ЖИВОТНЫЕ С ГУМАНИЗИРОВАННЫМ ГЕНОМ IL-15 Российский патент 2018 года по МПК A01K67/27 C07K14/54 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Отличные от человека животные в клетках зародышевой линии которых содержится эндогенный локус отличного от человеческого гуманизированного IL-15. Отличные от человека животные в клетках зародышевой линии которых содержится последовательность, кодирующая гуманизированный ген IL-15, под контролем отличных от человеческих эндогенных регуляторных элементов. Отличные от человека животные (например, млекопитающие, например, грызуны, такие как мыши, крысы и хомяки), которые характеризуются генетической модификацией, включающей замену в эндогенном локусе последовательности отличного от человеческого гена IL-15 на последовательность человеческого или гуманизированного гена IL-15. Грызуны и другие отличные от человека животные в клетках которых экспрессируется человеческий или гуманизированный ген IL-15, расположенный в модифицированном эндогенном локусе отличного от человеческого IL-15. Отличные от человека животные в клетках которых экспрессируется человеческий или гуманизированный IL-15 под контролем отличных от человеческих промотора и/или регуляторных последовательностей IL-15.

Включение перечня последовательностей посредством ссылки

Перечень последовательностей, содержащийся в текстовом файле ASCI, под названием 31013_SEQ.txt с размером 9 KB, созданный 14 октября 2014 года и поданный в Ведомство США по патентам и товарным знакам через EFS Web, включен в настоящий документ посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В данной области техники известны трансгенные мыши со случайным образом встроенными трансгенами, которые содержат последовательность человеческого гена IL-15. Однако трансгенные мыши, в клетках которых экспрессируется человеческий IL-15 в результате экспрессии случайным образом интегрированных трансгенов, в том или ином отношении не обладают оптимальными характеристиками. Например, у большинства мышей с трансгенным человеческим IL-15 отмечается аномальное количество и/или соотношение определенных клеток, включая лимфоциты (например, Т-клетки), что, очевидно, обусловлено нарушением регуляции функции иммунной системы. У таких мышей также отмечается множество патологий, что в конечном итоге предположительно обусловлено нарушением регуляции продукции трансгенного IL-15. Такие нарушения регуляции могут возникать, например, из-за отсутствия эндогенных регуляторных элементов и/или размещения последовательности человеческого гена IL-15 вдали от эндогенного локуса гена IL-15.

В данной области техники сохраняется потребность в получении отличных от человека животных в генах которых бы содержались последовательности, кодирующие человеческий IL-15, при этом последовательности, кодирующие человеческий IL-15, находились бы в отличном от человеческого эндогенном локусе IL-15 и/или под контролем отличных от человеческих регуляторных эндогенных элементов (например, некодирующие области, вышележащие и/или в нижележащие по ходу транскрипции). В данной области техники существует потребность в получении отличных от человека животных в клетках которых бы экспрессировался человеческий IL-15 под контролем отличных от человеческих эндогенных регуляторных элементов. В данной области техники существует потребность в получении отличных от человека животных в клетках которых экспрессия человеческого IL-15 происходила бы таким образом, который бы соответствовал особенностям физиологии данного отличного от человека животного. В данной области техники существует необходимость в получении отличных от человека животных в клетках которых бы экспрессировался человеческий IL-15, причем таким образом, что у отличных от человека животных количество клеток в популяции лимфоцитов, например, в популяции Т-клеток, значительно бы не отклонялось от нормы. В данной области техники также существует потребность в получении отличных от человека животных в клетках которых бы экспрессировался человеческий или гуманизированный IL-15 и у которых бы отсутствовала одна или несколько патологий, которые проявляются у отличных от человека животных трансгенных по человеческому IL-15.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Согласно различным аспектам и вариантам осуществления настоящее изобретение относится к генетически модифицированным отличным от человека организмам в геноме которых содержится гуманизированный локус IL-15. Настоящее изобретение относится к отличным от человека организмам в геноме которых содержится гуманизированный ген IL-15, причем гуманизированный ген IL-15 находится под контролем одного или нескольких отличных от человеческих эндогенных регуляторных элементов. Настоящее изобретение относится к отличным от человека организмам, которые содержат гуманизированный ген IL-15 в отличном от человеческого эндогенном локусе IL-15. Настоящее изобретение относится к отличным от человека организмам, которые содержат эндогенный гуманизированный локус IL-15, который может передаваться через клетки зародышевой линии указанных организмов. Настоящее изобретение относится к отличным от человека животным, например, млекопитающим (например, грызуны, например, мыши или крысы), в которые эксперссируют человеческий IL-15 с модифицированного эндогенного локуса IL-15, причем экспрессируемый IL-15 является полностью или частично человеческим.

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным отличным от человека животным, эмбрионам, клеткам, тканям и нуклеиновым кислотам, в которых содержится геномная последовательность человеческого IL-15, экспрессия которой регулируется отличными от человеческих регуляторными контрольными элементами IL-15. У отличных от человека животных экспрессируется гуманизированный белок IL-15 или полностью человеческий белок IL-15 (например, полностью зрелый человеческий белок IL-15) и отсутствует одна или несколько патологий, характерных для известных в данной области отличных от человека животных трансгенных по человеческому IL-15. Согласно различным вариантам осуществления отличные от человека животные относятся к млекопитающим, например, грызунам, например, мышам, крысам, хомякам и т.д. Согласно конкретному варианту осуществления млекопитающее представляет собой грызуна; согласно другому конкретному варианту осуществления грызун представляет собой мышь или крысу.

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным отличным от человека животным эмбрионам, клеткам, тканям и нуклеиновым кислотам, в которых содержится геномная последовательность человеческого IL-15 в отличном от человеческого эндогенном локусе IL-15. Отличные от человека животные эксперссируют гуманизированный белок IL-15 или полностью человеческий белок IL-15 (например, полностью зрелый человеческий белок IL-15) с отличного от человеческого модифицированного эндогенного локуса, который регулируется одной или несколькими отличными от человеческих эндогенными регуляторными последовательностями модифицированного эндогенного локуса IL-15, и у которых отсутствует одна или несколько патологий, характерных для известных в данной области отличных от человека животных трансгенных по человеческому IL-15. Согласно различным вариантам осуществления отличные от человека животные относятся к млекопитающим, например, грызунам, например, мышам, крысам, хомячкам и т.д. Согласно конкретному варианту осуществления млекопитающее представляет собой грызуна; согласно другому конкретному варианту осуществления грызун представляет собой мышь или крысу.

Согласно различным вариантам осуществления и аспектам в геноме отличных от человека животных содержится модифицированный локус IL-15, при этом модифицированный локус IL-15 может передаваться через зародышевые клетки, причем в модифицированном эндогенном локусе IL-15 гуманизирована по меньшей мере кодирующая зрелый белок часть эндогенного локуса IL-15. Согласно различным вариантам осуществления отличные от человека животные относятся к млекопитающим. Согласно различным вариантам осуществления млекопитающие относятся к грызунам, а грызуны являются гетерозиготными или гомозиготными по модифицированному локусу IL-15. Согласно различным вариантам осуществления грызуны выбраны из мыши и крысы. Согласно различным вариантам осуществления мыши и крысы являются гомозиготными по модифицированному локусу IL-15 и неспособны к экспрессии эндогенного полностью мышиного или полностью крысиного белка IL-15, причем и у мышей, и у крыс экспрессируется зрелый человеческий белок IL-15.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к отличному от человека животному, который содержит первый эндогенный аллель IL-15 дикого типа и второй эндогенный аллель гуманизированного IL-15.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к отличному от человека животному, у которого отсутствует первый эндогенный аллель IL-15 и второй эндогенный аллель гуманизированного IL-15.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к отличному от человека животному, у которого отсутствует функциональный эндогенный аллель IL-15 и содержится по меньшей мере одна копия гуманизированного аллеля IL-15, находящегося под контролем отличных от человеческих эндогенных регуляторных элементов. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере одна копия гуманизированного аллеля IL-15 находится в эндогенном локусе IL-15.

Согласно различным вариантам осуществления и аспектам гуманизации подвергаются один или несколько экзонов и/или интронов в отличном от человеческого эндогенном локусе IL-15. Согласно различным вариантам осуществления и аспектам настоящее изобретение относится к отличным от человека животным, содержащим модифицированный локус IL-15, причем у модифицированного отличного от человека животного сохраняются одна или обе области из отличной от человеческой эндогенной 5'-нетранслируемой области и отличной от человеческой эндогенной 3'-нетранслируемой области.

Согласно одному варианту осуществления гуманизация отличного от человеческого эндогенного локуса IL-15 осуществляется с использованием кодирующей области (или ее фрагмента), которая представляет собой геномный фрагмент локуса человеческого IL-15, в котором содержится по меньшей мере один экзон, кодирующий человеческий белок IL-15.

Согласно одному варианту осуществления гуманизация отличного от человеческого эндогенного локуса IL-15 осуществляется с использованием кодирующей области, которая представляет собой геномный фрагмент локуса человеческого IL-15, в котором содержится каждый человеческий экзон, кодирующий белок IL-15, но не содержится отличный от человеческого экзон, кодирующий белок IL-15.

Согласно одному варианту осуществления локус IL-15, в котором содержится человеческий геномный фрагмент, обеспечивает экспрессию белка IL-15, который при созревании становится полностью человеческим. Согласно одному варианту осуществления гуманизация отличного от человеческого эндогенного локуса IL-15 осуществляется с использованием кДНК, кодирующей человеческий белок IL-15, так что зрелый белок IL-15, образующийся в результате гуманизации локуса, после процессинга в клетках отличного от человека животного становится полностью человеческим.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному отличному от человека животному в геноме которого содержится эндогенный локус IL-15, который гуманизирован полностью или частично, причем в гуманизированном локусе IL-15 содержится гуманизированный ген, кодирующий IL-15, который находится под контролем отличных от человеческих эндогенных регуляторных элементов. Согласно одному варианту осуществления отличные от человеческих эндогенные регуляторные элементы содержат все регуляторные элементы IL-15, расположенные выше (по отношению к направлению транскрипции гена IL-15) первой области, кодирующей белок, или экзона гуманизированного гена IL-15. Согласно одному варианту осуществления отличные от человеческих эндогенные регуляторные элементы содержат все регуляторные элементы IL-15, расположенные ниже (по отношению к направлению транскрипции гена IL-15) последней области, кодирующей белок, или экзона в гуманизированном гене IL-15. Согласно одному варианту осуществления гуманизированный ген, кодирующий IL-15, содержит человеческую 3'-UTR.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, у которого в эндогенном локусе IL-15 заменена эндогенная геномная последовательность IL-15 грызуна на геномную последовательность человеческого IL-15. Согласно одному варианту осуществления генетическиой модификации подвергаются зародышевые клетки отличного от человека животного.

