СПОСОБ ОЦЕНКИ ОСТЕОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК Российский патент 2018 года по МПК A61K35/28 C12Q1/68 

Изобретение относится к клеточной медицине Предложен способ оценки остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток (МСК). Способ основан на измерении экспрессии генов ВМР2, ВМР6, FGF10, HDAC1, HNF1A, KDR, PTK2, SMURF1, SMURF2, TBX5. Способ позволяет определять наиболее оптимальные условия функционирования МСК в зависимости от типа тканевого источника МСК, клеточной плотности МСК, длительности пассирования МСК in vitro, концентрации ростовых сывороточных факторов в микроокружении.

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) относятся к классу соматических полипотентных клеток-предшественников, которые характеризуются способностью к самоподдержанию и дифференцировке в различные типы клеток мезодермы (остеобласты, хондроциты, адипоциты). МСК могут быть выделены также из жировой ткани, плацента, пуповинной крови, Вартонова студня пуповины, амниотической оболочки и жидкости, хрящевой и мышечной ткани. В 2006 году Комитетом по стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии была проведена согласительная конференция и определены «минимальные» критерии, специфичные для МСК: а) адгезия к пластику и фибробластоподобная морфология, б) характерный иммунофенотип (экспрессия CD73, CD90, CD105 и отсутствие экспрессии CD34, CD45, HLA-DR) и в) способность дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлении [Dominici М., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. // Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8, 4. - P. 315-317.1].

В настоящее время МСК, используют для восстановления репаративного остеогенеза у пациентов с различными его нарушениями как местного, так и системного характера [Патенты РФ 2167662, РФ 2235442].

Однако использование МСК в целях трансплантации диктует необходимость предварительной оценки их дифференцировочного потенциала. Способность МСК к направленной дифференцировке in vitro является ключевым параметром, отражающим функциональную активность МСК. Очевидно, что эффективность лечения с использованием трансплантации МСК во многом будет определяться сохранностью их дифференцировочного потенциала, который, в свою очередь, напрямую зависят от множества факторов, таких как источник получения, особенность выделения, способа культивирования и т.д.).

Дифференцировку МСК в остеогенном направлении стимулируют путем их культивирования в течение 18-21 сут в индукционной питательной среде, содержащей дексаметазон или 1,25-дигидроксивитамин D 3, -глицерофосфат и аскорбиновой кислоты-2-фосфат. Для оценки остеогенной дифференцировки МСК используют несколько подходов [4, 5]. Чаще всего проводят гистохимический анализ клеточного монослоя по окрашиванию депозитов кальция во внеклеточном матриксе с помощью специальных красителей (либо ализарина красного S, либо нитрата серебра методом von Kossa). Наличие минерализации, как результат отстеогенной дифференцировки МСК, оценивается визуально с помощью обычной световой микроскопии. Реже используют проточную цитофлюориметрию или полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (real-time PCR) для оценки экспрессии поверхностных маркеров или мРНК генов, специфичных для остеобластов Данные подходы являются, по сути, качественными методами, которые позволяют только выявить остеогенную дифференцировку МСК (есть/нет) без учета ее выраженности и интенсивности.

Для количественной оценки остеогенного потенциала МСК используют измерение уровня кальция в супернатантах, полученных из лизатов клеток монослоя и внеклеточного матрикса. Данный метод требует этапа экстракции синтезированного кальция, для чего МСК обрабатывают 0,5 М раствором HCl при 4°С в течение 4 ч, затем полученный супернатат ультрацентрифугируют, добавляют коммерческий детектирующий реагент и измеряют концентрацию кальция (Са2+, мМ/мкг белка) с помощью фотометрии при длине волны 598 нм. Аналогичный подход по оценке остеогенного потенциала МСК основан на измерении активности щелочной фосфатазы (ЩФ). В этом случае лизат клеток монослоя получают с помощью раствора 0,01% NaCl и 0,1% Triton Х-100, полученный супернатант инкубируют с раствором р-нитрофенил фосфата при 37°С, затем ферментативную реакцию останавливают добавлением 1 М раствора NaOH. Уровень активности ЩФ (нМ/мин/мкг белка) также определяют с помощью многоканальной фотометрии при длине волны 415 нм и температуре 37°С, используя стандартную калибровочную кривую разведений р-нитрофенола. Существенным недостатком данных методов является относительная сложность их выполнения, связанная с необходимостью 1) этапа экстракции для получения клеточного лизата, 2) дополнительной реагентики для постановки самого теста и создания калибровочных кривых, 3) стандартизации полученных результатов по белку. Перечисленные недостатки не только технически усложняют, но и существенно повышают время и стоимость лабораторного анализа.

