АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ СВЯЗЫВАЕТСЯ С VEGF И IL-1БЕТА, И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/22 C07K16/24 C07K16/46 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к антителам к VEGF/IL-1бетa и способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

О биспецифическом антителе, связывающемся с IL-1бета и VEGF, сообщалось ранее, и оно предлагалось для лечения сосудистых заболеваний глаз (WO 2016/075034, антитело «0032»). Биспецифическое антитело 0032 к VEGF/IL-1бета представляет собой полноразмерное подобное IgG антитело с обменом доменами VH/VL в одном связывающем плече (WO 2009/080252, Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191), причем связывающее плечо расположения доменов антитела дикого типа специфически связывается с IL-1бета, и связывающее плечо, содержащее кроссинговер доменов VH/VL, специфически связывается с VEGF. VEGF-связывающее плечо содержит домены VH и VL антитела к VEGF ранибизумаба.

Мультиспецифические антитела, содержащие два паратопа в одной паре вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и вариабельного домена легкой цепи (VL), были описаны в WO 2008/027236; WO 2010/108127 и Bostrom, J., et al., Science 323 (2009) 1610-1614, а также в WO 2012/163520.

В WO 2012/163520 раскрыты биспецифические антитела, содержащие два неперекрывающихся паратопа в одной паре доменов VH и VL («DutaFabs»). Каждый паратоп биспецифического антитела из WO 2012/163520 содержит аминокислоты из CDR тяжелой цепи и из легкой цепи, причем CDR-H1 и CDR-Н3 тяжелой цепи, а также CDR-L2 легкой цепи обеспечивают первый паратоп, а CDR-L1 и CDR-L3 легкой цепи, а также CDR-H2 тяжелой цепи обеспечивают второй паратоп. Моноспецифические антитела, содержащие отдельные паратопы, выделены независимо из различных Fab-библиотек, которые варьируют или в первом, или во втором паратопе. Аминокислотные последовательности указанных моноспецифических антител определены и объединены в бипаратопной паре VH и VL. Один типичный Fab-фрагмент, специфически связывающийся с VEGF и IL-6, раскрыт в WO 2012/163520.

Существует потребность в улучшенных терапевтических антителах, которые связываются с VEGF и IL-1бета.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам к VEGF/IL-1бета и способам их применения.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее паратоп VEGF и паратоп IL-1бета в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домена VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домена VH), причем паратоп VEGF содержит аминокислотные остатки из CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела, причем паратоп IL-1бета содержит аминокислотные остатки из CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее паратоп VEGF и паратоп IL-1бета в одной родственной паре домена VL и домена VH, причем пара вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи одновременно связывается с VEGF человека и IL-1бета человека.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее паратоп VEGF и паратоп IL-1бета в одной родственной паре домена VL и домена VH, причем ни одна из аминокислот, которые содержатся в паратопе VEGF, не содержится в паратопе IL-1бета.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее паратоп VEGF и паратоп IL-1бета в одной родственной паре домена VL и домена VH, причем антитело связывается с тем же эпитопом на VEGF человека и с тем же эпитопом на IL-1бета человека, что и антитело с вариабельным доменом тяжелой цепи SEQ ID NO:11 и вариабельным доменом легкой цепи SEQ ID NO:12.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF121 человека с K_D менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем связывание Fab-фрагмента антитела с VEGF человека ингибирует связывание VEGF с VEGFR2 с IC50 менее 50 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса; и причем связывание Fab-фрагмента антитела с IL-1бета человека ингибирует связывание IL-1бета с IL-1бетаR1 с IC50 менее 30 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и К94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее домен VH, содержащий аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101, и домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Е67, D68, Q69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату. В одном варианте реализации антитело содержит паратоп VEGF, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: D55, Н56, Y58, Т61, К62, F63, 164, R66 и R83, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: 12, Y27, W27a, S27c, S27d, Е67, D68, Q69, R92, Y93, Н94 и Y96; и паратоп IL-1бета, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, K94, D95, V96, F98 и D101, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Y91.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее домен VH, содержащий аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101, и домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, S67, Н68, Е69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату. В одном варианте реализации антитело содержит паратоп VEGF, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66 и R83, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: 12, Y27, W27a, S27c, S27d, S67, Н68, Е69, R92, Y93, Н94 и Y96; и паратоп IL-1бета, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, K94, D95, V96, F98 и D101, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Y91.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, причем домен VH содержит аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, R66, R83 и K94; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, причем домен VL содержит аминокислотные остатки 12, Y49, G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 с до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 с до 15 аминокислотных замен. В одном варианте реализации антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 с до 15 аминокислотных замен, причем аминокислотные замены расположены в положениях 3-25, 36-49, 97-82 с, 84-93 или 103-113 SEQ ID NO:11; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 с до 15 аминокислотных замен, причем аминокислотные замены расположены в положениях 1, 4, 6, 8-23, 35-48, 58-66, 70-88 или 98-107 SEQ ID NO:12, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 с до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 с до 15 аминокислотных замен.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и К94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, и содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 с до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 с до 15 аминокислотных замен.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее последовательность VH с SEQ ID NO:11 и последовательность VL с SEQ ID NO:12.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи с SEQ ID NO:20 и аминокислотную последовательность легкой цепи с SEQ ID NO:19.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи с SEQ ID NO:18 и аминокислотную последовательность легкой цепи с SEQ ID NO:19.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF121 человека с K_D менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12; причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF121 человека с K_D менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12; причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и (домен VL), содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12; причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12; и причем связывание Fab-фрагмента антитела с IL-1бета человека ингибирует связывание IL-1бета с IL-1бетаR1 с IC50 менее 30 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

Один вариант реализации настоящего изобретения относится к фрагменту антитела, который связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека. Один вариант реализации настоящего изобретения относится к фрагменту биспецифического антитела, который связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека. В одном варианте реализации фрагмент антитела выбран из Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ или одноцепочечных антител, полученных из них. Один вариант реализации настоящего изобретения относится к Fab-фрагменту, который связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека. Один вариант реализации настоящего изобретения относится к Fv-фрагменту, который связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека.

Один вариант реализации настоящего изобретения относится к полноразмерному антителу IgG, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело настоящего изобретения.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяина, содержащую нуклеиновую кислоту настоящего изобретения.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту настоящего изобретения.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения антитела, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, включающий культивирование клетки-хозяина настоящего изобретения так, чтобы получить антитело.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, полученное способом настоящего изобретения.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтический состав, содержащий антитело настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело настоящего изобретения для применения в качестве лекарственного средства, в одном варианте реализации для применения в лечении сосудистого заболевания.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение антитела настоящего изобретения или фармацевтической композиции настоящего изобретения в изготовлении лекарственного средства, в одном варианте реализации лекарственного средства для лечения сосудистого заболевания.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения индивидуума, имеющего сосудистое заболевание, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела настоящего изобретения или фармацевтической композиции настоящего изобретения.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования ангиогенеза у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела настоящего изобретения или фармацевтической композиции настоящего изобретения для ингибирования ангиогенеза.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается терапевтическое антитело к VEGF/IL-1бета, которое способно связываться с его целевыми антигенами одновременно, даже когда обеспечивается в виде биспецифического Fab-фрагмента. Кроме того, антитело настоящего изобретения обеспечивает несколько ценных свойств, которые позволяют его терапевтическое применение, таких как высокая аффинность, гидрофильность и высокая стабильность. Антитело настоящего изобретения может обеспечиваться в жидких составах с высокими концентрациями с вязкостью, подходящей для применения для глаз. Антитело настоящего изобретения подходит для лечения сосудистых заболеваний глаз.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1: Схематическое изображение Fab-фрагмента антитела к VEGF/IL- 1бета настоящего изобретения. Показан вид сверху вниз родственной пары VH/VL, включающий расположение аминокислоты CDR (верхнее изображение). Домен VH показан серым, домен VL показан белым. Кроме того, указано пространственное расположение областей CDR. Области паратопа антитела настоящего изобретения выделены (нижнее изображение), причем паратоп VEGF расположен в областях H-CDR2, L-CDR1 и L-CDR2, а паратоп IL-1бета расположен в областях H-CDR1, H-CDR3 и L-CDR2.

Фигура 2: Аминокислотные последовательности доменов VH типичных антител к VEGF/IL-1бета настоящего изобретения. Указана нумерация по Кабату положения аминокислот, а также областей CDR и FR. Выделены положения аминокислот, вносящие вклад в паратоп VEGF, а также паратоп IL-1бета, как определено в примере 8.

Фигура 3: Аминокислотные последовательности доменов VL типичных антител к VEGF/IL-1бета настоящего изобретения. Указана нумерация по Кабату положения аминокислот, а также областей CDR и FR. Выделены положения аминокислот, вносящие вклад в паратоп VEGF, а также паратоп IL-1бета, как определено в примере 8.

Фигура 4: Одновременное связывание с антигенами антитела 1HVL12.85 к VEGF/IL-1бета с VEGF и IL-1бета, как оценено посредством ППР согласно примеру 5.

Фигура 5: Одновременное связывание с антигенами антитела RO 7200394 к VEGF/IL-1бета с VEGF и IL-16eTa, как оценено посредством ППР согласно примеру 5.

Фигура 6: Одновременное связывание с антигенами антитела 0032 к VEGF/IL-1бета уровня техники с VEGF и IL-16eTa, как оценено посредством ППР согласно примеру 5.

Фигура 7А: Ингибирование связывания VEGF с hVEGFR2 в присутствии антитела RO 7200394 (Fab-фрагмента), как оценено в примере 6. Ингибирование связывания с рецептором оценивали в присутствии и в отсутствие другого антигена-мишени биспецифического антитела, IL-16eTa.

Фигура 7В: Ингибирование связывания VEGF с hVEGFR2 в присутствии антитела 0032 уровня техники (полноразмерного IgG), как оценено в примере 6. Ингибирование связывания с рецептором оценивали в присутствии и в отсутствие другого антигена-мишени биспецифического антитела, IL-16eTa.

Фигура 8А: Ингибирование связывания IL-16eTa с IL-16eTaRl в присутствии антитела RO 7200394 (Fab-фрагмента), как оценено в примере 6. Ингибирование связывания с рецептором оценивали в присутствии и в отсутствие другого антигена-мишени биспецифического антитела, VEGF.

Фигура 8В: Ингибирование связывания IL-16eTa с IL-16eTaRl в присутствии антитела 0032 уровня техники (полноразмерного IgG), как оценено в примере 6. Ингибирование связывания с рецептором оценивали в присутствии и в отсутствие другого антигена-мишени биспецифического антитела, VEGF.

Фигура 9: Конкурентный ИФА, оценивающий VEGF121-связывание с VEGF-R1 в присутствии указанных антител, как оценено в примере 6.

Фигура 10: Конкурентный ИФА, оценивающий VEGF165-связывание с VEGF-R1 в присутствии указанных антител, как оценено в примере 6.

Фигура 11: Результаты хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) антител настоящего изобретения, как оценено в примере 7.

Фигура 12: Результаты хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) антитела 0032 уровня техники (пример 7).

Фигура 13: Вязкость антитела 1HVL12.85, как оценено в примере 8.

Фигура 14: Вязкость антитела RO 7200394, как оценено в примере 8.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Определения

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области. Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе будут включать множественные формы, и термины во множественном числе будут включать единственное число. Способы и техники настоящего раскрытия в общем выполняются согласно обычным способам, хорошо известным в данной области. В общем, номенклатуры, используемые вместе с, и техники биохимии, ферментологии, молекулярной и клеточной биологии, микробиологии, генетики и химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации, описанные в настоящем документе, являются хорошо известными и обычно используемыми в данной области.

Если иное не определено в настоящем документе, термин «содержащий» будет включать термин «состоящий из».

Термин «приблизительно» при использовании в настоящем документе в связи с конкретным значением (например, температурой, концентрацией, временем и другими) будет относиться к вариации +/-1% конкретного значения, к которому относится термин «приблизительно».

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и включает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют требуемую антигенсвязывающую активность.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонента его природного окружения. В некоторых вариантах реализации антитело является очищенным до более чем 95% или 99% чистоты, определяемой, например, посредством электрофореза (например, ДСН-ПААГ-электрофорез, изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или метода хроматографии (например, ионообменной или обращенно-фазовой ВЭЖХ). Обзор методов оценки чистоты антител смотрите, например, в Flatman et al., J. Chromatogr. В 848:79-87 (2007).

В контексте данного документа термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих естественные мутации или возникающих при получении препарата моноклональных антител, причем такие варианты в целом присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение «моноклональный» указывает на характеристику антитела, как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует интерпретировать как требование получения антитела каким-либо конкретным способом.

В настоящем документе термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» используются взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу сходную со структурой нативного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, определенную в настоящем документе.

«Класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, которые содержит его тяжелая цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. В некоторых вариантах реализации антитело является антителом изотипа IgG1. В некоторых вариантах реализации антитело является антителом изотипа IgG1 с мутацией P329G, L234A и L235A для снижения эффекторной функции Fc-области. В других вариантах реализации антитело является антителом изотипа IgG2. В некоторых вариантах реализации антитело является антителом изотипа IgG4 с мутацией S228P в шарнирной области для улучшения стабильности антитела IgG4. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ, и μ, соответственно. Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности своего константного домена.

В данном документе термин «Fc-область» используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Этот термин включает Fc-области с нативной последовательностью и вариантные Fc-области. В одном варианте реализации Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Рго230 до карбокси-конца тяжелой цепи. Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

«Эффекторные функции» относятся к видам биологической активности, характерным для Fc-области антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ); связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; понижающую регуляцию клеточных поверхностных рецепторов (например, В-клеточного рецептора) и активацию В-клетки.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепей антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR) (смотрите, например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). В антителе настоящего изобретения одна пара домена VH и домена VL, т.е. родственная пара VH/VL, специфически связывается с двумя его мишенями: VEGF и IL-1бета.

«DutaFab» представляет биспецифическое антитело, как раскрыто в WO 2012/163520. В DutaFab одна пара домена VH и домена VL специфически связывается с двумя различными эпитопами, причем один паратоп содержит аминокислотные остатки из CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3, а другой паратоп содержит аминокислотные остатки из CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2. DutaFab содержат два неперекрывающихся паратопа в родственной паре VH/VL и могут одновременно связываться с двумя различными эпитопами. DutaFab и способы их получения путем просмотра библиотек, содержащих моноспецифические Fab-фрагменты, раскрыты в WO 2012/163520.

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, вырабатываемого человеком или клеткой человека, или полученную из источника, отличного от человека, в котором используются репертуары человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Это определение человеческого антитела явным образом исключает гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.

«Человеческая консенсусная каркасная область» представляет собой каркасную область, которая представляет наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в наборе последовательностей каркасных областей VL или VH человеческого иммуноглобулина. В общем случае набор последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина получен из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. В общем случае подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу согласно Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), т. 1-3. В одном из вариантов реализации для VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I по Кабату и соавт., ранее. В одном из вариантов реализации для VH подгруппа представляет собой подгруппу III по Кабату и соавт., ранее.

«Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab’)₂-фрагменты; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

«Паратоп» или «антигенсвязывающий сайт», что используются взаимозаменяемо в настоящем документе, относится к части антитела, которая распознает и связывается с антигеном. Паратоп образован несколькими отдельными аминокислотными остатками из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела, расположенных в пространственной близости в третичной структуре Fv-области. Антитела настоящего изобретения содержат два «неперекрывающихся» паратопа в одной родственной паре VH/VL. Под «неперекрывающимся» понимают, что ни одна из аминокислот, которые содержатся в одном из двух паратопов, не содержится в другом паратопе.

При использовании в настоящем документе «паратоп VEGF» представляет паратоп или антигенсвязывающий сайт, который связывается с VEGF. Паратоп VEGF антитела настоящего изобретения содержит аминокислотные остатки из CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела.

При использовании в настоящем документе «паратоп IL-1бета» представляет паратоп или антигенсвязывающий сайт, который связывается с IL-1бета. Паратоп IL-1бета антитела настоящего изобретения содержит аминокислотные остатки из CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела.

Употребляемый в данном документе термин «VEGF» относится к любому нативному VEGF из любого источника, относящегося к позвоночным, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Этот термин охватывает «полноразмерный» непроцессированный VEGF, а также любую форму VEGF, полученную в результате процессинга в клетке. Этот термин также охватывает варианты VEGF природного происхождения, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность типичного VEGF человека представлена в SEQ ID NO:26.

Термины «антитело к VEGF» и «антитело, которое связывается с VEGF» относятся к антителу, которое способно связывать VEGF с достаточной аффинностью, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического средства для нацеливания на VEGF. В одном варианте реализации степень связывания антитела к VEGF с неродственным, не являющимся VEGF белком составляет менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с VEGF, что измеряется, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР). В некоторых вариантах реализации антитело, которое связывается с VEGF, имеет константу диссоциации (K_D) ≤1 нМ, ≤ 0,1 нМ или ≤ 0,01 нМ. Антитело, как говорят, «специфически связывается» с VEGF, когда антитело имеет K_D 1 мкМ или менее.

