СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ Российский патент 2011 года по МПК C12N15/00 

Описание патента на изобретение RU2425880C2

Предлагаемый способ относится к генной инженерии и может быть использован для создания трансгенных мышей, в геноме которых присутствует искусственно введенная дополнительная генетическая информация (трансген). Предлагаемый способ может быть использован во всех научных исследованиях, посвященных механизмам действия и взаимодействия генов, визуализации экспрессии генов в контексте целого генома у мыши, а также при создании мышиных моделей многих заболеваний человека.

В настоящее время используют несколько способов получения трансгенных мышей: метод пронуклеарной микроинъекции, ретровирусная трансфекция зародышей, оплодотворение трансформированными сперматозоидами, введение в зародыш трансформированных культур эмбриональных стволовых клеток.

Метод пронуклеарной микроинъекции является основным методом получения трансгенных мышей. Трансген вводят в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши при помощи микроинъекционной пипетки, что приводит к хромосомной интеграции трансгена в 10-40% развившихся после процедуры зародышей (Gordon J.W. Gene Transfer in Mouse Eggs. Microinjection and Organelle Transplantation Techniques. P.351-370. Academic Press Inc. (London) Ltd., 1986). Количество трансгенных мышей, родившихся после пересадки зародышей, трансформированных методом пронуклеарной микроинъекции, реципиентным самкам, составляет не более 2% (R.L.Brinster, H.Y.Chen, M.E.Trumbauer, M.K.Yagle and R.D.Palmiter. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs // Proc. Nail. Acad. Sci., v.82, p.4438-4442, July, 1985; M.Hirabayashi, R.Takahashi, K.Ito, N.Kashiwazaki, M.Hirao, K.Hirasawa, S.Hichi, M.Ueda. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit and pig genomes // Exp. Anim., v.50 (2), p.125-131, 2001). Несмотря на то что введение чужеродных генов в пронуклеус яйцеклетки обеспечивает наличие трансгена во всех клетках новорожденной мыши, метод пронуклеарной инъекции является трудоемким и требует длительного обучения.

Для получения трансгенных мышей методом ретровирусной трансфекции доимплантационные зародыши культивируют в присутствии вирусных векторов либо производят микроинъекцию клеток, производящих вирусный вектор, в перивителлиновое пространство зародыша (С.Lois, E.J.Hong, S.Pease, E.J.Brown, D.Baltimore. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors // Science, v.295 (5556), 1, p.868-72, 2002). К недостаткам метода относят ограниченную емкость вирусных систем, возможное подавление экспрессии трансгенов и вероятность активации клеточных онкогенов.

Для получения трансгенных мышей также проводят инъекцию модифицированных сперматозоидов в неоплодотворенные яйцеклетки мыши (М.Lavitrano, М.Busnelli, M.G.Cerrito, R.Giovannoni, S.Manzini, A.Vargiolu. Sperm-mediated gene transfer // Reprod. Fertil. Dev., v.18 (1-2), p.19-23, 2006). Преимуществом метода является возможность использования сперматозоидов после криоконсервации. Однако этот метод связан с трудностями трансфекции сперматозоидов мыши и большим количеством микроманипуляций (Anthony С.F.Perry, Teruhiko Wakayama, Hidefumi Kishikawa, Tsuyoshi Kasai, Masaru Okabe, Yutaka Toyoda, Ryuzo Yanagimachi. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection // Sceince, v.284, p.14, May, 1999).

Широко используют для получения трансгенных мышей также трансформированные генными конструкциями культуры эмбриональных стволовых клеток мыши. Преимуществом этого подхода является возможность анализа интеграции и экспрессии введенного трансгена непосредственно в культуре клеток. Линии трансформированных эмбриональных стволовых клеток мыши с оптимальными характеристиками используются для получения химерных зародышей, а впоследствии и мышей, у которых в геном части клеток встроена дополнительная генетическая информация (A.Nagy, E.Gocza, E.M.Diaz, V.R.Prideau, E.I.Makkurla, J.Rossant. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse // Development, v.110, p.815-821, 1990; A.Bradley, M.Evans, M.H.Kaufman, E.Robertson. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines // Nature, v.17-23; 309 (5965), p.255-6, May, 1984). Трансформирование эмбриональных стволовых клеток для создания трансгенных мышей проводится различными способами: микроинъекцией, ретровирусной инфекцией, электропорацией.

