ***P<0,001 в сравнении с db/db мышами, обработанными контролем.

ФИГ. 4 является графическим представлением, показывающим, что лечение антителами против VEGF-B с использованием 2H10 снижает экспрессию нескольких генов, которые повышающе регулируются во время диабетического ранения. Конечные уровни экспрессии измеряли для IGF-1, TGF-b, TNF-α, α-SMA, COL1α, Fgf-7 и IFN-γ у db/db мышей, обработанных 2H10 или контрольными антителами, и у обработанных контролем db/+ мышей (n=8-14/группу). Величины представляют собой значения±с.о.с. *P < 0,05, в сравнении с db/db животными, обработанными контролем, # P < 0,05, ## P < 0,01, в сравнении с обработанными контролем db/+мышами. IGF-1; Инсулиноподобный фактор роста 1, TGF-b; трансформирующий ростовой фактор бета, TNF-α; Фактор некроза опухолей, α-SMA; альфа-актин гладкой мускулатуры, COL1a; коллаген альфа-1 типа I, Fgf-7; фактор роста фибробластов 7.

ФИГ. 5 включает ряд графических представлений, показывающих, что ингибирование VEGF-B у db/db мышей воздействует на морфологию кровеносных сосудов, но не стимулирует пролиферацию клеток. Верхний график показывает количественное измерение окрашивания Brdu/DAPI, а нижний график показывает количественное измерение окрашивания CD45, CIV и CD31 у db/db мышей с контролем или антителом 2H10. n=4-6/группу. Величины представляют собой среднее±с.о.с. * P < 0,05, ** P < 0,01 в сравнении с db/db мышами, обработанными контролем.

ФИГ. 6 является графическим представлением, показывающим, что сигнальный путь VEGF-B регулируется с повышением в диабетических ранах. Конечные показатели уровней экспрессии Vegfb, Vegfr1, Fatp4, Vegfa и Vegfr2 измеряли в ткани из раны от диабетических db/db мышей и недиабетических db/+ мышей. Уровни экспрессии нормализовали до TUBB5. Величины представляют собой значения±с.о.с. #P < 0,05, ##P<0,01, db/db, обработанные контролем, в сравнении с db/+ обработанными контролем, n= 3-5. Vegfb; фактор роста сосудистого эндотелия B; Vegfr1; рецептор 1 фактора роста сосудистого эндотелия, Fatp4; транспортер жирных кислот 4, Vegfa; фактор роста сосудистого эндотелия A; Vegfr2; рецептор 2 фактора роста сосудистого эндотелия.

ФИГ. 7 является графическим представлением, показывающим, что лечение антителами против VEGF-B с использованием 2H10 снижает накопление липидов в коже у db/db мышей. Изображенный график показывает количественное измерение окрашивания Масляным красным О у db/db и db/+ мышей, обработанных контролем или антителом 2H10. Величины представляют собой значения±с.о.с. ***P<0,001 db/db мыши, обработанные контролем в сравнении с db/db мышами, обработанными 2Н10. ### P<0,001 Db/+ животные в сравнении с db/db мышами, обработанными контролем.

ОПРЕДЕЛИТЕЛЬ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность изоформы VEGF-B₁₈₆ человека, содержащую N-концевую сигнальную последовательность из 21 аминокислоты.

SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность изоформы VEGF-B₁₆₇ человека, содержащую N-концевую сигнальную последовательность из 21 аминокислоты

SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H антитела 2H10.

SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L антитела 2H10.

SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность V_H гуманизированной формы антитела 2H10.

SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность V_L гуманизированной формы антитела 2H10.

SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H антитела 4E12.

SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L антитела 4E12.

SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H антитела 2F5.

SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L антитела 2F5.

SEQ ID NO: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_L CDR1 антитела 2H10

SEQ ID NO: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_L CDR2 антитела 2H10

SEQ ID NO: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_L CDR3 антитела 2H10

SEQ ID NO: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_H CDR1 антитела 2H10

SEQ ID NO: 15 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_H CDR2 антитела 2H10

SEQ ID NO: 16 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_H CDR3 антитела 2H10

SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L CDR1 антитела 2H10

SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L CDR2 антитела 2H10

SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L CDR3 антитела 2H10

SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H CDR1 антитела 2H10

SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H CDR2 антитела 2H10

SEQ ID NO: 22 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H CDR3 антитела 2H10

SEQ ID NO: 23 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_L CDR1 антитела 2F5

SEQ ID NO: 24 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_L CDR2 антитела 2F5

SEQ ID NO: 25 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_L CDR3 антитела 2F5

SEQ ID NO: 26 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_H CDR1 антитела 2F5

SEQ ID NO: 27 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_H CDR2 антитела 2F5

SEQ ID NO: 28 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_H CDR3 антитела 2F5

SEQ ID NO: 29 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L CDR1 антитела 2F5

SEQ ID NO: 30 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L CDR2 антитела 2F5

SEQ ID NO: 31 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L CDR3 антитела 2F5

SEQ ID NO: 32 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H CDR1 антитела 2F5

SEQ ID NO: 33 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H CDR2 антитела 2F5

SEQ ID NO: 34 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H CDR3 антитела 2F5

SEQ ID NO: 35 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_L CDR1 антитела 4E12

SEQ ID NO: 36 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_L CDR2 антитела 4E12

SEQ ID NO: 37 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_L CDR3 антитела 4E12

SEQ ID NO: 38 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_H CDR1 антитела 4E12

SEQ ID NO: 39 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_H CDR2 антитела 4E12

SEQ ID NO: 40 представляет собой нуклеотидную последовательность из V_H CDR3 антитела 4E12

SEQ ID NO: 41 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L CDR1 антитела 4E12

SEQ ID NO: 42 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L CDR2 антитела 4E12

SEQ ID NO: 43 представляет собой аминокислотную последовательность из V_L CDR3 антитела 4E12

SEQ ID NO: 44 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H CDR1 антитела 4E12

SEQ ID NO: 45 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H CDR2 антитела 4E12

SEQ ID NO: 46 представляет собой аминокислотную последовательность из V_H CDR3 антитела 4E12

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Общая часть

По всему объему данного описания, если конкретно не установлено иначе, или не требуется иным образом по контексту, считается, что ссылка на единственную стадию, смесь химически связанных веществ, группу стадий или группу смесей химически связанных веществ, охватывает одну и множество (т.е. одну или более) из этих стадий, смесей химически связанных веществ, групп стадий или групп смесей химически связанных веществ.

Специалистам в данной области должно быть понятно, что настоящее раскрытие подвержено вариациям и модификациям, отличающихся от тех, что описаны конкретно. Следует понимать, что раскрытие включает все такие вариации и модификации. Раскрытие также включает все из стадий, признаков, композиций и соединений, относящихся к данному описанию или указанных в нем, индивидуально или совместно, и любые и все комбинации или любые две или более из указанных стадий или признаков.

Настоящее раскрытие не ограничивается по объему конкретными примерами, описанными в настоящем документе, которые предназначены только для цели пояснения примерами. Функционально эквивалентные продукты, композиции и способы полностью находятся в пределах объема настоящего раскрытия.

Считают, что любой пример настоящего раскрытия в данном документе должен быть взят для применения принципа mutatis mutandis к любому другому примеру раскрытия, если конкретно не установлено иначе.

Если конкретно не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, должны рассматриваться, как имеющие такое же значение, какое обычно является понятным для рядового специалиста в области (например, культивирования клеток, молекулярной генетики, иммунологии, иммуногистохимии, химии белка и биохимии).

Если не указано иначе, получение рекомбинантных белков, культивирование клеток и иммунологические методы, используемые в настоящем раскрытии, являются стандартными методиками, хорошо известными специалистам в данной области. Такие методы описаны и объясняются во всем объеме литературы в источниках, таких как, J. Perbal, Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: Practical Approach, Volumes 1 и 2, IRL Press (1991), D.M. Glover и B.D. Hames (editors), DNA Cloning: Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 и 1996), и F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates и Wiley-Interscience (1988, включая все обновления до настоящего времени), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), и J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включая все обновления до настоящего времени).

Описание и определения вариабельных областей и их частей, иммуноглобулинов, антител и их фрагментов в данном документе могут быть дополнительно уточнены обсуждением в Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 и 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia и Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 и/или или Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997.

Будет понятно, что любое обсуждение белка или антитела в данном описании, включает любые варианты белка или антитела, полученные в процессе производства и/или хранения. Например, в процессе производства или хранения антитело может быть деамидировано (например, по остатку аспарагина или глутамина) и/или иметь измененное гликозилирование и/или иметь глутаминовый остаток, преобразованный в пироглутамин и/или иметь удаленный или "клиппированный" N-концевой или C-концевой остаток и/или иметь неполностью процессированную всю сигнальную последовательность или ее часть, и, вследствие этого, оставаться по концу антитела. Понятно, что композиция, содержащая конкретную аминокислотную последовательность, может представлять собой гетерогенную смесь установленной или кодируемой последовательности и/или вариантов такой установленной или кодируемой последовательности.

Термин "и/или", например, "X и/или Y" следует понимать, как означающий либо "X и Y" или "X или Y" и следует рассматривать, как обеспечивающий явное подтверждение для обоих значений или для каждого из двух значений.

По всему объему описания слово "содержит" или вариации, такие как "включает в себя" или "содержащий", понимают, как подразумевающее включение установленного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий.

Как используется в настоящем описании термин "полученный из" должен рассматриваться как указание на то, что установленное целое число может быть получено из конкретного источника, хотя и необязательно напрямую из этого источника.

Выбранные определения

Известно, что VEGF-B существует в двух основных изоформах, называемых VEGF-B₁₈₆ и VEGF-B₁₆₇. Только для целей номенклатуры, а не ограничения, иллюстративные последовательности человеческого VEGF-B₁₈₆ приведены в Эталонной последовательности NCBI: NP_003368.1, под инвентарными номерами белков в NCBI, NP_003368, P49765 и AAL79001, и в SEQ ID NO: 1. В контексте настоящего раскрытия, в последовательности VEGF-B₁₈₆ может отсутствовать N-концевая сигнальная последовательность из 21 аминокислоты (например, приведенная в виде аминокислот 1-21 в SEQ ID NO: 1). Только для целей номенклатуры, а не ограничения, иллюстративные последовательности человеческого VEGF-B₁₆₇ приведены в Эталонной последовательности: NP_001230662.1, под инвентарными номерами белков в NCBI, AAL79000 и AAB06274, и в SEQ ID NO: 2. В контексте настоящего раскрытия, в последовательности VEGF-B₁₆₇ может отсутствовать N-концевая сигнальная последовательность из 21 аминокислоты (например, приведенная в виде аминокислот 1-21 в SEQ ID NO: 2). Дополнительная последовательность VEGF-B может быть определена с использованием последовательностей, предоставленных в данном описании и/или в общедоступных базах данных, и/или определена с использованием стандартных методов (например, как описано в Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все обновления до настоящего времени) или Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Ссылка на человеческий VEGF-B может быть сокращена до hVEGF-B. В одном примере, ссылка в данном документе на VEGF-B относится к изоформе VEGF-B₁₆₇.

Ссылка в данном описании на VEGF-B также охватывает пептид VEGF-B_10-108, как описано в WO2006/012688.

Термин "рана" будет принят для обозначения любого повреждения, при котором ткань субъекта нарушена (например, разорвана, проколота, порезана или иным образом разрушена).

Как используется в настоящем описании, термин "кожная рана" будет принят для обозначения повреждения одного или нескольких слоев кожи субъекта, например, где повреждение включает в себя одну или несколько апоптотических кожных клеток и/или одну или несколько некротических кожных клеток. Термин "кожная рана" будет принят, как включающий рану, которая поражает эпидермальный слой субъекта и/или дермальный слой субъекта и/или гиподермальный слой субъекта.

Термин "хроническая рана" относится к ране, которая не излечивается при обычном наборе стадий и за предсказуемое количество временни. Как правило, раны, которые не излечиваются в пределах трех месяцев, считаются хроническими. Хронические раны включают, но не ограничиваются приведенными, например, артериальные язвы, диабетические язвы, пролежневые язвы, венозные язвы и т.д. Острая рана может развиться в хроническую рану.