В контексте данного документа термин «IL-1бета» относится к любому нативному IL-1бета из любого источника, относящегося к позвоночным, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Этот термин охватывает «полноразмерный» непроцессированный IL-1бета, а также любую форму IL-1бета, полученную в результате процессинга в клетке. Этот термин также охватывает варианты IL-1бета природного происхождения, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность типичного IL-1бета человека представлена в SEQ ID NO:27.

Термины «антитело к IL-1бета» и «антитело, которое связывается с IL-1бета» относятся к антителу, которое способно связывать IL-1бета с достаточной аффинностью, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического средства для нацеливания на IL-1бета. В одном варианте реализации степень связывания антитела к IL-1бета с неродственным, не являющимся IL-1бета белком составляет менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с IL-1бета, что измеряется, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР). В некоторых вариантах реализации антитело, которое связывается с IL-1бета, имеет константу диссоциации (K_D) ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ или ≤ 0,03 нМ. Антитело, как говорят, «специфически связывается» с IL-1бета, когда антитело имеет 1 мкМ или менее.

Антитело настоящего изобретения «одновременно связывается с VEGF человека и IL-гбета человека», что означает, что (а) Fab-фрагмент антитела настоящего изобретения, который связывается с IL-гбета человека, (также) специфически связывается с VEGF человека, и (б) Fab-фрагмент антитела настоящего изобретения, который связывается с VEGF человека, (также) специфически связывается с IL-1бета человека. Одновременное связывание можно оценить с помощью способов, известных в данной области, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса, как описано в настоящем документе.

Термин «определяющие комплементарность области» или «CDR» при использовании в настоящем документе относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными в последовательности и содержат контактирующие с антигеном остатки. В общем случае антитела содержат шесть CDR: три в домене VH (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) и три в домене VL (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). Если не указано иное, остатки CDR и другие остатки в вариабельном домене (например, FR-остатки) пронумерованы в настоящем документе согласно системе нумерации по Кабату (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

«Каркасные области» или «FR» при использовании в настоящем документе относятся к аминокислотным остаткам вариабельного домена, отличным от остатков CDR. Каркасная область вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов каркасной области: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, аминокислотные последовательности CDR и FR обычно расположены в следующем порядке в (а) домене VH: FR1-CDR-H1-FR2- CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4; и (б) в домене VL: FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4.

Согласно системе нумерации по Кабату, как используется в настоящем документе, каркасные и CDR области расположены в следующих областях вариабельных доменов:

* в CDR-H1 дополнительные аминокислоты между положением 35b и 36 могут присутствовать, в настоящем документе называемые положениями «35с», «35d» и «35е», как показано на фигуре 2

Положения аминокислот согласно системе нумерации по Кабату, упоминаемые в настоящем документе, показаны на фигуре 2 в соответствии с аминокислотными последовательностями антител настоящего изобретения. Ссылки на аминокислоты в некотором положении в аминокислотной последовательности в настоящем документе сделаны, как хорошо известно в данной области, путем указания соответствующей аминокислоты и положения аминокислоты, например, «Е2» относится к остатку глутаминовой кислоты, расположенному в положении 2 по Кабату аминокислотной последовательности соответствующего домена антитела.

Термин «аффинность» относится к силе суммарных общих нековалентных взаимодействий между одиночным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, в настоящем документе термин «аффинность связывания» относится к присущему молекуле сродству связывания, отражающему взаимодействие между членами пары связывающихся компонентов (например, антителом и антигеном) при их соотношении 1:1. Аффинность молекулы X в отношении ее партнера Y обычно может быть представлена константой диссоциации (K_D)- Аффинность можно измерять с помощью общепринятых методов, известных в данной области техники, включая описанные в данном документе. Конкретные иллюстративные и типичные варианты реализации для измерения аффинности связывания описаны в настоящем документе.

Термин «эпитоп» означает сайт на антигене, или белковый, или небелковый, с которым связывается антитело. Эпитопы могут быть образованы как из участков заменимых аминокислот (линейный эпитоп), так и содержать незаменимые аминокислоты (конформационный эпитоп), например, находятся в пространственной близости из-за сворачивания антигена, т.е. за счет третичного сворачивания белкового антигена. Линейные эпитопы обычно все еще связаны антителом после воздействия на белковый антиген денатурирующих средств, тогда как конформационные эпитопы обычно разрушаются при обработке денатурирующими средствами. Эпитоп содержит по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

Отбор антител, связывающихся с конкретным эпитопом (т.е. тех, которые связываются с одним и тем же эпитопом), можно проводить с помощью способов, обычных для данной области, таких как, например, помимо прочего, аланиновое сканирование, пептидные блоты (смотрите Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463), анализ расщепления пептидов, удаление эпитопа, экстракция эпитопа, химическая модификация антигенов (смотрите Prot. Sci. 9 (2000) 487-496) и перекрестный конкурентный анализ (смотрите «Antibodies», Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY).

Основанное на структуре антигена профилирование антител (ASAP), также известное как профилирование с помощью модификации (MAP), обеспечивает сохранение множества моноклональных антител, специфически связывающихся с VEGF или IL-16eTa, на основе профиля связывания каждого из антител из множества с химически или ферментативно модифицированными поверхностями антигена (см., например, US 2004/0101920). Антитела в каждой группе связываются с одним и тем же эпитопом, который может быть уникальным эпитопом или явно отличающимся, или частично перекрывающимся с эпитопом, представленным другой группой.

Также конкурентное связывание можно использовать для легкого определения того, связывается ли антитело с одним и тем же эпитопом VEGF или IL-16eTa, или конкурирует в отношении связывания с ним, что и эталонное антитело настоящего изобретения. Например, «антитело, которое связывается с теми же эпитопами на VEGF и IL-16eTa», что и эталонное антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание эталонного антитела с его антигенами в соответствующем конкурентном анализе на 50% или более, и, наоборот, эталонное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в соответствующем конкурентном анализе на 50% или более. Также в качестве примера, для определения того, связывается ли антитело с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, эталонному антителу позволяют связываться с VEGF или IL-1бета при условиях насыщения. После удаления избытка эталонного антитела оценивают способность интересующего антитела связываться с VEGF или IL-1бета. Если интересующее антитело способно связываться с VEGF или IL-1бета после насыщения соединения эталонного антитела, можно сделать вывод, что интересующее антитело связывается с другим эпитопом относительно эталонного антитела. Но если интересующее антитело не способно связываться с VEGF или IL-1бета после насыщения соединения эталонного антитела, тогда интересующее антитело может связываться с тем же эпитопом, что и эпитоп, связываемый эталонным антителом. Для подтверждения того, связывается ли интересующее антитело с тем же эпитопом или только мешает связыванию по стерическим причинам, можно использовать рутинные эксперименты (например, анализы мутаций и связывания пептидов при помощи ИФА, РИА, поверхностного плазмонного резонанса, цитометрии в потоке или любого другого количественного или качественного анализа связывания антител, доступного в данной области). Этот анализ можно проводить в двух установках, т.е. с обоими антителами, являющимися насыщающим антителом. Если в обеих установках только первое (насыщающее) антитело способно связываться с VEGF или IL-1бета, тогда можно сделать вывод, что интересующее антитело и эталонное антитело конкурируют в отношении связывания с VEGF или IL-1бета.

В некоторых вариантах реализации два антитела, как считается, связываются с одним и тем же или перекрывающимися эпитопами, если 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток одного антитела ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, меньшей мере на 75%, меньшей мере на 90% или даже 99% или более, что измерено в анализе конкурентного связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502).

В некоторых вариантах реализации два антитела, как считается, связываются с одним и тем же эпитопом, если по существу все аминокислотные мутации в антигене, которые снижают или исключают связывание одного антитела, также снижают или исключают связывание с другим. Два антитела, как считается, имеют «перекрывающиеся эпитопы», если только подмножество аминокислотных мутаций, которые снижают или исключают связывание одного антитела, снижают или исключают связывание с другим.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно эталонной полипептидной последовательности определяется как процентная доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей с целью выравнивания. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществлять различными способами, которые известны в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) или программный пакет FASTA. Специалисты в данной области техники могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Альтернативно, значения процента идентичности можно получить с помощью компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана Genentech, Inc., а исходный код был подан вместе с пользовательской документацией в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован под номером регистрации авторского права США TXU510087 и описан в WO 2000/005319.

Если не указано иное, для целей настоящего документа, однако, значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают с помощью программы ggsearch пакета FASTA версии 36.3.8 с или более поздней с матрицей сравнения BLOSUM50. Программный пакет FASTA был создан W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), «Improved Tools for Biological Sequence Analysis», PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) «Effective protein sequence comparison)) Meth. Enzymol. 266:227- 258; и Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36, и является общедоступным на www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta www2/fasta down.shtml или www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta. Альтернативно, публичный сервер, доступный на fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi, можно использовать для сравнения последовательностей, используя программу ggsearch (global protein:protein) и параметры по умолчанию (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup=2) для обеспечения выполнения общего, а не местного, выравнивания. Процент идентичности аминокислот дан в заголовке выходных данных выравнивания.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты» или «полинуклеотид» включает любое соединение и/или вещество, которое содержит полимер из нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из основания, в частности, пуринового или пиримидинового основания (т.е. цитозина (С), гуанина (G), аденина (А), тимина (Т) или урацила (U)), сахара (т.е. дезоксирибозы или рибозы) и фосфатной группы. Часто молекула нуклеиновой кислоты описана по последовательности оснований, при этом указанные основания представляют первичную структуру (линейную структуру) молекулы нуклеиновой кислоты. Последовательность оснований, как правило, представлена от 5' к 3'. В данном документе термин молекула нуклеиновой кислоты охватывает дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), включая, например, комплементарную ДНК (кДНК) и геномную ДНК, рибонуклеиновую кислоту (РНК), в частности, матричную РНК (мРНК), синтетические формы ДНК и РНК и смешанные полимеры, содержащие две или более из этих молекул. Молекула нуклеиновой кислоты может быть линейной или кольцевой. Кроме того, термин молекула нуклеиновой кислоты включает как смысловые, так и антисмысловые цепи, а также одноцепочечные и двухцепочечные формы. Помимо этого, описанная в данном документе молекула нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотиды природного и неприродного происхождения. Примеры нуклеотидов неприродного происхождения включают модифицированные нуклеотидные основания с дериватизированными сахарами, или фосфатными остовными связями, или химически модифицированными остатками. Молекулы нуклеиновых кислот также включают молекулы ДНК и РНК, подходящие в качестве вектора для управления экспрессией антитела по изобретению in vitro и/или in vivo, например, в организме хозяина или пациента. Такие ДНК (например, кДНК) или РНК (например, мРНК) векторы могут быть немодифицированными или модифицированными. Например, мРНК может быть химически модифицирована для повышения стабильности РНК-вектора и/или экспрессии кодируемой молекулы так, чтобы мРНК можно было вводить субъекту для генерации антител in vivo (смотрите, например, Stadler ert al, Nature Medicine 2017, опубликованную онлайн 12 июня 2017 г., doi:10.1038/nm.4356 или ЕР 2101823 В1).

«Выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат эту молекулу нуклеиновой кислоты, но при этом молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в хромосомном положении, которое отличается от ее природного хромосомного положения.

«Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело» относится к одной или более молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая молекулы нуклеиновых кислот в одном векторе или отдельных векторах и молекулы нуклеиновых кислот, присутствующие в одной или более локациях в клетке-хозяине.

В контексте данного документа термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной увеличивать число копий другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Этот термин включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую его внесли. Некоторые векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе «экспрессионными векторами».

Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была внесена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформантов» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированные клетки и полученное от них потомство вне зависимости от числа пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновой кислоты и может содержать мутации. Сюда включено мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, в отношении которых проводится скрининг или отбор изначально трансформированных клеток.

Термин «фармацевтическая композиция» или «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится в форме, обеспечивающей эффективность биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительные компоненты, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому предполагается вводить фармацевтическую композицию.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции или фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается этим, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.

«Эффективное количество» средства, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желательного терапевтического или профилактического результата.

«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваются этими, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак, лошадей), приматов (например, людей и приматов, не являющихся человеком, таких, как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). Согласно определенным вариантам реализации индивидуум или субъект представляет собой человека.

В настоящем документе термин «лечение» (и его грамматические варианты, такие как «лечить» или «лечащий») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения заболевания у индивидуума, которого лечат, и может проводиться как для профилактики, так и при течении клинической патологии. Необходимые эффекты лечения включают, но не ограничиваются этим, предотвращение появления или повторного появления заболевания, смягчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых вариантах реализации антитела согласно настоящему изобретению используют для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.

Термин «заболевание глаз» при использовании в настоящем документе включает любое заболевание глаз, связанное с патологическим ангиогенезом и/или атрофией. Заболевание глаз может характеризоваться измененной или нерегулируемой пролиферацией и/или инвазией новых кровеносных сосудов в структуры ткани глаза, такой как сетчатка или роговица. Заболевание глаз может характеризоваться атрофией ткани сетчатки (фоторецепторов и лежащего в основе пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и хориокапилляров). Неограничивающие заболевания глаз включают, например, ВМД (например, влажную ВМД, сухую ВМД, промежуточную ВМД, запущенную ВМД и географическую атрофию (ГА)), макулярную дегенерацию, макулярный отек, ДМО (например, фокальный, нецентральный ДМО и диффузный, с вовлечением центрального отдела сетчатки ДМО), ретинопатию, диабетическую ретинопатию (ДР) (например, пролиферативную ДР (ПДР), непролиферативную ДР (НПДР) и высотную ДР), другие связанные с ишемией ретинопатии, РН, окклюзию вены сетчатки (ОВС) (например, формы, связанные с центральной веной (ОЦВС) и ветвями вены (ОВВС)), ХНВ (например, миопическую ХНВ), неоваскуляризацию роговицы, заболевания, связанные с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризацию сетчатки, заболевания, связанные с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, центральную серозную ретинопатию (ЦСР), патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаза, СЭВРП, болезнь Коутса, болезнь Норри, нарушения сетчатки, связанные с синдромом остеопороза-псевдоглиомы (ОППГ), субконъюнктивальное кровоизлияние, покраснение радужки, неоваскулярное заболевание глаз, неоваскулярную глаукому, пигментный ретинит (ПР), гипертоническую ретинопатию, ангиоматозную пролиферацию сетчатки, макулярную телеангиэктазию, неоваскуляризацию радужной оболочки, внутриглазную неоваскуляризацию, дегенерацию сетчатки, кистозный макулярный отек (КМО), васкулит, отек диска зрительного нерва, ретинит, включая, помимо прочего, ЦМВ-ретинит, меланому глаз, бластому сетчатки, конъюнктивит (например, инфекционный конъюнктивит и неинфекционный (например, аллергический) конъюнктивит), наследственный амавроз Лебера (также известный как наследственный амавроз Лебера или НАЛ), увеит (включая инфекционный и неинфекционный увеит), хориоидит (например, мультифокальный хориоидит), гистоплазмоз глаз, блефарит, синдром сухого глаза, травматическое повреждение глаз, болезнь Шегрена и другие офтальмологические заболевания, причем заболевание или болезнь связана с неоваскуляризацией глаз, транссудацией и/или отеком сетчатки или атрофией сетчатки. Дополнительные типичные заболевания глаз включают ретиношизис (аномальное расщепление нейросенсорных слоев сетчатки), заболевания, связанные с покраснением радужки (неоваскуляризация угла передней камеры), и заболевания, вызванные атипичной пролиферацией сосудисто-волокнистой или волокнистой ткани, включая все формы пролиферативной витреоретинопатии. Типичные заболевания, связанные с неоваскуляризацией роговицы, включают, помимо прочего, эпидемический кератоконъюнктивит, дефицит витамина А, чрезмерное ношение контактных линз, атопический кератит, верхний лимбальный кератит, сухой кератит крыловидной плевы, синдром Шегрена, розацею, фликтенулезный конъюнктивит, сифилис, микобактериальные инфекции, липидную дегенерацию, химические ожоги, бактериальные язвы, грибковые язвы, инфекции простого герпеса, инфекции опоясывающего герпеса, инфекции простейшими, саркому Капоши, язву Мурена, маргинальную дегенерацию Терриена, краевую дистрофию роговицы, ревматоидный артрит, системную волчанку, полиартериит, травму, саркоидоз Вегенера, склерит, синдром Стивенса-Джонсона, перифигоидную радиальную кератотомию и отторжение роговичного трансплантата. Типичные заболевания, связанные с хориоидальной неоваскуляризацией и дефектами в сосудистой системе сетчатки, включая повышенную транссудацию, аневризмы и капиллярную закупорку, включают, помимо прочего, диабетическую ретинопатию, макулярную дегенерацию, серповидноклеточную анемию, саркоид, сифилис, эластическую псевдоксантому, болезнь Педжета, окклюзию вены, окклюзию артерии, обструктивную болезнь сонной артерии, хронический увеит/витрит, микобактериальные инфекции, болезнь Лайма, системную красную волчанку, ретинопатию недоношенных, отек сетчатки (включая макулярный отек), болезнь Илза, болезнь Бехчета, инфекции, вызывающие ретинит или хориоидит (например, мультифокальный хориоидит), предполагаемый гистоплазмоз глаз, болезнь Беста (врожденную макулярную дегенерацию), миопию, ямки диска зрительного нерва, pars planitis, отслоение сетчатки (например, хроническое отслоение сетчатки), синдром повышенной вязкости крови, токсоплазмоз, травму и осложнения после лазерной коррекции.

