Средство, обладающее свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии Российский патент 2018 года по МПК A61K31/195 A61P9/10 A61P25/00 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и касается производных гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), обладающих свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии.

Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) широко распространена в ЦНС млекопитающих, она присутствует примерно в 50% всех нервных окончаний мозга. ГАМК является важнейшим тормозным нейромедиатором центральной нервной системы человека и млекопитающих. Она улучшает кровообращение и обменные процессы в головном мозге. ГАМК синтезируется в нервных клетках из глутаминовой кислоты при участии фермента глутамат-декарбоксилазы (GAD) [Ben-Ari Y., Gaiarsa J.L., Tyzio R., Khazipov R. GABA: a pioneer transmitter that excites immature neurons and generates primitive oscillations. //Physiol Rev. 2007. Vol. 87. №4. P. 1215-1284]. ГАМК обнаружена в локальных сетях интернейронов, разнообразных по форме и функциям. Известно, что ГАМК-ергические интернейроны, нормально функционирующей локальной тормозной сети, обеспечивают надежную регуляцию возбуждения пирамидных нейронов, генерацию кортикальных ритмов, организацию сенсорных полей и кортикальную пластичность мозга [Benarroch Е.Е. Neocortical interneurons: functional diversity and clinical correlations. // Neurology. 2013. Vol. 81. №3. P. 273-280]. Сокращение численности популяций неокортикальных тормозных интернейронов, снижение их активности приводит к нейрологическим и психическим нарушениям, включая эпилепсию, врожденное слабоумие, шизофрению и аутизм, что довольно часто наблюдается в клинике постишемичеких энцефалопатий.

В развивающемся мозге ГАМК играет важную роль в регуляции пролиферации нервных клеток-предшественников, миграции и дифференцировки новых клеток, удлинении нейронов и формировании синапсов. Стимулируя выработку соматотропного гормона, она регулирует рост и развитие ребенка [Fine R., Zhang J., Stevens H.E. Prenatal stress and inhibitory neuron systems: implications for neuropsychiatric disorders // Molecular Psychiatry. 2014. Vol. 19. P. 641-651; Ben-Ari Y, Kahle K.T. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders // Neuroscientist. 2012. Vol. 18. №5. P. 467-486]. Как лекарственное средство ГАМК применяется для лечения некоторых сосудистых заболеваний головного мозга и относится к ноотропным препаратам [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: «Новая волна». 2012. С. 117; Раевский К.С., Георгиев В.П. Медиаторные аминокислоты. - М.: «Медицина». 1986. 165 с.; Ковалев Г.В. Ноотропные средства. Волгоград. Нижне-Волжское книжное издательство. 1990. 368 с.]. ГАМК не используется для лечения патологических состояний и нервно-психических заболеваний обусловленных перинатальной патологией. Ее свойства предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии также неизвестны.

Наиболее известные производные ГАМК - это 4-амино-3-(4-хлорфенил)бутановая кислота - действующее вещество лекарственного препарата баклофен и гидрохлорид 4-амино-3-фенилбутановая кислота -действующее вещество лекарственного препарата фенибут. Баклофен относится к миорелаксантам, имеет ряд существенных недостатков, в частности, противопоказан при атеросклерозе сосудов головного мозга, цереброваскулярной недостаточности и др. [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. «Новая волна». 2012. С. 49]. Кроме этого, его свойства предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии не описаны.

Фенибут - ноотропный препарат [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. «Новая волна». 2012. С. 121]. Описаны и другие свойства фенибута. Например, он обладает утеродепримирующим эффектом [Сергеев П.B., Сизов П.И., Филимонов В.Г., Шевелева Г.А., Духанин А.С. Экспериментальное обоснование для клинического изучения ГАМК-положителъных веществ при угрозе не вынашивания беременности // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1994. 118, N7. С. 35-37]. Однако фенибут не используется в качестве средства, обладающего свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии. Подобные его свойства также не описаны.

Гипоксия во время неонатального периода развития является одной из основных причин возникновения перинатальной патологии головного мозга у новорожденных, что часто приводит к младенческой смертности и инвалидности в последующем онтогенезе [Моргун А.В., Кувачева H.В., Таранушенко Т.Е., Хилажева Е.Д. и др. Современные представления о патогенезе перинатального ишемического повреждения клеток нейроваскулярной единицы головного мозга: молекулы-мишени для нейропротекции. // Вестник РАМН. 2013. Т. 12. С. 26-35].