Термин "острая рана" или "обычная рана" относится к ране, которая претерпевает обычное восстановление при заживлении раны.

Термин "прогрессирование раны" следует понимать, как означающий ухудшение состояния раны, например, увеличение размера и/или глубины и/или прогрессирование до более развитой стадии и/или развитие инфекции.

Термин "заживление" в контексте настоящего раскрытия означает инициацию или уменьшение времени от введения соединения до существенного или полного закрытия раны (полного сокращения раны).

Термин "ткань" относится к массе клеток в человеческом организме, которые группируются вместе для образования специфической функции. Ткань включает, но не ограничивается перечисленными, кожу, хрящ и соединительную ткань.

Термин "рекомбинантный" следует понимать, как означающий продукт искусственной генетической рекомбинации. Соответственно, в контексте рекомбинантного белка, содержащего вариабельную область антитела, данный термин не охватывает антитело, естественным образом находящееся в организме субъекта, которое является продуктом природной рекомбинации, которая происходит во время созревания B-клеток. Однако, если такое антитело изолируют, его будут считать изолированным белком, содержащим вариабельную область антитела. Аналогично, если изолируют нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, и экспрессируют с использованием рекомбинантных средств, полученный в результате белок является рекомбинантным белком, содержащим вариабельную область антитела. Рекомбинантный белок также охватывает белок, экспрессируемый посредством искусственных рекомбинантных средств, когда он находится внутри клетки, ткани или субъекта, например, в которых он экспрессируется.

Термин "белок" будет принят, как включающий одиночную полипептидную цепь, т.е., ряд смежных аминокислот, связанных пептидными связями, или ряд полипептидных цепей, ковалентно или нековалентно связанных друг с другом (т.е., полипептидный комплекс). Например, ряд полипептидных цепей может быть ковалентно связан с использованием подходящей химической или дисульфидной связи. Примеры нековалентных связей включают водородные связи, ионные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия.

Термин "полипептид" или "полипептидная цепь" будет понятен из предшествующего параграфа, как означающий ряд смежных аминокислот, связанных пептидными связями.

Квалифицированный специалист в данной области будет знать, что "антитело" обычно считают белком, который содержит вариабельную область, составленную из множества полипептидных цепей, например, полипептида, содержащего вариабельную область легкой цепи (V_L), и полипептида, содержащего вариабельную область тяжелой цепи (V_H). Антитело также обычно содержит константные домены, некоторые из которых могут быть расположены внутри константной области, которая включает константный фрагмент или фрагмент (Fc), кристаллизуемый, в случае тяжелой цепи. V_H и V_L взаимодействуют с образованием Fv, содержащего антигенсвязывающую область, которая обладает способностью к специфическому связыванию с одним или несколькими близкородственными антигенами. В целом, легкая цепь из млекопитающих представляет собой либо κ легкую цепь или λ легкую цепь, а тяжелая цепь из млекопитающих представляет собой α, δ, ε, γ или μ. Антитела могут принадлежать к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂) или подклассу. Термин "антитело" также охватывает гуманизированные антитела, приматизированные антитела, человеческие антитела, сингуманизированные антитела и химерные антитела.

Термины "непроцессированное антитело", "интактное антитело" или "цельное антитело" применяют взаимозаменяемо для обозначения антитела в его по существу интактной форме, в противоположность антигенсвязывющему фрагменту антитела. Конкретно, цельные антитела включают антитела с тяжелыми и легкими цепями, включающими область Fc. Константные домены могут представлять собой константные домены с последовательностью дикого типа (например, константные домены с человеческой последовательностью дикого типа) или их варианты аминокислотной последовательности.

Как используется в настоящем описании, "вариабельная область" относится к частям легких и/или тяжелых цепей антител, определенных в данном описании, которые обладают способностью к специфическому связыванию с антигеном, и включают аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей (CDR); т.е., CDRl, CDR2, и CDR3, и каркасных областей (FR). Иллюстративные вариабельные области содержат три или четыре FR (например, FR1, FR2, FR3 и необязательно FR4) вместе с тремя CDR. В случае белка, являющегося производным IgNAR, в белке может отсутствовать CDR2. V_H относится к вариабельной области тяжелой цепи. V_L относится к вариабельной области легкой цепи.

Как используется в настоящем описании, термин "определяющие комплементарность области" (син. CDR; т.е., CDRl, CDR2, и CDR3) относится к аминокислотным остаткам вариабельного домена антитела, присутствие которых является необходимым для связывания антигена. Каждый вариабельный домен типовым образом имеет три CDR области, идентифицируемые как CDRl, CDR2 и CDR3. Положения аминокислот, отнесенные к CDR и FR, могут быть определены согласно Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 и 1991 или другим системам нумерации при осуществлении данного раскрытия, например, канонической системе нумерации Chothia и Lesk J. Mol Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989; и/или Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927-948, 1997; системе нумерации IMGT из Lefranc et al., Devel. and Compar. Immunol., 27: 55-77, 2003; или системе нумерации AHO от Honnegher and Plükthun J. Mol. Biol., 309: 657-670, 2001.

"Каркасные области" (FR) представляют собой остатки вариабельных доменов, отличающиеся от остатков CDR.

Как используется в настоящем описании, термин "Fv" следует применять для обозначения любого белка, независимо от того состоит ли он из множества полипептидов или единственного полипептида, в котором V_L и V_H ассоциируют и образуют комплекс, имеющий антигенсвязывающий участок, т.е., способный к специфическому связыванию с антигеном. V_H и V_L, которые образуют антигенсвязывающий участок, могут находиться в единственной полипептидной цепи или в различных полипептидных цепях. Кроме того, Fv раскрытия (а также любой белок раскрытия) могут иметь множество антигенсвязывающих учасков, которые могут связываться или могут не связываться с одинаковым антигеном. Данный термин следует понимать, как охватывающий фрагменты, непосредственно полученные из антитела, а также белки, соответствующие такому фрагменту, полученному с использованием рекомбинантных средств. В некоторых примерах, V_H не является связанной с константным доменом тяжелой цепи (C_H) 1 и/или V_L не является связанной с константным доменом легкой цепи (C_L). Иллюстративные Fv, содержащие полипептиды или белки, включают фрагмент Fab, фрагмент Fabʹ, фрагмент F(abʹ), scFv, диатело, триатело, тетратело или комплекс более высокого порядка, или любые из приведенных выше, связанные с константной областью или ее доменом, например, доменом C_H2 или C_H3, например, минитело. "Фрагмент Fab" состоит из моновалентного антигенсвязывающего фрагмента антитела, и может быть получен посредством расщепления цельного антитела ферментом папаином, с получением фрагмента, состоящего из интактной легкой цепи и части тяжелой цепи, или может быть получен с использованием рекомбинантных средств. "Фрагмент Fab'" антитела может быть получен посредством обработки цельного антитела пепсином, с последующим восстановлением, с получением на выходе молекулы, состоящей из интактной легкой цепи и части тяжелой цепи, содержащей V_H и единственный константный домен. Два фрагмента Fab' получают из антитела, обработанного таким образом. Фрагмент Fab' также может быть получен рекомбинантными средствами. "Фрагмент F(ab')2" антитела состоит из димера двух фрагментов Fab', удерживаемых вместе двумя дисульфидными связями, и его получают посредством обработки цельной молекулы антитела ферментом пепсином, без последующего восстановления. Фрагмент "Fab₂" представляет собой рекомбинантный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных с использованием, например лейциновой "молнии", или домена C_H3. "Одноцепочечный Fv" или "scFv" представляет собой рекомбинантную молекулу, содержащую фрагмент вариабельной области (Fv) антитела, в котором вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи ковалентно связаны посредством подходящего, гибкого полипептидного линкера.

Как используется в настоящем описании, термин "связывается" со ссылкой на взаимодействие белка или его антигенсвязывающего участка с антигеном означает, что взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на антигене. Например, антитело распознает и связывается с конкретной белковой структурой в большей степени, чем с белками в целом. Если антитело связывается с эпитопом "A", присутствие молекулы, содержащей эпитоп "A" (или свободный, немеченый "A"), в реакционной смеси, содержащей меченый "A" и белок, будет снижать количество меченого "A", связанного с антителом.

Как используется в настоящем описании, термин "специфически связывается" или "связывается специфически" будет принят для обозначения того, что белок раскрытия взаимодействует или ассоциирует более часто, более быстро, с большей продолжительностью и/или с большей аффинностью с конкретным антигеном или клеткой, экспрессирующей его, чем делает это с альтернативными антигенами или клетками. Например, белок связывается с VEGF-B со значительно большей аффинностью (например, 20-кратной или 40-кратной или 60-кратной или 80-кратной, 100-кратной или 150-кратной или 200-кратной), чем делает это с другим фактором роста (например, VEGF-A) или с антигенами, обычно рапознаваемыми полиреактивными природными антителами (т.е., встречающимися в природе антителами, известными, как связывающие разнообразные антигены, обнаруживаемые в природе у людей). Обычно, не необязательно, ссылка на связывание означает специфичное связывание, и каждый термин следует понимать, как предоставляющий ясное подтверждение для другого термина.

Как используется в настоящем описании, термин "нейтрализует" будет принят для обозначения того, что белок имеет способность к блокированию, снижению или предотвращению сигнального пути VEGF-B в клетке через VEGF-R1. Методы определения нейтрализации известны в данной области и/или описаны в настоящем документе.

Как используется в настоящем описании, термины "предотвращение", "предотвращает" или "предупреждение" включают введение соединения раскрытия, чтобы, таким образом, остановить или затруднить развитие, по меньшей мере, одного симптома состояния.

Как используется в настоящем описании, термины "лечение", "лечит" или "терапия" включают введение белка, описанного в настоящем документе, чтобы, таким образом, уменьшить или устранить, по меньшей мере, один симптом обозначенного заболевания или состояния или замедлить прогрессирование заболевания или состояния.

Как используется в настоящем описании, термин "субъект" будет принят для обозначения любого животного, включая людей, например, млекопитающего. Иллюстративные субъекты включают, но не ограничиваются перечисленными, людей и приматов, не являющихся людьми. Например, субъект представляет собой человека.

Лечение ран

Настоящее раскрытие предоставляет способы ускорения и/или улучшения и/или стимуляции заживления ран при введении соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B. Например, способ включает в себя введение соединения в рану субъекта или системно субъекту.

В одном примере, субъект страдает от раны. Рана может быть хронической, острой или обычной раной. В одном примере, рана является хронической. В одном примере, рану подвергают лечению на стадии 0A раны или стадии 1A раны или Стадии 2A раны или Стадии 3A раны, как приведено в Таблице 1. В одном примере, рану подвергают лечению на стадии 0B раны или стадии 1B раны или Стадии 2B раны или Стадии 3B раны, как приведено в Таблице 1. В одном примере, рану подвергают лечению на стадии C раны или стадии 1C раны или Стадии 2C раны или Стадии 3C раны, как приведено в Таблице 1. В одном примере, рану подвергают лечению на стадии 0D раны или стадии 1D раны или Стадии 2D раны или Стадии 3D раны, как приведено в Таблице 1.

Таблица 1: Стадии раны (как определено по системе классификации ран Texas)

Степень/глубина раны Стадия/со-путствующие заболевания 0 1 2 3 A Пре- или пост-язвенное повреждение, полностью эпителизированное Поверхностная язва, не включающая сухожилие, капсулу или кость Язва, проникающая в сухожилие или капсулу Язва, проникающая в кость или сустав B Как для 0, с инфекцией Как для 1, с инфекцией Как для 2, с инфекцией Как для 3, с инфекцией C Как для 0, с ишемией Как для 1, с ишемией Как для 2, с ишемией Как для 3, с ишемией D Как для 0, с инфекцией и ишемией Как для 1, с инфекцией и ишемией Как для 2, с инфекцией и ишемией Как для 3, с инфекцией и ишемией

В одном примере, субъект страдает от раны, которая инфицирована и/или является ишемической.

В одном примере, рана является полнослойной раной.