Типичные заболевания, связанные с атрофией тканей сетчатки (фоторецепторов и лежащего в основе ПЭС), включают, помимо прочего, атрофическую или неэкссудативную ВМД (например, географическую атрофию или запущенную сухую ВМД), атрофию желтого пятна (например, атрофию, связанную с неоваскуляризацией и/или географической атрофией), диабетическую ретинопатию, болезнь Штаргардта, дистрофию глазного дна Сорсби, ретиношизис и пигментный ретинит.

Термин «вкладыш в упаковку» используется для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях относительно использования таких терапевтических продуктов.

2. Подробное описание вариантов реализации настоящего изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение основано, отчасти, на обеспечении биспецифических антител для терапевтического применения. В некоторых аспектах обеспечиваются антитела, которые связываются с VEGF человека и IL-1бета человека. Антитела настоящего изобретения пригодны, например, для диагностики или лечения сосудистых заболеваний, например, сосудистых заболеваний глаз.

А. Типичные антитела, которые связываются с VEGF человека и IL-1бета человека

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитела, которые связываются с VEGF человека и IL-1бета человека. В одном аспекте обеспечиваются выделенные антитела, которые связываются с VEGF человека и IL-1бета человека. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются с VEGF человека и IL-гбета человека.

В некоторых аспектах обеспечивается антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит паратоп VEGF (т.е. антигенсвязывающий сайт, который связывается с VEGF) и паратоп IL-1бета (т.е. антигенсвязывающий сайт, который связывается с IL-1бета) в одной родственной паре домена VL и домена VH, причем

• паратоп VEGF содержит аминокислотные остатки из CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела, причем паратоп IL-1бета содержит аминокислотные остатки из CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела; и/или

• пара вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи одновременно связывается с VEGF человека и IL-1бета человека; и/или

• ни одна из аминокислот, которые содержатся в паратопе VEGF, не содержится в паратопе IL-1бета; и/или

• ни одна из аминокислот, которые содержатся в паратопе IL-1бета, не содержится в паратопе VEGF; и/или

• антитело связывается с тем же эпитопом на VEGF человека и с тем же эпитопом на IL-1бета человека, что и антитело с вариабельным доменом тяжелой цепи с SEQ ID NO: 11 и вариабельным доменом легкой цепи с SEQ ID NO: 12; и/или

• Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF 121 человека с K_D менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса; и/или

• Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С; и/или

• Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света; и/или

• связывание Fab-фрагмента антитела с VEGF человека ингибирует связывание VEGF с VEGFR2 с IC50 менее 50 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса; и причем связывание Fab-фрагмента антитела с IL-1бета человека ингибирует связывание IL-1бета с IL-1бетаR1 с IC50 менее 30 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее домен VH, содержащий аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101, и домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Е67, D68, Q69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату. В одном варианте реализации антитело содержит паратоп VEGF, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66 и R83, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: 12, Y27, W27a, S27c, S27d, Е67, D68, Q69, R92, Y93, Н94 и Y96; и паратоп IL-1бета, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, К94, D95, V96, F98 и D101, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Y91.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, причем домен VH содержит аминокислотные остатки Е2, G26, V28, К30, W31, N35b, D35c, K52a, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, причем домен VL содержит аминокислотные остатки 12, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Е67, D68, Q69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, причем домен VH содержит аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, R66, R83 и K94; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, причем домен VL содержит аминокислотные остатки 12, Y49, G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотными заменами; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотными заменами.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотными заменами, причем аминокислотные замены расположены в положениях 3-25, 36-49, 97-82 с, 84-93 или 103-113 SEQ ID NO:11; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотными заменами, причем аминокислотные замены расположены в положениях 1, 4, 6, 8-23, 35-48, 58-66, 70-88 или 98-107 SEQ ID NO:12, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотными заменами; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотными заменами.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, и содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотными заменами; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотными заменами.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее домен VH, имеющий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11. В некоторых аспектах последовательность VH, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции в сравнении с эталонной последовательностью, но антитело, которое связывается с VEGF человека и II-1бета человека, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с VEGF человека и IL-1бета человека. В некоторых аспектах была проведена замена, вставка и/или делеция в общей сложности 1-10 аминокислот в SEQ ID NO:11. В некоторых аспектах замены, вставки или делеции находятся в областях за пределами CDR (т.е. в FR). В конкретном аспекте VH содержит (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13; (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14; и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело, содержащее домен VL, имеющий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12. В некоторых аспектах последовательность VL, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции в сравнении с эталонной последовательностью, но антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с VEGF человека и IL-1бета человека. В некоторых аспектах была проведена замена, вставка и/или делеция в общей сложности 1-10 аминокислот в SEQ ID NO:12. В некоторых аспектах замены, вставки или делеции находятся в областях за пределами CDR (т.е. в FR). В конкретном аспекте VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

В другом аспекте обеспечивается антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, причем антитело содержит последовательность VH, как в любом из аспектов, представленных выше, и последовательность VL, как в любом из аспектов, представленных выше. В одном аспекте антитело содержит последовательности VH и VL в SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, соответственно, включая посттрансляционные модификации этих последовательностей.

В другом аспекте обеспечивается антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, причем антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепь SEQ ID NO:20 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:19.

В другом аспекте обеспечивается антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, причем антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепь SEQ ID NO:18 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:19.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, согласно любому из вышеуказанных аспектов, является моноклональным антителом. В одном аспекте антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, является фрагментом антитела, например, фрагментом Fv, Fab, Fab', scFv, диателом или F(ab')₂. В другом аспекте антитело представляет собой полноразмерное антитело.

В дополнительном аспекте антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-гбета человека, согласно любому из вышеуказанных аспектов может включать любой из признаков, по отдельности или в комбинации, как описано в разделах 1-7 ниже.

1. Аффинность антител

В некоторых вариантах реализации антитело, представленное в настоящем документе, связывается с VEGF с константой диссоциации (K_D) ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ или ≤ 0,01 нМ. В некоторых вариантах реализации антитело, которое связывается с IL-1бета, имеет константу диссоциации (K_D) ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ или ≤ 0,03 нМ.

В одном аспекте K_D определяют, используя анализ методом поверхностного плазмонного резонанса BIACORE®.

Например, K_D антитела, связывающегося с VEGF, измеряют в анализе с применением BIACORE®-2000 или BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси), выполняемом при 25°С с иммобилизованным VEGF121 с чипами С1 при ~10 единицах ответа (ЕО). Для измерений кинетики двукратные серийные разведения Fab (от 1,2 нМ до 100 нМ) вводят в HBS-P+(10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl рН 7,4, 0,05% поверхностно-активного вещества Р20) при 25°С при скорости потока приблизительно 30 мкл/мин. Скорости ассоциации (k_acc.) и скорости диссоциации (k_дисс.) рассчитывают, используя простую один-к-одному модель связывания Лэнгмюра (оценочное программное обеспечение BIACORE®, версия 3.2), путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Ко) рассчитывали как соотношение k_дисс./k_acc.Смотрите, например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999).

Например, K_D антитела, связывающегося с IL-1бета, измеряют в анализе с применением BIACORE®-2000 или BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси), выполняемом при 25°С с иммобилизованным биспецифическим антителом с чипами С1 при -20 единицах ответа (ЕО). Для измерений кинетики двукратные серийные разведения IL-1бета человека (от 0,74 нМ до 60 нМ) вводят в HBS-P+(10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl рН 7,4, 0,05% поверхностно-активного вещества Р20) при 25°С при скорости потока приблизительно 30 мкл/мин. Скорости ассоциации (касс.) и скорости диссоциации (кдисс.) рассчитывают, используя простую один-к-одному модель связывания Лэнгмюра (оценочное программное обеспечение BIACORE, версия 3.2), путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (K_D) рассчитывали как соотношение кдиссАасс. Смотрите, например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999).

2. Фрагменты антител

В некоторых аспектах антитело, обеспеченное в настоящем документе, представляет собой фрагмент антитела.

В одном аспекте фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab, Fab', Fab'-SH или F(ab')₂, в частности Fab-фрагмент. Расщепление интактных антител папаином позволяет получить два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, каждый из которых содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепи (VH и VL, соответственно) и также константный домен легкой цепи (CL) и первый константный домен тяжелой цепи (СН1). Таким образом, термин «Fab-фрагмент» относится к фрагменту антитела, содержащему легкую цепь, содержащую домен VL и домен CL, и фрагмент тяжелой цепи, содержащий домен VH и домен СН1. «Fab'-фрагменты» отличаются от Fab-фрагментов добавлением остатков на карбоксильном конце домена СН1, содержащих один или более остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH представляют собой Fab'-фрагменты, в которых остаток(ки) цистеина константных доменов несет(ут) свободную тиольную группу. Обработка пепсином приводит к получению Е(ab’)₂-фрагмента, который имеет два антигенсвязывающих сайта (два Fab-фрагмента) и часть Fc-области. Обсуждение фрагментов Fab и F(ab')₂, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и имеющих увеличенное время полужизни in vivo, смотрите в патенте США №5869046.

Фрагменты антител можно получать различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также рекомбинантную выработку рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli, СНО), как описано в настоящем документе.

3. Термическая стабильность

Антитела, представленные в настоящем документе, характеризуются превосходной термической стабильностью. В некоторых вариантах реализации Fab-фрагмент антитела, представленный в настоящем документе, характеризуется температурой начала агрегации более 70°С. В некоторых вариантах реализации Fab-фрагмент антитела, представленный в настоящем документе, характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света.

4. Антитела, полученные из библиотек

В некоторых аспектах антитело, представленное в настоящем документе, получено из библиотеки. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть выделены путем скрининга комбинаторных библиотек антител с необходимой активностью или свойствами. Методы скрининга комбинаторных библиотек рассмотрены, например, в Lerner et al. в Nature Reviews 16:498-508 (2016). Например, в данной области техники известны различные способы получения библиотек фагового дисплея и скрининг таких библиотек в отношении антител, обладающих необходимыми характеристиками связывания. Такие методы рассмотрены, например, в Frenzel et al. в mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. в Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) и Zhao et al. в Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016), а также в Hoogenboom et al. в Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) и в Marks and Bradbury в Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003).

В некоторых способах на основе фагового дисплея репертуары генов VH и VL по отдельности клонируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и случайным образом рекомбинируют в фаговых библиотеках, которые затем можно подвергать скринингу в отношении антигенсвязывающего фага, как описано в Winter et al. в Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994). Как правило, фаг представляет фрагменты антител в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv) или Fab-фрагментов. Библиотеки из иммунизированных источников позволяют получать антитела с высокой аффинностью к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. В альтернативном варианте можно клонировать наивный репертуар (например, от человека) для получения единого источника антител к широкому спектру не собственных, а также собственных антигенов без какой-либо иммунизации, как описано в Griffiths et al. в EMBO Journal, 12: 725-734 (1993). Кроме того, наивные библиотеки также можно получать синтетически, клонируя неперестроенные V-генные сегменты из стволовых клеток и используя ПЦР-праймеры, содержащие случайную последовательность, для кодирования высоковариабельных областей CDR3 и осуществления перестройки in vitro, как описано в Hoogenboom and Winter в Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, в которых описаны фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например: патенты США №№5750373; 7985840; 7785903 и 8679490, а также публикации патентов США №№2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 и 2007/0292936.

Дополнительные примеры методов, известных в данной области для скрининга комбинаторных библиотек для антител с необходимой активностью или активностями, включают рибосомный и мРНК дисплей, а также методы для дисплея и выбора антител на бактериях, клетках млекопитающих, клетках насекомых или клетках дрожжей. Методы для дисплея поверхности дрожжей рассмотрены, например, в Scholler et al. в Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) и в Cherf et al. в Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015), a также в Zhao et al. в Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012). Методы рибосомного дисплея описаны, например, в Не et al. в Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) и в Hanes et al. в PNAS 94:4937-4942 (1997).

Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, считаются в данном документе человеческими антителами или фрагментами человеческих антител.

5. Мультиспецифические антитела

В некоторых аспектах предложенное в данном документе антитело представляет собой мультиспецифическое антитело. «Мультиспецифические антитела» представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности связывания для по меньшей мере двух различных сайтов, т.е. различных эпитопов на различных антигенах или различных эпитопов на одном и том же антигене. В некоторых аспектах мультиспецифическое антитело имеет три или более специфичности связывания.

Мультиспецифические антитела с тремя или более специфичностями связывания, содержащие антитела, обеспеченные в настоящем документе, могут быть представлены в асимметричной форме с кроссовером доменов в одном или более связывающих плечах одной и той же специфичности к антигену, т.е. путем замены доменов VH/VL (см., например, WO 2009/080252 и WO 2015/150447), доменов CH1/CL (см., например, WO 2009/080253) или полных Fab-фрагментов (см., например, WO 2009/080251, WO 2016/016299, также см. Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, и Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20). Различные дополнительные молекулярные форматы для мультиспецифических антител известны в данной области и включены в настоящий документ (см., например, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

6. Варианты антител

В некоторых аспектах предусмотрены варианты аминокислотной последовательности антител, представленных в настоящем документе. Например, может существовать потребность в изменении аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела можно получать путем внесения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или с помощью пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечной конструкции можно осуществлять любую комбинацию делеций, вставок и замен при условии, что конечная конструкция обладает необходимыми характеристиками, например, связывания антигена.

В некоторых аспектах предложены варианты антитела, содержащие одну или более аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для заместительного мутагенеза, включают CDR и FR. Консервативные замены показаны в таблице ниже под заголовком «предпочтительные замены». Более существенные изменения представлены в таблице 1 под заголовком «типовые замены», и как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислотных боковых цепей. Аминокислотные замены можно вносить в представляющее интерес антитело и проводить скрининг полученных продуктов в отношении необходимой активности, например, сохранения/улучшения связывания антигена, снижения иммуногенности или улучшения АЗКЦ или КЗЦ.

Аминокислоты можно разделить на группы в соответствии с общими свойствами боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены подразумевают замену представителя одного из этих классов представителем другого класса.

Один тип варианта замены включает замену одного или более остатков гипервариабельной области родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный вариант(ы), выбранный для дальнейшего изучения, будет иметь модификации (например, улучшения) определенных биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) по сравнению с родительским антителом и/или будет иметь по существу сохраненные некоторые биологические свойства исходного антитела. Типовой заместительный вариант представляет собой антитело с созревшей аффинностью, которое удобно получать, например, используя методики созревания аффинности на основе фагового дисплея, такие как описанные в данном документе. Вкратце, один или более, остатков CDR подвергают мутации и вариантные антитела представляют на поверхности фага и проводят скрининг в отношении конкретного вида биологической активности (например, аффинности связывания).

Модификации (например, замены) в CDR можно осуществить, например, с целью улучшения аффинности антитела. Такие изменения могут быть сделаны в «горячих точках» CDR, т.е. в остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и/или в остатках, которые контактируют с антигеном, при этом испытывают аффинность связывания полученного варианта VH или VL. Созревание аффинности путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, в Hoogenboom et al. в Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001). В некоторых аспектах созревания аффинности в вариабельные гены, выбранные для созревания, вносят разнообразие любым из ряда способов (например, ПЦР с внесением ошибок, перетасовки цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). Затем создают вторичную библиотеку. После этого библиотеку подвергают скринингу для идентификации любых вариантов антител с необходимой аффинностью. Другой способ для внесения разнообразия включает подходы, направленные на CDR, в которых несколько остатков CDR (например, 4-6 остатков подряд) являются рандомизированными. Остатки CDR, вовлеченные в связывание антигена, могут быть конкретно идентифицированы, например, с использованием сканирующего аланином мутагенеза или моделирования. В частности, мишенями часто являются CDR-H3 и CDR-L3.

В некоторых аспектах замены, вставки или делеции могут находиться в одной или более CDR при условии, что такие изменения по существу не снижают способность антитела связывать антиген. Например, в CDR можно проводить консервативные изменения (например, консервативные замены, предложенные в данном документе), которые существенно не снижают аффинность связывания. Такие изменения могут, например, находиться за пределами контактирующих с антигеном остатков в CDR. В некоторых вариантных последовательностях VH и VL, представленных выше, каждая CDR остается неизменной или содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

Удобный способ выявления остатков или областей антитела, которые могут быть мишенями для мутагенеза, называется «аланин-сканирующим мутагенезом», описанным Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В этом способе остаток или группу целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином) для определения влияния на взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены можно вносить в аминокислотные положения, демонстрирующие функциональную чувствительность к исходным заменам. В альтернативном или дополнительном варианте для выявления точек контакта между антителом и антигеном можно использовать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело. Такие контактные остатки и соседние остатки можно использовать для нацеливания или удалять из кандидатов для замены. Можно проводить скрининг вариантов, чтобы определить, имеют ли они необходимые свойства.

Вставки аминокислотных последовательностей включают амино- и/или карбокси-концевые слияния с диапазоном длины от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или некоторого количества аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионила. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние с N- или С-концом антитела с ферментом (например, для терапии ADEPT (антитело-направленной ферментной пролекарственной терапии)) или полипептидом, который увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки.