В настоящее время в клинических и экспериментальных исследованиях активно изучаются механизмы поражений головного мозга новорожденных после воздействия гипоксии, а также механизмы формирования перинатальной патологии мозга, проявляющейся в последующем онтогенезе [Fan X., Kavalaars F., Heijen С.J. et all. Fharmacological neuroprotection after perinatal hypoxic-ishemic brain injury. // Curr. Neuropharmacol. 2010. Vol. 8. №4. P. 324-334; Herrera-Marschitz M., Neira Pefia Т., Rojas-Mancilla E., Morales P. et all. Short - and long-term consequens of perinatal asphyxia: looking for neuroprotective strategies. //Adv. Neurobiol. 2015. №10. P. 169-198].

Перинатальная гипоксия довольно часто является причиной изменения цитоархитектоники неокортекса, задержки нейроногенеза, пролонгированной гибели части нейронов и, в конечном итоге, приводит к сокращению численности популяций разных типов нейронов в различных областях коры головного мозга [Northigton F.J., Chavez-Valdez R., Martin L.J. Neuronal cell death in neonatal hypoxia - ischemia. //Ann. Neuroll. 2011. Vol. 69. №5. P. 743-758; Отеллин B.A., Хожай Л.И., Ватаева Л.А. Влияние гипоксии в раннем перинатальном онтогенезе на поведение и структурные характеристики головного мозга. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии им. И.М. Сеченова. 2012. Т. 48. №5. С. 467-473]. Известно, что основную роль в различных нарушениях деятельности центральной нервной системы (ЦНС) в детском возрасте (задержка психического развития, расстройство памяти, внимания и сна) играет гипоксия в раннем перинатальном онтогенезе [Рогаткин С.О. Актуальные проблемы перинатальной неврологии на современном этапе. // Журн. неврол. психиатр. 2001. №7. С. 4-8; Моргун А.В., Кувачева Н.В., Таранушенко Т.Е., Хилажева Е.Д., Малиновская Н.А., Горина Я.В., Пожиленкова Е.А., Фролова О.В., Салмина А.Б.. Современные представления о патогенезе перинатального ишемического повреждения клеток нейроваскулярной единицы головного мозга: молекулы-мишени для нейропротекции. // Вестник РАМН. 2013. №12. С. 26-35]. Известно также, что перинатальные поражения нервной системы у новорожденных с гипоксией в онтогенезе почти у 40% детей приводят к инвалидности (детский церебральный паралич, симптоматическая эпилепсия, задержка умственного развития, нарушения в когнитивной и эмоциональной сферах) [Власюк В.В. Родовая травма и перинатальные нарушения мозгового кровообращения. СПб. Нестор-История. 2009. 252 с.]. Особенно остро неблагоприятное воздействие гипоксии-ишемии проявляется у недоношенных детей, органы и системы которых еще не сформированы для полноценного функционирования.

В настоящее время среди лекарственных препаратов отсутствуют средства для фармакологической коррекции последствий повреждающего действия перинатальной гипоксии на мозг. Фармакологически активные вещества, обладающие свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии также неизвестны.

Поэтому, поиск высокоэффективных средств в ряду производных ГАМК для фармакологической коррекции последствий повреждающего действия перинатальной гипоксии, сочетающих невысокую себестоимость с выраженной клинической эффективностью, низкой токсичностью, небольшим числом побочных эффектов и безопасных при длительном применении является одной из актуальных задач современной фармакологии.

Задача изобретения - получить высокоэффективное и малотоксичное производное ГАМК, обладающее свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии. Применение производного ГАМК основано на данных о механизмах и мишенях его действия.

Поставленная задача реализуется использованием предлагаемого гидрохлорида 4-амино-3-фенилбутановой кислоты следующей структурной формулы:

Гидрохлорид 4-амино-3-фенилбутановой кислоты обладает свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии.

Лекарственное средство содержит эффективную дозу гидрохлорида 4-амино-3-фенилбутановой кислоты, фармакологически приемлемые носители и целевые добавки.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в том, что предлагаемое вещество малотоксично и обладает свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии.

Гидрохлорид 4-амино-3-фенилбутановой кислоты получают по известному способу [Авт. свид. СССР №236479 (1968). Перекалин В.В., Зобачева М.М., Сопова А.С., Крузите М.П., Спунде Р.Я., Микстайс У.Я. Способ получения гидрохлорида бета-фенил-гамма-аминомасляной кислоты; http://dx.doi.org/10.5935/0103-5053.20160175; RU №2166497].

Полученное таким образом средство было изучено в опытах на животных с острой перинатальной гипоксией.

Далее приводятся примеры, иллюстрирующие специфическую активность гидрохлорида 4-амино-3-фенилбутановой кислоты (АФБК) в условиях острой перинатальной гипоксии.

Острая токсичность АФБК оценивалась по выживаемости белых мышей через 24 часа после парентерального (внутрибрюшинного) и энтерального (внутрижелудочного) введения вещества. Усредненные значения показателей ЛД₅₀: при парентеральном введении - 1200 мг/кг, при энтеральном - более 3500 мг/кг. Вещество относится к малотоксичным, что позволяет классифицировать его как малоопасное.