В одном примере, рана представляет собой диабетическую язву, например, диабетическую язву стопы. Диабетические язвы могут быть классифицированы с использованием системы, приведенной в Таблице 1. В еще одном примере, язву классифицируют в соответствии с системой классификации язв Вагнера, как приведено в Таблице 2.

Таблица 2: Система классификации язв Вагнера

Степень Повреждение 1 Поверхностная диабетическая язва 2 Расширение язвы, включающее связку, сухожилие, суставную капсулу или фасцию без абсцесса или остеомиелита 3 Глубокая язва с абсцессом или остеомиелитом 4 Гангрена части переднего отдела стопы 5 Обширная гангрена стопы

Примеры некоторых факторов риска для язвы диабетической стопы включают периферическую нейропатию, которая воздействует как на моторные, так и сенсорные функции стопы, ограниченную подвижность суставов, деформации стопы, аномальное распределение давления в стопе, повторную небольшую травму и ухудшенную остроту зрения. Периферическая сенсорная нейропатия является первичным фактором. Приблизительно 45%-60% из всех диабетических изъязвлений являются нейропатическими, в то время как до 45% имеют как нейропатические, так и ишемические компоненты. С бесчувственной стопой, пациент неспособен воспринимать повторное повреждение стопы вызываемое, например, плохо подходящей обувью во время передвижения после операции и деятельности в повседневной жизни. Нейропатия, в сочетании с измененной биомеханикой ходьбы, приводит к повторной грубой травме и распределению аномально высоких стрессовых нагрузок на уязвимые части стопы, что в результате приводит к образованию костной мозоли и кожной эрозии. Как только образуется язва, она часто медленно заживает, может продолжать увеличиваться, предоставляет возможность для появления местной или системной инфекции, и требует всестороннего медицинского и хирургического ухода для инициации заживления.

В одном примере, рана присутствует или присутствовала на субъекте в течение, по меньшей мере, приблизительно 2 недель до введения соединения, описанного в настоящем документе. В одном примере, рана присутствует или присутствовала на субъекте в течение, по меньшей мере, приблизительно 4 недель до введения соединения, описанного в настоящем документе. В одном примере, рана присутствует или присутствовала на субъекте в течение, по меньшей мере, приблизительно 6 недель до введения соединения, описанного в настоящем документе.

Способы раскрытия также являются применимыми к субъектам, которые проходят или проходили лечение, где лечение отложено или обеспечивает неэффективное заживление раны. Способы лечения могут включать, но не ограничиваются приведенными, медикаментозное лечение, облучение, терапии, которые приводят к подавлению иммунной системы, и т.д. В одном примере, субъект имеет вторичное состояние, где вторичное состояние отложено или обеспечивает неэффективное заживление ран. Вторичные состояния, включают, но не ограничиваются приведенными, например, диабет, заболевания перферических сосудов, инфекцию, аутоиммунные или коллагеновые сосудистые растройства, болезненные состояния, которые приводят к подавлению иммунной системы, и т.д.

Для оценки заживления раны может применяться количественный анализ, например, определение % снижения площади раны или полного закрытия раны (например, измеряемое по кожному закрытию без требований дренажа или повязки). Область раны оценивают до, во время и после лечения методами, известными специалистам в области. Например, оценка может быть определена посредством, например, количественной планиметрии, фотографии, физических исследований, и т.д. Область раны может быть определена до, во время и после лечения. В одном примере, площадь раны может оцениваться посредством измерения длины, L, раны, наиболее протяженной приямой длины, например, в см, и ширины, W, наиболее протяженной приямой ширины, перпендикулярной к L, например, в см, и перемножения LxW, чтобы получить оцениваемую площадь поверхности (см²). Размер раны для лечения может варьировать. В одном примере изобретения, площадь поверхности раны до лечения составляет приблизительно 0,4 см² или более или приблизительно 1,0 см² или более, или между приблизительно 0,4 см² и приблизительно 10 см², или между приблизительно 1 см² и приблизительно 10 см², или между приблизительно 1 см² и приблизительно 7 см², или между приблизительно 1 см² и приблизительно 5 см², или более чем 4,0 см². Площадь поверхности может быть измерена до или после санации раневой полости.

Ускорение заживления раны может быть описано посредством % ускорения заживления раны и/или Отношения рисков. Например, введение соединения ускоряет заживление раны более чем на 50%, или на 60% или более, на 70% или более, на 74% или более, на 75% или более, на 80% или более, на 85% или более, на 90% или более, на 95% или более, на 100% или более, на 110% или более, по сравнению с контролем.

Способы раскрытия охватывают ускорение и/или улучшение и/или стимуляцию заживления раны в популяции субъектов. Например, способ включает в себя введение соединения субъекту из популяции, где введение соединения приводит в результате к более высокому, чем 10% (или более высокому, чем 12% или 14% или 15% или 17% или 20% или 25% или 30% или 33% или 35% или 40% или 45% или 50% или более) улучшения при заживлении раны в популяции по сравнению с контролем.

Способы снижения рецидива ран (или язв) также предоставлены настоящим раскрытием. Например, способ включает в себя введение соединения субъекту, таким образом, что наступление рецидива язвы снижается.

Предоставлены также способы снижения тяжести раны, например, у субъекта, имеющего риск развития раны (например, хронической раны), которому предстоит пройти через хирургическое вмешательство (когда рана будет индуцирована).

В альтернативном примере, раскрытие предоставляет способ снижения рубцевания, являющегося результатом раны, у субъекта, способ, включающий в себя введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B.

В дополнительном альтернативном примере, раскрытие предоставляет способ предотвращения образования раны (т.е. новой раны), способ, включающий в себя введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B.

Ингибиторы сигнального пути VEGF-B

Белки, содержащие вариабельные области антитела

Иллюстративный ингибитор сигнального пути VEGF-B содержит вариабельную область антитела, например, представляет собой антитело или фрагмент антитела, которые связываются с VEGF-B и нейтрализуют сигнальный путь VEGF-B.

В одном примере, вариабельная область антитела специфически связывается с VEGF-B.

Подходящие антитела и белки, содержащие их вариабельные области, являются известными в данной области.

Например, антитела против VEGF-B и их фрагменты описаны в WO2006/012688.

В одном примере, антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело, которое конкурентно ингибирует связывание 2H10 с VEGF-B, или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном примере, антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело 2H10 или его химерную, CDR-привитую или гуманизированную версию или его антигенсвязывающий фрагмент. В этой связи, антитело 2H10 содержит V_H, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, и V_L, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4. Иллюстративные химерные и гуманизированные версии этого антитела описаны в WO2006/012688.

В одном примере, антитело против VEGF-B или его фрагмент содержит V_H, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, и V_L, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6.

В одном примере, антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело, которое конкурентно ингибирует связывание 4E12 с VEGF-B, или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном примере, антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело 4E12 или его химерную, CDR-привитую или гуманизированную версию или его антигенсвязывающий фрагмент. В этом отношении, антитело 4E12 содержит V_H, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, и V_L, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8.

В одном примере, соединение является белком, содержащим гуманизированную вариабельную область антитела 4E12. Например, белок содержит вариабельную область, содержащие области, определяющие комплементарность (CDR) из V_H и/или V_L антитела 4E12. Например, белок содержит:

(i) V_H, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 25-34 из SEQ ID NO: 7;

(b) CDR2, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 49-65 из SEQ ID NO: 7; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 98-105 из SEQ ID NO: 7; и/или

(ii) V_L, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 24-34 из SEQ ID NO: 8;

(b) CDR2, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 50-56 из SEQ ID NO: 8; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 89-97 из SEQ ID NO: 8.

В одном примере, антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело, которое конкурентно ингибирует связывание 2F5 с VEGF-B, или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном примере, антитело против VEGF-B или его фрагмент представляет собой антитело 2F5 или его химерную, CDR-привитую или гуманизированную версию или его антигенсвязывающий фрагмент. В этой связи, антитело 2E5 содержит V_H, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, и V_L, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10.

В одном примере, соединение является белком, содержащим гуманизированную вариабельную область антитела 2F5. Например, белок содержит вариабельную область, содержащую области, определяющие комплементарность (CDR) из V_H и/или V_L антитела 2F5. Например, белок содержит:

(i) V_H, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 25-34 из SEQ ID NO: 9;

(b) CDR2, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 49-65 из SEQ ID NO: 9; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 98-107 из SEQ ID NO: 9; и/или

(ii) V_L, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 24-34 из SEQ ID NO: 10;

(b) CDR2, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 50-56 из SEQ ID NO: 10; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 89-96 из SEQ ID NO: 10.

В еще одном примере, антитело или белок, содержащий его вариабельную область, продуцируется с использованием стандартного метода, например, известного в данной области, или кратко описанного в настоящем документе.

Методы, основанные на иммунизации

Для генерации антитела, VEGF-B или его несущий эпитоп фрагмент или его часть или его модифицированная форма или нуклеиновая кислота, кодирующая его ("иммуноген"), необязательно составляют вместе с подходящим или желательным адъювантом и/или фармацевтически приемлемым носителем, вводят субъекту (например, животному субъекту, не являющемуся человеком, такому как мышь, крыса, цыпленок и т.д.) в форме инъекционной композиции. Иллюстративные животные, не являющиеся людьми, являются млекопитающими, такими как мышиные животные (например, крысы или мыши). Инъекция может быть интраназальной, внутримышечной, подкожной, внутривенной, внутрикожной, внутрибрюшинной или вводиться другим известным путем. Необязательно, иммуноген вводят много раз. Средства для получения и характеризации антител являются известными в данной области (см., например, Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Методы продуцирования антител против VEGF-B у мышей описаны в WO2006/012688.

Выработка поликлональных антител может подвергаться мониторингу посредством отбора образцов крови иммунизированного животного в различные моменты времени после иммунизации. Если требуется, вторая, бустер-инъеция, может проводиться, чтобы достичь желательного титра антител. Процесс повторной иммунизации и определения титра повторяют до достижения подходящего титра. Когда получают желательный уровень иммуногенности, иммунизированное животное обескровливают и сыворотку выделяют и сохраняют, и/или животное применяют для генерации моноклональных антител (mAb).

Моноклональные антитела являются иллюстративными антителами, предусмотренными настоящим раскрытием. Обычно, получение моноклональных антител включает в себя иммунизацию субъекта (например, грызуна, например, мыши или крысы) иммуногеном при условиях, достаточных для стимуляции клеток, продуцирующих антитела. В некоторых примерах, мышь генетически сконструированную, чтобы экспрессировать человеческие антитела и не экспрессировать мышиные белки антител, иммунизируют для получения антител (например, как описано в PCT/US2007/008231 и/или Lonberg et al., Nature 368 (1994): 856-859). После иммунизации, соматические клетки, продуцирующие антитела (например, B-лимфоциты), гибридизуют с клетками, способными к неограниченной пролиферации, например, иммортализованными клетками миеломы. Различные методы получения таких гибридизированных клеток (гибридом) являются известными в данной области и описаны, например, в Kohler и Milstein, Nature 256, 495-497, 1975. Клетки гибридомы могут затем культивироваться при условиях, достаточных для продуцирования антител.

Настоящее раскрытие предполагает другие методы получения антител, например, технологию ABL-MYC (как описано, например в Largaespada et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 166, 91-96. 1990).

Методы, основанные на библиотеках

Настоящее раскрытие также охватывает скрининг библиотек антител или белков, содержащих их антигенсвязывающие домены (например, содержащих их вариабельные области) чтобы идентифицировать антитело, связывающее VEGF-B, или белок, содержащий его вариабельную область.

Примеры библиотек, предусмотренных данным раскрытием, включают наивные библиотеки (от субъектов, не подвергнутых иммунизации), иммунизированные библиотеки (от субъектов, иммунизированных антигеном) или синтетические библиотеки. Нуклеиновую кислоту, кодирующую антитела или их области (например, вариабельные области), клонируют общепринятыми методами (например, как раскрыто в Sambrook и Russell, eds, Molecular Cloning: Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) и применяют, чтобы кодировать и отображать белки с использованием метода, известного в области. Другие методы получения библиотек белков описаны, например, в US6300064 (например, библиотека HuCAL от Morphosys AG); US5885793; US6204023; US6291158; или US6248516.