Согласно одному варианту осуществления в гене IL-15 генетически модифицированного грызуна содержится первая регуляторная последовательность гена грызуна, расположенная выше (по отношению к направлению транскрипции гена IL-15) последовательности человеческого гена IL-15, и вторая регуляторная последовательность гена грызуна, расположенная ниже последовательности человеческого гена IL-15. Согласно одному варианту осуществления первая регуляторная последовательность гена грызуна содержит промотор и/или энхансер гена грызуна и вторая регуляторная последовательность гена грызуна содержит 3'-UTR.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному отличному от человека животному, в которое экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-15.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированной мыши, в геноме которой в эндогенном локусе заменена эндогенная последовательность IL-15 мыши (или ее фрагмент) на геномную последовательность человеческого IL-15 (или ее фрагмент) с целью получения модифицированного локуса, причем геномная последовательность человеческого IL-15 содержит по меньшей мере один человеческий экзон, кодирующий белок.

Согласно одному варианту осуществления замещающий фрагмент представляет собой человеческий геномный фрагмент, содержащий по меньшей мере два экзона человеческого IL-15, кодирующих белок. Согласно одному варианту осуществления замещающий фрагмент представляет собой человеческий геномный фрагмент, который содержит по меньшей мере три экзона человеческого IL-15, кодирующих белок. Согласно одному варианту осуществления замещающий фрагмент представляет собой человеческий геномный фрагмент, который содержит по меньшей мере четыре экзона человеческого IL-15, кодирующих белок. Согласно одному варианту осуществления замещающий фрагмент представляет собой человеческий геномный фрагмент, который содержит 3-й, 4-й, 5-й и 6-й экзоны человеческого IL-15, кодирующих белок. Согласно одному варианту осуществления замещающий фрагмент содержит не все экзоны человеческого IL-15, причем человеческие экзоны, которые используются для замены, включают наиболее проксимальные (по отношению к направлению транскрипции гена IL-15) четыре экзона человеческого IL-15, кодирующие белок. Согласно одному варианту осуществления замещающий фрагмент представляет собой, по существу, человеческий геномный фрагмент, который содержит не более, чем четыре экзона человеческого IL-15, кодирующих белок; согласно одному варианту осуществления замена дополнительно включает, по существу, чловеческую последовательность интрона, расположенную перед наиболее дистальным человеческим экзоном, и человеческую последовательность, не кодирующую белок, расположенную за человеческими стоп-кодоном и 3'-UTR.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированной мыши, в геноме которой содержится гуманизированный локус IL-15, причем в гуманизированном локусе IL-15 содержатся экзоны гена мыши, не кодирующие белок, причем каждый экзон мыши, кодирующий (зрелый) белок, заменен на человеческие экзоны, кодирующие (зрелый) белок. Согласно одному варианту осуществления гуманизированный локус IL-15 содержит замену геномного фрагмента мыши, который кодирует последовательность зрелого белка IL-15 мыши (т.е. не белка-предшественника) на человеческий геномный фрагмент, который кодирует последовательности зрелого человеческого белка IL-15 (т.е. не белка-предшественника).

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированной мыши, в гене которой содержится последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или полностью идентична SEQ ID NO: 5.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированной мыши, в гене которой содержится последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или полностью идентична SEQ ID NO: 5; причем в гене мыши отсутствует эндогенная последовательность, кодирующая экзоны с 3 по 6 белка IL-15 мыши, как описано в настоящем документе, и в гене мыши содержится последовательность нуклеиновой кислоты в эндогенном локусе IL-15 мыши, причем последовательность нуклеиновой кислоты кодирует 3-й, 4-й, 5-й и 6-й экзоны человеческого IL-15, как описано в настоящем документе.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого образуется человеческий или гуманизированный белок IL-15 в результате экспрессии эндогенного локуса IL-15 мыши, который модифицирован таким образом, чтобы включить в его соста по меньшей мере один экзон человеческого IL-15, который кодирует аминокислоты, входящие в состав зрелого человеческого белка IL-15. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус IL-15 грызуна содержит по меньшей мере два экзона человеческого IL-15, которые кодируют аминокислоты, входящие в состав зрелого человеческого белка IL-15. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус IL-15 грызуна содержит по меньшей мере три экзона человеческого IL-15, которые кодируют аминокислоты, входящие в состав зрелого человеческого белка IL-15. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус IL-15 грызуна содержит по меньшей мере четыре экзона человеческого IL-15, которые кодируют аминокислоты, входящие в состав зрелого человеческого белка IL-15. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус IL-15 грызуна содержит 3-й, 4-й, 5-й и 6-й экзоны человеческого IL-15, которые кодируют аминокислоты, входящие в состав зрелого человеческого белка IL-15. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус IL-15 грызуна содержит всю последовательность человеческой нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты, входящие в состав зрелого человеческого белка IL-15.

Согласно одному варианту осуществления для гуманизации используют 3'-UTR человеческого IL-15. Согласно одному варианту осуществления локус гена грызуна содержит по меньшей мере один экзон, который не кодирует аминокислоты зрелого белка IL-15 или по меньшей мере один экзон, который содержит нуклеотидную последовательность, которая не кодирует аминокислоты зрелого белка IL-15. Согласно одному варианту осуществления локус гена грызуна содержит по меньшей мере два экзона, которые не кодируют аминокислоты зрелого белка IL-15. Согласно одному варианту осуществления локус гена грызуна содержит по меньшей мере три экзона, которые не кодируют аминокислоты зрелого белка IL-15. Согласно одному варианту осуществления локус гена грызуна содержит четыре экзона, которые не кодируют аминокислоты зрелого белка IL-15.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем популяция лимфоцитов грызуна характериузуется популяцией Т-клеток, которая в количественном отношении не отличается от популяции Т-клеток у мышей дикого типа аналогичного возраста. Согласно одному варианту осуществления модифицированный грызун характериузуется популяцией зрелых Т-клеток, которая в количественном отношении не отличается от популяции зрелых Т-клеток у мышей дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем популяция лимфоцитов грызуна характериузуется популяцией Т-клеток, которая в количественном отношении не отличается от популяции Т-клеток у мышей дикого типа аналогичного возраста. Согласно одному варианту осуществления модифицированный грызун характеризуется популяцией зрелых Т-клеток, которая в количественном отношении не отличается от популяции зрелых Т-клеток у мышей дикого типа аналогичного возраста. Согласно одному варианту осуществления модифицированный грызун характеризуется популяцией периферических Т-клеток, которая в количественном отношении не отличается от популяции периферических Т-клеток у мышей дикого типа аналогичного возраста. Согласно одному варианту осуществления зрелый гуманизированный белок IL-15 идентичен зрелому человеческому белку IL-15.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем популяция лимфоцитов грызуна характеризуется популяцией Т-клеток, в которой соотношение CD4:CD8 не отличается от соотношения CD4:CD8 в популяции Т-клеток мышей дикого типа аналогичного возраста. Согласно одному варианту осуществления гуманизированный белок IL-15 идентичен человеческому белку IL-15.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем популяция лимфоцитов грызуна характеризуется популяцией натуральных киллеров (NK), размер которой примерно совпадает с популяцией NK-клеток мышей дикого типа аналогичного возраста. Согласно одному варианту осуществления гуманизированный белок IL-15 идентичен человеческому белку IL-15.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-15, причем популяция лимфоцитов грызуна характеризуется популяцией Т-клеток и популяцией NK-клеток, причем размер каждой из них не отличается от размера популяции Т-клеток и популяции NK-клеток у мышей дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развивается спонтанное воспаление кишечника. Согласно одному варианту осуществления у грызуна не проявляется предрасположенность к развитию воспаления кишечника в большей степени, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развивается спонтанное воспаление в дуоденоеюнальной области. Согласно одному варианту осуществления у грызуна не проявляется предрасположенность к развитию воспаления в дуоденоеюнальной области в большей степени, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна кишечный эпителий не разрушается в большей степени, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не проявляется целиакия с более высоким коэффициентом и частотой заболеваемости, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не проявляется более высокая резистентность к алиментарному ожирению и не проявляется более высокая чувствительность к инсулину, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем при инфицировании патогеном грызун не более подвержен летальному поражению печени, вызванному липополисахаридом, чем грызун дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развиваются псориатические повреждения с более высоким коэффициентом и частотой заболеваемости, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развивается артрит с более высоким коэффициентом и частотой заболеваемости, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развивается лимфоцитарная инфильтрация суставов с более высоким коэффициентом и частотой заболеваемости, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна развивается воспалительный синовит с более низкой частотой, чем у контрольного грызуна дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развивается одна или несколько патологий с более высоким коэффициентом и частотой заболеваемости, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста, причем указанная одна или несколько патологий выбрана из группы, состоящей из артрита, лимфоцитарной инфильтрации суставов, воспалительного синовита, псориатических повреждений, летального поражения печени, вызванного липополисахаридом бактериального происхождения, резистентности к инсулину, резистентности к алиментарному ожирению, спонтанного воспаления кишечника, спонтанного воспаления в дуоденоеюнальной области, разрушения кишечного эпителия, целиакия и их комбинации.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развивается две или более патологии с более высоким коэффициентом и частотой заболеваемости, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста, причем указанные две или более патологии выбраны из группы, состоящей из артрита, лимфоцитарной инфильтрации суставов, воспалительного синовита, псориатических повреждений, летального поражения печени, вызванного липополисахаридом бактериального происхождения, резистентности к инсулину, резистентности к алиментарному ожирению, спонтанного воспаления кишечника, спонтанного воспаления в дуоденоеюнальной области, разрушения кишечного эпителия и целиакии.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развивается три или более патологии с более высоким коэффициентом и частотой заболеваемости, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста, причем указанные три или более патологии выбраны из группы, состоящей из артрита, лимфоцитарной инфильтрации суставов, воспалительного синовита, псориатических повреждений, летального поражения печени, вызванного липополисахаридом бактериального происхождения, резистентности к инсулину, резистентности к алиментарному ожирению, спонтанного воспаления кишечника, спонтанного воспаления в дуоденоеюнальной области, разрушения кишечного эпителия и целиакии.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развивается четыре или более патологии с более высоким коэффициентом и частотой заболеваемости, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста, причем указанные четыре или более патологии выбраны из группы, состоящей из артрита, лимфоцитарной инфильтрации суставов, воспалительного синовита, псориатических повреждений, летального поражения печени, вызванного липополисахаридом бактериального происхождения, резистентности к инсулину, резистентности к алиментарному ожирению, спонтанного воспаления кишечника, спонтанного воспаления в дуоденоеюнальной области, разрушения кишечного эпителия и целиакии.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развивается пять или более патологий с более высоким коэффициентом и частотой заболеваемости, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста, причем указанные пять или более патологий выбраны из группы, состоящей из артрита, лимфоцитарной инфильтрации суставов, воспалительного синовита, псориатических повреждений, летального поражения печени, вызванного липополисахаридом бактериального происхождения, резистентности к инсулину, резистентности к алиментарному ожирению, спонтанного воспаления кишечника, спонтанного воспаления в дуоденоеюнальной области, разрушения кишечного эпителия и целиакии.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, в клетках которого экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-15, причем у грызуна не развивается шесть или более патологий с более высоким коэффициентом и частотой заболеваемости, чем у грызуна дикого типа аналогичного возраста, причем указанные шесть или более патологий выбраны из группы, состоящей из артрита, лимфоцитарной инфильтрации суставов, воспалительного синовита, псориатических повреждений, летального поражения печени, вызванного липополисахаридом бактериального происхождения, резистентности к инсулину, резистентности к алиментарному ожирению, спонтанного воспаления кишечника, спонтанного воспаления в дуоденоеюнальной области, разрушения кишечного эпителия и целиакии.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному отличному от человека животному у которого гуманизирован эндогенный локус IL-15, причем в клетках животного экспрессируется частично или полностью зрелый человеческий белок IL-15 и, причем частично или полностью зрелый человеческий белок IL-15 экспрессирован на сопоставимом уровне и в тех же тканях, что и эндогенный белок IL-15 у животного дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к большому нацеливающему вектору (LTVEC), который содержит плечи, гомологичные к отличному от человеческого эндогенному локусу IL-15, причем LTVEC содержит расположенный между указанными гомологичными плечами непрерывный человеческий геномный фрагмент, содержащий экзоны человеческого гена IL-15, кодирующие белок. Согласно одному варианту осуществления непрерывный человеческий геномный фрагмент не содержит экзоны человеческого локуса IL-15, не кодирующие белок. Согласно одному варианту осуществления непрерывный человеческий геномный фрагмент дополнительно содержит человеческую 3'-UTR гена IL-15.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к конструкции, состоящей из нуклеиновой кислоты (например, ДНК), содержащей от 5'- к 3'-концу по отношению к направлению транскрипции: последовательность нуклеиновой кислоты, гомологичную некодирующей последовательности IL-15 мыши, расположенной на 5'-конце, человеческий геномный фрагмент, содержащий человеческие экзоны, кодирующие белок IL-15, но не содержащий человеческую регуляторную последовательность, расположенный выше по отношению к последовательности человеческого гена, кодирующей белок IL-15, и последовательность нуклеиновой кислоты, гомологичной расположенной на 3'-конце некодирующей последовательности IL-15 мыши. Согласно одному варианту осуществления человеческий геномный фрагмент дополнительно содержит 3'-UTR человеческого IL-15.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к конструкции, состоящей из нуклеиновой кислоты (например, ДНК), содержащей от 5'- к 3'-концу по отношению к направлению транскрипции: последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит область, гомологичную последовательностям гена IL-15 мыши, расположенным выше первого экзона IL-15 мыши, кодирующего белок, человеческий геномный фрагмент, кодирующий человеческий белок IL-15, но не содержащий человеческую регуляторную последовательность, расположенную выше последовательности, кодирующей человеческий белок IL-15, и последовательность нуклеиновой кислоты, гомологичную некодирующей последовательности гена IL-15 мыши, расположенной на 3'-конце. Согласно одному варианту осуществления человеческий геномный фрагмент дополнительно содержит 3'-UTR человеческого IL-15.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к отличной от человеческой генетически модифицированной клетке, причем в отличной от человеческой клетке в отличном от человеческого эндогенном локусе IL-15 заменена последовательность отличного от человеческого гена, кодирующего IL-15, на геномную человеческую последовательность, кодирующую человеческий IL-15.