В качестве прототипа предлагаемого способа выбран способ получения трансгенных мышей с использованием линии эмбриональных стволовых клеток мыши, трансформированных методом электропорации (Khillan. Jaspal S. (Cherry Hill, NJ). Efficient method for production of compound transgenic animals, United States Patent 6281408, 2001; F.Paul. Lurquin Gene transfer by electroporation // Mol. Biotechnol, v.7(1), p.5-35, Feb, 1997). При помощи электропорации трансген вводят в культуру эмбриональных стволовых клеток мыши. Трансгенные эмбриональные стволовые клетки мыши инъецируют в зародыш мыши, находящийся на стадии морулы или бластоцисты, или смешивают с клетками зародыша. После этого зародыш трансплантируют в матку реципиентной самке. Новорожденные мыши являются химерами и могут нести в себе разное количество трансгенных клеток, развившихся из пересаженных в зародыш трансформированных эмбриональных стволовых клеток. Наличие трансгена в половых клетках родившихся мышей анализируют в процессе их скрещиваний с мышами дикого типа. Недостаток метода заключается в сложности методики, необходимости поддерживать дорогостоящие линии эмбриональных стволовых клеток мыши и в том, что скрещивания для выведения гомозиготной по вносимому трансгену мыши требуют много времени.

В предлагаемом способе, также как и в прототипе, для получения трансгенных мышей производят манипуляции с зародышами мыши в культуре, после чего зародыши переносят в матку самке и получают новорожденных мышей. Также как и прототипе, в предлагаемом способе трансген в геном клеток мыши вводят при помощи электропорации. Но в отличие от прототипа, в предлагаемом способе электропорации подвергают целиком зародыш мыши на стадии одной клетки. При этом не нужно использовать линии эмбриональных стволовых клеток и травмировать зародыши мыши для получения химер. Так как введение дополнительной генетической информации в предлагаемом способе осуществляется на стадии одной клетки, то новорожденные мыши, в отличие от мышей, получаемых с использованием линии эмбриональных стволовых клеток, будут содержать трансген во всех клетках организма. Поэтому не понадобятся дополнительные скрещивания, которые необходимы для получения трансгенных мышей в прототипе предлагаемого способа.

Задачей предлагаемого способа является разработка способа введения дополнительной генетической информации в геном зародыша мыши. Поставленная задача решается тем, что введение дополнительной генетической информации в геном зародыша мыши осуществляется при помощи метода электропорации зародышей мыши на стадии одной клетки.

Сущность предлагаемого способа заключается во введении трансгена в зародыши мыши на стадии одной клетки методом электропорации: до 50 оплодотворенных зародышей мыши помещают в изотонический солевой буферный раствор, содержащий нуклеиновую кислоту в концентрации не менее 5 нг/мкл раствора; электропорацию проводят два раза с интервалом 20-40 секунд, генерируя 3 электрических импульса длительностью 500-1000 мс с напряженностью поля 100-200 В/см. После электропорации зародыши культивируют до стадии бластоцисты. Развившиеся бластоцисты трансплантируют самкам мыши для рождения трансгенных мышей. Предлагаемый способ позволяет сократить сроки получения трансгенных мышей и значительно повысить их количество.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Оплодотворенные мышиные ооциты F1, полученные от самок СВА и самцов C57BL/6, выделяли спустя 13-15 часов после оплодотворения в фосфатном буфере (раствор Дульбекко), содержащем 250 ед./мл гиалуронидазы, свободные от кумулюсных клеток зародыши отмывали семь раз от гиалуронидазы раствором Виттена. Зародыши трансформировали линейным фрагментом гена Igf2 длиной 1143 п.н. с заменой трех нуклеотидов в сайте узнавания рестриктазы StuI (последовательность «AGGCCT» изменена на «AGGGGT»), которая не приводит к изменению аминокислотной последовательности белкового продукта. Для трансформации проводили электропорацию 50 зародышей мыши в 1-мм кювете в 220 мкл раствора, содержащего 200 мкл буферного раствора (150 мМ NaCl и 2 мМ HEPES) и 20 мкл раствора 1 мкг модифицированного фрагмента гена Igf2 в деонизированной воде. Проводили 3 электрических импульса, с напряжением 15 В и длительностью 750 мс с повтором процедуры два раза с интервалом в 30 секунд. Трансформированные зародыши пять раз отмывали свежей средой Виттена и культивировали 4 суток в герметичном флаконе в 500 мкл среды Виттена. Развившиеся бластоцисты трансплантировали в матку ложнобеременным самкам. Наличие модифицированного фрагмента гена Igf2 в геноме новорожденных мышей определяли полимеразной цепной реакцией с рестрикцией. ДНК выделяли из тканей ушной раковины новорожденных мышей, проводили ПЦР с праймерами к фрагменту гена Igf2, содержащему сайт рестрикции StuI, амплифицированный в ходе ПЦР фрагмент подвергали рестрикции рестриктазой StuI. У 48% новорожденных мышей наблюдали после рестрикции и электрофореза наличие трех продуктов в агарозном геле (717 п.н., 426 п.н. и 1143 п.н.), что показывает, что в одном аллеле гена Igf2 отсутствует сайт узнавания рестриктазы StuI, то есть новорожденные мыши являются гетерозиготами по модифицированному фрагменту гена Igf2. Общая эффективность трансгенеза (отношение числа полученных трансгенных мышей к общему числу пересаженных эмбрионов) составила 9,7%.