Белки в соответствии с раскрытием могут представлять собой растворимые секретируемые белки или могут быть представлены в виде гибридного белка на поверхности клетки или частицы (например, фага или другого вируса, рибосомы или споры). Разнообразные форматы библиотек отображения являются известными в данной области. Например, библиотека представляет собой библиотеку отображения in vitro (например, библиотеку отображения рибосомы, ковалентную библиотеку отображения или библиотеку отображения мРНК, например, как описано в US7270969). В еще одном другом примере, библиотека отображения представляет собой библиотеку фагового отображения, где белки, содержащие антигенсвязывающие домены антител, экспрессируются на фаге, например, как описано в US6300064; US5885793; US6204023; US6291158; или US6248516. Другие методы фагового отображения являются известными в данной области и предусмотрены настоящим раскрытием. Аналогично, раскрытие изобретения предполагает методы клеточного отображения посредством, например, библиотек бактериального отображения, например, как описано в US5516637; библиотек дрожжевого отображения, например, как описано в US6423538, или библиотек отображения млекопитающих.

Методы скрининга библиотек отображения являются известными в данной области. В одном примере, библиотеку отображения настоящего раскрытия подвергают скринингу с использованием аффинной очистки, например, как описано в Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Методы аффинной очистки типовым образом включают в себя контактирование белков, содержащих антигенсвязывающие домены, отображаемые библиотекой, с целевым антигеном (например, VEGF-B), и, после промывки, элюирование этих доменов, которые остаются связанными с антигеном.

Если желательно, любые вариабельные области или scFv, идентифицированные посредством скрининга, легко модифицируют в цельное антитело. Иллюстративные методы для модификации или переформатирования вариабельных областей или scFv в цельные антитела описаны, например, в Jones et al., J Immunol Methods. 354:85-90, 2010; или Jostock et al., J Immunol Methods, 289: 65-80, 2004. Альтернативно или дополнительно, применяют стандартные методы клонирования, например, как описано в Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987), и/или (Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001).

Деиммунизированные, химерные, гуманизированные, сингуманизированные, приматизированные и человеческие белки

Белки настоящего раскрытия могут представлять собой гуманизированный белок.

Термин "гуманизированный белок" следует понимать, как относящийся к белку, содержащему человекоподобную вариабельную область, которая включает CDR из антител вида, не являющегося человеком (например, мыши или крысы или нечеловеческого примата), привитую на или вставленную в FR из человеческого антитела (этот тип антитела также называют "CDR-привитое антитело"). Гуманизированные белки также включают белки, в которых один или несколько остатков человеческого белка модифицированы посредством одной или нескольких аминокислотных замен и/или один или несколько остатков FR человеческого белка заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизированные белки могут также содержать остатки, которые не обнаруживаются в человеческих антителах или нечеловеческих антителах. Любые дополнительные области белка (например, Fc область) обычно являются человеческими. Гуманизация может проводиться с использованием метода, известного в данной области, например, US5225539, US6054297, US7566771 или US5585089. Термин "гуманизированный белок" также охватывает супергуманизированный белок, например, как описано в US7732578.

Белки настоящего раскрытия могут представлять собой человеческие белки. Термин "человеческий белок", как используется в настоящем описании, относится к белкам, имеющим вариабельную и, необязательно, константную область антитела, обнаруживаемые у людей, например, в человеческой зародышевой линии или соматических клетках, или взятые из библиотек, полученных с использованием таких областей. "Человеческие" антитела могут включать аминокислотные остатки, некодируемые человеческими последовательностями, например, мутации, вводимые посредством случайных или сайт-направленных мутаций in vitro (при конкретных мутациях, которые включают в себя консервативные замены или мутации в малом числе остатков белка, например, в 1, 2, 3, 4 или 5 из остатков белка). Эти "человеческие антитела" необязательно должны генерироваться в результате иммунного ответа человека, в большей степени, они могут генерироваться с использованием рекомбинантных средств (например, библиотеки скрининга фагового отображения) и/или трансгенного животного (например, мыши), содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую константную и/или вариабельную области человеческого антитела и/или с использованием направленной селекции (например, как описано в US5565332). Данный термин также охватывает формы со зрелой аффинностью таких антител. Для целей настоящего раскрытия, человеческий белок также будет рассматриваться, как включающий белок, содержащий FR из человеческого антитела или FR, содержащие последовательности из консенсусной последовательности человеческих FR, и, в которых одна или более из CDR, являются случайными или полуслучайными, например, как описано в US6300064 и/или US6248516.

Белки настоящего раскрытия могут являться сингуманизированными белками. Термин "сингуманизированный белок" относится к белку, полученному методом, описанным в WO2007/019620. Сингуманизированный белок включает вариабельную область антитела, где вариабельная область содержит FR из вариабельной области антитела приматов Нового Света и CDR из вариабельной области антитела приматов Нового Света. Например, сингуманизированный белок включает вариабельную область антитела, где вариабельная область содержит FR и CDR из мышиного или крысиного антитела.

Белки настоящего раскрытия могут представлять собой приматизированные белки. "Приматизированный белок" содержит вариабельные область (области) из антитела, генерируемого после иммунизации примата, не являющегося человеком (например, обезьяны-макаки). Необязательно, вариабельные области антитела примата, не являющегося человеком, связаны с человеческими константными областями для получения приматизированных антител. Иллюстративные методы получения приматизированных антител описаны в US6113898.

В одном примере белок раскрытия представляет собой химерный белок. Термин "химерные белки" относится к белкам, в которых антигенсвязывающий домен происходит из конкретного вида (например, мышиного, такого как мышь или крыса) или принадлежит к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть белка происходит из белка, полученного из еще одного вида (такого как, например, человек или примат, не являющийся человеком), или принадлежит к еще одному классу или подклассу антител. В одном примере, химерный белок представляет собой химерное антитело, содержащее V_H и/или V_L из нечеловеческого антитела (например, мышиного антитела), а остальные области антитела берутся из человеческого антитела. Получение таких химерных белков является известным в данной области, и может достигаться стандартными средствами (как описано, например, в US6331415; US5807715; US4816567 и US4816397).

Настоящее раскрытие также предусматривает деиммунизированный белок, например, как описано в WO2000/34317 и WO2004/108158. Деиммунизированные антитела и белки имеют один или несколько удаленных (т.е., подвергшихся мутации) эпитопов, например, B-клеточных эпитопов или T-клеточных эпитопов, чтобы, таким образом снизить вероятность того, что субъект будет повышать иммунный ответ против антитела или белка.

Другие белки, содержащие вариабельные области антитела

Настоящее раскрытие также предусматривает другие белки, содержащие вариабельную область или антигенсвязывающий домен антитела, такие как:

(i) однодоменное антитело, которое является одиночной полипептидной цепью, содержащей всю V_H или V_L антитела или ее часть (см., например, US6248516);

(ii) диатела, триатела и тетратела, например, как описано в US5844094 и/или US2008152586;

(iii) scFv, например, как описано в US5260203;

(iv) минитела, например, как описано в US5837821;

(v) биспецифические белки типа "ключ и замочная скважина", описанные в US5731168;

(vi) гетероконъюгатные белки, например, описанные в US4676980;

(vii) гетероконъюгатные белки, продуцированные с использованием химического кросслинкера, например, как описано в US4676980;

(viii) Fab'-SH фрагменты, например, описанные в Shalaby et al, J. Exp. Med., 175: 217-225, 1992; или

(ix) Fab₃ (например, описанные в EP19930302894).

Гибриды константных доменов

Настоящее раскрытие охватывает белок, содержащий вариабельную область антитела и константную область или Fc или ее домен, например, C_H2 и/или C_H3 домен. Подходящие константные области и/или домены будут очевидными для квалифицированного специалиста в данной области, и/или последовательности таких полипептидов являются легкодоступными из общедоступных баз данных. Kabat et al также предоставляет описание некоторых подходящих константных областей/доменов.

Константные области и/или их домены являются применимыми для обеспечения биологических активностей, таких как димеризация, увеличенный период полужизни в сыворотке, например, посредством связывания с FcRn (неонатальным Fc-рецептором), антигензависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), комплементзависимая цитотоксичность (CDC, антигензависимый клеточный фагоцитоз (ADCP).

Настоящее раскрытие также предусматривает белки, содержащие мутантные константные области или домены, например, описанные в US7217797; US7217798; или US20090041770 (имеющие увеличенный период полужизни) или US2005037000 (с увеличенной ADCC).

Стабилизированные белки

Нейтрализующие белки настоящего раскрытия могут содержать константную область IgG4 или стабилизированную константную область IgG4. Термин "стабилизированная константная область IgG4" следует понимать как означающий константную область IgG4, которая была модифицирована, чтобы снизить обмен плеча Fab или расположенность к протеканию обмена плеча Fab или образованию полуантитела или расположенность к образованию полуантитела. "Обмен плеча Fab" относится к типу модификации белка для человеческого IgG4, при котором тяжелая цепь IgG4 и присоединенная легкая цепь (полумолекула) обмениваются на пару тяжелая-легкая цепь из еще одной молекулы IgG4. Таким образом, молекулы IgG4 могут приобретать два отличающихся плеча Fab, распознающих два отличающихся антигена (что приводит в результате к биспецифическим молекулам). Обмен плеча Fab происходит естественным образом in vivo и может быть индуцирован in vitro очищенными клетками крови или восстанавливающими агентами, такими как восстановленный глутатион. "Полуантитело" образуется, когда антитело IgG4 диссоциирует с образованием двух молекул, каждая из которых содержит единственную тяжелую цепь и единственную легкую цепь.

В одном примере, стабилизированная константная область IgG4 содержит пролин в положении 241 шарнирной области в соответствии с системой Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 и/или 1991). Это положение соответствует положению 228 шарнирной области в соответствии с системой нумерации EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 и Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85, 1969). В человеческом IgG4, этот остаток обычно представляет собой серин. После замены серина на пролин, шарнирная область IgG4 содержит последовательность CPPC. В этой связи, квалифицированный специалист будет знать, что "шарнирная область" представляет собой обогащенную пролином часть константной области тяжелой цепи антитела, которая связывает Fc и Fab области, которая придает подвижность двум плечам Fab антитела. Шарнирная область включает цистеиновые остатки, которые включены в дисульфидные связи между тяжелыми цепями. Ее обычно определяют как проходящую от Glu226 до Pro243 человеческого IgG1 в соответствии с системой нумерации Кабата. Шарнирные области других изотипов IgG могут быть выровнены с последовательностью IgG1 посредством помещения первого и последнего цистеиновых остатков, образующих дисульфидные (S-S) связи между тяжелыми цепями в одинаковые положения (см., например WO2010/080538).

Дополнительные белковые ингибиторы сигнального пути VEGF-B

Другие белки, которые могут препятствовать эффективному взаимодействию VEGF-B с его рецептором, включают мутантные белки VEGF-B.

В одном примере, ингибитор является растворимым белком, содержащим один или несколько доменов VEGF-R1, которые связываются с VEGF-B (и, например, не связываются значительно с VEGF-A). В одном примере, растворимый белок дополнительно содержит константную область антитела, такого как антитело IgG1. Например, растворимый белок дополнительно содержит область Fc и, необязательно шарнирную область антитела, например, антитела IgG1.

В одном примере, белковый ингибитор представляет собой миметик антитела, например, белковую матрицу, содержащую вариабельные области, которые связываются с целевым белком аналогично антителу. Описание иллюстративных миметиков антител следует далее.

Иммуноглобулины и фрагменты иммуноглобулинов

Пример соединения настоящего раскрытия представляет собой белок, содержащий вариабельную область иммуноглобулина, такой как T-клеточный рецептор или иммуноглобулин с тяжелой цепью (например, IgNAR, антитело верблюдовых).