Согласно одному варианту осуществления геномная человеческая последовательность содержит непрерывную последовательность человеческой нуклеиновой кислоты, охватывающую все экзоны человеческого гена IL-15, кодирующие белок.

Согласно одному варианту осуществления в эндогенном локусе IL-15 генетически модифицированного отличного от человека грызуна содержится промотор отличного от человеческого гена IL-15.

Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное отличное от человека животное содержит все экзоны гена грызуна, не кодирующие белок, и регуляторные области выше первого экзона гена IL-15 грызуна, кодирующего белок.

Согласно одному варианту осуществления клетка выбрана из плюрипотентной клетки, индуцированной плюрипотентной клетки, тотипотентной клетки, эмбриональной стволовой клетки, соматической клетки и яйцеклетки.

Согласно одному варианту осуществления клетки экспрессируют человеческий белок IL-15.

Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. Согласно одному варианту осуществления млекопитающее представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызун выбран из мыши и крысы.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к отличному от человеческого эмбриону, причем эмбрион содержит по меньшей мере одну отличную от человеческой донорскую клетку (например, эмбриональная стволовая клетка, плюрипотентная клетка, тотипотентная клетка и т.д.), в которой в эндогенном локусе отличного от человеческого гена IL-15 заменена кодирующая IL-15 эндогенная последовательность отличной от человеческой нуклеиновой кислоты на человеческую кодирующую IL-15 последовательность нуклеиновой кислоты. Согласно одному варианту осуществления донорская отличная от человеческой клетка относится к эмбриональной стволовой клетке, а эмбрион относится к эмбриону отличного от человека животного-хозяина, который находится на стадии ранней морулы, морулы или бластоцисты.

Согласно одному варианту осуществления отличный от человеческого эмбрион представляет собой эмбрион крысы и по меньшей мере одна донорская отличная от человеческой клетка представляет собой клетку крысы. Согласно одному варианту осуществления эмбриональная стволовая отличная от человеческой клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку крысы, и эмбрион животного-хозяина представляет собой эмбрион крысы.

Согласно одному варианту осуществления отличный от человеческого эмбрион представляет собой эмбрион мыши, и по меньшей мере одна донорская отличная от человеческой клетка представляет собой клетку мыши. Согласно одному варианту осуществления эмбриональная стволовая отличная от человеческой клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и эмбрион животного-хозяина представляет собой эмбрион мыши.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к ткани грызуна, в которой содержится гуманизированный ген IL-15 в эндогенном локусе IL-15 грызуна. Согласно одному варианту осуществления ткань выбрана из эпителиальной ткани, кожной ткани и мышечной ткани.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к генетически модифицированному грызуну, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты (например, ДНК), которая кодирует человеческий белок IL-15, причем грызун не экспрессирует IL-15 грызуна и, причем грызун характеризуется популяцией NK-клеток, размер которой примерно совпадает с популяцией NK-клеток грызуна дикого типа. Согласно одному варианту осуществления грызун представляет собой крысу. Согласно одному варианту осуществления грызун представляет собой мышь.

Согласно одному варианту осуществления грызун характеризуется популяцией периферических Т-клеток, размер которой примерно совпадает с популяцией периферических Т-клеток, свойственной для грызуна дикого типа аналогичного возраста.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу получения отличного от человека животного, которое экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-15, включающий генетическую модификацию отличного от человека животного как описано в настоящем документе, с целью получения последовательности нуклеиновой кислоты в клетках отличного от человека животного, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты (например, ДНК), которая кодирует человеческий или гуманизированный белок IL-15, причем последовательность нуклеиновой кислоты находится под контролем отличных от человеческих эндогенных вышележащих и нижележащих по ходу транскрипции регуляторных элементов.

Согласно некоторым вариантам осуществления отличное от человека животное подвергается генетической модификации путем замены эндогенной геномной последовательности IL-15 (или ее фрагмента), находящейся в эндогенном локусе гена IL-15, на геномную последовательность человеческого IL-15 (или ее фрагмент) с целью получения модифицированного локуса, причем геномная последовательность человеческого IL-15 содержит по меньшей мере один человеческий экзон, кодирующий белок. Согласно одному варианту осуществления замещающий фрагмент представляет собой человеческий геномный фрагмент, содержащий по меньшей мере два экзона человеческого IL-15, кодирующих белок. Согласно одному варианту осуществления замещающий фрагмент представляет собой человеческий геномный фрагмент, который содержит по меньшей мере три экзона человеческого IL-15, кодирующих белок. Согласно одному варианту осуществления замещающий фрагмент представляет собой человеческий геномный фрагмент, который содержит по меньшей мере четыре экзона человеческого IL-15, кодирующих белок. Согласно конкретному варианту осуществления замещающий фрагмент представляет собой человеческий геномный фрагмент, который содержит 3-й, 4-й, 5-й и 6-й экзоны человеческого гена IL-15, кодирующих белок. Согласно одному варианту осуществления замена дополнительно включает человеческую последовательность, не кодирующую белок, расположенную ниже стоп-кодона человеческого гена (например, человеческую 3'-UTR).

Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное получают из плюрипотентной или тотипотентной клетки (например, эмбриональной стволовой клетки, ES-клетки). Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное получают с использованием стадии нуклеарной инъекции, причем конструкцию, состоящую из нуклеиновой кислоты, содержащую гуманизированный ген IL-15 (необязательно вместе с отличными от человеческих вышележащими и/или в нижележащими по ходу транскрипции эндогенными регуляторными последовательностями) вводят путем пронуклеарной инъекции. Согласно одному варианту осуществления конструкция из нуклеиновой кислоты содержит человеческий геномный фрагмент, который содержит 3-й, 4-й, 5-й и 6-й экзоны человеческого IL-15, кодирующих белок. Согласно одному варианту осуществления конструкция из нуклеиновой кислоты дополнительно содержит человеческую последовательность, не кодирующую белок, расположенную ниже человеческого стоп-кодона (например, человеческую 3'-UTR). Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное получают с использованием отличного от человеческого фибробласта, который подвергается генетической модификации с использованием человеческого или гуманизированного гена IL-15 и (необязательно) отличных от вышележащих и/или в нижележащих по ходу транскрипции человеческих регуляторных элементов гена IL-15.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу определения средства, которое является антагонистом человеческого IL-15, предусматривающему стадию введения средства генетически модифицированному грызуну, как описано в настоящем документе, определения влияния указанного средства на опосредованную человеческим IL-15 функцию у грызуна и определения того, является ли указанное средство антагонистом IL-15, если оно оказывает антагонистическое влияние на функцию человеческого IL-15 у генетически модифицированного грызуна.

Согласно одному варианту осуществления средство включает вариабельный домен иммуноглобулина, который связывается с IL-15. Согласно одному варианту осуществления средство специфически связывается с человеческим IL-15, но не с IL-15 грызуна. Согласно одному варианту осуществления средство представляет собой антитело.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу определения того, подавляет ли средство IL-15-опосредованное развитие лимфоцитов, предусматривающему стадию введения генетически модифицированному грызуну, как описано в настоящем документе, антагониста IL-15 на определенное время, определения у грызуна количества лимфоцитов через один или несколько интервалов времени после введения и определения того, уменьшает ли антагонист IL-15 популяцию лимфоцитов.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу определения того, уменьшает ли средство IL-15-опосредованную лимфоцитарную инфильтрацию ткани или сустава, предусматривающему стадию введения генетически модифицированному грызуну, как описано в настоящем документе, антагониста IL-15 на определенное время, определения инфильтрации ткани или сустава через один или несколько интервалов времени после введения, определения того, уменьшает ли антагонист IL-15 лимфоцитарную инфильтрацию ткани или сустава.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу определения того, уменьшает ли средство прогрессирование IL-15-опосредованного артрита, предусматривающему стадию введения генетически модифицированному грызуну, как описано в настоящем документе, антагониста IL-15 на определенное время и дополнительно предусматривающий стадию индукции артрита, определения прогрессирования артрита и определения того, влияет ли антагонист IL-15 на прогрессирование артрита у грызуна.

Если иное не указано или не следует из контекста, то два или более аспекта и/или варианта осуществления могут быть объединены.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана (без соблюдения масштаба) схема локуса мыши, содержащего ген IL-15 дикого типа (вверху), и локуса мыши, содержащего гуманизированный эндогенный ген IL-15 мыши (внизу). Участки последовательности, принадлежащие человеческому гену, показаны символами без заливки; участки последовательности, принадлежащие мышиному гену, показаны символами с темной заливкой; штриховкой обозначены нетранслируемые области. В 3'-5' направлении (в левой части фигуры) некодирующие экзоны гена IL-15 мыши не показаны (и не были гуманизированы). Конструкция в нижней части рисунка изображает вариант осуществления гуманизированного гена IL-15, содержащего гуманизированную 3'-UTR (обозначена штриховкой) и удаляемую кассету с селективным маркером, которую необязательно можно удалить из гуманизированного гена животного.

На фиг. 2 представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 1), в которой представлен расположенный в 3'-5' направлении (по отношению к направлению транскрипции гена IL-15) участок слияния последовательности гена мыши и последовательности человеческого гена; показанная последовательность начинается с последовательности гена мыши, обозначенной прописными буквами, за которой следует сайт рестрикции AsisI, обозначенный строчными буквами, за которым следует последовательность нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-15, обозначенная прописными буквами. Многоточие обозначает, что последовательность продолжается в 3'-5' направлении и 5'-3' направлении по отношению к показанной последовательности.

На фиг. представлен вариант осуществления последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 2), в которой в 5'-3' направлении обозначены кодирующая и некодирующая последовательности человеческого гена IL-15 прописными буквами (человеческая 3'-UTR выделена подчеркиванием), за которыми следует сайт XhoI, обозначенный прописными буквами, за которым следует сайт lox (прописные буквы, подчеркивание), за которым следует последовательность расположенной в 5-3' направлении кассеты с селективным маркером, обеспечивающей устойчивость к неомицину (прописные буквы), которая простирается на расстояние 2,6 т.п.н. в 5'-3' направлении.

На фиг. 4 представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 3), в которой показан участок слияния расположенной в 5'-3' направлении части кассеты с селективным маркером устойчивости к неомицину (прописные буквы) и сайта lox (прописные буквы и подчеркивание), за которым следует сайт NheI (строчные буквы), и за которым следует последовательность гена мыши, расположенная ниже гуманизированного участка (прописные буквы); 2,6 т.п.н. обозначает, что кассета с селективным маркером простирается дополнительно в 3'-5' направлении; многоточие обозначает, что последовательность продолжается.

На фиг. 5 показано выравнивание последовательностей белка для белка-предшественника IL-15 мыши (верхняя строка, «mIL15_precursor», SEQ ID NO: 4); гибридный (мышь/человек) белок-предшественник IL-15 (средняя строка, «Regn_Hybrid_m/h», SEQ ID NO: 5), полученный в результате гуманизации локуса, изображенного на фиг. 1; и известный белок-предшественник человеческого IL-15 изоформы 1 (нижняя строка, «hIL15 isoform 1», SEQ ID NO: 6); место слияния генов, образовавшееся в результате гуманизации, как показано на фиг. 1, обозначено вертикальной стрелкой, указывающей на замену первой аминокислоты с С-конца; начало зрелого белка hIL-15 обозначено изогнутой стрелкой в положении первой аминокислоты с N-конца.

На фиг. 6 показана концентрация IL-15, обнаруженного в сыворотке крови гетерозиготных мышей по гену hIL-15, которым вводили поли(И)-поли(Ц). Контроль означает, что в культивированных спленоцитах мышей дикого типа, которым вводили поли(И)-поли(Ц) hIL-15 не был обнаружен.

На фиг. 7 показано, что при проведении ИФА антитела к человеческому IL-15 не реагируют с IL-15 мыши или поли(И)-поли(Ц). IL-15 мыши был использован в концентрации 1000 пг/мл.

На фиг. 8 показаны данные по секреции IL-15 ДККМ мышей, гетерозиготных по гену человеческого IL-15, полученные с использованием 7-кратно концентрированных супернатантов, собранных после осаждения ДККМ, для мышей, которым не проводили инъекцию, мышей, которым вводили поли(И)-поли(Ц), и мышей, которым вводили ЛПС.

На фиг. 9 показано, что в ДККМ мышей, гетерозиготных по гену человеческого IL-15, образуется транскрипт человеческого гена IL-15 (данные RT-PCR). Дорожка 1: мыши, которым не вводили препарат; дорожка 2: мыши, которым вводили поли(И)-поли(Ц); дорожка 3: только ЛПС; дорожка 4: мыши дикого типа, которым не вводили препарат; дорожка 5: мыши дикого типа, которым вводили поли(И)-поли(Ц); дорожка 6: мыши дикого типа, которым вводили ЛПС; дорожка 7: контроль без кДНК (только вода).

На фиг. 10 показано, что уровень образовавшегося человеческого IL-15 после инъекции поли(И)-поли(Ц) гетерозиготным мышам линии MAID 5218, сопоставим с уровнем человеческого IL-15, характерным для гетерозиготных мышей линии MAID 5217.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным отличным от человека организмам, у которых модифицирован эндогенный локус IL-15, в котором содержится человеческая последовательность, например, одна или несколько отличных от человеческих последовательностей, заменены на одну или несколько человеческих последовательностей. Как правило, модифицированный ген может передаваться от указанных организмов потомкам, т.е. посредством передачи через зародышевые клетки. В частности, настоящее изобретение относится к генетически модифицированным отличным от человека животным.

Генетически модифицированное отличное от человека животное может быть выбрано из группы, состоящей из мыши, крысы, кролика, свиньи, крупного рогатого скота (например, корова, бык, буйвол), оленя, овцы, козы, курицы, кошки, собаки, хорька, примата (например, мармозетка, макак-резус). Что касается отличных от человека животных если не всегда удается получить подходящие генетически модифицируемые эмбриональные стволовые клетки, то используются другие способы для получения генетически модифицированного отличного от человека животного. Такие способы включают, например, модификацию генов отличных от эмбриональных стволовых клеток (например, фибробласты или индуцированные плюрипотентные клетки) и использование пересадки ядер для переноса модифицированных генов в подходящую клетку, например, ооцит, и имплантации модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) в организм отличного от человека животного для формирования эмбриона в подходящих условиях.

Согласно одному аспекту отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. Согласно одному аспекту отличное от человека животное представляет собой небольшое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызун выбран из мыши, крысы и хомячка. Согласно одному варианту осуществления грызун выбран из надсемейства Muroidea. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное относится к семейству, выбранному из Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомяк, крысы и мыши Нового света, полевки), Muridae (настоящие мыши и крысы, песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (лазающие хомячки, скальные мыши, белохвостые крысы, мадагаскарские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие сони) и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). Согласно конкретному варианту осуществления генетически модифицированный грызун выбран из настоящих мышей и крыс (семейство Muridae), песчанки, колючего хомячка и косматого хомяка. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированная мышь относится к представителю семейства Muridae. Согласно одному варианту осуществления животное представляет собой грызуна. Согласно конкретному варианту осуществления грызун выбран из мыши и крысы. Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное представляет собой мышь.

Согласно конкретному варианту осуществления отличное от человека животное относится к грызуну, который представляет собой мышь линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/O1a. Согласно другому варианту осуществления мышь относится к линии 129, выбранной из группы, состоящей из линии 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129Т1, 129Т2 (см., например, Festing et al. (1999) Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, см. также, Auerbach et al. (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). Согласно конкретному варианту осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой гибридную мышь, полученную в результате скрещивания мышей вышеупомянутой линий 129 и линии C57BL/6. Согласно другому конкретному варианту осуществления мышь представляет собой гибридную мышь, полученную в результате скрещивания мышей вышеупомянутых линий 129 или линий BL/6. Согласно конкретному варианту осуществления гибридная линия мышей 129 представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). Согласно другому варианту осуществления мышь относится к линии BALB, например, линии BALB/c. Согласно еще одному варианту осуществления мышь гибридную мышь, полученную в результате скрещивания мышей линии BALB и другой вышеупомянутой линии. Согласно еще одному варианту осуществления мышь относится к гибридной линии (например, 50% BALB/c - 50% 129S4/Sv; или 50% C57BL/6 - 50% 129; например, клетки F1H4, см., например, Auerbach et al. (2000)).

Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное представляет собой крысу. Согласно одному варианту осуществления крыса выбрана из крысы линии Wistar, линии LEA, линии Sprague Dawley, линии Fischer, F344, F6 и Dark Agouti. Согласно одному варианту осуществления линия крыс представляет собой гибридную линию, полученную в результате скрещивания крыс двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 и Dark Agouti.

Отличные от человека животные могут быть генетически модифицированы и/или модифицированы другим способом, подходящим для достижения конкретной цели, с которой получают мышь с гуманизированным IL-15. Например, мыши, пригодные для обеспечения выживания ксенотрансплантата (например, злокачественного новообразования или опухоли человека), могут быть модифицированы одним или несколькими способами, которые могут приводить к частичному или полному подавлению, инактивации или разрушению клеток иммунной системы отличного от человека животного. Подавление, инактивация или разрушение клеток иммунной системы отличного от человека животного могут включать, например, разрушение гемопоэтических клеток и/или иммунокомпетентных клеток химическими средствами (например, введение токсина), физическими средствами (например, облучение животного) и/или с помощью генетической модификации (например, нокаут одного или нескольких генов). Неограничивающие примеры таких мышей могут включать, например, мышей линии NOD, мышей линии SCID, мышей линии NON/SCID, мышей с нокаутом IL2Rγ, мышей линии NOD/SCID/γc^null (см., например, Ito, M. et al. (2002) NOD/SCID/γc^null mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells, Blood 100(9):3175-3182), безтимусных мышей и мышей с нокаутом Rag1 и/или Rag2. Этих мышей необязательно можно облучить или на них можно воздействовать иным образом для разрушения одного или нескольких типов иммунных клеток. Таким образом, согласно различным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к генетически модифицированной мыши, у которой гуманизирована по меньшей мере часть эндогенного локуса отличного от человеческого IL-15 и которую дополнительно подвергают воздействию для частичного или полного подавления, инактивации или разрушения иммунной системы (или одного или нескольких типов клеток иммунной системы) отличного от человека животного. Согласно одному варианту осуществления модификация выбрана, например, из группы, состоящей из модификации, что приводит к получению мыши линии NOD, мыши линии SCID, мыши линии NOD/SCID, мыши с нокаутом IL2Rγ, мыши линии NOD/SCID/γc^null, безтимусной мыши и мыши с нокаутом Rag1 и/или Rag2. Согласно конкретному варианту осуществления в генах мыши заменена вся зрелая последовательность, кодирующая IL-15, на человеческую зрелую последовательность, кодирующую IL-15.

Согласно одному варианту осуществления в генах мыши заменена вся зрелая последовательность, кодирующая IL-15, на человеческую зрелую последовательность, кодирующую IL-15, и мышь относится к линии NOD. Согласно одному варианту осуществления в генах мыши заменена вся зрелая последовательность, кодирующая IL-15, на человеческую зрелую последовательность, кодирующую IL-15, и мышь относится к линии SCID. Согласно одному варианту осуществления в генах мыши заменена вся зрелая последовательность, кодирующая IL-15, на человеческую зрелую последовательность, кодирующую IL-15, и мышь относится к линии NOD/SCID. Согласно одному варианту осуществления в генах мыши заменена вся зрелая последовательность, кодирующая IL-15, на человеческую зрелую последовательность, кодирующую IL-15, и у мыши нокаутирован ген IL-2Rγ. Согласно одному варианту осуществления в генах мыши заменена вся зрелая последовательность, кодирующая IL-15, на человеческую зрелую последовательность, кодирующую IL-15, и мышь относится к линии NOD/SCID/γc^null. Согласно одному варианту осуществления в генах мыши заменена вся зрелая последовательность, кодирующая IL-15, на человеческую зрелую последовательность, кодирующую IL-15, и мышь представляет собой безтимусную мышь. Согласно одному варианту осуществления в генах мыши заменена вся зрелая последовательность, кодирующая IL-15, на человеческую зрелую последовательность, кодирующую IL-15, и у мыши нокаутированы гены Rag1 и/или Rag2.

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным отличным от человека животным у которых модифицирован эндогенный локус отличного от человеческого IL-15, причем модифицирована последовательность человеческой нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере часть зрелого белка IL-15. Хотя настоящее изобретение также относится к генетически модифицированным клеткам, которые модифицированы, как описано в настоящем документе (например, эмбриональные стволовые клетки, соматические клетки), согласно многим аспектам и вариантам осуществления у генетически модифицированных отличных от человека животных модифицирован эндогенный локус IL-15 в зародышевых клетках.

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным отличным от человека животным у которых заменена последовательность отличного от человеческого гена IL-15 на последовательность человеческого гена. Согласно различным вариантам осуществления эндогенный локус отличного от человеческого гена IL-15 полностью или частично модифицирован с целью включения последовательности человеческой нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон, кодирующий зрелый белок IL-15. Согласно различным вариантам осуществления человеческая последовательность представляет собой геномную человеческую последовательность, например, непрерывную геномную человеческую последовательность, содержащую один или несколько экзонов, которые кодируют часть зрелого белка IL-15, или, например, кДНК, которая содержит по меньшей мере один или несколько экзонов, которые кодируют часть зрелого белка IL-15. Согласно различным вариантам осуществления все экзоны, кодирующие белок IL-15, которые кодируют последовательности белка, что входят в состав зрелого человеческого белка IL-15, являются гуманизированными. Согласно различным вариантам осуществления гуманизированный локус IL-15 находится под контролем расположенных выше эндогенных регуляторных последовательностей (например, все эндогенные последовательности, расположенные выше гуманизированного участка). Согласно различным вариантам осуществления гуманизированный участок содержит человеческую 3'-UTR.

Согласно различным вариантам осуществления к отличным от человека животным относятся млекопитающие. Согласно определенным вариантам осуществления к млекопитающим относятся грызуны. Настоящее изобретение относится к грызунам, у которых гуманизирован ген IL-15 в эндогенном локусе IL-15. Настоящее изобретение относится к способам получения грызунов, например, мышей, у которых в эндогенном локусе IL-15 заменен эндогенный ген IL-15 или его фрагмент (например, фрагмент, содержащий один или несколько экзонов) на гуманизированный ген IL-15 или его фрагмент (например, фрагмент, содержащий один или несколько экзонов). Настоящее изобретение относится к клеткам, тканям и мышам, в геноме которых содержится гуманизированный ген, а также к клеткам, тканям и мышам, которые экспрессируют человеческий IL-15 с эндогенного локуса отличного от человеческого IL-15. Настоящее изобретение также относится к грызунам, в клетках которых экспрессируется человеческий белок IL-15 под контролем эндогенного промотора грызуна.

Было установлено, что IL-15 является IL-2-независимым фактором роста Т-клеток, который стимулирует пролиферацию Т-клеток и поддерживает их дифференцировку в тимусе и дифференцировку натуральных киллеров (NK) (Burton, J.D. t al. (1994) А lymphokine, provisionally designated interleukin Τ and produced by a human adult T-cell leukemia line, stimulates T-cell proliferation and the induction of lymphokine-activated killer cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4935-4939; Grabstein, K.H. et al. (1994) Cloning of a Τ Cell Growth Factor That Interacts with the β Chain of the Interleukin-2 Receptor, Science 264:965-968). В рецепторах IL-2 и IL-15 содержатся субъединицы, характерные для обоих интерлейкинов. Однако отдельное значение IL-15 в поддержании популяций иммунокомпетентных клеток не вызывает сомнения; у мышей с нокаутом IL-15/IL-15R отмечается низкое количество CD8+ Т-клеток, низкое количество CD8+ Т-клеток памяти и низкое количество NK-клеток, а также других типов клеток (обзор содержится в Steel, J.C. et al. (2012) Interleukin-15 biology and its therapeutic implications in cancer, Trends in Pharmacological Sciences, 33(1):35-41).

Известно, что IL-15 экспрессируется в эндотелиальных клетках; IL-15, полученный из эндотелиальных клеток, стимулирует трансэндотелиальную миграцию Т-клеток (см., Oppenheimer-Marks, N. (1998) Interleukin 15 is Produced by Endothelial Cells and Increases the Transendothelial Migration of Τ Cells in Vitro and in the SCID Mouse-Human Rheumatoid Arthritis Model In Vivo, J. Clin. Invest. 101(6): 1261-1272). Таким образом, в ранних работах была установлена вероятность того, что привлечение Т-клеток в очаги воспаления опосредовано IL-15 (Id.). Этот факт имеет большое значение, поскольку нарушение регуляции или избыточная экспрессия IL-15 может явно привести к патологическому фенотипу - ситуация, характерная для трансгенных отличных от человека животных в клетках которых нарушена регуляция экспрессии IL-15. Нормальная регуляция IL-15 имеет важное значение, поскольку считается, что IL-15 является провоспалительным цитокином, который находится на вершине каскада провоспалительных цитокинов, предшествующем экспрессии многих медиаторов воспаления (Mclnnes, I.B. et al. (1997) Interleukin-15 mediates Τ cell-dependent regulation of tumor necrosis factor-α production in rheumatoid arthritis, Nature Med. 3:189-195, цитируется в Waldmann, T.A. (2006) The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design, Nature Rev. Immunol. 6:595-601).

У трансгенных мышей, экспрессируюющих человеческий IL-15 под контролем энтероцит-специфического промотора (промотор T3b), используемого для экспрессии человеческого IL-15 в клетках кишечного эпителия, развивается спонтанное воспаление в дуоденоеюнальной области (Yokoyama, S. et al. (2008) Antibody-mediated blockade of IL-15 reverses the autoimmune intestinal damage in transgenic mice that overexpress IL-15 in enterocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(37)15849-15854; Ohta, N. et al. (2002) IL-15-dependent activation-induced cell death-resistant Thl type CD8 alpha beta + NK1.1+ Τ cells for the development of small intestinal inflammation, J. Immunol. 169:460-468). См., также, Nishimura, H. et al. (2005) A novel autoregulatory mechanism for transcriptional activation of the IL-15 gene by nonsecretable isoform of IL-15 generated by alternative splicing, FASEB J. 19:19-28 (трансгенные мыши со случайным образом встроенным вариантом гена mIL-15).