а. Варианты по гликозилированию

В некоторых аспектах антитело, предложенное в данном документе, изменяют с целью увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования к антителу удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности так, чтобы создать или удалить один или более сайтов гликозилирования.

Если антитело содержит Fc-область, можно изменять присоединенный к ней олигосахарид. Нативные антитела, вырабатываемые клетками млекопитающих, обычно содержат разветвленный биантеннарный олигосахарид, который обычно присоединен посредством N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-области. Смотрите, например, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Олигосахарид может содержать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стебле» биантеннарной олигосахаридной структуры. В некоторых аспектах модификации олигосахарида в антителе по данному изобретению можно осуществлять с целью создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.

В одном аспекте предлагаются варианты антител, содержащие нефукозилированный олигосахарид, т.е. олигосахаридную структуру с недостаточным количеством фукозы, присоединенной (непосредственно или косвенно) к Fc-области. Такой нефукозилированный олигосахарид (также называемый «афукозилированный» олигосахарид), в частности, представляет N-связанный олигосахарид с недостаточным количеством фукозного остатка, присоединенного к первой GlcNAc в основе биантенарной олигосахаридной структуры. В одном аспекте предлагаются варианты антитела, содержащие увеличенную долю нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с нативным или родительским антителом. Например, доля нефукозилированных олигосахаридов может составлять по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 80% или даже приблизительно 100% (т.е. нет фукозилированных олигосахаридов). Процент нефукозилированных олигосахаридов представляет (среднее) количество олигосахаридов без фукозных остатков относительно суммы всех олигосахаридов, присоединенных к Asn 297 (например, сложных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), согласно результатам измерения методом масс-спектрометрии ВП-МАЛДИ, например, как описано в WO 2006/082515. Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному в позиции 297 в области Fc (согласно нумерации ЕС остатков области Fc); при этом Asn297 также может быть расположен на около ±3 аминокислот выше или ниже позиции 297, т.е. между позициями 294 и 300, вследствие незначительных вариаций последовательностей в антителах. Такие антитела, содержащие увеличенную долю нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области, могут иметь улучшенное связывание с рецептором FcγRIIIa и/или улучшенную эффекторную функцию, в частности, улучшенную функцию АЗКЦ. См., например, US 2003/0157108; US 2004/0093621.

Примеры клеточных линий, способных производить антитела с уменьшенным дефукозилированием, включают клетки СНО Lec13 с недостаточностью в отношении фукозилирования белка (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108 и WO 2004/056312, особенно в Примере 11), а также нокаутированные клеточные линии, таких как нокаутированные по гену альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, клетки СНО (см., например, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и WO 2003/085107), или клетки со сниженной или аннулированной активностью синтеза GDP-фукозы или транспортного белка (см., например, US 2004259150, US 2005031613, US 2004132140, US 2004110282).

В дополнительном аспекте предложены варианты антител с раздвоенными олигосахаридами, например, в которых биантеннарный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, разделен пополам GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь сниженный уровень фукозилирования и/или улучшенную функцию АЗКЦ, как описано выше. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878.

Согласно данному изобретению также предложены варианты антител с по меньшей мере одним остатком галактозы в олигосахариде, прикрепленном к Fc-области. Такие варианты антител могут иметь улучшенную функцию КЗЦ. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764.

б. Варианты по Fc-области

В определенных аспектах одну или более аминокислотных модификаций можно вносить в Fc-область антитела, предложенного в данном документе, с получением, таким образом, варианта по Fc-области. Вариант по Fc-области может содержать последовательность человеческой Fc-области (например, Fc-области человеческого IgG₁ IgG₂, IgG₃ или IgG₄), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одной или более аминокислотных положениях.

Согласно некоторым аспектам настоящее изобретение предусматривает вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желательным кандидатом для вариантов применения, в которых важен период полужизни антитела в условиях in vivo, но при этом определенные эффекторные функции (такие как комплементзависимая цитотоксичность (КЗЦ) и антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ)) не нужны или вредны. Цитотоксические анализы могут быть проведены in vitro и/или in vivo для подтверждения восстановления/ослабления активности CDC и/или АЗКЦ. Например, исследования связывания рецептора Fc (FcR) могут быть проведены, чтобы убедиться в том, что антитело не способно к связыванию FcγR (следовательно, вероятно, не обладает АЗКЦ-активностью), но сохраняет способность связывать FcRn. Первичные клетки для опосредования АЗКЦ, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках обобщенно описана в Таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Неограничивающие примеры методов in vitro анализа для оценки АЗКЦ-активности представляющей интерес молекулы, описаны в патенте США №5500362 (смотрите, например, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) и Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5821337 (смотрите Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). В альтернативном варианте можно использовать нерадиоактивные методы анализа (смотрите, например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности для проточной цитометрии ACTI™ (CellTechnology, Inc., Маунтин-Вью, Калифорния); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96^® (Promega, Мадисон, Висконсин). Эффекторные клетки, подходящие для такого анализа, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте АЗКЦ-активность представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, в животной модели, такой как раскрыта в Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Также можно проводить анализ связывания C1q, чтобы подтвердить, что антитело не способно связывать C1q и, следовательно, у него отсутствует КЗЦ-активность. См., например, анализ связывания C1q и С3с ИФА в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно проводить исследование КЗЦ (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Определение связывания с FcRn и in vivo клиренса/времени полужизни также можно проводить, используя методы, известные в данной области техники (смотрите, например, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929 A1).

Антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или более остатков Fc-области 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (патент США №6737056). Такие Fc-мутанты включают Fc-мутантов с заменами в двух или более аминокислотных положениях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый Fc-мутант «DANA» с заменой остатков 265 и 297 аланином (патент США №7332581).

Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR. (Смотрите, например, патент США №6737056, WO 2004/056312 и Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые улучшают АЗКЦ, например, с заменами в позициях 298, 333 и/или 334 Fc-области (нумерация остатков EU).

В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые снижают связывание с FcγR, например, с заменами в положениях 234 и 235 Fc-области (нумерация остатков EU). В одном аспекте замены представляют L234A и L235A (LALA). В некоторых аспектах вариант антитела дополнительно содержит D265A и/или P329G в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG₁. В одном аспекте замены представляют L234A, L235A и P329G (LALA-PG) в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG₁. (См., например, WO 2012/130831). В другом аспекте замены представляют L234A, L235A и D265A (LALA-DA) в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG₁.

В некоторых аспектах изменения сделаны в Fc области, что привело к изменению (то есть или к улучшению, или к ухудшению) связывания C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), например, как описано в патенте США №6194551, международной патентной заявке WO 99/51642 и публикации Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Антитела с увеличенным периодом полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором Fc (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в США 2005/0014934 (Hinton et al.). Эти антитела содержат Fc-домен с одной или более заменами, которые улучшают связывание Fc-области с FcRn. Такие Fc-варианты включают варианты с заменами в одном или более остатках Fc-области: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замена остатка 434 Fc-области (см., например, патент США №7371826; Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524).

Остатки Fc-области, важные для взаимодействия мышиного Fc-мышиного FcRn, были идентифицированы сайт-направленным мутагенезом (см., например, Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180). Остатки I253, H310, H433, N434 и Н435 (нумерация согласно EU-индексу) вовлечены во взаимодействие (Medesan, С., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). Остатки I253, H310 и H435, как было обнаружено, важны для взаимодействия человеческого Fc с мышиным FcRn (Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819). Исследования комплекса человеческого Fc-человеческого FcRn показали, что остатки I253, S254, Н435 и Y436 являются важными для взаимодействия (Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). В Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) сообщали и исследовали различные мутанты остатков 248-259, и 301-317, и 376-382, и 424-437.

В определенных вариантах реализации вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые снижают связывание с FcRn, например, с заменами в положениях 253, и/или 310, и/или 435 Fc-области (нумерация остатков EU). В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 253, 310 и 435. В одном аспекте замены представляют I253A, Н310А и Н435А в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG1. См., например, Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.

В определенных вариантах реализации вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые снижают связывание с FcRn, например, с заменами в позициях 310, и/или 433, и/или 436 Fc-области (нумерация остатков EU). В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 310, 433 и 436. В одном аспекте замены представляют Н310А, Н433А и Y436A в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG1. (См., например, WO 2014/177460 А1).

В определенных вариантах реализации вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые улучшают связывание с FcRn, например, с заменами в позициях 252, и/или 254, и/или 256 Fc-области (нумерация остатков EU). В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 252, 254 и 256. В одном аспекте замены представляют M252Y, S254T и Т256Е в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG₁. См. также Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США №5648260; патент США №5624821; и WO 94/29351 в отношении других примеров вариантов Fc-области.

С-конец тяжелой цепи представленного в данном документе антитела может представлять собой полный С-конец, оканчивающийся аминокислотными остатками PGK. С-конец тяжелой цепи может представлять собой укороченный С-конец, в котором были удалены один или два С-концевых аминокислотных остатка. В одном предпочтительном аспекте С-конец тяжелой цепи представляет собой укороченный С-конец, оканчивающийся PG. В одном аспекте из всех представленных в данном документе аспектов антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую С-концевой СН3-домен, описанный в данном документе, содержит С-концевой глицин-лизиновый дипептид (G446 и K447, нумерация в соответствии с индексом EU положений аминокислот). В одном аспекте из всех представленных в данном документе аспектов антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую С-концевой СН3-домен, описанный в данном документе, содержит С-концевой остаток глицина (G446, нумерация в соответствии с индексом EU положений аминокислот).

в. Варианты антител, сконструированные с использованием цистеина

В некоторых аспектах может быть желательно создать антитела, сконструированные с использованием цистеина, например, антитела THIOMAB™, в которых один или более остатков замещены остатками цистеина. В конкретных аспектах замещенные остатки находятся в доступных сайтах антитела. При замене этих остатков цистеином реакционноспособные тиоловые группы располагаются в доступных сайтах антитела и могут использоваться для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как лекарственные фрагменты или фрагменты линкер-лекарственный препарат, для создания иммуноконъюгата, как дополнительно описано в данном документе. Антитела, сконструированные с использованием цистеина, можно получить, как описано, например, в патентах США №№7521541, 830930, 7855275, 9000130 или в заявке WO 2016040856.

7. Иммуноконъюгаты

В настоящем изобретении также предложены иммуноконъюгаты, содержащие предложенное в данном документе антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, конъюгированное (химически связанное) с одним или более терапевтическими средствами, такими как цитотоксические средства, химиотерапевтические средства, лекарственные препараты, ингибиторы роста, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.

В одном аспекте иммуноконъюгат представляет конъюгат антитела-лекарственного средства (АЛС), в котором антитело конъюгировано с одним или более терапевтическими средствами, указанными выше. Антитело, как правило, соединено с одним или более терапевтическими средствами с помощью линкеров. Обзор технологии АЛС, включая примеры терапевтических средств и лекарственных средств и линкеров, приведен в Pharmacol Review 68:3-19 (2016).

Б. Рекомбинантные способы и композиции

Антитела могут быть получены с применением рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в US 4816567. Для этих способов представлена одна или более выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих антитело.

В одном аспекте представлены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело настоящего изобретения.

В одном аспекте предложен способ получения антитела, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую предложенное выше антитело, в условиях, подходящих для экспрессии антитела, и, необязательно, выделение антитела из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).

Для рекомбинантной продукции антитела, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело, например, как описано выше, являются выделенными и вставленными в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такие нуклеиновые кислоты легко выделять и секвенировать, используя традиционные процедуры (например, используя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела), или получать рекомбинантными методами, или получать химическим синтезом.

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в данном документе. Например, антитела могут вырабатываться в бактериях, в частности, если не требуется гликозилирование и Fc-эффекторная функция. Касательно экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях см., например, патенты US 5648237, US 5789199 и US 5840523. (См. также Charlton, K.A., в: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, где описана экспрессия фрагментов антитела в Е. coli). После экспрессии антитело можно выделять из бактериальной клеточной пасты в растворимую фракцию и дополнительно очищать.

Клетки позвоночных также можно использовать в качестве хозяев. Например, можно использовать линии клеток млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другими примерами применимых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (клетки 293 или 293Т, описанные, например, в Graham F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); клетки почки новорожденного хомяка (BHK); клетки Сертоли мышей (клетки ТМ4, описанные, например, в Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK; клетки печени серой крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мышей (ММТ 060562); клетки TRI (как описано, например, в Mather, J.Р. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие подходящие линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), включая DHFR-клетки СНО (Urlaub G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); и линии клеток миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, пригодных для получения антител, смотрите, например, в Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

В одном аспекте клетка-хозяин является эукариотической, например клетка яичника китайского хомяка (СНО) или лимфоидная клетка (например, клетка Y0, NS0, Sp20).

В. Фармацевтические композиции

В дополнительном аспекте предложены фармацевтические композиции, содержащие любое из предложенных в настоящем документе антител, например, для применения в любом из нижеприведенных терапевтических способов. В одном аспекте фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных в настоящем документе антител и фармацевтически приемлемый носитель. В другом аспекте фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных в настоящем документе антител и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, как описано ниже.

Фармацевтические композиции описанного в настоящем документе антитела, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, готовят путем смешивания такого антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или более необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители в общем случае являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях и включают, но не ограничиваются этим: буферы, такие как гистидин, фосфат, цитрат, ацетат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензил аммония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлсодержащие комплексы (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Типовые фармацевтически приемлемые носители по данному документу дополнительно включают средства для диспергирования лекарственных препаратов в интерстициальном пространстве, такие как растворимые нейтрально-активные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX^®, Halozyme, Inc.). Некоторые типовые sHASEGP и способы их применения, включая rHuPH20, описаны в патентных публикациях США №№2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP комбинируют с одной или более дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

Типовые композиции лиофилизированных антител описаны в патенте США №6267958. Водные композиции антител включают описанные в патенте США №6171586 и WO 2006/044908, причем последние композиции содержат гистидин-ацетатный буфер.

Фармацевтическая композиция настоящего документа также может содержать более одного активного ингредиента, если это необходимо для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно те, которые обладают дополняющими видами активности и не оказывают отрицательного влияния друг на друга. Такие активные ингредиенты приемлемо присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предполагаемой цели.

Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулах, полученных, например, с помощью методик коацервации или путем межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах для доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методики описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Фармацевтические композиции для замедленного высвобождения можно получать. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем матрицы находятся в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул.

Фармацевтические композиции, предназначенные для введения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильность можно легко обеспечить, например, путем фильтрования через мембраны для стерильной фильтрации.

Г. Терапевтические способы и пути введения

Любое из антител, которые связываются с VEGF человека и IL-1бета человека, представленные в настоящем документе, можно использовать в терапевтических методах.

В одном аспекте представлено антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для применения в качестве лекарственного препарата. В дополнительных аспектах представлено антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для применения в лечении сосудистого заболевания. В некоторых аспектах представлено антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для применения в способе лечения. В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для применения в способе лечения индивидуума, имеющего сосудистое заболевание, включающем введение индивидууму эффективного количества антитела, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека. В одном таком аспекте способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства (например, одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дополнительных терапевтических средств), например, как описано ниже. В дополнительных аспектах настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для применения в ингибировании ангиогенеза. В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для применения в способе ингибирования ангиогенеза у индивидуума, включающем введение индивидууму эффективного количества антитела, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для ингибирования ангиогенеза. «Индивидуум» в соответствии с любым из вышеприведенных аспектов предпочтительно является человеком.