Иммуноглобулины с тяжелой цепью

Иммуноглобулины с тяжелой цепью структурно отличаются от многих других форм иммуноглобулинов (например, антител) постольку, поскольку они содержат тяжелую цепь, но не содержат легкую цепь. Соответственно, эти иммуноглобулины также называют "антитела только с тяжелой цепью". Иммуноглобулины с тяжелой цепью обнаруживают, например, у верблюдовых и в хрящевых рыбах (также называемые IgNAR).

Вариабельные области, присутствующие в природных иммуноглобулинах с тяжелой цепью, обычно называют "домены V_HH" в верблюдовых Ig и V-NAR в IgNAR, чтобы отличать их от вариабельных областей тяжелой цепи, которые присутствуют в традиционных 4-цепочечных антителах (которые называются "доменами V_H"), и от вариабельных областей легкой цепи, которые присутствуют в традиционных 4-цепочечных антителах (которые называются "доменами V_L").

Иммуноглобулины с тяжелой цепью не требуют присутствия легких цепей, чтобы связываться с высокой аффинностью и высокой специфичностью с соответствующим антигеном. Это означает, что однодоменные связывающие фрагменты могут быть получены из иммуноглобулинов с тяжелой цепью, которые легко экспрессируются и обычно являются стабильными и растворимыми.

Общее описание иммуноглобулинов с тяжелой цепью из верблюдовых и их вариабельных областей и методов их получения и/или выделения и/или применения находится среди прочего в следующих ссылках WO94/04678, WO97/49805 и WO 97/49805.

Общее описание иммуноглобулинов с тяжелой цепью из хрящевых рыб и их вариабельных областей и методов их получения и/или выделения и/или применения находится среди прочего в WO2005/118629.

V-образные белки

Примером соединения раскрытия является T-клеточный рецептор. T-клеточные рецепторы имеют два V-домена, которые объединяются в структуру, аналогичную модулю Fv антитела. Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650, 1991 описывает, как два V-домена T-клеточного рецептора (именуемые альфа и бета) могут гибридизоваться и экспрессироваться в виде одноцепочечного полипептида и, дополнительно, как изменить поверхностные остатки, чтобы снизить гидрофобность непосредственно аналогично scFv антитела. Другие публикации, описывающие получение одноцепочечных T-клеточных рецепторов или мультимерных T-клеточных рецепторов, содержащих два домена, V-альфа и V-бета, включают WO1999/045110 или WO2011/107595.

Другие белки, не являющиеся антителами, содержащие антигенсвязывающие домены, включают белки с V-образными доменами, которые обычно являются мономерными. Примеры белков, содержащих такие V-образные домены, включают CTLA-4, CD28 и ICOS. Дополнительное раскрытие белков, содержащих такие V-образные домены, включено в WO1999/045110.

Аднектины

В одном примере, соединение раскрытия представляет собой аднектин. Аднектины основаны на десятом домене фибронектина типа III (¹⁰Fn3) человеческого фибронектина, в котором петлевые области являются измененными для придания антигенсвязывающих свойств. Например, три петли на одном конце β-сэндвича домена ¹⁰Fn3 могут быть сконструированы, чтобы обеспечить аднектину специфическое распознавание антигена. Дополнительные подробности см. в US20080139791 или WO2005/056764.

Антикалины

В дополнительном примере, соединение раскрытия представляет собой антикалин. Антикалины являются производными липокалинов, которые представляют собой семейство внеклеточных белков, которые транспортируют малые гидрофобные молекулы, такие как стероиды, билины, ретиноиды и липиды. Липокалины имеют жесткую β-складчатую вторичную структуру с множеством петель по открытому концу конической структуры, которая может быть сконструирована, чтобы связываться с антигеном. Такие сконструированные липикалины известны как антикалины. Дополнительное описание антикалинов см. в US7250297B1 или US20070224633.

Аффитела

В дополнительном примере, соединение раскрытия представляет собой аффитело. Аффитело представляет собой матрицу, являющуюся производной домена Z (антигенсвязывающего домена) Белка А из Staphylococcus aureus, который может быть сконструирован, чтобы связываться с антигеном. Домен Z состоит из трехспирального пучка из приблизительно 58 аминокислот. Библиотеки были сгенерированы посредством рандомизации поверхностных остатков. Дополнительные подробности см. в EP1641818.

Авимеры

В дополнительном примере, соединение раскрытия представляет собой Авимер. Авимеры являются мультидоменными белками, производными семейства матрицы A-домена. Нативные домены из приблизительно 35 аминокислот принимают заданную дисульфидно связанную структуру. Разнообразие генерируют перетасовкой природной изменчивости, проявляемой семейством A-доменов. Дополнительные подробности см. в WO2002088171.

Дарпины

В дополнительном примере, соединение раскрытия представляет собой сконструированный белок с анкириновым повтором (ДАРПин). Дарпины получают из Анкирина, который представляет собой семейство белков, которые опосредуют присоединение интегральных мембранных белков к цитоскелету. Одиночный анкириновый повтор является мотивом из 33 остатков, состоящим из двух α-спиралей и β-петли. Они могут быть сконструированы, чтобы связываться с различными целевыми антигенами посредством рандомизации остатков в первой α-спирали и β-повороте каждого повтора. Их межфазная поверхность связывания может быть увеличена посредством увеличения числа модулей (методом созревания аффинности). Дополнительные подробности см. в US20040132028.

Способы получения белков

Рекомбинантная экспрессия

В случае рекомбинантного белка, нуклеиновая кислота, кодирующая его, может клонироваться в векторах экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки дрожжей, клетки насекомых или клетки млекопитающих, такие как клетки COS обезьян, клетки яичника китайского хомяка (CHO), зародышевые клетки человеческой почки (HEK) или клетки миеломы, которые не продуцируют антитела иным образом. Иллюстративные клетки, применяемые для экспрессии белка раскрытия, представляют собой клетки CHO, клетки миеломы или клетки HEK. Технологии молекулярного клонирования для достижения этих конечных целей известны в данной области и описаны, например, в Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все обновления до настоящего времени) или Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Большое разнообразие методов клонирования и амплификации in vitro подходит для построения рекомбинантных нуклеиновых кислот. Методы получения рекомбинантных антител также являются известными в данной области. См. US4816567 или US5530101.

После выделения, нуклеиновую кислоту вводят в функционально связанном состоянии с промотором в конструкции экспрессии или вектор экспрессии для дополнительного клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии в бесклеточной системе или в клетках.

Как используется в настоящем описании, термин "промотор" будет принят в его самом широком контексте и включает транскрипционные регуляторные последовательности геномного гена, включающие ТАТА-бокс или инициаторный элемент, который требуется для точной инициации транскрипции, с дополнительными регуляторными элементами или без них (например, активирующие с возрастанием последовательности, участки связывания фактора транскрипции, энхансеры и сайленсеры), которые изменяют экспрессию нуклеиновой кислоты, например, в ответ на относящийся к развитию и/или внешний стимул, или тканеспецифичным образом. В настоящем контексте, термин "промотор" также применяют для описания рекомбинантной, синтетической или гибридной нуклеиновой кислоты или производного, которое предоставляет, активирует или усиливает экспрессию нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Иллюстративные промоторы могут содержать дополнительные копии одного или нескольких специфичных регуляторных элементов, чтобы дополнительно усилить экспрессию и/или изменить пространственную экспрессию и/или временную экспрессию указанной нуклеиновой кислоты.

Как используется в настоящем описании, термин "функционально связанный с" означает расположение промотора относительно нуклеиновой кислоты таким образом, что экспрессия нуклеиновой кислоты управляется промотором.

Доступными являются многие векторы для экспрессии в клетках. Векторные компоненты обычно включают, но не ограничиваются приведенными, одно или несколько из следующих: сигнальную последовательность, последовательность, кодирующую антитело (например, полученную исходя из информации, предоставленной в настоящем описании), энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции. Квалифицированный специалист в данной области будет обладать знаниями о подходящих последовательностях для экспрессии антитела. Иллюстративные сигнальные последовательности включают сигналы прокариотической экспрессии (например, pelB, щелочную фосфатазу, пенициллиназу, Ipp или теплостойкий энтеротоксин II), сигналы дрожжевой секреции (например, лидер инвертазы, лидер α-фактора или лидер кислотной фосфатазы) или сигналы секреции млекопитающих (например, сигнал gD простого герпеса).

Иллюстративные промоторы, активные в клетках млекопитающих, включают немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE), промотор человеческого фактора элонгации 1-α (EF1), промоторы малой ядерной РНК (U1a и U1b), промотор тяжелой цепи α-миозина, промотор вируса обезьян 40 (SV40), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), основной поздний промотор аденовируса, промотор β-актина; гибридный регуляторный элемент, содержащий cmV энхансер/промотор β-актина или промотор иммуноглобулина или его активный фрагмент. Примеры применимых линий клеток-хозяев млекопитающих представляют собой линию CV1 почки обезьяны, трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию человеческих эмбриональных клеток почек (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре; клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); или клетки яичника китайского хомяка (CHO).

Типовые промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжевых клетках, таких как, например клетки дрожжей, выбранных из группы, состоящей из Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и S. pombe, включают, но не ограничиваются приведенными, ADH1 промотор, GAL1 промотор, GAL4 промотор, CUP1 промотор, PHO5 промотор, nmt промотор, RPR1 промотор, или TEF1 промотор.

Средства для введения изолированной нуклеиновой кислоты или содержащей ее экспрессионной конструкции в клетку для экспрессии известны специалистам в данной области. Метод, применяемый для данных клеток, зависит от известных успешных методов. Средства для введения рекомбинантной ДНК в клетки включают микроинъекцию, трансфекцию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном, трансфекцию, опосредованную липосомами, таким образом, как посредством использования липофектамина (Gibco, MD, USA) и/или целфектина (Gibco, MD, USA), ПЭГ-опосредованный захват ДНК, электропорацию и бомбардировку микрочастицами, таким образом, как с использованием частиц ДНК-покрытого вольфрама или частиц золота (Agracetus Inc., WI, USA), среди других.

Клетки-хозяева, применяемые для получения антител, могут культивироваться в различных средах, в зависимости от типа применяемых клеток. Среды, доступные для приобретения, такие как Fl0 Хэма (Sigma), минимальная незаменимая среда ((MEM), (Sigma), RPM1-1640 (Sigma) и модифицированная Дульбекко среда Игла ((DMEM), Sigma), являются подходящими для культивирования клеток млекопитающих. Среды для культивирования других типов клеток, обсуждаемых в настоящем описании, являются известными в данной области.

Очистка белка

После продуцирования/экспрессии белок раскрытия очищают с использованием метода, известного в данной области. Такая очистка обеспечивает белок раскрытия, не содержащий по существу неспецифического белка, кислот, липидов, углеводов и т.п. В одном примере, белок будет содержаться в препарате, где более, чем приблизительно 90% (например, 95%, 98% или 99%) белка в препарате является белком раскрытия изобретения.

Для получения выделенного белка раскрытия изобретения используются стандартные методы очистки пептидов, включающие, но не ограниченные перечисленными, различные методики жидкостной хроматографии высокого давления (или разрешения) (ВЭЖХ) и методики выделения полипептидов без использования ВЭЖХ, такие как гель-фильтрация, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, хроматография со смешанными методами, методы фазового разделения, электрофоретические разделения, методы осаждения, методы высаливания, иммунохромтография и/или другие методы.

В одном примере, аффинная очистка является применимой для выделения гибридного белка, содержащего метку. Методы выделения белка с использованием аффинной хроматографии известны в данной области и описаны, например, в Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Например, антитело или соединение, которое связывается с меткой (в случае полигистидиновой метки оно может представлять собой, например, никель-NTA) иммобилизуют на твердом носителе. Образец, содержащий белок, затем приводят в контакт с иммобилизованным антителом или соединением в течение времени и при условиях, достаточных, чтобы произошло связывание. После промывки, чтобы удалить любой несвязанный или неспецифически связанный белок, белок элюируют.

В случае белка, содержащего Fc область антитела, белок А или белок G или их модифицированные формы могут применяться для аффинной очистки. Белок А является применимым для выделения очищенных белков, содержащих человеческую γl, γ2 или γ4 Fc область тяжелой цепи. Белок G рекомендуется для всех мышиных изотипов Fc и для человеческой γ3.

