ВЕЩЕСТВО, НЕОБРАТИМО УГНЕТАЮЩЕЕ ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 2018 года по МПК C07C309/15 A61K31/185 A61P7/02 

Изобретение относится к медицине, к антитромботическим веществам, а именно к веществам, которые необратимо угнетают функции тромбоцитов. В медицине существует потребность в веществах с антиагрегантным свойством, препятствующих образованию тромбов при участии тромбоцитов в артериальном отделе системы кровообращения.

Известны антиагрегантная и антитромботическая активности ацетилсалициловой кислоты, аспирина (Siller-Matula J.M., Krumphuber J., Jilma В. Pharmacokinetic, pharmacodynamic and clinical profile of novel antiplatelet drugs targeting vascular diseases. British Journal of Pharmacology, 2010, Vol. 159, pp. 502-517). Ацетилсалициловая кислота подавляет функции тромбоцитов путем химической реакции, которая приводит к необратимому ацетилированию серина 530 в тромбоцитной циклооксигеназе 1. В тромбоцитах уменьшается образование тромбоксана А₂, который является вторичным стимулятором тромбоцитов. Ацетилсалициловая кислота проявляет антиагрегантное и соответственно антитромботическое действие только в условиях, когда в стимуляции тромбоцитов участвует их циклооксигеназа.

Известны антиагрегантные тиенопиридиновые соединения: тиклопидин, клопидогрел, прасугрел (Guerre D.R., Tcheng J.E. Prasugrel: Clinical Development and Therapeutic Application. Adv. Ther. 2009, Vol. 26, No. 11, pp. 999-1011). В кровяном русле антиагрегантное действие оказывает метаболит этих соединений, имеющий химически активную сульфгидрильную группу атомов. Метаболит реагирует с пуриновым тромбоцитным рецептором P2Y12 с образованием смешанного дисульфида и инактивирует рецептор. В результате этого тромбоцит необратимо утрачивают способность к агрегации, вызываемой аденозиндифосфорной кислотой (АДФ). При использовании тиенопиридиновых антиагрегантов существует сложность в том, что их антиагрегантное действие проявляется после метаболических превращений.

Известна группа антиагрегантных соединений, которые представляют собой хлорзамещенные фрагменты белков, а именно N-хлорпроизводные пептидов, аминокислот, иминокислот и некоторых родственных соединений. Химически активной частью этих соединений является хлораминовая или хлориминовая группа атомов (Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Средство для снижения агрегации тромбоцитов. Патент СССР №1834659). Эти вещества образуются в организме при активации фагоцитов. Недостатком указанных веществ является низкая устойчивость, так что срок хранения составляет несколько часов.

Известно соединение N,N-дихлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновая кислота (Wang L., Belisle В., Bassiri М. et al. Chemical characterization and biological properties of NVC-422, a novel, stable N-chlorotaurine analog. Antimicrob Agents Chemother. 2011, Vol. 55, No. 6, pp. 2688-2692), имеющее активный хлор и характеризующееся высокой устойчивостью, его антиагрегантная активность неизвестна.

Имеются изобретения (Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Сергиенко В.И. Вещество, угнетающее функции тромбоцитов, патент РФ №2382764; Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Сергиенко В.И. Соединение, реагирующее с тиольной группой атомов и угнетающее функции тромбоцитов, патент РФ на изобретение №2452727), в которых описаны антиагрегантные соединения, относящееся к структурным аналогам N-хлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты. Они, благодаря наличию активного хлора, необратимо угнетают функции тромбоцитов, химически взаимодействуя с серосодержащими группами атомов в белках плазматической мембраны тромбоцитов. Эти соединения имеют недостаточную собственную устойчивость вследствие протекания внутримолекулярной перестройки, приводящей к утрате активного хлора.

Задача изобретения состоит в разработке нового соединения, которое характеризуется повышенной устойчивостью, способно реагировать с сульфгидрильной группой атомов и которое эффективно угнетает способность тромбоцитов к агрегации.

Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании изобретения. "Насыщенное" органическое соединение - атомы углерода в соединении связаны между собой одинарными связями. "Алкил" обозначает насыщенный радикал, получающийся при удалении атома водорода из С-Н связи. Он представляет собой разветвленную или линейную углеводородную цепь атомов. Разветвленная углеводородная цепь - это цепь, которая имеет один или несколько низших алкильных заместителей. "Ацил" обозначает остаток карбоновой кислоты, имеющей насыщенную линейную или разветвленную углеводородную цепь атомов.

Задача изобретения, во-первых, решается тем, что создают соединение, которое является структурным аналогом ацилопроизводного N-хлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ацилопроизводного хлорамина таурина), относящейся к веществам биологического происхождения. Общая формула заявленного соединения следующая:

.

Здесь символ R означает алкил.

Заявленное соединение синтезируют путем введения водного раствора гипохлорита натрия в водный раствор исходного вещества общей формулы

.