В дополнительных аспектах представлено антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для применения в лечении заболевания глаз. В одном варианте реализации заболевание глаз выбрано из ВМД (в одном варианте реализации влажной ВМД, сухой ВМД, промежуточной ВМД, запущенной ВМД и географической атрофии (ГА)), макулярной дегенерации, макулярного отека, ДМО (в одном варианте реализации фокального, нецентрального ДМО и диффузного, с вовлечением центрального отдела сетчатки ДМО), ретинопатии, диабетической ретинопатии (ДР) (в одном варианте реализации пролиферативной ДР (ПДР), непролиферативной ДР (НПДР) и высотной ДР), других связанных с ишемией ретинопатии, РН, окклюзии вены сетчатки (ОВС) (в одном варианте реализации форм, связанных с центральной веной (ОЦВС) и ветвями вены (ОВВС)), ХНВ (в одном варианте реализации миопической ХНВ), неоваскуляризации роговицы, заболеваний, связанных с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризации сетчатки, заболеваний, связанных с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, центральной серозной ретинопатии (ЦСР), патологической миопии, болезни Гиппеля-Линдау, гистоплазмоза глаза, СЭВРП, болезни Коутса, болезни Норри, нарушений сетчатки, связанных с синдромом остеопороза-псевдоглиомы (ОППГ), субконъюнктивального кровоизлияния, покраснения радужки, неоваскулярного заболевания глаз, неоваскулярной глаукомы, пигментного ретинита (ПР), гипертонической ретинопатии, ангиоматозной пролиферации сетчатки, макулярной телеангиэктазии, неоваскуляризации радужной оболочки, внутриглазной неоваскуляризации, дегенерации сетчатки, кистозного макулярного отека (КМО), васкулита, отека диска зрительного нерва, ретинита, включая, помимо прочего, ЦМВ-ретинит, меланому глаз, бластому сетчатки, конъюнктивит (в одном варианте реализации инфекционный конъюнктивит и неинфекционный (в одном варианте реализации аллергический) конъюнктивит), наследственного амавроза Лебера (также известного как наследственный амавроз Лебера или НАЛ), увеита (включая инфекционный и неинфекционный увеит), хориоидита (в одном варианте реализации мультифокального хориоидита), гистоплазмоза глаз, блефарита, синдрома сухого глаза, травматического повреждения глаз, болезни Шегрена и других офтальмологических заболеваний, причем заболевание или болезнь связана с глазной неоваскуляризацией, транссудацией и/или отеком сетчатки или атрофией сетчатки. В одном варианте реализации заболевание глаз выбрано из ВМД (в одном варианте реализации влажной ВМД, сухой ВМД, промежуточной ВМД, запущенной ВМД и географической атрофии (ГА)), макулярной дегенерации, макулярного отека, ДМО (в одном варианте реализации фокального, нецентрального ДМО и диффузного, с вовлечением центрального отдела сетчатки ДМО), ретинопатии, диабетической ретинопатии (ДР) (в одном варианте реализации пролиферативной ДР (ПДР), непролиферативной ДР (НПДР) и высотной ДР.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение антитела, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, в производстве или приготовлении лекарственного средства. В одном аспекте лекарственное средство предназначено для лечения сосудистого заболевания. В дополнительном аспекте лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения заболевания, включающем введение индивидууму, имеющему сосудистое заболевание, эффективного количества лекарственного средства. В одном таком аспекте указанный способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, как описано ниже.

В одном аспекте состав предназначен для применения в лечении заболевания глаз. В одном аспекте лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения заболевания глаз, включающем введение индивидууму, имеющему заболевание глаз, эффективного количества лекарственного средства. В одном таком аспекте указанный способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, как описано ниже.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения сосудистого заболевания. В одном аспекте способ включает введение индивидууму, имеющему такое сосудистое заболевание, эффективного количества антитела, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека. В одном таком аспекте указанный способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, как описано ниже.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения заболевания глаз. В одном аспекте способ включает введение индивидууму, имеющему такое заболевание глаз, эффективного количества антитела, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека. В одном таком аспекте указанный способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, как описано ниже.

«Индивидуум» в соответствии с любым из вышеуказанных аспектов может быть человеком.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие любое из предложенных в настоящем документе антител, которые связываются с VEGF человека и IL-1бета человека, например, для применения в любом из вышеприведенных терапевтических способов. В одном аспекте фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных в настоящем документе антител, которые связываются с VEGF человека и IL-1бета человека, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом аспекте фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных в данном документе антител, которые связываются с VEGF человека и IL-1бета человека, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, как описано ниже.

Антитела настоящего изобретения можно вводить по отдельности или использовать в комбинированной терапии. Например, комбинированная терапия содержит введение антитела настоящего изобретения и введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства (например, одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дополнительных терапевтических средств).

Например, в некоторых вариантах реализации любой из предыдущих способов дополнительно включает введение одного или более дополнительных соединений. В некоторых вариантах реализации предложенное в настоящем документе антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, вводят одновременно с дополнительным соединением(ями). В некоторых вариантах реализации антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, вводят перед или после дополнительного соединения(й). В некоторых вариантах реализации дополнительное соединение связывается со второй биологической молекулой, выбранной из группы, состоящей из IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; ангиопоэтина; Ang2; Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5 и α5β1; бетацеллулина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора комплемента D; TNFα; HtrA1; рецептора VEGF; рецептора ST-2; и белков, генетически связанных с риском ВМД, такими как компоненты пути комплемента С2, фактор В, фактор Н, CFHR3, C3b, С5, С5а и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; интерлейкин-8 (IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC; COL10A1 и TNFRSF10A. В некоторых вариантах реализации дополнительное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах реализации согласно (или применительно к) любому из вышеуказанных вариантов реализации глазное расстройство представляет внутриглазную неоваскуляризационное заболевание, выбранное из группы, состоящей из пролиферативных ретинопатии, хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ), возрастной макулярной дегенерации (ВМД), диабетической и других связанных с ишемией ретинопатии, диабетического макулярного отека, патологической миопии, болезни Гиппеля-Линдау, гистоплазмоза глаз, окклюзии вены сетчатки (ОВС), включая ОЦВС и ОВВС, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки и ретинопатии недоношенных (РН).

В некоторых случаях представленное в настоящем документе антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, можно вводить в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством для лечения глазного расстройства, например, глазного расстройства, описанного в настоящем документе (например, ВМД (например, влажной ВМД), ДМО, ДР, ОВС или ГА). Типичные дополнительные терапевтические средства для комбинированной терапии для лечения глазных расстройств включают, помимо прочего, антиангиогенные средства, такие как антагонисты VEGF, включая, например, антитела к VEGF (например, Fab к VEGF LUCENTIS® (ранибизумаб)), растворимые слитые белки рецепторов (например, рекомбинантные растворимые слитые белки рецепторов EYLEA® (афлиберцепт, также известный как VEGF Trap Eye; Regeneron/Aventis)), аптамеры (например, пегилированный аптамер к VEGF MACUGEN® (пегаптаниб натрия; NeXstar Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals)) и ингибиторы тирозинкиназы VEGFR (например, 4-(4-бром-2-фторанилино)-6-метокси-7-(1-метилпиперидин-4-илметокси)хиназолин (ZD6474), 4-(4-фтор-2-метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3-пирролидин-1-илпропокси)хиназолин (AZD2171), ваталаниб (PTK787), семаксаминиб (SU5416; SUGEN) и SUTENT® (сунитиниб)); триптофанил-тРНК-синтазу (TrpRS); скваламин; RETAANE® (ацетат анекортава для суспензии депо, Alcon, Inc.); пролекарство комбретастатин А4 (СА4Р); MIFEPREX® (мифепристон-ru486); субтенон триамцинолона ацетонид; интравитреальный кристаллический ацетонид триамцинолона; ингибиторы матриксной металлопротеиназы (например, Prinomastat (AG3340; Pfizer)); ацетонид флуоцинолона (включая внутриглазной имплант флуоцинолона; Bausch & Lomb/Control Delivery Systems); линомид; ингибиторы функции интегрина β3; ангиостатин и их комбинации. Эти и другие терапевтические средства, которые можно вводить в комбинации с антителом, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения описаны, например, в заявке на патент США №US 2014/0017244, которая включена в настоящий документ ссылкой во всей своей полноте.

Дополнительные примеры дополнительных терапевтических средств, которые можно использовать в комбинации с представленным в настоящем документе антителом, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА), включают, помимо прочего, VISUDYNE® (вертепорфин; активируемое на свету лекарственное средство, которое обычно используют вместе с фотодинамической терапией с нетермическим лазером), PKC412, Endovion (NS 3728; NeuroSearch A/S), нейротрофические факторы (например, глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и ресничный нейротрофический фактор (CNTF)), дилтиазем, дорзоламид, PHOTOTROP®, 9-цис-ретинальное, лекарственное средство для глаз (например, йодид фосфолина, эхотиофат или ингибиторы угольной ангидразы), веовастат (АЕ-941; AEterna Laboratories, Inc.), Sirna-027 (AGF-745; Sima Therapeutics, Inc.), нейротрофины (включая, только в качестве примера, NT-4/5, Genentech), Cand5 (Acuity Pharmaceuticals), INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals), антагонисты интегрина (включая из Jerini AG и Abbott Laboratories), EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.), BDM-E (BioDiem Ltd.), талидомид (как используется, например, EntreMed, Inc.), кардиотрофин-1 (Genentech), 2-метоксиэстрадиол (Allergan/Oculex), DL-8234 (Toray Industries), NTC-200 (Neurotech), тетратиомолибдат (Университет Мичигана), LYN-002 (Lynkeus Biotech), соединения из микроводорослей (Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals), D-9120 (Celltech Group plc), ATX-S10 (Hamamatsu Photonics), TGF-beta 2 (Genzyme/Celtrix), ингибиторы тирозинкиназы (например, от Allergan, SUGEN или Pfizer), NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), Opt-24 (OPTIS France SA), нейропротекторы ганглиев клеток сетчатки (Cogent Neurosciences), производные N-нитропиразола (Texas A&M University System), KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals), циклоспорин А, терапевтические средства, используемые в фотодинамической терапии (например, VISUDYNE®; нацеленный на рецептор PDT, Bristol-Myers Squibb, Co.; порфимер натрия для инъекции с PDT; вертепорфин, QLT Inc.; ростапорфин с PDT, Miravent Medical Technologies; талапорфин натрия с PDT, Nippon Petroleum; и мотексафин лютеций, Pharmacyclics, Inc.), антисмысловые олигонуклеотиды (включая, в качестве примера, продукты, протестированные Novagali Pharma SA и ISIS-13650, Ionis Pharmaceuticals) и их комбинации.

Представленное в настоящем документе антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, можно вводить в комбинации с терапией или хирургической процедурой для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА), включая, например, лазерную фотокоагуляцию (например, панретинальную фотокоагуляцию сетчатки (ПФС)), лазерную обработку друз, хирургию макулярной дыры, макулярную транслокационную хирургию, имплантируемые миниатюрные телескопические устройства, ангиографию PHI-motion (также известную как микролазерная терапия и лечение питающих сосудов), терапию протонным пучком, микростимуляционную терапию, хирургию отслоения сетчатки и стекловидного тела, пломбирование склеры, субмакулярную хирургию, транспупиллярную термотерапию, терапию с использованием фотосистемы I, использование РНК-интерференции (РНКи), экстракорпоральный реофорез (также известный как мембранная дифференциальная фильтрация и реотерапия), имплантацию микрочипа, терапию стволовыми клетками, генно-заместительную терапию, генную терапию с использованием рибозимов (включая генную терапию для восприимчивого к гипоксии элемента, Oxford Biomedica; Lentipak, Genetix; и генную терапию PDEF, GenVec), трансплантацию фоторецепторов/клеток сетчатки (включая трансплантируемые эпителиальные клетки сетчатки, Diacrin, Inc.; трансплантат клеток сетчатки, например, Astellas Pharma US, Inc., ReNeuron, СНА Biotech), акупунктуру и их комбинации.

В некоторых случаях антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, можно вводить в комбинации с антиангиогенным средством для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА). Любое подходящее антиангиогенное средство можно использовать в комбинации с антителом, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения, включая, помимо прочего, перечисленные в Carmeliet et al. Nature 407:249-257, 2000. В некоторых вариантах реализации антиангиогенное средство представляет собой антагонист VEGF, включая, помимо прочего, антитело к VEGF (например, Fab к VEGF LUCENTIS® (ранибизумаб), RTH-258 (ранее ESBA-1008, одноцепочечный фрагмент антитела к VEGF; Novartis), или биспецифическое антитело к VEGF (например, биспецифическое антитело к VEGF/к ангиопоэтину 2, такое как фарицимаб; Roche)), растворимый рекомбинантный слитый белок рецептора (например, EYLEA® (афлиберцепт)), вариант VEGF, растворимый фрагмент VEGFR, аптамер, способный блокировать VEGF (например, пегаптаниб) или VEGFR, нейтрализующее антитело к VEGFR, низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназ VEGFR, DARPin® к VEGF (например, абиципар пегол, Molecular Partners AG/Allergan), малые интерферирующие РНК, которые ингибируют экспрессию VEGF или VEGFR, ингибитор тирозинкиназ VEGFR (например, 4-(4-бром-2-фторанилино)-6-метокси-7-(1-метилпиперидин-4-илметокси)хиназолин (ZD6474), 4-(4-фтор-2-метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3-пирролидин-1-илпропокси)хиназолин (AZD2171), ваталаниб (PTK787), семаксаминиб (SU5416; SUGEN) и SUTENT® (сунитиниб)), и их комбинации.

Другие подходящие антиангиогенные средства, которые можно вводить в комбинации с представленным в настоящем документе антителом, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА) включают кортикостероиды, ангиостатические стероиды, ацетат анекортава, агиостатин, эндостатин, ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы матриксной металлопротеиназы (ММР), белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 3 (IGFBP3), антагонисты фактора, полученного из стромы (SDF-1), (например, антитела к SDF-1), фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), гамма-секретаза, дельта-подобный лиганд 4, антагонисты интегрина, антагонисты фактора, индуцируемого гипоксией (HIF)-1α, антагонисты протеинкиназы CK2, средства, которые ингибируют хоуминг стволовых клеток (например, эндотелиальных клеток-предшественников) в сайт неоваскуляризации (например, антитело к антиваскулярному эндотелиальному кадгерину (CD-144) и/или антитело к SDF-1), и их комбинации.

В дополнительном примере в некоторых случаях антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, и/или его полимерный состав можно вводить в комбинации со средством, которое имеет активность против неоваскуляризации, для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА), таким как противовоспалительное лекарственное средство, мишень млекопитающих для ингибитора рапамицина (mTOR) (например, рапамицин, AFINITOR® (эверолимус) и TORISEL® (темсиролимус)), циклоспорин, антагонист фактора некроза опухолей (TNF) (например, антитело к TNFα или его антигенсвязывающий фрагмент (например, инфликсимаб, адалимумаб, цертолизумаб пегол и голимумаб) или растворимый рецептор слитого белка (например, этанерцепт)), средство против комплемента, нестероидное противовоспалительное средство (NSAID) или их комбинации.

В еще одном примере в некоторых случаях антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, можно вводить в комбинации со средством, которое является нейропротектором и может потенциально снижать прогрессирование сухой ВМД во влажную ВМД, например, класс лекарственных средств, называемый «нейростероиды», который включает лекарственные средства, такие как дегидроэпиандростерон (DHEA) (торговые названия: PRASTERA™ и FIDELIN®), сульфат дегидроэпиандростерона и сульфат прегненолона.

Любое подходящее терапевтическое средство от ВМД можно вводить как дополнительное терапевтическое средство в комбинации с представленным в настоящем документе антителом, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА), включая, помимо прочего, антагонист VEGF, например, антитело к VEGF (например, LUCENTIS® (ранибизумаб), RTH-258 (ранее ESBA-1008, одноцепочечный фрагмент антитела к VEGF; Novartis), или биспецифическое антитело к VEGF (например, биспецифическое антитело к VEGF/к ангиопоэтину 2, такое как фарицимаб; Roche)), растворимый слитый белок рецептора VEGF (например, EYLEA® (афлиберцепт)), DARPin® к VEGF (например, абиципар пегол; Molecular Partners AG/Allergan), или аптамер к VEGF (например, MACUGEN® (пегаптаниб натрия)); антагонист фактора роста, полученного из тромбоцитов (PDGF), например, антитело к PDGF, антитело к PDGFR (например, REGN2176-3), пегилированный аптамер к PDGF-BB (например, FOVISTA®; Ophthotech/Novartis), растворимый слитый белок рецептора PDGFR или двойной антагонист PDGF/VEGF (например, низкомолекулярный ингибитор (например, DE-120 (Santen) или Х-82 (TyrogeneX)) или биспецифическое антитело к PDGF/к VEGF)); VISUDYNE® (вертепорфин) в комбинации с фотодинамической терапией; антиоксидант; антагонист системы комплемента, например, антагонист фактора комплемента С5 (например, низкомолекулярный ингибитор (например, ARC-1905; Opthotech) или антитело к С5 (например, LFG-316; Novartis), антагонист пропердина (например, антитело к пропердину, например, CLG-561; Alcon), или антагонист фактора комплемента D (например, антитело к фактору комплемента D, например, лампализумаб; Roche)); С3-блокирующий пептид (например, APL-2, Appellis); модификатор цикла превращений родопсина (например, гидрохлорид эмиксустата); скваламин (например, OHR-102; Ohr Pharmaceutical); витаминные и минеральные добавки (например, описанные в исследовании 1 (AREDS1; цинк и/или антиоксиданты) и исследовании 2 возрастных заболеваний глаз (AREDS2; цинк, антиоксиданты, лютеин, зеаксантин и/или омега-3 жирные кислоты)); клеточную терапию, например, NT-501 (Renexus); РН-05206388 (Pfizer), трансплантацию клеток huCNS-SC (StemCells), CNTO-2476 (линия стволовых клеток пуповины; Janssen), OpRegen (суспензия клеток RPE; Cell Cure Neurosciences) или трансплантацию клеток MA09-hRPE (Ocata Therapeutics); антагонист тканевого фактора (например, hI-con1; Iconic Therapeutics); агонист альфа-адренергического рецептора (например, тартрат бримонидина; Allergan); пептидную вакцину (например, S-646240; Shionogi); антагонист амилоида-бета (например, моноклональное антитело к амилоиду-бета, например, GSK-933776); антагонист S1P (например, антитело к S1P, например, iSONEP™; Lpath Inc); антагонист ROBO4 (например, антитело к ROBO4, например, DS-7080a; Daiichi Sankyo); лентивирусный вектор, экспрессирующий эндостатин и ангиостатин (например, RetinoStat); и любую их комбинацию. В некоторых случаях терапевтические средства от ВМД (включая любые из предыдущих терапевтических средств от ВМД) могут быть совместно составленными. Например, антитело к PDGFR REGN2176-3 можно совместно составлять с афлиберцептом (EYLEA®). В некоторых случаях такой совместный состав можно вводить в комбинации с антителом, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения. В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с LUCENTIS® (ранибизумабом) для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ВМД (например, влажную ВМД). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ГА.