Пример 2. Выделяли и трансформировали зародыши мыши как описано в примере 1, но в качестве трансгена использовали не линейный фрагмент ДНК, а плазмиду pEGFP-N1, которая несет ген зеленого флуоресцентного белка GFP. Детекцию последовательности гена EGFP в геноме новорожденных мышей проводили методом ПЦР. ДНК выделяли так, как описано в примере 1. У 29% новорожденных мышей методом электрофореза детектировали продукт реакции - 200 п.н.; отношение числа полученных трансгенных мышей к общему числу пересаженных эмбрионов составило 8,6%. Среди полученного от трансгенных по гену EGFP мышей потомства F2 определяли гомозигот EGFP/EGFP методом ПЦР в реальном времени. Анализ экспрессии трансгена EGFP у мышей EGFP/EGFP проводили с помощью микроскопического флюоресцентного анализа. Зародыши мышей EGFP/EGFP выделяли и культивировали до стадии бластоцисты как описано в примере 1. Бластоцисты переносили из среды Виттена в каплю буфера PBS и фотографировали в двух каналах: в проходящем свете (выдержка 50 мс) и в канале GFP (выдержка 100 мс). У 100% трансгенных бластоцист наблюдали наличие экспрессии белка GFP в виде ярких светлых включений в клетках бластоцист в канале GFP (см. чертеж). На криосрезах тканей печени, мозга и матки самок EGFP/EGFP также наблюдали свечение в канале GFP, что говорит о функциональной активности введенного в геном мыши экзогенного гена EGFP методом электропорации зародышей мыши.