Ингибиторы сигнального пути VEGF-B на основе нуклеиновых кислот

В одном примере раскрытия изобретения, терапевтические и/или профилактические способы, описанные в настоящем документе, в соответствии с любым примером раскрытия включают в себя снижении экспрессии VEGF-B. Например, такой способ включает в себя введение соединения, которое снижает транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты. В одном примере, соединение представляет собой нуклеиновую кислоту, например, антисмысловой полинуклеотид, рибозим, ПНК, интерферирующую РНК, миРНК или микроРНК.

Антисмысловые нуклеиновые кислоты

Термин "антисмысловая нуклеиновая кислота" будет принят для обозначения ДНК или РНК или их производного (например, ЛНК или ПНК), или их комбинации, которая является комплементарной, по меньшей мере, части специфичной молекулы мРНК, кодирующей полипептид, описанный в настоящем документе в любом примере раскрытия, и способной препятствовать пост-транскрипционному событию, такому как трансляция мРНК. Применение антисмысловых методов известно в данной области (см., например, Hartmann and Endres (editors), Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)).

Антисмысловая нуклеиновая кислота раскрытия будет гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой при физиологических условиях. Антисмысловые нуклеиновые кислоты включают последовательности, которые соответствуют структурным генам или кодирующим областям или последовательностям, которые осуществляют контроль над экспрессией гена или сплайсингом. Например, антисмысловая нуклеиновая кислота может соответствовать целевой кодирующей области нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF-B, или 5'-нетранслируемой области (UTR) или 3'-UTR или их комбинации. Она может быть частично комплементарной интронным последовательностям, которые могут подвергаться сплайсингу во время или после транскрипции, например, только в последовательности экзонов целевого гена. Длина антисмысловой последовательности должна составлять, по меньшей мере, 19 смежных нуклеотидов, например, по меньшей мере, 50 нуклеотидов, таким образом, как, по меньшей мере, 100, 200, 500 или 1000 нуклеотидов из нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF-B. Может применяться непроцессированная последовательность, комплементарная полному транскрипту гена. Длина может составлять 100-2000 нуклеотидов. Степень идентичности антисмысловой последовательности целевому транскрипту должна составлять, по меньшей мере, 90%, например, 95-100%.

Иллюстративные антисмысловые нуклеиновые кислоты против VEGF-B описаны, например, в WO2003/105754.

Каталитическая нуклеиновая кислота

Термин "каталитическая нуклеиновая кислота" относится к молекуле ДНК или ДНК-содержащей молекуле (также известным в данной области как "дезоксирибозим" или "ДНК-фермент") или РНК или РНК-содержащей молекуле (также известной как "рибозим" или "РНКзим"), которая специфически распознает различимый субстрат и катализирует химическую модификацию этого субстрата. Основания нуклеиновой кислоты в каталитической нуклеиновой кислоте могут представлять собой основания A, C, G, T (и U для РНК).

Обычно, каталитическая нуклеиновая кислота содержит антисмысловую последовательность для специфичного распознавания целевой нуклеиновой кислоты, и нуклеиновую кислоту с расщепляющей ферментативной активностью (также называемую в данном документе "каталитическим доменом"). Типы рибозимов, которые являются применимыми в данном раскрытии, представляют собой молотоголовый рибозим и шпилечный рибозим.

РНК-интерференция

РНК-интерференция (РНКи) является применимой для специфического ингибирования продуцирования конкретного белка. Не будучи ограниченной теорией, эта технология основана на присутствии молекул дсРНК, которые содержат последовательность, которая является идентичной по существу мРНК гена, представляющего интерес или ее части, в данном случае, мРНК, кодирующей VEGF-B. Удобным образом, дсРНК может быть получена из одиночного промотора в рекомбинантном векторе клетки-хозяина, где смысловые и антисмысловые последовательности являются фланкированными неродственной последовательностью, которая обеспечивает гибридизацию смысловых и антисмысловых последовательностей с образованием молекулы дсРНК с неродственной последовательностью, образующей петлевую структуру. Дизайн и получение подходящих молекул дсРНК для настоящего раскрытия находится в пределах профессиональных навыков специалиста в данной области, особенно с учетом WO99/32619, WO99/53050, WO99/49029, и WO01/34815.

Длина каждой из смысловых и антисмысловых последовательностей, которые гибридизируются, должна составлять, по меньшей мере, 19 смежных нуклеотидов, таким образом, как, по меньшей мере, 30 или 50 нуклеотидов, например, по меньшей мере, 100, 200, 500 или 1000 нуклеотидов. Может применяться непроцессированная последовательность, соответствующая полному транскрипту гена. Длины могут составлять 100-2000 нуклеотидов. Степень идентичности смысловых и антисмысловых последовательностей целевому транскрипту должна составлять, по меньшей мере, 85%, например, по меньшей мере, 90%, таким образом, как 95-100%.

Иллюстративные молекулы малой интерферирующей РНК ("миРНК") содержат нуклеотидную последовательность, которая является идентичной приблизительно 19-21 смежным нуклеотидам целевой мРНК. Например, последовательность миRНК начинается с динуклеотида AA, содержит GC-содержимое приблизительно на 30-70% (например, 30-60%, таким образом, как 40-60%, например, приблизительно 45%-55%), и не обладает высоким процентом идентичности с любой нуклеотидной последовательностью, отличающейся от целевой в геноме млекопитающего, в которого она должна быть введена, например, определенной посредством стандартным поиском BLAST. Иллюстративные миРНК, которые снижают экспрессию VEGF-B являются доступными для приобретения от Santa Cruz Biotechnology или Novus Biologicals.

Короткие шпилечные РНК (кшРНК), которые снижают экспрессию VEGF-B, также известны в данной области и являются доступными для приобретения от Santa Cruz Biotechnology.

Аналитические тесты для скрининга

Соединения, которые ингибируют сигнальный путь VEGF-B, могут быть идентифицированы с использованием методов, известных в данной области, например, как описано ниже. Аналогично, количества ингибиторов сигнального пути VEGF-B, подходящие для применения в способе, описанном в настоящем документе, могут быть определены или оценены с использованием методов, известных в данной области, например, как описано ниже.

Аналитические тесты на нейтрализацию

Для соединений, которые связываются с VEGF-B и ингибируют сигнальный путь, может применяться аналитический тест на нейтрализацию.

В одном примере, аналитический тест на нейтрализацию включает в себя контактирование VEGF-B с соединением в присутствии или отсутствии обнаруживаемого меченого растворимого VEGF-R1 или контактирование обнаруживаемого меченого VEGF-B с соединением в присутствии или отсутствии клетки, экспрессирующей VEGF-R1 или растворимый VEGF-R1. Затем оценивают уровень VEGF-B, связанного с VEGF-R1. Сниженный уровень связанного VEGF-B в присутствии соединения в сравнении с таким уровнем в отсутствии соединения указывает на то, что соединение ингибирует связывание VEGF-B с VEGF-R1 и, как следствие, сигнальный путь VEGF-B.

Еще один аналитический тест на нейтрализацию описан в WO2006/012688 и включает в себя контактирование фрагмента VEGF-R1, содержащего второй Ig-подобный домен, иммобилизованный на твердом носителе, с субнасыщающей концентрацией рекомбинантного VEGF-B, предварительно инкубированного с соединением. После промывки, чтобы удалить несвязанный белок, иммобилизованный белок приводят в контакт с антителом против VEGF-B, и определяют количество связанного антитела (показывающего иммобилизованный VEGF-B). Соединение, которое снижает уровень связанного антитела в сравнении с уровнем в осутствии соединения, рассматривают как ингибитор сигнального пути VEGF-B.

В еще одном примере, соединение, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, идентифицируют с использованием клеток, пролиферация которых зависит от сигнального пути VEGF-B, например, клеток BaF3, модифицированных, как описано в WO2006/012688 для экспрессии химерного рецептора, включающего внутриклеточный домен рецептора человеческого эритропоэтина, и внеклеточный домен VEGF-R1. Клетки культивируют в присутствии VEGF-B и в присутствии или отсутствии соединения. Пролиферацию клеток затем оценивают с использованием стандартных методов, например, анализа образования колоний, введения тимидина или захвата еще одного подходящего маркера пролиферации клеток (например, анализа на снижения окраски красителем MTS). Соединение, которое снижает уровень пролиферации в присутствии VEGF-B, рассматривают как ингибитор сигнального пути VEGF-B.

Соединения могут также оцениваться по их способности связываться с VEGF-B с использованием стандартных методов. Методы оценки связывания с белком известны в данной области, например, как описано в Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Такой метод обычно включает в себя мечение соединения и его контактирование с иммобилизованным VEGF-B. После промывки, чтобы удалить неспецифическое связанное соединение, количество метки и, как следствие, связанное соединение обнаруживают. Несомненно, соединение может быть иммобилизованным, а VEGF-B меченным. Могут также применяться аналитические тесты типа пэннинга. Альтернативно, или дополнительно, могут применяться аналитические тесты с поверхностным плазмонным резонансом.

Аналитические тесты на экспрессию

Соединение, которое снижает или предотвращает экспрессию VEGF-B, идентифицируют посредством контактирования клетки с соединением и определения уровня экспрессии VEGF-B. Подходящие методы определения экспрессии гена на уровне нуклеиновой кислоты известны в данной области и включают, например, количественную полимеразную цепную реакцию (колПЦР) или микроматричные аналитические тесты. Подходящие методы определения экспрессии на уровне белка также известны в данной области и включают, например, фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), флуоресцентно-связанный иммуносорбентный анализ (FLISA), иимунофлуоресценцию или Вестерн-блоттинг.

Аналитические тесты in vitro

Для оценки заживления раны были описаны многочисленные аналитические тесты in vitro, включающие аналитические тесты с соскобом или царапиной, в которых культуру эндотелиальных клеток или фибробластов соскабливают для получения бесклеточной области, и скорость закрытия этой бесклеточной области оценивают в присутствии или отсутствии соединения.

Другие аналитические тесты включают модель хорионаллантоисной мембраны цыпленка (CAM).

Аналитические тесты in vivo

Существуют многочисленные аналитические тесты in vivo для оценки заживления раны. Например, авторы настоящего изобретения применяли модель, в которой диабетическим животным наносили рану (например, получали раны с полной толщиной), и скорость и/или количество закрытия раны оценивали с течением времени в присутствии или отсутствии тестируемого соединения.

Другие модели хронической раны включают, например, "язвенную" модель уха кролика, модели с лоскутом кожи, модели пролежневой язвы (например, посредством приложения давления к ноге борзой собаки с использованием шины) или подкожное введение адриамицина.

Модели нанесения острой раны включают, например, модели с надрезом, модели с иссечением и модели с ожогами.

Раны могут производиться у животных, страдающих от других дефектов, например, метаболических дефектов (например, описанных в настоящем документе, или посредством введения стрептозотоцина).

Различные модели ран описаны, например, в Demling et al., РАНS. 13(1 Suppl A):5-14, 2001 и в Руководстве FDA по лечению хронических кожных язв и ожоговых ран.

Фармацевтические композиции и способы лечения

Соединение, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B (син. активный ингредиент) является применимым для парентерального, местного, перорального, или местного введения, аэрозольного введения или чрескожного введения, для профилактического или для терапевтического лечения. В одном примере, соединение вводят парентерально, таким образом, как подкожно или внутривенно.

Лекарственная форма соединения, подлежащего введению, будет варьировать в соответствии с путем введения и выбранной лекарственной формой (например, раствором, эмульсией, капсулами). Соответствующая фармацевтическая композиция, содержащая соединение, подлежащее введению, может быть получена в физиологически приемлемом носителе. Для растворов или эмульсий подходящие носители включают, например, водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включающие физиологический раствор и забуференные среды. Несущие среды для парентерального введения могут включать раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактатированный раствор Рингера или нелетучие масла. Квалифицированному специалисту в данной области известны различные соответствующие водные носители, включающие воду, забуференную воду, забуференный физраствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль), раствор декстрозы и глицин. Несущие среды для внутривенного введения могут включать различные добавки, консерванты или текучую среду, питательный компонент или компенсирующие добавки к электролиту (См., в целом, Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980). Композиции могут необязательно содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, требуемые для приближения к физиологическим условиям, такие как регулирующие pH и забуферивающие средства и средства, регулирующие токсичность, например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хорид кальция и лактат натрия. Соединение может быть лиофилизировано для хранения и восстановлено в подходящем носителе перед применением в соответствии с известными в данной области технологиями лиофилизации и восстановления.