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с EYLEA® (афлиберцепт) для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ВМД (например, влажную ВМД). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ГА.

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с MACUGEN® (пегаптаниб натрия) для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ВМД (например, влажную ВМД). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ГА.

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с VISUDYNE® (вертепорфин) в комбинации с фотодинамической терапией для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ВМД (например, влажную ВМД). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ГА.

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с антагонистом PDGF для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА). Типичные антагонисты PDGF, которые можно использовать в комбинации с антителом, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения, включают антитело к PDGF, антитело к PDGFR, низкомолекулярный ингибитор (например, скваламин), пегилированный аптамер к PDGF-B, такой как FOVISTA® (Е10030; Ophthotech/Novartis), или двойной антагонист PDGF/VEGF (например, низкомолекулярный ингибитор (например, DE-120 (Santen) или Х-82 (TyrogeneX)) или биспецифическое антитело к PDGF/к VEGF). Например, FOVISTA® можно вводить как вспомогательную терапию с антителом, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения. OHR-102 можно вводить в комбинации с антагонистами VEGF, такими как LUCENTIS® или EYLEA®. В некоторых вариантах реализации антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с OHR-102, LUCENTIS® и/или EYLEA®. В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ВМД (например, влажную ВМД). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ГА.

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с RTH-258 для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА). RTH-258 можно вводить, например, при помощи интравитреальной инъекции или инфузии в глаз. В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ВМД (например, влажную ВМД). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ГА.

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с абиципаром пеголом для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ВМД (например, влажную ВМД). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ГА.

Любое терапевтическое средство от ДМО и/или ДР можно вводить в комбинации с антителом, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА), включая, помимо прочего, антагонист VEGF (например, LUCENTIS® или EYLEA®), кортикостероид (например, кортикостероидный имплант (например, OZURDEX® (интравитреальный имплантат дексаметазона) или ILUVIEN® (интравитреальный имплантат ацетонида флуоцинолона)) или кортикостероид, составленный для введения интравитреальной инъекцией (например, ацетонид триамцинолона)), или их комбинации. В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ДМО и/или ДР.

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с LUCENTIS® (ранибизумаб) для лечения ДМО и/или ДР (например, НПДР или ПДР).

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с EYLEA® (афлиберцепт) для лечения ДМО и/или ДР (например, НПДР или ПДР).

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с OZURDEX® (интравитреальный имплантат дексаметазона) для лечения ДМО и/или ДР.

Антитело, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения можно вводить в комбинации с ILUVIEN® (интравитреальный имплантат дексаметазона) для лечения ДМО и/или ДР.

В некоторых случаях схему лечения TAO/PRN или схему лечения ТАЕ можно использовать для введения терапевтического средства от ВМД (например, ранибизумаба или афлиберцепта) в комбинации с антителом, которое связывается с VEGF человека и 1b-1бета человека, настоящего изобретения, и/или его полимерным составом. В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ВМД (например, влажную ВМД). В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ГА.

Такие виды комбинированной терапии, отмеченные выше, охватывают комбинированное введение (при котором два или более терапевтических средств включены в один и тот же или отдельные препараты) и раздельное введение, и в этом случае введение антитела, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства или средств. В одном варианте реализации введение антитела, которое связывается с VEGF человека и IL-1бета человека, настоящего изобретения и введение дополнительного терапевтического средства может разделять около одного, двух, трех, четырех или пяти месяцев, или около одной, двух или трех недель, или около одних, двух, трех, четырех, пяти или шести суток.

Антитело согласно настоящему изобретению (и любое дополнительное терапевтическое средство) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, если необходимо для местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение дозы можно проводить любым удобным способом, например путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или постоянным. В данном документе предусмотрены различные схемы дозирования, включая, но не ограничиваясь этим, однократное или многократное введение в различные моменты времени, болюсное введение и импульсную инфузию.

Антитела по данному изобретению готовят, дозируют и вводят способом, соответствующим надлежащей медицинской практике. Факторы, которые необходимо учитывать в этом контексте, включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место доставки средства, способ введения, график введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело необязательно готовят с одним или более средствами, применяемыми в настоящее время для предотвращения или лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антитела, присутствующего в фармацевтической композиции, типа нарушения или лечения и других факторов, которые обсуждались выше. Другие средства обычно применяют в таких же дозировках и вводят путями, описанными в данном документе, или в дозировках, составляющих от около 1 до 99% дозировок, описанных в данном документе, или в любой дозировке и любым путем, которые эмпирически/клинически определены как подходящие.

Для профилактики или лечения заболевания соответствующая доза антитела по данному изобретению (используемого отдельно или в комбинации с одним или более другими дополнительными терапевтическими средствами) зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, того, вводится ли антитело с профилактической или терапевтической целью, предыдущей терапии, истории болезни пациента и его ответа на антитела, а также решения лечащего врача. Антитело удобно вводить пациенту однократно или в течение серии курсов лечения. В зависимости от типа и тяжести заболевания, начальная кандидатная дозировка антитела для введения пациенту может составлять от приблизительно 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг), например, за одно или более отдельных введений или в виде непрерывной инфузии. Одна типичная суточная доза может варьироваться от около 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. В случае повторных введений в течение нескольких суток или более, в зависимости от состояния, лечение в общем случае проводят до достижения необходимой степени подавления симптомов заболевания. Одна типовая дозировка антитела находится в диапазоне от около 0,05 мг/кг до около 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или более доз, составляющих около 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Такие дозы можно вводить с интервалами, например, раз в неделю или раз в три недели (например, чтобы пациент получал от около двух до около двадцати или, например, около шести доз антитела). Можно вводить начальную более высокую нагрузочную дозу, за которой следует одна или более меньших доз. Эффективность такой терапии легко контролировать при помощи традиционных методик и анализов.

Д. Готовые изделия

В другом аспекте данного изобретения предложено готовое изделие, содержащее материалы, применяемые при лечении, предотвращении и/или диагностике вышеописанных нарушений. Промышленное изделие включает контейнер и этикетку или листок-вкладыш в упаковке, нанесенный на или связанный с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты с раствором для внутривенного введения и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в комбинации с другой композицией эффективна для лечения, предотвращения и/или диагностики состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере одно активное средство в композиции представляет собой антитело по данному изобретению. На этикетке или на вкладыше в упаковку указано, что композицию применяют для лечения выбранного патологического состояния. Кроме того, промышленное изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, причем указанная композиция содержит антитело по данному изобретению; и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, причем указанная композиция содержит дополнительный цитотоксический или иное терапевтическое средство. Готовое изделие в этом аспекте настоящего изобретения может дополнительно содержать вкладыш в упаковку, на котором указано, что композиции можно применять для лечения конкретного патологического состояния. В альтернативном или дополнительном варианте готовое изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (БВДИ), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Дополнительно могут быть включены другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы и шприцы.

3. Конкретные варианты реализации настоящего изобретения

Далее перечислены конкретные варианты реализации настоящего изобретения.

1. Антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее паратоп VEGF и паратоп IL-1бета в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домена VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домена VH), причем паратоп VEGF содержит аминокислотные остатки из CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела, причем паратоп IL-1бета содержит аминокислотные остатки из CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела.

2. Антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее паратоп VEGF и паратоп IL-1бета в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домена VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домена VH), причем пара вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи одновременно связывается с VEGF человека и IL-1бета человека.

3. Антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее паратоп VEGF и паратоп IL-1бета в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домена VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домена VH), причем ни одна из аминокислот, которые содержатся в паратопе VEGF, не содержится в паратопе IL-1бета.

4. Антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее паратоп VEGF и паратоп IL-1бета в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домена VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домена VH), причем антитело связывается с одним и тем же эпитопом на VEGF человека и с одним и тем же эпитопом на IL-1бета человека как антитело с вариабельным доменом тяжелой цепи SEQ ID NO: 11 и вариабельным доменом легкой цепи SEQ ID NO: 12.

5. Антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее паратоп VEGF и паратоп IL-1бета в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домена VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домена VH), причем

• паратоп VEGF содержит аминокислотные остатки из CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела, причем паратоп IL-1бета содержит аминокислотные остатки из CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела; и/или

• пара вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи одновременно связывается с VEGF человека и IL-1бета человека; и/или

• ни одна из аминокислот, которые содержатся в паратопе VEGF, не содержится в паратопе IL-1бета; и/или

• антитело связывается с тем же эпитопом на VEGF человека и с тем же эпитопом на IL-1бета человека, что и антитело с вариабельным доменом тяжелой цепи с SEQ ID NO: 11 и вариабельным доменом легкой цепи с SEQ ID NO: 12; и/или

• Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF 121 человека с Kd менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса; и/или

• Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С; и/или

• Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света; и/или

• связывание Fab-фрагмента антитела с VEGF человека ингибирует связывание VEGF с VEGFR2 с IC50 менее 50 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса; и причем связывание Fab-фрагмента антитела с IL-1бета человека ингибирует связывание IL-1бета с IL-1бетаR1 с IC50 менее 30 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

6. Антитело по одному из предыдущих вариантов реализации, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

7. Антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

8. Антитело по одному из предыдущих вариантов реализации, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток I2, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

9. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) CDR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

10. Антитело по одному из предыдущих вариантов реализации, содержащее домен VH, содержащий аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, I64, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101, и домен VL, содержащий аминокислотные остатки I2, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Е67, D68, Q69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

11. Антитело варианта реализации 10, содержащее

- паратоп VEGF, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66 и R83, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: I2, Y27, W27a, S27c, S27d, Е67, D68, Q69, R92, Y93, Н94 и Y96; и

- паратоп IL-1бета, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, K94, D95, V96, F98 и D101, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Y91.

12. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее в одной паре домена VL и домена VH: (i) домен VH, содержащий аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101, и (ii) домен VL, содержащий аминокислотные остатки I2, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Е67, D68, Q69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

13. Антитело варианта реализации 12, содержащее

- паратоп VEGF, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66 и R83, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: I2, Y27, W27a, S27c, S27d, Е67, D68, Q69, R92, Y93, Н94 и Y96; и

- паратоп Il-1бета, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, K94, D95, V96, F98 и D101, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Y91.

14. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12.

15. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, причем домен VH содержит аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, причем домен VL содержит аминокислотные остатки I2, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Е67, D68, Q69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

16. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12.

17. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, причем домен VH содержит аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, R66, R83 и K94; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, причем домен VL содержит аминокислотные остатки I2, Y49, G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

18. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) CDR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток I2, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12.

19. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 с до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 с до 15 аминокислотных замен.

20. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 с до 15 аминокислотных замен, причем аминокислотные замены расположены в положениях 3-25, 36-49, 97-82 с, 84-93 или 103-113 SEQ ID NO: 11; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 с до 15 аминокислотных замен, причем аминокислотные замены расположены в положениях 1, 4, 6, 8-23, 35-48, 58-66, 70-88 или 98-107 SEQ ID NO: 12, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату.

21. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 с до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 с до 15 аминокислотных замен.

22. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) CDR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, и содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 с до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 с до 15 аминокислотных замен.

23. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, содержащее последовательность VH с SEQ ID NO: 11 и последовательность VL с SEQ ID NO: 12.

24. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее последовательность VH с SEQ ID NO: 11 и последовательность VL с SEQ ID NO: 12.

25. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 19.

26. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи с SEQ ID NO: 20 и аминокислотную последовательность легкой цепи с SEQ ID NO: 19.

27. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 18 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 19.

28. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи с SEQ ID NO: 18 и аминокислотную последовательность легкой цепи с SEQ ID NO: 19.

29. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, в котором Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF 121 человека с K_D менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

30. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF 121 человека с K_D менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

31. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF 121 человека с Kd менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

32. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) CDR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF 121 человека с K_D менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

33. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее в одной паре домена VH и VL: (i) домен VH, содержащий аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52а, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101, и (ii) домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Е67, D68, Q69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF 121 человека с K_D менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

34. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (e) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12; причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF121 человека с K_D менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

35. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С.

36. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С.

37. Антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С.

38. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) CDR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С.

39. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее в одной паре домена VH и VL: (i) домен VH, содержащий аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101, и (ii) домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Е67, D68, Q69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С.

40. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12; причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С.

41. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света.

42. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света.

43. Антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света.

44. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света.

45. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее в одной паре домена VH и VL: (i) домен VH, содержащий аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101, и (ii) домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Е67, D68, Q69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света.

46. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (домен VL), содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12; причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света.

47. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, в котором связывание Fab-фрагмента антитела с VEGF человека ингибирует связывание VEGF с VEGFR2 с IC50 менее 50 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса; и причем связывание Fab-фрагмента антитела с IL-1бета человека ингибирует связывание IL-1бета с IL-1бетаR1 с IC50 менее 30 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

48. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем связывание Fab-фрагмента антитела с VEGF человека ингибирует связывание VEGF с VEGFR2 с IC50 менее 50 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса; и причем связывание Fab-фрагмента антитела с IL-1бета человека ингибирует связывание IL-1бета с IL-1бетаR1 с IC50 менее 30 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

49. Антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и причем связывание Fab-фрагмента антитела с IL-1бета человека ингибирует связывание IL-1бета с IL-1бетаR1 с IC50 менее 30 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

50. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Е2, G26, V28 и K30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66, R83 и K94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотный остаток 12, (ii) FR2, содержащим аминокислотный остаток Y49, (iii) FR3, содержащим аминокислотные остатки G57, Е67, D68 и Q69, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату, и причем связывание Fab-фрагмента антитела с IL-1бета человека ингибирует связывание IL-1бета с IL-1бетаR1 с IC50 менее 30 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

51. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее в одной паре домена VH и VL: (i) домен VH, содержащий аминокислотные остатки Е2, G26, V28, K30, W31, N35b, D35c, K52a, D55, Н56, Y58, Т61, K62, F63, 164, R66, R83, K94, D95, V96, F98 и D101, и (ii) домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y27, W27a, S27c, S27d, L32, Y49, D50, Y53, K54, L56, G57, Е67, D68, Q69, Y91, R92, Y93, Н94 и Y96, причем нумерация в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату; и причем связывание Fab-фрагмента антитела с IL-1бета человека ингибирует связывание IL-1бета с IL-1бетаR1 с IC50 менее 30 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

52. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12; и причем связывание Fab-фрагмента антитела с IL-1бета человека ингибирует связывание IL-1бета с IL-1бетаR1 с IC50 менее 30 нМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

53. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, являющееся моноклональным антителом.

54. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, являющееся фрагментом антитела, который связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека.

55. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, причем антитело является биспецифическим.

56. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, причем антитело является Fab-фрагментом.

57. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, причем антитело является фрагментом биспецифического антитела.

58. Антитело по любому из предыдущих вариантов реализации, причем антитело является мультиспецифическим антителом.

59. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из вариантов реализации 1-58.

60. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту согласно варианту реализации 59.

61. Экспрессионный вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту согласно варианту реализации 61.

62. Способ получения антитела, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, включающий культивирование клетки-хозяина согласно варианту реализации 60 так, чтобы получить антитело.

63. Способ варианта реализации 62, дополнительно включающий извлечение антитела из клетки-хозяина.

64. Антитело, полученное способом варианта реализации 62 или 63.

65. Фармацевтический состав, содержащий антитело по любому из вариантов реализации 1-58 и фармацевтически приемлемый носитель.

66. Антитело по любому из вариантов реализации 1-58 для применения в качестве лекарственного средства.

67. Антитело по любому из вариантов реализации 1-58 для применения в лечении сосудистого заболевания.

68. Антитело по любому из вариантов реализации 1-58 для применения в лечении сосудистого заболевания глаз.

69. Применение антитела по любому из вариантов реализации 1-58 или фармацевтической композиции варианта реализации 65 в производстве лекарственного средства.

70. Применение антитела по любому из вариантов реализации 1-58 или фармацевтической композиции варианта реализации 65 в производстве лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза.

71. Способ лечения индивидуума, имеющего сосудистое заболевание, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по любому из вариантов реализации 1-58 или фармацевтической композиции варианта реализации 65.

72. Способ лечения индивидуума, имеющего сосудистое заболевание глаз, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по любому из вариантов реализации 1-58 или фармацевтической композиции варианта реализации 65.

73. Способ ингибирования ангиогенеза у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по любому из вариантов реализации 1-58 или фармацевтической композиции по любому из вариантов реализации 65 для ингибирования ангиогенеза.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры представлены для помощи в понимании настоящего изобретения, подлинный объем которого указан в приложенной формуле изобретения. Понятно, что модификации можно сделать в указанных процедурах без отклонения от сущности настоящего изобретения.

Пример 1:

Получение Fab-фрагмента биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета Fab-фрагмент биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета получали путем независимого скрининга моноспецифических антител, которые связываются с VEGF и IL-1бета, с неперекрывающимися паратопами и последующего слияния аминокислотных последовательностей в бипаратопной паре VH/VL, которая связывается с VEGF и IL-1бета, способом, описанным ранее, например, в WO2012/163520.