Смешивание проводят из расчета не более 1 моля активного хлора на 1 моль исходного вещества, рН смеси устанавливают 4-5. Примеры полученного соединения: N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновая кислота (синоним: N-ацетил-N-хлор-2,2-диметилтаурин) (формула 1), N-пропионил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновая кислота (синоним: N-пропионил-N-хлор-2,2-диметилтаурин) (формула 2).

,.

В заявленном соединении во втором положении этановой части имеются две метальные группы, что обеспечивает повышенную устойчивость соединения.

Задача изобретения, во-вторых, решается тем, что созданное соединение используют в качестве антиагреганта. Заявленное соединение угнетает функции тромбоцитов в крови благодаря наличию N-хлорамидной атомной группы(-N(CI)С(O)-), в которой атом хлора способен химически модифицировать сульфгидрильные группы в белках на поверхности тромбоцита.

На фиг. 1 дана иллюстрация оптического спектра поглощения, т.е. зависимости оптической плотности (D) от длины волны раствора N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты после синтеза и после хранения 2 суток; на фиг. 2 - иллюстрация зависимости от времени оптической плотности раствора N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты при действии восстановленного глютатиона; на фиг. 3 - иллюстрация степени агрегации, вызванной аденозиндифосфорной кислотой, тромбоцитов кролика в смеси с плазмой крови при разных концентрациях N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты; на фиг. 4 - иллюстрация степени агрегации, вызванной аденозиндифосфатом, тромбоцитов человека в смеси с плазмой крови при разных концентрациях N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты.

Создание заявленного соединения, которое имеет повышенную устойчивость, способно реагировать с сульфгидрильной группой и обладает способностью угнетать агрегационную функцию тромбоцитов, подтверждается следующими примерами.

Пример 1

Путем смешивания раствора гипохлорита натрия и водного раствора исходного соединения N-ацетил-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и инкубации смеси (рН 4-4,5) в течение 1 часа получили N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновую кислоту. Смешивание проводили из расчета не более 1 моля активного хлора на 1 моль исходного вещества. Измерили зависимость оптической плотности (D) от длины волны в ультрафиолетовой области, т.е. оптический спектр поглощения, образовавшегося соединения в концентрации 0,4 ммоль/л на спектрофотометре Сагу 50 Varian (фиг. 1, кривая 1 - спектр поглощения N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты сразу после синтеза, кривая 3 для сравнения - спектр поглощения раствора исходного соединения N-ацетил-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты). В интервале длин волн от 235 до 200 нм оптическая плотность резко увеличивается, а в области от 235 до 300 им плавно уменьшается, имеет низкие значения. Такой спектр поглощения характерен для N-хлорамидной группы атомов. Молярный коэффициент поглощения N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты при 250 нм равен 195±10 л/(моль^⋅см).

Пример 2

Получили N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфонову кислоту, как описано в примере 1. Для установления повышенной устойчивости заявленного соединения его раствор в концентрации 3 ммоль/л хранили 2 и 150 суток при температуре 8°С. После хранения в течение 2 суток раствор разбавили водой и измерили спектр поглощения в концентрации 0,4 ммоль/л (фиг. 1, кривая 2). В интервале длин волн 260-200 нм средняя величина разницы оптических плотностей раствора N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты до и после хранения составила менее 9%. Определили содержание активного хлора йодометрическим методом в растворе N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты: через 150 суток сохранилось 75% активного хлора. Таким образом, заявленное соединение обладает повышенной устойчивостью.

Пример 3

Получили описанным в примере 1 способом N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфонову кислоту. Для установления способности заявленного соединения реагировать с сульфгидрильной группой восстановленного глютатиона, представляющего собой фрагмент белков, измерили в зависимости от времени оптическую плотность при длине волны 255 нм водного раствора N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты. Для этого применяли спектрофотометр фирмы Cary 50. В момент, отмеченный стрелкой (фиг. 2, кривая 1), к 1,5 мл раствора заявленного соединения быстро добавили 0,5 мл водного раствора восстановленного глютатиона. Измерили зависимость от времени оптической плотности смеси, в которой конечные концентрации заявленного соединения и восстановленного глютатиона составили соответственно 0,48 и 1,0 ммоль/л. Оптическая плотность быстро уменьшилась на 30% в результате разведения, заявленное соединение окисляет сульфгидрильную группу восстановленного глютатиона с образованием начального продукта, имеющего сульфеновую группу атомов, этот продкт реагирует с непрореагировавшим восстановленным глютатионом с образованием окисленного глютатиона, имеющего дисульфидную (-CH₂SSCH₂-) группу, в итоге оптическая плотность увеличивается (фиг. 2, кривая 2). Таким образом, заявленное соединение реагирует с сульфгидрильной атомной группой.