В одном примере, настоящее раскрытие предоставляет лекарственную форму для местного применения, содержащую соединение раскрытия изобретения. В одном примере, соединение составляют с носителем, подходящим для местной лекарственной формы. Подходящие носители включают соединение или его смесь, которая является подходящей для нанесения на один или несколько кожных слоев, необязательно на наружный слой кожи, и которые могут быть подходящими для применения в других контекстах. Носитель и эксципиент, применимые в композиции для местного применения настоящего раскрытия, обычно не будут ингибировать в любой значительной степени соответствующую биологическую активность активного соединения, например, носитель или эксципиент не будут значительно ингибировать ингибиторную активность активного соединения по отношению к сигнальному пути VEGF-B. Например, носитель или эксципиент предоставляет забуферивающую активность, чтобы поддерживать соединение при подходящем pH, для проявления, таким образом, его биологической активности, например, носитель или эксципиент представляют собой забуференный фосфатом физраствор. Альтернативно или в дополнение, носитель или эксципиент содержит соединение, которое усиливает захват ингибитора и/или увеличивает чрескожную доставку ингибитора. Например, носитель или эксципиент содержит усилитель проницаемости через кожу, такой как, например, дипропиленгликоль и/или олеиловый спирт. Альтернативно или в дополнение, носитель или эксципиент содержит липосомы для облегчения захвата клетками.

Альтернативно или в дополнение, носитель или эксципиент содержит соединение, которое увеличивает активность соединения и/или снижает ингибирование соединения, например, ингибитор протеазы и/или ингибитор ДНКазы и/или ингибитор РНКазы, чтобы, таким образом, повысить стабильность ингибитора.

Оптимальная концентрация активного ингредиента (ингредиентов) в выбранной среде может быть определена эмпирически, в соответствии с методиками, известными квалифицированному специалисту в данной области, и будет зависеть от окончательной желательной фармацетической лекарственной формы.

Интервалы дозировки для введения соединения раскрытия представляют собой интервалы, достаточно большие, чтобы произвести желательный эффект. Например, композиция содержит терапевтически или профилактически эффективное количество соединения.

Как используется в настоящем описании, термин "эффективное количество" будет принят для обозначения достаточного количества соединения, чтобы ингибировать/снизить/предотвратить сигнальный путь VEGF-B у субъекта. Квалифицированный специалист в данной области будет осведомлен, что такое количество будет варьировать в зависимости от, например, соединения и/или конкретного субъекта и/или типа и/или тяжести раны, подвергаемой лечению. Соответственно, данный термин не должен рассматриваться, как ограничивающий раскрытие конкретным количеством, например, массой или количеством соединений.

Как используется в настоящем описании, термин "терапевтически эффективное количество" будет принят для обозначения достаточного количества соединения, чтобы ускорить или индуцировать заживление раны.

Как используется в настоящем описании, термин "профилактически эффективное количество" будет принят для обозначения достаточного количества соединения, чтобы предотвратить или ингибировать или замедлить прогрессирование раны.

Дозировка не должна быть такой высокой, чтобы вызвать неблагоприятные побочные эффекты, такие как синдромы избыточной вязкости, отек легких, застойную сердечную недостаточность и т.п. Обычно, дозировка будет варьировать в зависимости от возраста, состояния, пола и степени заболевания у пациента и может быть определена квалифицированным специалистом в области. Дозировка может регулироваться индивидуальным терапевтом в случае наступления события любого осложнения.

Дозировка может варьировать от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 300 мг/кг, например, от приблизительно 0,2 мг/кг до приблизительно 200 мг/кг, таким образом, как от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг, в одном или нескольких введениях дозы ежедневно, в течение одного или нескольких дней.

В некоторых примерах, соединение вводят при начальной (или нагрузочной) дозе, которая является более высокой, чем последующие (поддерживающие дозы). Например, соединение вводят при начальной дозе, находящейся между приблизительно 1 мг/кг и приблизительно 30 мг/кг. Соединение затем вводят при поддерживающей дозе, составляющей между приблизительно 0,0001 мг/кг и приблизительно 1 мг/кг. Поддерживающие дозы могут вводиться каждые 7-35 дней, таким образом, как каждые 14 или 21 или 28 дней.

В некоторых примерах применяют режим наращивания дозы, при котором соединение первоначально вводят при более низкой дозе, чем применяют в последующих дозах. Данный режим дозирования является применимым в случае субъекта, изначально страдающего от неблагоприятных явлений.

В случае субъекта, который является неадекватно реагирующим на лечение, может вводиться множество доз в неделю. Альтернативно, или в дополнение, могут вводиться увеличивающиеся дозы.

Субъект может подвергаться повторному лечению соединением, посредством получения более одного воздействия или набора доз, таким образом, как, по меньшей мере, приблизительно двух воздействий соединения, например, приблизительно от 2 до 60 воздействий, и, более конкретно, приблизительно от 2 до 40 воздействий, наиболее конкретно, приблизительно от 2 до 20 воздействий.

В еще одном примере, любое повторное лечение может обеспечиваться при заданных интервалах. Например, последующие воздействия могут вводиться при различных интервалах, таких как, например, приблизительно 24-28 недель или 48-56 недель или более. Например, такие воздействия вводят при интервалах, каждый из которых равен приблизительно 24-26 неделям или приблизительно 38-42 неделям или приблизительно 50-54 неделям.

Способ настоящего раскрытия также может включать совместное введение, по меньшей мере, одного соединения в соответствии с раскрытием вместе с введением еще одного терапевтически эффективного средства для предотвращения или лечения раны и/или диабета.

В одном примере, соединение (соединения) раскрытия применяют в комбинации, по меньшей мере, с одним дополнительным известным соединением, которое используется в настоящее время или находится в разработке для предотвращения или лечения диабета. Примеры таких известных соединений включают, но не ограничиваются перечисленными, обычные противодиабетические лекарственные средства, такие как сульфонилмочевины (например, гликазид, глипизид), метформин, глитазоны (например, пиоглитазон), пищевые средства, высвобождающие глюкозу (например, репаглитинид, натеглинид), акарбозу и инсулин (включая все природные, синтетические и модифицированные формы инсулина, такие как человеческий инсулин, инсулин бычьего или свиного происхождения; инсулин, суспендированный, например, в изофане или цинке и производные, такие как инсулин глюлизин, инсулин лизпро, инсулин лизпро протамин, инсулин гларгин, инсулин детемир или инсулин аспарт).

В одном примере, соединение раскрытия вводят с соединением, известным, как применимое для лечения раны. Например, соединение вводят в комбинации с противоинфекционными средствами (например, антибиотиком или противогрибковым средством), VEGF-A, IGF-1, IGF-2, PDGF, TGF-β, EGF или стволовыми клетками (например, мезенхимальными стволовыми клетками или клетками-предшественниками или эндотелиальными стволовыми клетками).

В одном примере, соединение раскрытия вводят с еще одним другим лечением для раны, например перевязочным материалом и/или трансплантатом и/или отрицательным давлением.

Дополнительными примерами средств, которые могут совместно вводиться с соединением (соединениями) в соответствии с раскрытием, являются кортикостероиды и иммуносупрессорные лекарственные терапии.

Как будет ясно из изложенного выше, настоящее раскрытие предоставляет способы сопутствующего терапевтического лечения субъекта, включающие в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества первого соединения и второго соединения, где указанное средство представляет собой соединение раскрытия (т.е., ингибитор сигнального пути VEGF-B), а второе средство предназначено для предотвращения или лечения раны или диабета.

Как используется в настоящем описании, термин "сопутствующее", как во фразе "сопутствующее терапевтическое лечение" включает введение первого средства в присутствии второго средства. Способ сопутствующего терапевтического лечения включает способы, в которых первое, второе, третье или дополнительное средства вводят совместно. Способ сопутствующего терапевтического лечения также включает способы, в которых первое или дополнительное средства вводят в присутствии второго или дополнительного средства, где второе или дополнительное средства, например, могли вводиться прежде. Способ сопутствующего терапевтического лечения может выполняться постадийно различными исполнителями. Например, один исполнитель может вводить субъекту первое средство, и, как второй исполнитель может вводить субъекту второе средство, и стадии введения могут выполняться в одно и то же время, или почти в одно и то же время, или в удаленное время, поскольку первое средство (и/или дополнительные средства) представлены после введения в присутствии второго средства (и/или дополнительных средств). Исполнитель и субъект могут представлять собой один и тот же объект (например, человека).

В одном примере, раскрытие также предоставляет способ лечения или предотвращения ран у субъекта, способ, включающий в себя введение субъекту первой фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, одно соединение раскрытия, и второй фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько дополнительных соединений.

В одном примере, способ раскрытия включает в себя введение ингибитора сигнального пути VEGF-B субъекту, страдающему от раны (например, диабетической язвы) и получение еще одного лечения (например, диабета).

Наборы и другие композиции материалов

Еще один другой пример раскрытия предоставляет наборы, содержащие соединения, применимые для лечения раны, как описано выше.

В одном примере, набор содержит (a) контейнер, содержащий соединение, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, описанное в настоящем документе, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе; и (b) листовку-вкладыш в упаковке с инструкциями по лечению раны у субъекта.

В соответствии с данным примером раскрытия изобретения, листовка-вкладыш в упаковке находится на контейнере или является ассоциированной с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, пузырьки, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть сформированы из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер удерживает или содержит композицию, которая является эффективной для лечения раны и может иметь стерильное отверстие для прохода (например, контейнер может представлять собой мешок с раствором для внутривенного введения или пузырек, имеющий пробку, прокалываемую иглой для гиподермальной инъекции). По меньшей мере, одно активное средство в композиции является соединением, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B. Этикетка или листовка-вкладыш в упаковке указывает на то, что композицию применяют для лечения субъекта, подходящего для лечения, например, субъекта, имеющего рану или предрасроложенного к ране, вместе с конкретным руководством, касающимся количеств дозирования и интервалов для соединения и любого другого предоставляемого лекарственного средства. Набор может дополнительно содержать дополнительный контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавительный буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекции (BWFI), забуференный фосфатом физраствор, раствор Рингера и/или раствор декстрозы. Набор может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включающие другие буферы, разбавители, фильты, иглы и шприцы.

Набор необязательно дополнительно содержит контейнер, содержащий второе лекарственное средство, где соединение, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, представляет собой первое лекарственное средство, а изделие, которое дополнительное содержит инструкции на листовке-вкладыше в упаковке по лечению субъекта, является вторым лекарственным средством, в эффективном количестве или для еще одного лечения раны. Второе лекарственное средство может являться любым из средств, приведенных выше.

Настоящее раскрытие также предоставляет перевязочный материал для раны, импрегнированный или содержащий иммобилизованное в нем (например, обратимо иммобилизованное в нем) соединение, раскрытое в настоящем описании. Иллюстративные перевязочные материалы включают бинты, например, тканевый бинт или пластиковый бинт или марлевый бинт или марлевый перевязочный материал или травматическую повязку. Альтернативно, или в дополнение, перевязочный материал содержит поддерживающую основу, например, биодеградируемую основу. Например, основа содержит коллаген и/или поли(молочную) кислоту и/или поли(гликолевую) кислоту и/или фибрин. Такая основа может быть пористой или непористой или являться их смесью. Преимущество таких основ состоит в том, что они приспосабливаются к форме раны и доставляют терапевтическое соединение к участку ранения. Более того, по мере заживления раны, поддерживающая основа разрушается, таким образом, снижая биологические отходы.

Настоящее раскрытие включает следующие неограничивающие Примеры.