Использовали две отдельные библиотеки фаговых дисплеев синтетических Fab-фрагментов, причем в первой библиотеке фаговых дисплеев остатки в областях CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 Fab-фрагментов были различными, и причем во второй библиотеке фаговых дисплеев остатки в областях CDR-L1, CDR-L3 и CDR-H2 Fab-фрагментов были различными. В каждой библиотеке другие три области CDR поддерживали недиверсифицированными как инвариантная фиктивная последовательность. В обеих библиотеках домен СН1 Fab-фрагментов был слит посредством линкера с усеченным белком гена-III для облегчения фагового дисплея.

Первая библиотека была обогащена связующими против IL-1бета человека, а вторая библиотека была обогащена связующими против VEGF-А человека, путем пэннинга фаговой библиотеки. После пэннинга мини-препараты плазмид получали для обоих обогащенных пулов фагемидных векторов. Минипрепараты усваивались рестрикционным ферментом для удаления области, кодирующей усеченный белок гена-III, и повторно циркулировались путем сшивания с получением пулов экспрессионных векторов, кодирующих растворимые Fab-фрагменты, которые были обогащены связующими IL-1бета или связующими VEGF-A, соответственно. Эти пулы векторов превращали в клетки TGI E.coli, и отдельные колонии выбирали и культивировали для растворимой экспрессии отдельных Fab-клонов на титрационном микропланшете. Супернатанты, содержащие растворимые Fab-фрагменты, отбирали для связывания с IL-1бета или VEGF-А, используя стандартные методы ИФА, и клоны TG1, дающие специфические связующие, подвергали действию препаратов плазмид ДНК и секвенированию с получением пар последовательностей VH и VL, специфически связывающихся или с IL-1бета, или с VEGF-A, соответственно.

Пару последовательностей VH и VL биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета разрабатывали in silico путем (1) замены неподходящих остатков VH 52b-65 в последовательности VH специфического к IL-1бета Fab на выбранные остатки VH 52b-65 специфического к VEGF-A Fab, таким образом замещая остатки CDR-H2, потенциально являющиеся частью специфического к VEGF-A паратопа, на тяжелую цепь связующего IL-1бета, и (2) замены неподходящих остатков VL 49-57 в последовательности VL специфического к VEGF-A Fab на выбранные остатки VL 49-57 специфического к IL-1бета Fab, таким образом замещая остатки CDR-L2, потенциально являющиеся частью специфического к IL-1бета паратопа, на легкую цепь связующего VEGF-A.

Пример 2:

Экспрессия 1HVL2.3 Fab-фрагмента биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета

Полученную разработанную пару последовательностей VH и VL биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета синтезировали и клонировали в экспрессионном векторе E.coli в рамке с генными последовательностями, кодирующими домены СН1 и Скаппа. Вектор превращался в клетки TGI E.coli, и отдельную колонию культивировали для растворимой экспрессии Fab-фрагмента биспецифического антитела. Биспецифическое антитело очищали от супернатанта культуры TG1 путем аффинной хроматографии, и проверяли специфическое связывание как с IL-1бета, так и VEGF-A.

Биспецифическое антитело «1HVL2.3» к VEGF/IL-1бета выбирали, и оно характеризовалось тяжелой цепью с SEQ ID NO: 9 и легкой цепью с SEQ ID NO: 10.

Для дальнейших анализов антитела к VEGF/IL-1бета настоящего изобретения превращали в и экспрессировали из клеток HEK293 стандартными рекомбинантными способами.

Пример 3:

Определение характеристик Fab-фрагмента биспецифического антитела 1HVL2.3 к VEGF/IL-1бета

Аффинность связывания, гидрофильность и термическую стабильность биспецифического антитела 1HVL2.3 оценивали следующим образом:

Кинетика связывания VEGF, оцененная при помощи поверхностного плазмонного резонанса (ППР):

Захватывающее антитело к His (GE Healthcare 28995056) иммобилизировали на Sensor Chip С1 серии S (GE Healthcare 29104990), используя стандартную химию аминного связывания, что давало плотность поверхности приблизительно 500 единиц резонанса (ЕР). В качестве подвижного буфера и буфера для разведения использовали HBS-P+(10 мМ ГЭПЭС, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,05% сурфактанта Р20). VEGF121-His человека захватывался на поверхности с получением плотностей лигандов приблизительно 10 и 20 ЕР, соответственно. Последовательно вводили серийные разведения Fab-фрагмента биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета (1,2-100 нМ, разведение 1:3) в течение 90 с каждое, диссоциацию отслеживали в течение 3600 с при скорости потока 30 мкл/мин (кинетика одного цикла). Поверхность регенерировали путем введения 10 мМ глицина с рН 1,5 в течение 60 с. Объемную разницу показателя преломления корректировали путем вычитания контрольных введений и путем вычитания ответа, полученного от контрольной проточной ячейки без иммобилизованного VEGF 121 человека. Аппроксимацию кривых проводили, используя 1:1 модель связывания Ленгмюра в оценочном программном обеспечении Biacore. Для обеспечения более надежного соответствия вариант Multiple Rmax выбирали для общего соответствия, используя обе плотности лигандов.

Кинетика связывания IL-1b, оцененная при помощи поверхностного плазмонного резонанса (ППР):

Захватывающее антитело к Fab (GE Healthcare 28958325) иммобилизировали на Sensor Chip С1 серии S (GE Healthcare 29104990), используя стандартную химию аминного связывания, что давало плотность поверхности приблизительно 500 единиц резонанса (ЕР). Fab-фрагмент биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета иммобилизировали на поверхности с полученными уровнями иммобилизации приблизительно 20 ЕР. Серийные разведения в диапазоне от 0,74 до 60 нМ (разведение 1:3) или IL-1 бета человека (PeproTech 200-01 В), или IL-1бета яванского макака (Sino Biological 90010-CNAE) вводили в течение 90 с, диссоциацию отслеживали в течение по меньшей мере 600 с при скорости потока 30 мкл/мин. Поверхность регенерировали путем двух последовательных впрысков 10 мМ глицина с рН 2,1 в течение 60 с каждый. Объемную разницу показателя преломления корректировали путем вычитания контрольных введений и путем вычитания ответа, полученного от контрольной проточной ячейки без иммобилизованного Fab-фрагмента биспецифического антитела к VEGF/IL-1 бета. Аппроксимацию кривых проводили, используя 1:1 модель связывания Ленгмюра в оценочном программном обеспечении Biacore.

Хроматография гидрофобного взаимодействия (ХГВ):

Видимую гидрофобность определяли путем впрыска 20 мкг Fab-фрагмента биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета на колонку с ХГВ-эфир-5PW (Tosoh), уравновешенную 25 мМ фосфатом Na, 1,5 М сульфатом аммония, рН 7,0. Элюирование проводили с линейным градиентом от 0 до 100% буфера В (25 мМ фосфата Na, рН 7,0) в течение 60 минут. Время удержания сравнивали с белковыми стандартами с известной гидрофобностью.

Термическая стабильность:

Образцы Fab-фрагмента биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета готовили в концентрации 1 мг/мл в 20 мМ смеси гистидина/хлорида гистидина, 140 мМ NaCl, рН 6,0, переносили в оптический 384-луночный планшет путем центрифугирования через 0,4 мкм фильтровальную пластину и покрывали парафинным маслом. Гидродинамический радиус повторно измеряли методом динамического рассеяния света на планшет-ридере DynaPro (Wyatt) при нагревании образцов со скоростью 0,05°С/мин от 25°С до 80°С. В альтернативном варианте образцы переносили в 10 мкл микрокюветную матрицу и записывали данные по статическому рассеянию света, а также данные по флуоресценции после возбуждения лазером с 266 нм на инструменте Optim1000 (Avacta Inc.) при нагревании со скоростью 0,1°С/мин от 25°С до 90°С.

Температуру начала агрегации определяли как температуру, при которой гидродинамический радиус (DLS) или интенсивность рассеянного света (Optim1000) начинала повышаться. Температуру плавления определяют как точку перегиба на графике зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны.

Результаты приведены в Таблицах 1 и 2.

Пример 4:

Улучшение Fab-фрагмента биспецифического антитела 1HVL2.3 к VEGF/IL-1бета

Как показано выше, Fab-фрагмент биспецифического антитела 1HVL2.3 к VEGF/IL-1бета, являясь очень стабильным, характеризуется аффинностью к IL-1бета в наномолярном диапазоне, а также значительной гидрофобностью. Для лечения сосудистых заболеваний глаз, которые требуют инъекции терапевтического средства в глаз, желательно обеспечивать терапевтическое средство с высокой аффинностью к целевому антигену и в очень высоких концентрациях для увеличения длительности терапевтического эффекта и для минимизации неудобств для пациента. Для предполагаемой цели, таким образом, желательно увеличивать аффинность и снижать гидрофобность антитела, чтобы обеспечить растворимость в изотоничном буфере в высоких концентрациях.

Следовательно, для клинического применения антитело требовало дополнительного улучшения, например, в отношении связывания с IL-1бета (в частности, путем увеличения скорости диссоциации) и снижения гидрофобности. Несколько кругов созревания проводили путем введения отдельных аминокислотных замен в домен VH и VL. При созреваниях кандидантные антитела, полученные из антитела 1HVL2.3, отбирали и выбирали на основе их желаемых свойств относительно выхода, аффинности, одновременного связывания с антигеном, гидрофильности, стабильности, вязкости и других параметров.

Улучшенные кандидантные антитела 1HVL5.15, 1HVL12.85 и RO7200394 выбирали из множества протестированных молекул кандидатных антител. Аминокислотные последовательности этих улучшенных Fab-фрагментов биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета идентифицированы в таблице 3.

Фигуры 2 и 3 показывают выравнивание вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи полученных Fab-фрагментов биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета. Нумерация положений аминокислот в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату. Для простоты нумерация включена на фигуре, дополнительно показывая скелет и положения аминокислот CDR.

Пример 5:

Кинетика связывания с антигеном улучшенных Fab-фрагментов биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета

Кинетику связывания с VEGF и IL-1бета для кандидатных антител оценивали, как описано в примере 3, используя указанные Fab-фрагменты биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета (аминокислотная последовательность, как показано в таблице 3). Для сравнения показана кинетика связывания с антигеном антитела 0032 к VEGF/IL-1бета уровня техники, полноразмерного антитела IgG, раскрытого в WO2016/075034.

Результаты кинетики связывания с IL-1бета показаны в таблице 4 и таблице 5.

Кинетика связывания с IL-1бета других частиц и родственных белков оценивали для антител 1HVL5.15 и 1HVL12.85 при помощи ППР, используя такую же экспериментальную установку, как описано в примере 3. Не наблюдали никакого связывания в отношении IL-1бета крыс, IL-1бета свиней, IL-1 альфа человека и IL-1RA человека. Слабое связывание наблюдали в отношении IL-1бета мышей и кроликов.

Результаты для кинетики связывания с VEGF показаны в таблице 6.

Одновременное связывание с антигенами VEGF и IL-1бета кандидатных антител оценивали следующим образом:

Захватывающее антитело к His (GE Healthcare 28995056) иммобилизировали на Sensor Chip С1 серии S (GE Healthcare 29104990), используя стандартную химию аминного связывания, что давало плотность поверхности приблизительно 500 единиц резонанса (ЕР). В качестве подвижного буфера и буфера для разведения использовали HBS-P+(10 мМ ГЭПЭС, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,05% сурфактанта Р20). VEGF 121-His человека иммобилизировали на поверхности с последующими инъекциями кандидатных антител и IL-1бета. Поверхность регенерировали путем введения 10 мМ глицина с рН 1,5 в течение 60 с. Объемную разницу показателя преломления корректировали путем вычитания контрольных введений и путем вычитания ответа, полученного от контрольной проточной ячейки без иммобилизованного VEGF 121 человека.

Одновременное связывание кандидатных антител с VEGF и IL-1бета подтверждали для всех улучшенных Fab-фрагментов биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета, т.е. 1HVL5.15, 1HVL12.85 и RO7200394. Фигура 4 показывает одновременное связывание антитела 1HVL12.85 к VEGF/IL-1бета. Фигура 5 показывает одновременное связывание антитела RO7200394 к VEGF/IL-1бета.

Одновременное связывание с антигенами полноразмерного антитела 0032 IgG уровня техники (WO2016/075034) также оценивали при помощи такой же экспериментальной установки. Результаты показаны на фигуре 6.

Пример 6:

Ингибирование связывания VEGF и IL-1бета с соответствующими рецепторами

Анализ ингибирования рецепторов

Ингибирование связывания VEGF и IL-1бета с их соответствующими рецепторами, hVEGFR2 и IL-1бетаR1, в присутствии кандидатного антитела RO7200394 (Fab-фрагмент) оценивали, как описано ниже. Для сравнения кинетику антитела 0032 к VEGF/IL-1бета уровня техники (полноразмерного IgG), раскрытого в WO2016/075034, также оценивали.

hVEGFR2 (R&D Systems 357-KD) и IL-1bR1 (Sino Biological Inc. 10126-H02H) иммобилизировали в различных проточных ячейках для Sensor Chip СМ5 серии S (GE Healthcare 29104988), используя стандартную химию аминного связывания, что давало плотности поверхности приблизительно 8000 и 20000 единиц резонанса (ЕР), соответственно. В качестве подвижного буфера и буфера для разведения использовали HBS-P+(10 мМ ГЭПЭС, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,05% сурфактанта Р20).

Для оценки ингибирования связывания с рецептором VEGF конечную концентрацию 200 нМ RO7200394 или 400 нМ антитела 0032 предварительно инкубировали с 50 нМ VEGF 121. Для оценки ингибирования связывания с рецептором IL-1бета конечную концентрацию 200 нМ RO7200394 или 200 нМ антитела 0032 предварительно инкубировали с 50 нМ IL-1бета. Образцы разводили (1:2) в соответствующем растворе 50 нМ VEGF121 или IL-1бета.

Смеси антитело/лиганд вводили на поверхность VEGFR2 или IL-1R1 в течение 60 с при скорости потока 5 мкл/мин. После фазы диссоциации в течение 60 с поверхность VEGFR2 регенерировали путем введения 5 мМ NaOH в течение 60 с, тогда как поверхность IL-1R1 регенерировали путем введения 10 мМ глицина с рН 3,0, а потом 5 мМ NaOH в течение 60 с каждый. Объемную разницу показателя преломления корректировали путем вычитания контрольных введений и путем вычитания ответа, полученного от контрольной проточной ячейки. Для оценки ответа связывания через 5 секунд после окончания введения отбирали. Полученный ответ в ЕР превращали в ответ связывания относительно исходного сигнала, соответствующего лиганду(ам) без антитела. Значения IC50 рассчитывали при помощи 4-параметрической логистической модели (XLfit, ID Business Solutions Ltd.).

Результаты показаны в таблице 7 и таблице 8; и на фигуре 7А (ингибирование VEGFR2 в присутствии антитела RO7200394), фигуре 7В (ингибирование VEGFR2 в присутствии антитела 0032), фигуре 8А (ингибирование IL-1R1 в присутствии антитела RO7200394) и фигуре 8В (ингибирование IL-1R1 в присутствии антитела 0032).

Показано, что связывание IL-1бета с Fab-фрагментом биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета настоящего изобретения не мешает ингибированию взаимодействия VEGF/VEGFR2. Также связывание VEGF с Fab-фрагментом биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета настоящего изобретения не мешает ингибированию взаимодействия IL-1бета/IL-1бетаR1.

Конкурентный ИФА для VEGF

Использовали следующие буферы: PBS (1x PBS рН 7,4); PBST (1x PBS, дополненный 0,1% об./об. Tween-20); PBST 1% BSA (PBST, дополненный 1% BSA (раствор альбумина бычьей сыворотки 30% от Sigma-Aldrich, А0336)); NaHCO₃ (раствор NaHCO₃, рН 9,4, полученный от BupH Buffer Packs (ThermoScientific, 28382)); 2% MPBST (PBST, дополненный 2% (масс/об.) сухого обезжиренного молока (Carl Roth, Т145.3)).

96-луночные планшеты (Maxisorp Nunc-Immoplates) покрывали 50 мкл/лунку rhVEGFR-l-Fc (R&D #321-FL-050) с конечной концентрацией 1 мкг/мл в 200 мМ NaHCO₃, рН 9,4 в течение 1 часа при комнатной температуре.