Похожие патенты RU2425880C2

название год авторы номер документа
ТРАНСГЕНЕЗ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПУТЕМ ИНТРАЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ИНЪЕКЦИИ СПЕРМЫ 1999
  • Янагимачи Рюзо
  • Перри Энтони С.Ф.
RU2267270C2
ТРАНСГЕННАЯ МЫШЬ, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ СОСТОЯНИЙ, УГРОЖАЮЩИХ РАЗВИТИЕМ СИНДРОМА ВНЕЗАПНОЙ СЕРДЕЧНОЙ СМЕРТИ ПРИ ДИСТРОФИН-ДЕФИЦИТНОЙ КАРДИОМИОПАТИИ 2011
  • Стенина Марина Александровна
  • Кривов Леонид Иванович
  • Савчук Вера Игоревна
  • Нажимов Владимир Павлович
RU2460287C1
ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СТЕРИЛЬНЫЕ ПТИЦЫ И СПОСОБ ИХ ВОСПРОИЗВОДСТВА 2019
  • Макгрю, Майк
  • Вудкок, Марк
RU2807599C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ КУР ОПОСРЕДОВАННЫМ ПЕРЕНОСОМ ГЕНА ПУТЕМ ОБЫЧНОГО ИСКУССТВЕННОГО ОСЕМЕНЕНИЯ 2011
  • Сураева Наталья Михайловна
  • Самойлов Артем Владимирович
  • Городецкий Станислав Иванович
  • Мартиросян Валентина Владимировна
  • Гороховец Неонила Васильевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
RU2517731C2
Способ получения линии гуманизированных мышей, трансгенных по hACE2 2020
  • Брутер Александра Владимировна
  • Кубекина Марина Владиславовна
  • Силаева Юлия Юрьевна
  • Коршунова Диана Сергеевна
  • Коршунов Евгений Николаевич
  • Солдатов Владислав Олегович
  • Дейкин Алексей Васильевич
  • Сергиев Пётр Владимирович
RU2757114C1
СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК В СПЕРМАТОЗОИДЫ 1994
  • Кузнецов Андрей Вадимович
  • Кузнецова Ирина Владимировна
  • Народицкий Борис Савельевич
  • Гольдман Игорь Львович
  • Эрнст Лев Константинович
RU2081914C1
ТРАНСГЕН ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛИПЕПТИДА В МОЛОКЕ ТРАНСГЕННЫХ КОРОВ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННОЙ КОРОВЫ (ВАРИАНТЫ), МОЛОКО ОТ ТРАНСГЕННОЙ КОРОВЫ, ПИЩЕВОЙ СОСТАВ 1990
  • Херберт Л.Хейнекер[Nl]
  • Герман А.Дебор[Nl]
  • Райн Страйкер[Nl]
  • Герард Плантенбург[Nl]
  • Санг Хе Ли[Us]
RU2095414C1
Линия мышей, трансгенных по альфа-цепи Т-клеточного рецептора клеток памяти, для изучения их функциональной активности 2017
  • Замкова Мария Анатольевна
  • Казанский Дмитрий Борисович
  • Калинина Анастасия Андреевна
  • Силаева Юлия Юрьевна
  • Хромых Людмила Менделевна
RU2691484C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕГРАЦИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК В ГЕНОМ ЖИВОТНЫХ НА СТАДИИ ЭМБРИОНА 1999
  • Амиров А.Р.
  • Шайхаев Г.О.
  • Рябых В.П.
RU2178464C2
Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1 2021
  • Кубекина Марина Владиславовна
  • Брутер Александра Владимировна
  • Силаева Юлия Юрьевна
  • Коршунова Диана Сергеевна
  • Коршунов Евгений Николаевич
  • Солдатов Владислав Олегович
  • Дейкин Алексей Васильевич
  • Яблонская Мария Игоревна
RU2768048C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 425 880 C2

Реферат патента 2011 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ

Способ относится к области генной инженерии и биологии развития. Способ предусматривает трансплантацию зародышей, все клетки которых содержат дополнительную генетическую информацию, реципиентной самке. При этом введение дополнительной генетической информации в одноклеточный зародыш проводят в среде, содержащей 150 мМ NaCl, 2 мМ HEPES и нуклеиновую кислоту в концентрации 5 нг/мкл, путем создания двух серий электрических импульсов с напряженностью поля 100-200 В/см длительностью 750 мс, с интервалом 30 с. Способ позволяет существенно повысить количество получаемых трансгенных мышей и сократить сроки их получения. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

Формула изобретения RU 2 425 880 C2

1. Способ получения трансгенных мышей, предусматривающий трансплантацию зародышей, все клетки которых содержат дополнительную генетическую информацию, реципиентной самке, отличающийся тем, что введение дополнительной генетической информации в одноклеточный зародыш проводят в среде, содержащей 150 мМ NaCl, 2 мМ HEPES и нуклеиновую кислоту в концентрации 5 нг/мкл, путем создания двух серий электрических импульсов с напряженностью поля 100-200 В/см длительностью 750 мс, с интервалом 30 с.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда для проведения электропорации содержит до 50 оплодотворенных зародышей мыши.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2011 года RU2425880C2

НЕСТЕРОВА А.П
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
US 2002046414 A1, 18.04.2002.

RU 2 425 880 C2

Авторы

Нестерова Анастасия Петровна

Головатенко-Абрамов Павел Кириллович

Платонов Евгений Семенович

Климов Евгений Александрович

Брускин Сергей Александрович

Даты

2011-08-10Публикация

2009-07-30Подача