Пример 1: Нейтрализущие антитела против VEGF-B излечивают раны у диабетических мышей

Опосредованное антителами ингибирование VEGF-B умеренно влияет на уровни глюкозы в крови у диабетических db/db//BKS мышей

Разводимые внутри компании самцы мышей C57BKS/Leprdb (db/db/BKS) были приобретены у Jackson Laboratory. Мышей содержали по одной мыши в клетке до нанесения раны и во время эксперимента. Средства для содержания животных обеспечивали 12-часовой темновой/световой цикл с пищей и водой, доступными ad libitum. Дополнительные средства включали крысиные норы и материал для гнездования для снижения стресса. Самцов db/db/BKS мышей (8 недель) предварительно обрабатывали 2 раза/в неделю (в.бр.) в течение 4 недель до нанесения раны, с использованием 400 мкг антител против VEGF-B (2H10) или совпадающих по изотипу контрольных антител (BM4). Такой же режим обработки продолжали после нанесения раны до умерщвления животных. Массу тела и уровень глюкозы в крови подвергали мониторингу до и во время эксперимента. Уровни глюкозы в крови анализировали с забором крови из хвоста с использованием измерителя глюкозы в крови (Countour stick, Bayer), и массу тела измеряли на лабораторных весах.

Как показано на ФИГ. 1, в данном эксперименте лечение антителами против VEGF-B не изменяло уровни глюкозы в крови или прирост массы тела у диабетических db/db BKS мышей с тяжелой формой диабета или у недиабетических db/⁺ BKS мышей.

Фармакологическое ингибирование VEGF-B с использованием 2H10 ускоряет закрытие раны на мышиной модели с тяжелой формой диабета.

После достижения уровней глюкозы в крови натощак свыше 15 мМ, db/db или db/⁺ мышей, обработанных 2H10 или BM4 (контроль), содержали в течение дополнительных двух недель перед нанесением раны. Это проводили, чтобы получить животных с тяжелой формой диабета во время нанаесения раны. Нанесение ран проводили при общей анестезии ингаляцией изофлурана. Шерсть с задней стороны шеи удаляли с помощью электрической машинки для стрижки волос и нанесения крема-депилятория (Veet). Кожу дезинфицировали 70% этанолом, после чего с использованием 6 мм дерматома наносили две парных круговых полнослойных раны, которые проникали через кожу и поверхностный подкожный слой. Во время первых двух дней после нанесения раны, мышам вводили подкожные анальгезирующие инъекции 0,05-0,1 мг/кг бупренорфина дважды в день. Размер раны и прогрессирование заживления отслеживали с помощью цифровой фотографии непосредственно после нанесения раны и затем в каждый другой день во время эксперимента. Область раны измеряли дважды для каждой раны с использованием программного обеспечения Image J. Расстояние между камерой и раной корректировали по отношению размера раны к эталонному объекту, включенному в каждое изображение. Одиночную рану (по две на животное) обрабатывали как единственный экспериментальный результат наблюдения.

Как показано на ФИГ. 2, закрытие раны значительно ускоряется на диабетической мышиной модели (db/db BKS) при обработке антителом против VRGF-B.

Лечение антителами против VEGF-B увеличивало скорость закрытия раны и заживление на диабетической мышиной модели. Наиболее выдающийся эффект лечения антителами против VEGF-B обнаруживался на ранней фазе закрытия раны (в день 4 и 6). Этот результат дополнительно показан на ФИГ. 3, при котором лечение антителами против VEGF-B ускоряет заживление раны во время первых четырех дней, несмотря на отсутствие различий по уровням глюкозы в крови.

Данные, представленные в настоящем описании, позволяют предположить, что гипергликемия при диабете сама по себе не явлется основной причиной нарушения процесса заживления раны.

Лечение антителами против VEGF-B с использованием 2H10 снижает экспрессию генов, регулируемых с повышением при заживлении раны

Самцов db/db и db/+ мышей (обработанных, как описано выше, и умерщвленных в день 16) использовали для анализа экспрессии. Раны иссекали и моментально замораживали сухим льдом. Общую РНК экстрагировали и очищали из раны с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Первую цепь кДНК синтезировали из 0,5-1 мкг общей РНК с использованием набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad). Количественную ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием набора для ПЦР KAPA SYBR FAST Master Mix (2x) Universal (KAPA Biosystems) в амплификаторе для ПЦР в режиме реального времени Rotor-Gene Q (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Уровни экспрессии нормализовали до экспрессии L19.

Как показано на ФИГ. 4, лечение антителами против VEGF-B у db/db мышей снижает экспрессию нескольких генов, которые повышающе регулируются во время диабетического ранения.

Лечение антителами против VEGF-B с использованием 2H10 оказывает воздействие на морфологию кровеносных сосудов, но не стимулирует пролиферацию клеток

Самцов db/db мышей (обработанных, как описано выше, и умерщвленных в день 16) использовали для иммунологических анализов. Раны иссекали и фиксировали в параформальдегиде при +4°C в течение 24 часов, гидратировали в 70% этаноле, погружали в парафин и нарезали поперечными срезами с толщиной по 3 мкм. Демаскирование антигена выполняли с использованием раствора для демаскирования антигена с pH6 (DAKO) и посредством нагрева срезов до +98°C в течение 10 минут. Срезы инкубировали при +4°C в течение 12 часов с соответствующими первичными антителами (Brdu, CD45, CIV и CD31, разбавленными до 1-5 мкг/мл). Вносили совместимые флуоресцентно меченые вторичные антитела (Invitrogen, Alexa fluor, разбавленные 1:1000), и срезы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре (КТ) после чего их подготавливали для микроскопии. Срезы фотографировали на микроскопе AxioVision (Carl Zeiss) при 20x увеличении. Срезы затем оценивали и количественно измеряли с использованием программы AxioVision Run wizard (пиксели²). Интенсивность окрашивания определяли количественно по отношению к интенсивности контрастного окрашивания для DAPI, и все другое окрашивание количественно измеряли в пикселях по общей области.

Как показано на ФИГ. 5, лечение антителами против VEGF-B инициирует созревание кровеносных сосудов во время заживления диабетической раны.

Сигнальный путь VEGF-B повышающе регулируется в диабетических ранах

db/db или db/+ мышам, обработанным контрольными антителами (BM4), наносили рану по существу, как описано выше, и мышей умерщвляли на день 16 после нанесения раны. С помощью 6 мм дерматома из ран были взяты пробы для оценки экспрессии и гистологического анализа. Ткани замораживали в жидком азоте и выдерживали при -80°C до дополнительной обработки. РНК выделяли с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) и набора QIAGEN RNeasy (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Общую РНК (500 нг) обратно транскрибировали в соответствии с инструкциями изготовителя (набор для синтеза кДНК iScript, Bio-Rad). Количественную ПЦР проводили с использованием Platinum SYBR green SuperMix (Invitrogen) и 25 нг кДНК на реакцию. Уровни экспрессии нормализовали до экспрессии TUBB5 (тубулин, бета 5 класс I).

Как показано на ФИГ. 6, экспрессия Vegfb- и VEGF-B-связывающего рецептора, Vegfr1, увеличивается в ранах при диабете и ожирении. Эти данные показывают, что сигнальный путь VEGF-B является подходящей мишенью для лечения диабетического ранения.

Лечение антителами против VEGF-B с использованием 2H10 уменьшает накопление липидов в коже у db/db мышей

Самцов db/db и db/+ мышей (обработанных, как описано выше) использовали для анализа с Масляным красным О (ORO). Раны иссекали и моментально замораживали сухим льдом и погружали в Tissue-Tek® (Sakura) непосредственно на форме криостата. Криосрезы (12 мкм) выдерживали 12 мин в рабочем растворе масляного красного О (2,5 г масляного красного О (Sigma-Aldrich), растворенные в 400 мл 99% изопропанола, дополнительно разбавляли 6:10 в H₂O, фильтровали через 22 мкм фильтр (Corning)) и споласкивали 20 мин в потоке водопроводной воды перед их установкой. Окрашенные срезы исследовали методом светлопольной микроскопии (Axio Vision микроскоп, Carl Zeiss) при 40x увеличении и минимально снимали 4 кадра на животное. Изображения захватывали из центральной области раны. Для количественного определения капелек липидов, количество красных пикселей в каждом кадре количественно оценивали с использованием программы Axio Vision Run wizard для полного окрашивания ORO (пиксели, у.е).

Как показано на ФИГ. 7, лечение антителами против VEGF-B с использованием 2H10 снижает накопление липидов в коже после нанесения раны у самцов db/db мышей.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ заживления кожной раны у субъекта, в том числе диабетического, включающий введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B. Изобретение расширяет арсенал средств заживления ран. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Способ лечения раны или стимулирования заживления раны или предотвращения или замедления прогрессирования раны у субъекта, страдающего от раны, включающий введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, где рана является кожной раной.

2. Способ по п. 1, где рана является острой или обычной.

3. Способ по п. 1, где рана является хронической.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где субъект страдает от ожирения и/или диабета.

5. Способ лечения раны у диабетического субъекта или стимулирования или индуцирования заживления раны у диабетического субъекта, страдающего от раны, или снижения или предотвращения прогрессирования раны у диабетического субъекта, включающий введение субъекту соединения, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B.

6. Способ по любому из пп. 1-3 или 5, где соединение вводят в количестве, эффективном для оказания одного или нескольких из следующих эффектов:

(a) увеличение скорости закрытия раны по сравнению со скоростью у субъекта (например, у субъекта, страдающего от диабета и раны), которому соединение не вводили; и/или

(b) количественное увеличение закрытия раны в конкретный момент времени (например, после начала лечения) по сравнению со скоростью у субъекта (например, у субъекта, страдающего от диабета и раны), которому соединение не вводили; и/или

(c) стимуляция созревания кровеносных сосудов у субъекта в сравнении с субъектом (например, субъектом, страдающим от диабета и раны), которому соединение не вводили.

7. Способ по любому из пп. 1-3 или 5, где соединение, которое ингибирует сигнальный путь VEGF-B, связывается с VEGF-B.

8. Способ по п. 7, где соединение представляет собой миметик антитела.

9. Способ по п. 7, где соединение является белком, содержащим вариабельную область антитела, которая связывается или специфически связывается с VEGF-B и нейтрализует сигнальный путь VEGF-B.

10. Способ по п. 9, где соединение является белком, содержащим Fv.

11. Способ по п. 10, где белок выбирают из группы, состоящей из:

(i) одноцепочечного фрагмента Fv (scFv);

(ii) димерного scFv (ди-scFv); или

(iii) диатела;

(iv) триатела;

(v) тетратела;

(vi) Fab;

(vii) F(ab’)2;

(viii) Fv; или

(ix) одного из (i)-(viii), связанного с константной областью антитела, Fc или константным доменом тяжелой цепи (CH)2 и/или CH3.

12. Способ по п. 10, где белок представляет собой антитело.

13. Способ по любому из пп. 1-3 или 5, где соединение конкурентно ингибирует связывание антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, с VEGF-B.

14. Способ по любому из пп. 1-3 или 5, где соединение является белком, содержащим гуманизированную вариабельную область указанного антитела с VEGF-B.

15. Способ по п. 14, где белок содержит вариабельную область, содержащую области, определяющие комплементарность (CDR) из VH и/или VL указанного антитела с VEGF-B.

16. Способ по п. 15, где белок содержит:

(i) VH, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 25-34 из SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 49-65 из SEQ ID NO: 3; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 98-108 из SEQ ID NO: 3; и

(ii) VL, содержащую:

(a) CDR1, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 23-33 из SEQ ID NO: 4;

(b) CDR2, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 49-55 из SEQ ID NO: 4; и

(c) CDR3, содержащую последовательность, приведенную в амнокислотах 88-96 из SEQ ID NO: 4.

17. Способ по п. 16, где белок представляет собой антитело, содержащее VH, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, и VL, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6.

18. Способ по любому из пп. 1-3 или 5, где соединение представляет собой нуклеиновую кислоту, которая ингибирует или предотвращает экспрессию VEGF-B.

19. Способ по п. 18, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из антисмысловой последовательности, миРНК, РНКи, рибозима и ДНК-фермента.