При этом Fab-фрагменты антител с различными концентрациями предварительно инкубировали с VEGF для получения премикса Fab антитела-VEGF следующим образом: Серийные разведения Fab-фрагмента антитела получали путем добавления 280 мкл раствора Fab-фрагментов антител (409,6 нМ антитела в PBST-1% BSA) в лунках первого столбца круглодонного 96-луночного планшета PS. Отдельные лунки столбцов 2-12 того же планшета заполняли 140 мкл PBST-1% BSA. Затем разведения 1:2 проводили путем переноса 140 мкл раствора антитела в следующий столбец, путем перемешивания и продолжения переноса 140 мкл этого разбавленного раствора антитела в следующий столбец. Это повторяли до столбца 11. Избыток 140 мкл отбрасывали, чтобы все лунки содержали 140 мкл. Столбец 12 служил в качестве контроля (пустой). Для предварительной инкубации с VEGF круглодонные 96-луночные планшеты PS предварительно заполняли 50 мкл/лунку 2 нМ раствора VEGF121 (Humanzyme, HZ-1206, Lot 0614-01) или 2 нМ VEGF165 (Humanzyme, HZ-1153, Lot 0716-01) в PBST-1%BSA. 50 мкл серийных разведений соответствующего Fab-фрагмента антитела добавляли в VEGF121 или VEGF165, соответственно; тщательно перемешивали и инкубировали в течение 1,5 часов при комнатной температуре.

Покрытые rhVEGFR-1-Fc планшеты промывали дважды с помощью PBST и блокировали в течение 45 мин с помощью 200 мкл 2% MPBST. После смывания раствора MPBST дважды с помощью PBST 50 мкл премикса Fab антитела-VEGF добавляли на планшет и инкубировали в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Затем планшеты промывали дважды с помощью PBST. Затем 50 мкл раствора, содержащего биотинилированное антитело к VEGF (R&D, BAF293; разведение 1:2000 в PBST) и SA-HRP (KPL, 14-30-00; разведение 1:2000 в PBST) добавляли и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. После 6х промываний с помощью PBST 50 мкл раствора субстрата ТМВ (двухкомпонетный субстрат HRP (KPL, 34021); используемого при комнатной температуре) добавляли и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. 50 мкл 1н H₂SO₄ добавляли и поглощение считывали при 450 нм.

Результаты показаны на фигуре 9 и фигуре 10, и показано улучшение ингибирования связывания с VEGF-R1 для 1HVL12.85 и RO7200394 относительно 1HVL2.3.

Пример 7:

Биофизические свойства улучшенных Fab-фрагментов биспецифических антител к VEGF/IL-1бета (стабильность и гидрофобность)

Указанные биофизические свойства кандидатных антител оценивали, как описано в примере 3, используя указанные Fab-фрагменты биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета (аминокислотная последовательность, как показано в таблице 3).

Таблица 9 показывает термическую стабильность и гидрофобность анализируемых антител. Для сравнения включена термическая стабильность антитела 0032 к VEGF/IL-1бета уровня техники, полноразмерного антитела IgG, раскрытого в WO2016/075034. Хроматограммы из ХГВ показаны на фигуре 11 для Fab-фрагментов биспецифических антител к VEGF/IL-1бета, а на фигуре 12 - для антитела IgG 0032 к VEGF/IL-1бета уровня техники.

Пример 8:

Биофизические свойства улучшенных Fab-фрагментов биспецифических антител к VEGF/IL-1бета (динамическая вязкость)

Вязкость кандидатных антител оценивали следующим образом, используя указанные Fab-фрагменты биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета (аминокислотная последовательность, как показано в таблице 3):

Вязкость измеряли при помощи метода с латексным шариком DLS, как описано ранее (Не F et al.; Anal Biochem. 2010 Apr 1;399(1): 141-3). Вкратце, образцы концентрировали до >200 мг/мл (на основе доступности материала) при помощи центрифужных концентрационных устройств, например, Amicon Ultra -0,5 мл фильтровальные центрифуги, Ultracel - 10K, № по каталогу UFC501096.

Серийные разведения от приблизительно 10 мг/мл до максимально выполнимой концентрации получали и Polysorbate 20 и шарики (Nanosphere Size Standards, номинальный диаметр: 300 нм, 1% твердых веществ, ThermoFisher № по каталогу 3300А) добавляли до конечной концентрации 0,02% (PS20) и 0,03% (масс./масс., шарики), соответственно.

Небольшую аликвоту этих образцов центрифугировали в течение 1 минуты при максимальной скорости перед определением концентрации белка путем поглощения UV280.

Оставшийся образец переносили на оптический 384-луночный планшет, покрывали слоем парафинового масла для предотвращения испарения и данные DLS записывали при указанной температуре. Из данных DLS для кажущегося гидродинамического радиуса латексных шариков вязкость раствора рассчитывали, как описано в Не F et al.; выше. Вязкость при наивысшей концентрации указана в таблице 10. Результаты также показаны на фигуре 13 (1HVL12.85) и фигуре 14 (RO7200394).

Результаты показывают, что антитела настоящего изобретения можно составлять в высокой концентрации, содержащей вязкость ниже приемлемого предела вязкости для шприцевания, что составляет до 30 спз. Хотя оба тестируемых антитела показали сильную концентрируемость, эффект более очевиден для антитела RO7200394.

Следовательно, антитела настоящего изобретения являются очень подходящими для глазных применений, поскольку они обеспечивают высокую молярную дозу в ограниченном объеме инъекции, что при объединении с высокой активностью приводит к продолжительному сроку годности и, следовательно, сниженной частоте дозирования, что желательно для снижения сложностей со стороны пациента.

Пример 9:

Химическая стабильность улучшенного Fab-фрагмента биспецифического антитела к VEGF/IL-1бета Тест на химическое разложение:

Образцы антител составляли в 20 мМ His/HisCl, 140 мМ NaCl, рН 6,0, и делили на три аликвоты: одну аликвоту повторно буферизовали в PBS, соответственно, и две аликвоты сохраняли в исходном составе. Аликвоту в PBS и одну аликвоту в His/HisCl инкубировали в течение 2 недель (2 недели) при 40°C (His/NaCl) или 37°С (PBS) в 1 мг/мл, образец в PBS инкубировали дополнительно всего в течение 4 недель (4недели). Третий образец контрольной аликвоты хранили при -80°С. После окончания инкубации образцы анализировали на относительную концентрацию активного вещества (Biacore; концентрация активного вещества обоих подвергнутых обработке аликвот каждого связующего нормализовали до не подвергнутой обработке аликвоты при 4°С), агрегацию (SEC) и фрагментирование (капиллярный электрофорез или SDS-PAGE) и сравнивали с необработанным контролем.

Активность связывания после обработки оценивали следующим образом:

Захватывающее антитело к Fab (GE Healthcare 28958325) иммобилизировали на Sensor Chip СМ5 серии S (GE Healthcare 29104988), используя стандартную химию аминного связывания, что давало плотность поверхности 4000-6000 единиц резонанса (ЕР). В качестве подвижного буфера и буфера для разведения использовали HBS-P+(10 мМ ГЭПЭС, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,05% сурфактанта Р20). Антитело 1HVL12.85 к VEGF/IL-1бета с концентрацией 2 мкг/мл вводили в течение 60 с при скорости потока 5 мкл/мин. HuVEGF121 (внутренний препарат) или huIL-1beta (Peprotech 200-01 В) с концентрацией 2 мкг/мл каждый вводили в течение 60 с, диссоциацию наблюдали в течение 60 с при скорости потока 5 мкл/мин. Поверхность регенерировали путем двух последовательных впрысков 10 мМ глицина с рН 2,1 в течение 60 с каждый. Объемную разницу показателя преломления корректировали путем вычитания контрольных введений и путем вычитания ответа, полученного от контрольной проточной ячейки. Для оценки ответа связывания через 5 секунд после окончания введения отбирали. Для нормализации сигнала связывания ответ связывания с VEGF или IL-1 бета делили на ответ к Fab. Относительную концентрацию активного вещества рассчитывали путем привязки каждого образца, подвергшегося обработке при температуре, к соответствующему образцу, не подвергавшемуся обработке.

Результаты показаны в таблицах 11 и 12.

Пример 10:

Структурный анализ улучшенного Fab-фрагмента биспецифического антитела 1HVL5.15 к VEGF/IL-1бета

Структурный анализ Fab-фрагмента антитела 1HVL5.15 к VEGF/IL-1бета проводили при помощи рентгенокристаллографии следующим образом:

Комплексообразование и кристаллизация третичного комплекса IL1β-VEGF121 - Fab 1HVL5.15

Для комплексообразования Fab-фрагмент антитела 1HVL5.15 и IL1B человека (Peprotech) смешивали в мольном отношении 1:1,1. После инкубации в течение 16 часов в течение ночи при 4°С, VEGF121 человека (внутренний препарат) добавляли с получением третичного комплекса, который концентрировали до 10 мг/мл. Испытания на исходную кристаллизацию проводили при диффузии паров в сидячей капле при 21°С. Первые микрокристаллы возникали в течение 4 дней из 1,4М малоната натрия. Последующие эксперименты на высеивание давали кристаллы из 0,1 М какодилата натрия рН 5,5, 0,1 М ацетата кальция, 12% PEG8000. Кристаллы непосредственно собирали с планшета для отбора без каких-либо дополнительных этапов оптимизации.

Получение данных и определение структуры

Для сбора данных кристаллы мгновенно охлаждали при 100 K в растворе осадителя с добавлением 15% этиленгликоля в качестве криопротектора. Данные дифракции собирали при длине волны 1,0000 с помощью детектора PILATUS 6М при канале пучка X10SA Swiss Light Source (Villigen, Швейцария). Данные обрабатывали с помощью XDS (Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010)) и наносили на шкалу SADABS (BRUKER). Кристаллы относятся к пространственной группе C222₁ с осями ячейки а=177,97 b=286,70 с=105,39 α=β=γ=90° и преломляются для разрешения 2,97 Структуру определяли молекулярной заменой с помощью PHASER (McCoy, A.J. et al. J. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007)), используя координаты связанных внутренних структур Fab-фрагмента, IL1β и pdb входных данных 1MKK для VEGF в качестве моделей поиска. Программы из комплекта ССР4 (Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)) и Buster (Bricogne, G., et al. (2011). Buster version 2.9.5 Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd) использовали для уточнения структуры. Перестройку вручную белка, используя разницу электронной плотности, проводили с помощью COOT (Emsley, P., et al. Acta Cryst D66, 486-501 (2010)). Сбор данных и статистика уточнения подытожены в таблице 13. Все графические представления получали с помощью PYMOL (DeLano Scientific, Palo Alto, CA, 2002). Структуру анализировали при помощи программы CONTACT из комплекта ССР4 (Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)) для идентификации остатков паратопа и эпитопа, используя контактное расстояние максимум 4

¹ Значения в интервале относятся к наивысшим ячейкам разрешения.

² R_слитый=∑|I-<I>|/∑I, где I представляет интенсивность.

³ R_{рабочий}=∑|F_o-<F_c>|/∑F_o, где F_o представляет наблюдаемую, a F_c - рассчитанную амплитуду показателя структуры.

⁴ R_{свободный} рассчитывали на основе 5% всех данных, исключенных при уточнении.

Аминокислотные остатки в контакте с соответствующими антигенами, VEGF и IL-1бета, идентифицировали из кристаллической структуры Fab-фрагмента биспецифического антитела 1HVL5.15 к VEGF/IL-1бета в комплексе. Иллюстрация положения аминокислотных остатков паратопа в доменах VH и VL изображена на фигуре 2 и фигуре 3.

Аминокислоты из легкой цепи CDR1 и CDR3, а также тяжелой цепи CDR2 участвуют в паратопе VEGF. Паратоп VEGF не содержит аминокислоты из легкой цепи CDR2, тяжелой цепи CDR1 и тяжелой цепи CDR3. Паратоп IL-1бета не содержит аминокислоты из легкой цепи CDR2.

Аминокислотные остатки, определенные как участвующие в связывании антигена, идентифицированы в таблице 14 (для аминокислотных остатков вариабельного домена тяжелой цепи) и таблице 15 (для аминокислотных остатков вариабельного домена легкой цепи). Положения аминокислот представлены согласно номерам в системе нумерации по Кабату (такую же нумерацию используют на фигуре 2 и 3). Положения аминокислот, вовлеченных в связывание антигена, идентифицированы по их положению по Кабату в домене VH или VL (см. также нумерацию на фигуре 2 и 3).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ

<120> Антитело, которое связывается с VEGF и IL-1бета, и способы

применения

<130> P35223 (MME)

<150> EP18215023.5

<151> 2018-12-21

<160> 27

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH 1HVL2.3

<400> 1

Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Met Val Phe Ser Trp Asn Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Pro Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Asp Ile Gly Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL 1HVL2.3

<400> 2

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Tyr Arg Ile Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR1 1HVL2.3

<400> 3

Trp Asn Ala Met Ser

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR2 1HVL2.3

<400> 4

Ser Ile Ser Pro Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR3 1HVL2.3

<400> 5

Asp Ile Gly Phe Phe Asp Val

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR1 1HVL2.3

<400> 6

His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR2 1HVL2.3

<400> 7

Asp Ala Ser Tyr Arg Ile Ile

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR3 1HVL2.3, 1HVL12.85, 1HVL5.15 и RO7200394

<400> 8

Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 223

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь Fab-фрагмента 1HVL2.3

<400> 9

Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Met Val Phe Ser Trp Asn Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Pro Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Asp Ile Gly Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Lys Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

<210> 10

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь Fab-фрагмента 1HVL2.3

<400> 10

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Tyr Arg Ile Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> домен VH 1HVL12.85 и RO7200394

<400> 11

Asp Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Glu Gly Met Val Phe Lys Trp Asn

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Lys Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Glu Lys Asp Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Val Gly Phe Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> домен VL 1HVL12.85 и RO7200394

<400> 12

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Ser Leu

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Lys Tyr Lys His Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Lys Glu Asp Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR1 1HVL12.85, 1HVL5.15 и RO7200394

<400> 13

Trp Asn Asp Met Ser

1 5

<210> 14

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR2 1HVL12.85, 1HVL5.15 и RO7200394

<400> 14

Ser Ile Ser Lys Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR3 1HVL12.85, 1HVL5.15 и RO7200394

<400> 15

Asp Val Gly Phe Phe Asp Ile

1 5

<210> 16

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR1 1HVL12.85 и RO7200394

<400> 16

His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Ser Leu Val Ala

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR2 1HVL12.85, 1HVL5.15 и RO7200394

<400> 17

Asp Ala Lys Tyr Lys His Leu

1 5

<210> 18

<211> 224

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь Fab-фрагмента 1HVL12.85

<400> 18

Asp Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Glu Gly Met Val Phe Lys Trp Asn

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Lys Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Glu Lys Asp Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Val Gly Phe Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

<210> 19

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь Fab-фрагмента 1HVL12.85 и RO7200394

<400> 19

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Ser Leu

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Lys Tyr Lys His Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Lys Glu Asp Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 20

<211> 224

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь Fab-фрагмента RO7200394 (SEQ ID NO: 19 с мутацией

K196Q)

<400> 20

Asp Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Glu Gly Met Val Phe Lys Trp Asn

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Lys Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Glu Lys Asp Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Val Gly Phe Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

<210> 21

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> домен VH 1HVL5.15

<400> 21

Asp Glu Thr Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Glu Gly Met Val Phe Lys Trp Asn

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Lys Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Glu Lys Asp Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Val Gly Phe Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> домен VL 1HVL5.15

<400> 22

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Ser Leu

20 25 30

Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Lys Tyr Lys His Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR1 1HVL5.15

<400> 23

His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Ser Leu Met Ala

1 5 10

<210> 24

<211> 224

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь Fab-фрагмента 1HVL5.15

<400> 24

Asp Glu Thr Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Glu Gly Met Val Phe Lys Trp Asn

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Lys Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Glu Lys Asp Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Val Gly Phe Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

<210> 25

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь Fab-фрагмента 1HVL5.15

<400> 25

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Ser Leu

20 25 30

Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Lys Tyr Lys His Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 26

<211> 232

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 26

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

130 135 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp

165 170 175

Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys

180 185 190

His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn

195 200 205

Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr

210 215 220

Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

225 230

<210> 27

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 27

Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser

1 5 10 15

Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met

20 25 30

Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile

35 40 45

Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala

50 55 60

Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro

65 70 75 80

Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe

85 90 95

Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu

100 105 110

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителу, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, а также к способу его получения. Также раскрыты выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело, а также вектор и клетка, ее содержащие. Изобретение эффективно для лечения сосудистых заболеваний глаз. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 14 ил., 16 табл., 10 пр.

1. Антитело, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее паратоп VEGF и паратоп IL-1бета в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домена VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домена VH), причем паратоп VEGF содержит аминокислотные остатки из CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела, причем паратоп IL-1бета содержит аминокислотные остатки из CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела, в котором антитело включает VH последовательность SEQ ID NO: 11 и VL последовательность SEQ ID NO: 12.

2. Антитело, которое специфически связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, содержащее последовательность VH с SEQ ID NO: 11 и последовательность VL с SEQ ID NO: 12.

3. Антитело по любому из предыдущих пунктов, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 19.

4. Антитело по любому из предыдущих пунктов, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF121 человека с K_D менее 10 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и (ii) с IL-1бета человека с K_D менее 30 пМ, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

5. Антитело по любому из предыдущих пунктов, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации более 70°С.

6. Антитело по любому из предыдущих пунктов, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, что измеряется с помощью динамического рассеяния света.

7. Антитело по любому из предыдущих пунктов, причем антитело представляет собой фрагмент биспецифического антитела.

8. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп. 1-7.

9. Клетка-хозяин, предназначенная для получения антитела по любому из пп. 1-7, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 8.

10. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 8.

11. Способ получения антитела, которое связывается с VEGF человека и с IL-1бета человека, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 9 так, чтобы получить антитело.