Были получены мыши, трансгенные по секретируемой изоформе IL-15 под контролем промотора гена МНС класса I, но для них характерна избыточная экспрессия IL-15 (Yajima, T. et al. (2001) Memory phenotype CD8(+) Τ cells in IL-15 transgenic mice are involved in early protection against a primary infection with Listeria monocytogenes, Eur. J. Immunol. 31(3):757-766). Избыточная экспрессия IL-15 коррелирует со степенью разрушения кишечного эпителия IL-15-активированными цитотоксическими Т-лимфоцитами при целиакии (Yokoyama, S. et al. (2011) Transgenic Mice that Overexpress Human IL-15 in Enterocytes Recapitulate Both В and Τ Cell- Mediated Pathologic Manifestations of Celiac Disease, J. Clin. Immunol. 31:1038-1044), что предположительно обусловлено стимуляцией пролиферации CD8+ Т-клеток, которые направленно воздействуют на энтероциты через NKG2D (натуральные киллеры группы 2, представитель D)-опосредованный процесс, в который вовлечены распознаваемые рецепторы, такие как MICA/B (Id., на стр. 1039). На настоящий момент представляется очевидным, что локально экспрессируемый IL-15 вызывает опосредованное Т-клетками-повреждение тканей кишечника при целиакии (Id.).

По меньшей мере в одном исследовании по трансгенным мышам, которые были получены методами генной инженерии с целью избыточной экспрессии IL-15 в мышечной ткани и в клетках крови (с использованием промотора, специфичного для скелетных мышц) было установлено, что избыточная экспрессия IL-15 влияет на метаболизм; у таких мышей IL-15, по-видимому, используется в качестве миокина, который уменьшает количество жировой ткани и обеспечивает устойчивость к алиментарному ожирению (Quinn, L.S. et al. (2009) Oversecretion of interleukin-15 from skeletal muscle reduces adiposity, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296:E191-E202).

Также считается, что IL-15 участвует в развитии ревматоидного артрита, возможно, через приводящую к патологии Т-клеточную инфильтрацию суставов (обзор содержится, например, в Fehninger T.A. and Caligiuri, Μ.Α. (2001) Interleukin 15: biology and relevance to human disease, Blood 97(1): 14-32). У пациентов, больных саркоидозом, также образуются альвеолярные макрофаги, в которых экспрессируется IL-15, что может опосредовать пролиферацию Т-клеток в легких (Id., на стр. 23). IL-15 также может опосредовать отторжение органа при аллотрансплантации в результате пролиферации Т-клеток (Id., на стр. 24). IL-15 также может участвовать в развитии Т-клеточного лейкоза взрослых (например, HTLV-1-опосредованный), по меньшей мере частично вследствие активации IL-15-опосредованных путей у взрослых пациентов с Т-клеточным лейкозом (Id.). Работа in vitro дает основания предполагать, что IL-15 активирует репликацию ВИЧ, что также может происходить у людей (Id., на стр. 25).

У трансгенных мышей, у которых экспрессия гена IL-15 происходит под контролем промотора гена МНС класса I, при заражении Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin избыточная продукция IL-15 приводит к их подверженности летальному поражению печени, вызываемому ЛПС, подобного эффекта не наблюдали у мышей лишенных CD8+ Т-клеток (Yajima, Т. (2004) Overexpression of Interleukin-15 Increases Susceptibility to Lipopolysaccharide-Induced Liver Injury in Mice Primed with Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin, Infection and Immunity 72(7):3855-3862), что дает основание полагать, что это явление опосредовано избыточной продукцией IL-15.

Трансгенные мыши, в клетках которых экспрессируется IL-15 под контролем промотора, специфичного для скелетных мышц, характеризуются более высокой чувствительностью к инсулину и резистентностью к алиментарному ожирению, и, как оказалось, активацией метаболизма жирных кислот (Quinn, L.S. et al. (2011) Overexpression of interleukin-15 in mice promotes resistance to diet-induced obesity, increased insulin sensitivity, and markers of oxidative skeletal muscle metabolism, International Journal of Interferon, Cytokine and Mediator Research, 3:29-42).

Была исследована селективная блокада мышиного IL-15, включая растворимую форму IL-15Rα, которая может оказывать благоприятный клинический эффект при лечении ревматоидного артрита (Id., на стр. 27). Таким образом, отличные от человека животные в клетках которых экспрессируется человеческий или гуманизированный IL-15, в том числе в соответствии с физиологическими особенностями животного, являются пригодными для оценки или идентификации селективных блокаторов человеческого гена IL-15. Согласно одному автору обзора: «разработка эффективных блокаторов человеческого гена IL-15, … обладающих in vivo блокирующим действием, может способствовать быстрому внедрению таких подходов в клиническую практику» (Id., на стр. 27). Таким образом, генетически модифицированные отличные от человека животные например, отличные от человека животные в зародышевых клетках которых содержится человеческий ген IL-15, причем если у отличных от человека животных экспрессируется человеческий IL-15 в соответствии с физиологическими особенностями животного, могут оказаться весьма полезными.

IL-15 представляет собой плейотропный цитокин, которые необходим для развития и функционирования NK-клеток и Т-клеточного гомеостаза. Особо важную роль он играет для компартмента CD8+ Т-клеток памяти. Главным образом, IL-15 продуцируют дендритные клетки и макрофаги, и он путем транспрезентации через комплекс IL-15/IL-15R попадает в NK-клетки и Т-клетки. Также известно, что IL-15 является провоспалительным цитокином, который индуцирует продукцию других цитокинов, привлекает и активирует Т-клетки и другие воспалительные клетки, способствует развитию и выживанию NK-клеток и способствует ангиогенезу; и многие из этих признаков проявляются при псориатических повреждениях (обзор и сообщение содержатся в Villadsen, L.S. (2003) Resolution of psoriasis upon blockade of IL-15 biological activity in a xenograft mouse model, J. Clin. Invest. 112(10):1571-1580). Было выдвинуто предположение, что IL-15 находится на вершине каскада провоспалительных цитокинов, причем различные стратегии к модуляции сигнального пути IL-15 для лечения заболеваний находятся в процессе разработки (обзор содержится в Waldman (2006) The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design, Nature Reviews Immmunology, 6:595-601). В ксенотрансплантатной мышиной модели псориаза на мышах линии SCID блокада IL-15 с использованием антитела к IL-15R (или IL-15) привела к уменьшению тяжести псориаза (Id). Таким образом, отличные от человека животные в клетках которых экспрессируется IL-15 в соответствии с их физиологическими особенностями, являются пригодными (например, обладают полезными свойствами) для разработки моделей человеческих заболеваний, включая, в том числе, модели на иммунодефицитных мышах, таких как, например, мыши линии SCID, и других иммунодефицитных мышах. Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к грызуну (например, мышь), в клетках которого содержится человеческий или гуманизированный ген IL-15, находящийся под контролем отличных от человеческих эндогенных регуляторных элементов (например, гуманизация гена, кодирующего IL-15, у грызуна, например, у мыши).

Ген IL-15 находится на хромосоме 4q31 человека и на хромосоме 8 мыши. Человеческий ген содержит 8 экзонов (7 кодирующих) и, как оказывается, встречается в двух изоформах как у людей, так и мышей (см., например, Fehninger Т.А. and Caligiuri, М.А. (2001) Interleukin 15: biology and relevance to human disease, Blood 97(1): 14-32). мРНК для IL-15 получают из целого ряда тканей и типов клеток, и отрицательная регуляция транскрипции гена IL-15 у людей, как оказывается, осуществляется под контролем расположенной в 3'-5' направлении области, удаление которой приводит к значительному увеличению активности промотора IL-15 (Id, на стр. 17). У трансгенных мышей, у которых отсутствует посттранскрипционный контроль гена IL-15, развивается летальный лимфолейкоз (Id). Экспрессия IL-15, как оказывается, подвергается строгой регуляции, которая опосредована по меньшей мере триплетами AUG 5'-нетранслируемой области, 3'-регуляторными элементами и предполагаемым регуляторный сайтом С-концевой области (обзор содержится в Mclnnes, I.B. and Gracie, J.A. (2004) Interleukin-15: a new cytokine target for the treatment of inflammatory diseases, Current Opinion in Pharmacology 4:392-397). Человеческий ген IL-15 содержит девять экзонов и восемь интронов, причем включает экзон 4а, который встречается у людей, а не у мышей, хотя зрелый белок IL-15 кодируется всего лишь с 5 по 8 экзонами (обзор содержится в Budagian, V. et al. (2006) IL-15/IL-15 receptor biology: A guided tour through an expanding universe, Cytokine & Growth Factor Reviews 17:259-280). Существует два мРНК-продукта, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, результатом трансляции которых являются две изоформы IL-15, которые различаются только по длине сигнального пептида, что характерно и для мышиных, и человеческих белков (см., например, Id.). На фиг. 1, на которой показана стратегия гуманизация локуса гена IL-15 мыши, с целью упрощения не показаны расположенные в 3-5' направлении мышиные последовательности, которые не были гуманизированы (включая экзоны, продукты экспрессии которых отсутствуют в зрелом белке), и представлен измененный порядок нумерации экзонов, имеющих отношение к показанной гуманизации. На фиг. 1, на которой показана стратегия гуманизация локуса гена IL-15 мыши, с целью упрощения не показаны расположенные в 3'-5' направлении мышиные последовательности, которые не были гуманизированы (включая экзоны, продукты экспрессии которых отсутствуют в зрелом белке), и представлен измененный порядок нумерации экзонов, имеющих отношение к показанной гуманизации.

IL-15 экспрессирован во многих типах клеток и тканей, включая моноциты, макрофаги, дендритные клетки, кератиноциты, эпидермальные клетки, фибробласты и эпителиальные клетки нервной системы, почек, плаценты, легких, сердца и мышц (Grabstein, K.Н. et al. (1994) Cloning of а Τ Cell Growth Factor That Interacts with the b Chain of the Interleukin-2 receptor, Science 264:965-968).

Кодирующие последовательности IL-15 мыши гуманизировали, как показано на фиг. 1, на которой не представлены два некодирующих экзона (которые не гуманизировали), расположенных намного выше кодирующих экзонов. Для гуманизации гена IL-15 была произведена замена 12299 нуклеотидов последовательности гена мыши на 12896 нуклеотида последовательности человеческого гена.