Наиболее близким решением, избранным в качестве прототипа, является

Способ оценки остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток [Патент 2370771 RU], включающий фотометрическое измерение оптической плотности красителя, используемого для окрашивания депозитов кальция, содержащихся во внеклеточном матриксе МСК после их культивирования в остеогенной индукционной среде, отличающийся тем, что оптическую плотность красителя измеряют в цельных культурах МСК в заданном диапазоне 2-х кратно возрастающих клеточных концентраций, в качестве красителя используют нитрат серебра, при этом интенсивность цветовой реакции оценивают на многоканальном фотометре при длине волны 492 нм, и затем рассчитывают индекс остеогенной дифференцировки в виде соотношения О/К, где О - оптическая плотность в опытных образцах МСК и К - в контрольных образцах МСК, культивированных в таком же диапазоне клеточных концентраций без добавления индукторов остеогенной дифференцировки.

Недостатком данного способа является недостаточная информативность, присущая методам, основанным на фенотипических показателях.

Задачей изобретения является создание способа оценки остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток (МСК). Способ основан на измерении экспрессии генов ВМР2, ВМР6, FGF10, HDAC1, HNF1A, KDR, PTK2, SMURF1, SMURF2. Эта комбинация генов наиболее полно отражает состояние клеток в динамике. Культивирование стволовых клеток на твердой подложке активирует дифференцировку клеток в остеогенном направлении. Так, в частности на примере, культур клеток фетальных фибробластов и клеток пульпы зуба, как в зависимости от длительности, так и при пассировании культур, продемонстрировано изменение остеогенного потенциала культуры МСК, о чем свидетельствует увеличение экспрессии.

В таблице 1 показано изменение количества мРНК в клетках эмбриональных фибробластов при культивировании на твердой поверхности, показывающее активацию остеогенной дифференцировки - увеличение экспрессии генов BGLAP Osteocalcin IGF1 TWIST1 COL1A1 COL3A1 VDR ВМР1 и снижение генов низкой дифференцировки SPP1 Osteopontin IGFR1 FGF-2

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для оценки остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток. Способ включает оценку экспрессию генов BGLAP Osteocalcin, BMPR1A, ВМР1, IGF1, COL1A1,COL3A1, ALPL, RUNX2, SMAD2, SMAD4, VDR, FGF-2, IGFR1, SPP1 Osteopontin, TGFBR1 методом реал-тайм ПЦР. По изменению экспрессии судят об изменении остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток, причем в качестве критерия повышения остеогенного принимают повышение экспрессии генов BGLAP Osteocalcin, ВМР1, IGF-1, COL1A1,COL3A1, ALPL, RUNX2, SMAD2, SMAD4, VDR и понижение экспрессии генов низкой дифференцировки BMPR1A, FGF-2, IGFR1, SPP1 Osteopontin, TGFBR1 на 20-й день культивирования. Использование данного способа позволяет сравнивать между собой различные культуры, а также разные пассажи одной и той же культуры, что позволит выбирать оптимальные клеточные культуры для использования в медицине. 1 табл.

Способ оценки остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток, отличающийся тем, что оценивают экспрессию генов BGLAP Osteocalcin, BMPR1A, ВМР1, IGF1, COL1A1,COL3A1, ALPL, RUNX2, SMAD2, SMAD4, VDR, FGF-2, IGFR1, SPP1 Osteopontin, TGFBR1 методом реал-тайм ПЦР и по изменению экспрессии судят об изменении остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток, причем в качестве критерия повышения остеогенного принимают повышение экспрессии генов BGLAP Osteocalcin, ВМР1, IGF-1, COL1A1,COL3A1, ALPL, RUNX2, SMAD2, SMAD4, VDR и понижение экспрессии генов низкой дифференцировки BMPR1A, FGF-2, IGFR1, SPP1 Osteopontin, TGFBR1 на 20-й день культивирования.