Для изучения специфической активности АФБК были использованы стандартные экспериментальные методы исследования, основанные на применении глутамат-декарбоксилазы GAD-67 в качестве маркера ГАМК-ергических нейронов.

В работе были использованы новорожденные животные лабораторных крыс линии Wistar, содержавшиеся в условиях лабораторного вивария, в течение двух недель до начала эксперимента, на стандартном пищевом рационе, при свободном доступе к воде, при естественном световом режиме. Эксперименты проводились в одно и то же время суток. Приводимые в таблицах значения показателей представляют собой среднестатистическую оценку результатов измерения параметров с учетом принятых уровней достоверности (р<0.05).

Острая перинатальная гипоксия моделировалась на вторые постнатальные сутки крысят в барокамере с проточной газовой смесью: кислород - 7.6-7.8%; углекислый газ - 0.15-0.21% и азот - 91.8% в течение одного часа, при температуре 21.3°С - 23°С и нормальном общем давлении.

Для проведения эксперимента были сформированы следующие группы животных ювенильного (на 20-е сутки жизни) и препубертатного (на 40-е сутки жизни) возраста: контрольная группа 1 - новорожденные крысята (интактные животные), перорально получавшие физиологический раствор -позитивный контроль (n=8-10); контрольная группа 2 - животные, подвергавшиеся воздействию гипоксии и получавшие физиологический раствор - негативный контроль (n=8-10); опытная группа 3 - новорожденные крысята с гипоксией, получавшие АФБК (n=8-10). Исследуемое вещество в дозе 15 мг/кг вводили подкожно, один раз в день, ежедневно в течение 14 суток.

Для проведения гистологических исследований мозг крысят фиксировали в течение 24 часов в цинк-этанол-формальдегиде на фосфатно-солевом буфере (рН=7.4). Фиксированный материал обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике.

Иммуноцитохимическую реакцию проводили на серийных фронтальных парафиновых срезах толщиной 4-5 мкм, окрашенных по методу Ниссля метиленовым синим (Sigma, США) в синтетической среде Permaunt (Termo, США).

Для выявления ГАМК-ергических нейронов использовали кроличьи поликлональные антитела (Spring Bioscience, США); в качестве вторичных реагентов для GAD-67 использовали реактивы из набора EnVision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit (DakoCytomation, США). Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции применяли стандартную тест-систему, в качестве хромогена использовали 3,3'-диаминобензидин (DAB+) (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали гематоксилином Джилла и заключали в синтетическую заливочную среду Permaunt (Termo, США). При проведении иммуноцитохимической реакции все процедуры были стандартизированы и осуществлялись одновременно для гистологических срезов, полученных от животных контрольных и опытной групп.

Количественный подсчет ГАМК-ергических нейронов проводили на цифровых изображениях серийных срезов, полученных при помощи светового микроскопа Leica DME (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica ЕСЗ (Leica, Германия). Подсчитывали число ГАМК-ергических нейронов в соматосенсорной области неокортекса на стандартной площади 1,06 мм² при увеличении: окуляр × 10; объектив × 10 или 0,1 μκμ² при увеличении: окуляр × 10; объектив × 40. Подсчитывали среднее число ГАМК-ергических нейронов на площади фрагментов неокортекса и стандартную ошибку среднего значения. Для подсчета использовали прикладные компьютерные программы Statistica 6.0, ImageScope Color и ORIGIN50. Приводимые в таблицах значения показателей представляют собой среднестатистическую оценку результатов измерения параметров с учетом принятых уровней достоверности (р<0.05).

Влияние АФБК на число ГАМК-ергических нейронов в соматосенсорной области неокортекса (ювенильный и препубертатный возраст животных) (табл. 1)

Результаты исследования показали, что у интактных животных ювенильного возраста (контрольная группа 1) иммунореактивные нейроны присутствуют во всех слоях неокортекса, их достаточно много, они диффузно равномерно рассеяны по всему неокортексу (табл. 1). У животных контрольной группы 2 острая перинатальная гипоксия вызывала существенное снижение (на 22%) общего числа ГАМК-ергических нейронов, в соматосенсорной области неокортекса, по сравнению с таковым у крыс контрольной группы 1 (табл. 1). Такой результат свидетельствует о значительной гибели ГАМК-ергических нейронов после воздействия перинатальной гипоксии. Изучение влияния АФБК на гибель ГАМК-ергических нейронов у животных в условиях гипоксии показало, что у крысят ювенильного возраста опытной группы 3 наблюдалось незначительное снижение общего числа ГАМК-ергических нейронов по сравнению с исходными показателями (контрольная группа 1) и было значительно выше (30.7%), чем у животных контрольной группы 2 (табл. 1).