Согласно одному варианту осуществления в гуманизированном локусе гена IL-15 отсутствует 5'-UTR человеческого IL-15. Согласно одному варианту осуществления гуманизированный локус IL-15 содержит 5'-UTR грызуна. Согласно конкретному варианту осуществления грызун представляет собой мышь, и гуманизированный локус IL-15 содержит 5'-UTR IL-15 мыши.

Грызунов, в клетках которых экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-15, например, в соответствии с физиологическими особенностями животного, можно использовать для различных целей, которые включают, в том числе, разработку терапевтических средств для лечения человеческих заболеваний и нарушений. Антагонисты IL-15, такие как, например, растворимые формы рецептора IL-15, могут предотвращать развитие коллаген-опосредованного артрита в модели на животных (см., Ruchatz, H. et al., (1998) Soluble IL-15 receptor α-chain administration prevents murine collagen-induced arthritis: a role for IL-15 in development of antigen-induced immunopathology, J. Immunol. 160:5654-5660); антитела к IL-15 проявляли эффективность против целого ряда заболеваний, включая псориаз и ревматоидный артрит; в модели артрита на животных антагонист рецептора IL-15 предотвращает как развитие, так и прогрессирование артрита, а также уменьшает лимфоцитарную инфильтрацию суставов (Ferrari-Lacraz, S. et al. (2004) Targeting IL-15 Receptor-Bearing Cells with an Antagonist Mutant IL-15/Fc Protein Prevents Disease Development and Progression in Murine Collagen-Induced Arthritis, J. Immunol.. 173:5815-5826); IL-15-опосредованный сигнальный путь также был вовлечен в развитие IBD, SLE, воспалительного синовита, сахарного диабета и астмы (обзор содержится в Budagian, V. et al. (2006) IL-15/IL-15 receptor biology: A guided tour through an expanding universe, Cytokine & Growth Factor Reviews 17:259-280).

В исследованиях с использованием мышей с нокаутом IL-15 было установлено, что IL-15 необходим для развития определенных иммунокомпетентных клеток, в частности, NK- клеток (обзор содержится в Lodolce, J.P. (2002) Regulation of lymphoid homeostasis by interleukin-15, Cytokine & Growth Factor Reviews, 13:429-439). Действительно, мыши с нокаутом IL-15 не переносят длительное воздействие определенных патогенов (например, вирус осповакцины), что предположительно обусловлено недостатком NK- и CD8+ Т-клеток (Id). Таким образом, изучение влияния антагонистов hIL-15 на функцию человеческих NK-клеток является важной областью применения животных с гуманизированным геном IL-15.

Согласно различным аспектам настоящее изобретение относится к генетически модифицированным животным, в клетках которых экспрессируется человеческий или гуманизированный IL-15, на которых можно проводить исследования антагонистов человеческого IL-15. Генетически модифицированные животные дополнительно могут быть использованы для разработки моделей человеческих заболеваний, например, заболеваний, которые вызваны генетической модификацией (нокин или нокаут) или другим способом. Согласно различным вариантам осуществления у генетически модифицированных отличных от человека животных дополнительно подавляется иммунная система, например, это касается отличных от человека животных которых генетически модифицировали с целью поддержания или обеспечения выживания ксенотрансплантата человеческой опухоли, например, солидной опухоли человека или опухоли кроветворной системы (например, лимфоцитарная опухоль, например, В- или Т-клеточная опухоль).

ПРИМЕРЫ

Пример 1: гуманизация л о куса гена IL-15 мыши

Эмбриональные стволовые клетки мыши были модифицированы для замены определенных последовательностей гена IL-15 мыши на определенные последовательности гена IL-15 человека в эндогенном локусе гена IL-15 мыши под контролем регуляторных элементов гена IL-15 мыши с использованием генно-инженерной технологии VELOCIGENE® для получения гуманизированного локуса, как показан на фиг. 1. На фиг. 1 не показаны расположенные в 3'-5' направлении (по отношению к направлению транскрипции гена IL-15) экзоны 5'-нетранслируемой области гена мыши; в экзоне 1, представленном на фиг. 1, показана небольшая нетранслируемая область (без заливки), расположенная выше кодирующего экзона. Как видно из нижней части рис. 1, в результате проведенной гуманизации кодирующие экзоны 1 и 2 мышиного гена были сохранены, а кодирующие экзоны с 3 по 6 были заменены на экзоны с 3 по 6 человеческого гена. По направлению к 3'-концу за человеческим экзоном 6 следует стоп-кодон и человеческая 3'-UTR и дополнительно человеческая последовательность, расположенная ниже человеческой 3'-UTR. С целью проведения селекции в последовательность была включена кассета с селективным маркером (фланкированная loxP для удаления с помощью Cre). В результате экспрессии гуманизированного локуса, показанного на фиг. 1, образуется зрелый белок IL-15, который является полностью идентичным человеческому.

Направленная конструкция. Бактериальная гомологическая рекомбинация (BHR) используется для конструирования большого направленного вектора (LTVEC), содержащего последовательности человеческого гена IL-15, для адресной доставки человеческого гена в локус гена IL-15 мыши с использованием стандартных методов BHR (см., например, Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659) и BHR для репарации бреши. Линейные фрагменты были получены путем лигирования гомологичных фрагментов, полученных с помощью ПЦР, в клонированные кассеты с последующей экстракцией из геля продуктов лигирования и электропорацией в BHR-компетентные бактерии, несущие целевую бактериальную искусственную хромосому (ВАС). ВАС PRCI23-203P7 используется в качестве источника последовательности гена мыши; ВАС RP11-103B12 используется в качестве источника последовательности человеческого гена IL-15. Вслед за этапом селекции, проводится идентификация требуемых рекомбинантных клонов путем проведения ПЦР новых комбинаций гена ИЛ-15 и рестрикционного анализа. Был создан большой направленный вектор (LTVEC), содержащий гомологичные участки и последовательности человеческого гена IL-15. Эмбриональные стволовые клетки мыши, в которые с помощью электропорации были введены LTVEC конструкции, культивировали на селективной среде и использовали в качестве донорских эмбриональных стволовых клеток для получения мышей с гуманизированным геном IL-15, несущих замену эндогенного локуса мышиного гена IL-15 на человеческую последовательность, как показано на фиг. 1.

Ген IL-15 мыши (mouse GeneID: 103014; RefSeq transcript: NM_008357.2; ensemble eID:16168) модифицируют путем использования геномных координат для делеции GRCM38: ch 8: 82331173-82343471 (минус-цепь); геномный координаты для замены GRCh37: ch4: 142642924-142655819 (плюс-цепь). 12299 нуклеотида последовательности гена мыши были заменены на 128996 нуклеотида последовательности человеческого гена. Последовательность гена IL-15 мыши, содержащая замены, которые описаны выше, графически представлена на фиг. 1.

В векторе LTVEC, содержащем гуманизированный ген IL-15, находился расположенный на 5'-конце участок гена мыши длиной 13 т.н., обеспечивающий адресную доставку, фланкированный на 5'-конце сайтом MluI, и расположенный на 3'-конце участок гена мыши длиной 27 т.н., фланкированный на 3'-конце сайтом AscI. LTVEC подвергали линеаризации с помощью MluI и AscI для осуществления электропорации.

После конструирования LTVEC была получена нуклеотидная последовательность LTVEC, охватывающая расположенный ближе к 5'-концу участок слияния последовательности гена мыши и последовательности человеческого гена, и расположенный ближе к 3'-концу участок слияния последовательности человеческого гена и последовательности гена мыши, которая показана на фиг. 2-4.

После электропорации эмбриональных стволовых клеток осуществляется анализ потери нативнго аллеля (см., например, Valenzuela et al. (2003)) для детекции потери эндогенных последовательностей гена IL-15, обусловленной адресной доставкой.

Эмбриональные стволовые клетки (MAID 5217), содержащие необходимые гены, дополнительно подвергали электропорации с использованием вектора, транзиетно экспрессирующего Cre, для удаления селективной кассеты, обеспечивающая устойчивость к неомицину. Эмбриональные стволовые клетки, полученные в результате удаления кассеты, были обозначены MAID 5218.

Пример 2: мыши с гуманизированным геном IL-15

Получение мышей с гуманизированным геном IL-15. Донорские эмбриональные стволовые клетки мыши, в геноме которых содержится гуманизированный локус гена IL-15 (например, MAID 5217 или MAID 5218), вводят в эмбрионы мыши на ранней стадии развития по методу VELOCIMOUSE® (Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat Biotechnol 25:91-99). Получают гетерозиготных мышей и для получения гомозигот по гуманизированному гену IL-15, проводят скрещивание гетерозигот.

Пример 3: фенотипирование мышей с гуманизированным геном IL-15

Мыши. Были использованы либо самки линии Balb/c дикого типа (ДТ) возрастом 8-10 недель, либо самки линии MAID 5217 аналогичного возраста (гетерозиготные по гену человеческого IL-15). Как альтернативный вариант, были использованы либо мыши дикого типа (ДТ), либо мыши MAID 5217, или MAID 5218 аналогичного возраста (обе линии гетерозиготные по человеческому гену IL-15).

Инъекция поли(И)-поли(Ц) in vivo. Мышам ДТ линии Balb/c или гетерозиготным мышам линии MAID 5217 вводили 50 мкг поли(И)-поли(Ц) (Invivogen; номер по каталогу tlrl-pic) через хвостовую вену (внутривенная инъекция). Через 24 часа, мышей умерщвляли, и производили забор крови путем пункции сердца, а также выделяли сыворотку крови. Также получали образцы селезенки и выделяли спленоциты путем механической дезинтеграции образцов селезенки и фильтрации через сетчатый фильтр с размером пор 70 мкм, после чего проводили обработку лизирующим буфером АСК (Invitrogen) для лизиса эритроцитов. Выделенные спленоциты культивировали для дополнительной стимуляции (см. ниже). В сыворотке крови анализровали содержание человеческого IL-15 с использованием набора R&D Systems human IL-15 QUANTIKINE™. Мышам ДТ или гетерозиготным мышам MAID 5218 мыши интраперитонеально вводили 50 мкг поли(И)-поли(Ц) (Invivogen; номер по каталогу tlrl-pic). На следующий день производили забор крови у мышей путем пункции сердца, и в сыворотке крови анализировали содержание человеческого IL-15 с помощью ИФА (набор R&D Systems QUANTIKINE™ ELISA).

Получение дендритных клеток костного мозга (ДККМ). Костный мозг вымывали из большеберцовой кости мышей, которым не проводили инъекцию, и эритоциты лизировали с помощью лизирующего буфера АСК. Клетки промывали полной средой RPMI (с HEPES, гентамицином, пируватом натрия, L-глутамином и неосновными аминокислотами) + 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС) и подсчитывали их количество. Клетки в количестве 2×10⁶ на лунку культивировали в 6-луночных планшетах с 3 мл/лунка полной RPMI + 10% ФТС + 50 нг/мл мышиного ГМКСФ + 50 нг /мл мышиного IL-4. Клетки культивировали при 37°С / 5% CO2 и добавляли свежеприготовленный ГМКСФ / IL-4 на 2-й и 4-й дни культивирования. На 5-й день культивирования собирали неадгезировавшие ДККМ из культур, и собирали соответствующие культуральные среды для хранения (кондиционированные среды).

Культура спленоцитов. Получали образцы селезенки у соответствующих мышей и получали спленоциты путем механической дезинтеграции образцов селезенки и фильтрации через сетчатый фильтр с размером пор 70 мкм, после чего проводили обработку лизирующим буфером АСК (Invitrogen) для лизиса эритроцитов. Выделенные спленоциты культивировали в 48-луночных планшетах с концентрацией 2×10⁶/мл в 1 мл полной среды RPMI + 10% ФТС. На клетки воздействовали 10 мкг/мл поли(И)-поли(Ц), 10 мкг/мл ФМА или не подвергали воздействию. Клетки культивировали в таких условиях в течение ночи и на следующий день собирали супернатант, и его концентрировали 8-кратно с использованием концентраторов с исходным объемом образца 2 мл Amicon и порогом отсечения по молекулярной массе 3 кДа (MWCO). В концентрированных супернатантах анализировали содержание человеческого IL-15 с использованием набора R&D systems human IL-15 QUANTIKINE™.

Культивирование ДККМ. 2×10⁶/мл ДККМ высевали в 24-луночные планшеты в 0,5 мл свежей полной среды RPMI + 10% ФТС и 0,5 мл кондиционированной среды. На клетки воздействовали 25 мкг/мл поли(И)-поли(Ц), 1 мкг/мл ЛПС или не подвергали воздействию. Все эксперименты проводили в двух повторностях. Клетки культивировали в таких условиях в течение 36 часов и затем собирали супернатант. Супернатанты концентрировали 7-кратно с использованием концентраторов с исходным объемом образца 2 мл Amicon и порогом отсечения по молекулярной массе 3 кДа (MWCO). Уровни человеческого IL-15 в концентрированных супернатантах анализировали с использованием набора R&D systems human IL-15 QUANTIKINE™. РНК выделяли из клеток с помощью набора RNAeasy™ mini prep от Qiagen для ПЦР-анализа с обратной транскрипцией уровня транскрипции человеческого гена IL-15.

ИФА. Для измерения содержания человеческого IL-15 в сыворотке крови и концентрированных супернатантах, полученных после осаждения спленоцитов или ДККМ, использовали набор R&D systems human IL-15 QUANTIKINE™. Набор использовали согласно инструкциям производителя. Дополнительные контрольные испытания (анализы) были проведены с тем, чтобы валидировать специфичность данного набора (идентифицирует только человеческий, а не мышиный, ИЛ-15), и чтобы подтвердить его инертность в отношении поли(И)-поли(Ц). Следовательно, для ИФА использовали 1000 пг/мл мышиного IL-15 (примечание: самая высокая концентрация стандарта для человеческого IL-15 составляет 250 пг/мл) и отдельно поли(И)-поли(Ц) в концентрациях 25 мкг/мл и 12,5 мкг/мл. Было установлено, что антитела набора реагируют специфически с человеческим IL-15 (мышиный IL-15 не был обнаружен) и не реагируют с поли(И)-поли(Ц).

ПЦР с обратной транскрипцией. кДНК получали из ~200 нг выделенной РНК с использованием набора Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Специфический транскрипт человеческого IL-15 амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы Taqman со следующими праймерами: прямой праймер hIL-15: gtaaraagtg atttgaaaaa aattgaagat (SEQ ID NO: 7); обратный праймер hIL-15: tacaaaactc tgcaaaaatt ctttaatat (SEQ ID NO: 8). ПЦР-реакцию осуществляли с использованием следующих 40 циклов: денатурация при 94°С в течение 15 секунд, отжиг при 60°С в течение 30 секунд, элонгация при 72°С, и затем рекцию поддерживают при температуре 4°С. Транскрипты анализировали на 1% агарозном геле с использованием буфера с красителем для нанесения проб Promega 6х loading dye.

Результаты. Человеческий IL-15 был обнаружен в сыворотке крови гетерозиготных мышей MAID 5217, которым вводили поли(И)-поли(Ц), но не у мышей ДТ линии Balb/c аналогичного пола/возраста, которым вводили поли(И)-поли(Ц) (фигура 6; и фигура 10, правая панель). Аналогичным образом, человеческий IL-15 был обнаружен в сыворотке крови гетерозиготных мышей MAID 5218, которым вводили поли(И)-поли(Ц), но не у мышей ДТ аналогичного пола/возраста, которым вводили поли(И)-поли(Ц) (фигура 10, левая панель). Уровень IL-15, вырабатываемого у мышей MAID 5218, был сопоставимым с уровнем IL-15 у мышей MAID 5217 (фигура 10). ФМА-стимулированные спленоциты мышей MAID 5217 секретируют человеческий IL-15 на низком уровне in vitro (в спленоцитах мышей ДТ секреция не наблюдалась).

В дополнение к этому, отмечается секреция человеческого IL-15 ДККМ, полученными у гетерозиготных мышей MAID 5217, после стимуляции поли(И)-поли(Ц) (агонист TLR3) и ЛПС (агонист TLR4) in vitro, а также значительные базальные уровни. ПЦР-анализ с обратной транскрипцией продемонстрировал образование специфического транскрипта человеческого IL-15 только в ДККМ, полученных у гетерозиготных мышей MAID 5217.

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что у гетерозиготных мышей MAID 5217 и MAID 5218 экспрессируется человеческий IL-15.

Пример 4: мыши, гомозиготные по гену человеческого IL-15

Проводили скрещивание гетерозиготных мышей, затем генотипирование, как описано выше. Популяцию гомозиготных по hIL-15 мышей поддерживали путем инбридинга.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированной мыши, которая экспрессирует зрелый полипептид IL-15 человека, в геноме которой в эндогенном локусе IL-15 мыши заменен геномный фрагмент мыши, содержащий последовательности экзонов 3, 4, 5 и 6 IL-15 мыши, которые кодируют зрелый полипептид IL-15 мыши, на человеческий геномный фрагмент, содержащий 3-6-й экзоны человеческого гена IL-15 и кодирующий зрелый полипептид IL-15 человека. Также раскрыт способ получения генетически модифицированной мыши, включающий модификацию генома мыши путем замены геномного фрагмента мыши, содержащего последовательности экзонов 3, 4, 5 и 6 IL-15 мыши, которые кодируют зрелый полипептид IL-15 мыши, в эндогенном локусе IL-15 мыши на человеческий геномный фрагмент, содержащий 3-6-й экзоны человеческого IL-15. Изобретение позволяет эффективно экспрессировать зрелый полипептид IL-15 человека в мыши. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 ил., 4 пр.

1. Генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует зрелый полипептид IL-15 человека, в геноме которой в эндогенном локусе IL-15 мыши заменен геномный фрагмент мыши, содержащий последовательности экзонов 3, 4, 5 и 6 IL-15 мыши, которые кодируют зрелый полипептид IL-15 мыши, на человеческий геномный фрагмент, содержащий 3-6-й экзоны человеческого гена IL-15 и кодирующий зрелый полипептид IL-15 человека, для получения гуманизированного гена IL-15, причем гуманизированный ген IL-15 находится под контролем эндогенных вышележащих регуляторных элементов IL-15 мыши в эндогенном локусе IL-15 мыши.

2. Генетически модифицированная мышь по п. 1, причем экзоны человеческого IL-15, содержащиеся в указанном человеческом геномном фрагменте, содержат 3-й, 4-й, 5-й и 6-й экзоны человеческого IL-15.

3. Генетически модифицированная мышь по п. 1, причем гуманизированный ген, кодирующий IL-15, кодирует белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

4. Генетически модифицированная мышь по п. 1, причем в человеческом геномном фрагменте дополнительно содержится человеческая нуклеиновая кислота, нижележащая по отношению к 3'-UTR человеческого IL-15 в локусе человеческого IL-15.

5. Способ получения генетически модифицированной мыши, включающий модификацию генома мыши путем замены геномного фрагмента мыши, содержащего последовательности экзонов 3, 4, 5 и 6 IL-15 мыши, которые кодируют зрелый полипептид IL-15 мыши, в эндогенном локусе IL-15 мыши на человеческий геномный фрагмент, содержащий 3-6-й экзоны человеческого IL-15 и кодирующий зрелый полипептид человеческого IL-15, для получения гуманизированного гена IL-15, причем гуманизированный ген IL-15 находится под контролем эндогенных вышележащих регуляторных элементов IL-15 мыши в эндогенном локусе IL-15 мыши.

6. Способ по п. 5, причем экзоны человеческого IL-15 в человеческом геномном фрагменте состоят из 3, 4, 5 и 6 экзонов человеческого IL-15.

7. Способ по п. 5, причем в человеческом геномном фрагменте дополнительно содержится человеческая нуклеиновая кислота, нижележащая по отношению к 3'-UTR человеческого IL-15, в локусе человеческого IL-15.

8. Способ по п. 5, причем гуманизированный ген, кодирующий IL-15, кодирует белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

9. Генетически модифицированная мышь по п. 1, причем гуманизированный ген IL-15 содержит эндогенные 1-2-й экзоны IL-15 мыши и 3-6-й экзоны человеческого IL-15.

10. Способ по п. 5, причем гуманизированный ген IL-15 содержит эндогенные 1-2-й экзоны IL-15 мыши и 3-6-й экзоны человеческого IL-15.