Таким образом, предлагаемый АФБК обладает выраженным свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов мозга крысят ювенильного возраста в условиях острой перинатальной гипоксии, о чем свидетельствует незначительное снижение общего количества ГАМК-ергических нейронов во всех слоях соматосенсорной области неокортекса (табл. 1).

Изучение протективного влияния предлагаемого АФБК на животных, достигших препубертатного возраста, показало, что у интактных животных (контрольная группа 1) также наблюдается значительная популяция ГАМК-ергических нейронов во всех слоях неокортекса (табл. 1). У крыс после острой перинатальной гипоксии (контрольная группа 2) общее число ГАМК-ергических нейронов значительно меньше (на 39.5%), по сравнению с таковым у животных контрольной группы 1, что свидетельствует о прогрессирующем снижении плотности ГАМК-ергических нейронов в структурах соматосенсорной области неокортекса (табл. 1). Результаты экспериментов показали, что у крыс препубертатного возраста опытной группы 3 общее число ГАМК-ергических нейронов во всех слоях неокортекса значительно больше (на 72.3%), чем у животных негативного контроля (контрольная группа 2). Таким образом, АФБК обладает выраженным свойством предотвращать повреждение и гибель ГАМК-ергических нейронов, а также увеличивать миграцию этих нейронов в неокортексе у крыс, перенесших на второй день жизни острую перинатальную гипоксию (табл. 1).

Влияние АФБК на численность тормозных ГАМК-ергических нейронов в различных слоях соматосенсорной области неокортекса (ювенильный и препубертатный возраст животных) (табл. 2, 3)

Изучение влияния АФБК на состояние ГАМК-ергической тормозной системы в разных слоях соматосенсорной области неокортекса животных ювенильного возраста (на 20-е сутки жизни) показало, что у крысят контрольной группы 2 наблюдалось значительное снижение числа тормозных нейронов во всех, но особенно в V и VI слоях неокортекса (табл. 2). В эксперименте на крысятах опытной группы 3 получавших АФБК в дозе 15 мг/кг установлено, что число ГАМК-ергических нейронов у этих животных превосходило таковое у крыс контрольной группы 2 в 1.3-2.0 раза (табл. 2).

Исследование разных слоев соматосенсорной области неокортекса у крыс препубертатного возраста показало, что у животных контрольной группы 2 после перинатальной гипоксии сохраняется тенденция к снижению числа тормозных нейронов в неокортексе (табл. 3). У животных опытной группы 3, получавших АФБК, число тормозных ГАМК-ергических нейронов в разных слоях неокортекса практически соответствует значениям интактных животных (контрольных группа 1) и превосходит в 1.9-2.1 раза таковые у крыс негативного контроля (группа 2) (табл. 3).

Результаты проведенного эксперимента показали, что АФБК в условиях острой перинатальной гипоксии обладает выраженным свойством предупреждать повреждение и гибель ГАМК-ергических нейронов как на 20-е, так и на 40-е сутки постнатального развития.

Лекарственное средство, содержащее в качестве действующего вещества гидрохлорид 4-амино-3-фенилбутановой кислоты, в зависимости от выбранных носителей и целевых добавок, может быть изготовлено в любой твердой или жидкой лекарственной форме.

Таким образом, предлагаемый гидрохлорид 4-амино-3-фенилбутановой кислоты (АФБК) обладает выраженным свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии, имеет низкую токсичность, что предполагает возможность его длительного применения для фармакологической коррекции последствий повреждения ЦНС у детей с перинатальной гипоксией.

Примечания * - в процентах по сравнению с контрольной группой 1;

** - в процентах по сравнению с контрольной группой 2

Примечания * - в процентах по сравнению с контрольной группой 1;

** - в процентах по сравнению с контрольной группой 2

Примечания * - в процентах по сравнению с контрольной группой 1;

** - в процентах по сравнению с контрольной группой 2

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине. Предложено применение гидрохлорида 4-амино-3-фенилбутановой кислоты следующей структурной формулы (I) в качестве средства, обладающего свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии. Технический результат состоит в выраженном свойстве предупреждать повреждение и гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии как на 20-е, так и на 40-е сутки постнатального развития. Низкая токсичность соединения предполагает возможность его длительного применения для фармакологической коррекции последствий повреждения ЦНС у детей с перинатальной гипоксией. 3 табл.

структурная формула (I)

Применение гидрохлорида 4-амино-3-фенилбутановой кислоты следующей структурной формулы:

в качестве средства, обладающего свойством предупреждать гибель ГАМК-ергических нейронов в условиях острой перинатальной гипоксии.