Пример 4

Из краевой вены уха кролика получили кровь, стабилизированную 3,8% раствором цитрата натрия (9:1 по объему), и центрифугировали в течение 15 мин при 460 g. Надосадочную жидкость, представляющую собой смесь тромбоцитов и плазмы (богатая тромбоцитами плазма, сокращенно БТП), использовали для исследования агрегации тромбоцитов. Для этого использовали турбидиметрический агрегометр фирмы Chrono-Log (США). Измерили зависимость коэффициента светопропускания (Т) БТП от времени, т.е. кинетическую кривую агрегации тромбоцитов. Агрегацию вызывали аденозиндифосфорной кислотой (АДФ) в конечной концентрации 10 мкмоль/л. Измерили аналогичные кинетические кривые агрегации при действии N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты в трех концентрациях: 0,25, 0,50, 1,00 ммоль/л; ее получили, как описано в примере 1. Богатую тромбоцитами плазму инкубировали 5 мин с N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислотой до введения АДФ.

Количественным показателем агрегации тромбоцитов служило изменение коэффициента светопропускания образца БТП через 5 мин после введения АДФ; краткое название показателя - степень агрегации. Степень агрегации тромбоцитов в присутствии заявленного соединения характеризовали относительной величиной ΔТ_в/ΔТ_к, выраженной в процентах: ΔТ_в - изменение коэффициента светопропускания богатой тромбоцитами плазмы после инкубации с заявленным соединением, ΔТ_к - изменение коэффициента светопропускания БТП без заявленного соединения (контрольного образца БТП). N-Ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновая кислота значительно снижает агрегационную активность тромбоцитов: в конечных концентрациях 0,50, 0,75 и 1,00 ммоль/л относительная степень агрегации тромбоцитов составляет соответственно 83±5,8, 57±9,9, 49±6,4% (фиг. 3).Таким образом, заявленное соединение обладает антиагрегантной активностью в тесте с богатой тромбоцитами плазмой крови кролика при стимуляции клеток агонистом АДФ.

Пример 5

Получили кровь здорового донора из локтевой вены, стабилизированную 3,8% раствором цитрата натрия (9:1 по объему). Получили смесь тромбоцитов и плазмы, как описано в примере 4. Измерили кинетическую кривую агрегации тромбоцитов в контрольном образце и аналогичную кривую агрегации тромбоцитов в БТП после инкубации с N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислотой, как описано в примере 4. Агрегацию вызывали введением АДФ в конечной концентрации 5 мкмоль/л. Рассчитали степень агрегации тромбоцитов в присутствии заявленного соединения согласно процедуре, описанной в примере 4. Действие заявленного соединения на агрегацию тромбоцитов исследовали в трех конечных концентрациях 0,50, 0,75 и 1,00 ммоль/л на образцах БТП, полученных из крови четырех доноров, и характеризовали относительной степенью агрегации, как описано в примере 3. N-Ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновая кислот значительно снижает агрегационную активность тромбоцитов: в конечных концентрациях 0,50, 0,75 и 1,00 ммоль/л относительная степень агрегации составляет соответственно 65±12, 52±10, 22±15% (фиг. 4). Таким образом, заявленное соединение обладает антиагрегантной активностью в тесте с богатой тромбоцитами плазмой крови человека в условиях стимуляции клеток агонистом АДФ.

Пример 6

Получили кровь здорового донора из локтевой вены, стабилизированную 3,8% раствором цитрата натрия (9:1 по объему), и для определения агрегационной активности тромбоцитов ее разбавили в 2 раза физиологическим раствором. Агрегацию тромбоцитов индуцировали последовательным введением хлорида кальция (1 ммоль/л) и АДФ (20 мкмоль/л), исследовали с помощью импедансного агрегометра фирмы Chrono-Log (США). Измерили кинетическую кривую агрегации тромбоцитов в крови, представляющую собой зависимость сопротивления для переменного тока от времени, и аналогичные кривые агрегации при действии N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислоты в трех конечных концентрациях: 0,50, 0,75 и 1,00 ммоль/л. Кровь инкубировали 5 мин с N-ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновой кислотой до введения хлорида кальция и АДФ. Показателем агрегационной активности тромбоцитов служила величина изменения электрического сопротивления (обозначение ΔZ) образца крови через 6 мин после введения хлорида кальция и АДФ. Степень агрегации тромбоцитов в присутствии заявленного соединения характеризовали относительной величиной ΔZ_в/AZ_к, где ΔZ_в - изменение электрического сопротивления крови, содержащей заявленное вещество, ΔZ_к - изменение электрического сопротивления контрольного образца. N-Ацетил-N-хлор-2,2-диметил-2-аминоэтансульфоновая кислота, введенная в кровь в конечных концентрациях 0,50 и 0,75 ммоль/л, снижала агрегационную активность тромбоцитов соответственно до 74±16 и 14±13% от контрольного образца. Таким образом, заявленное соединение обладает антиагрегантной активностью в образцах крови.

Изобретение относится к соединению общей формулы

,

где R представляет собой насыщенную линейную или разветвленную углеводородную цепь атомов. Технический результат: получено новое соединение, которое характеризуется повышенной устойчивостью и может найти применение в медицине для угнетения агрегации тромбоцитов. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 6 пр.

1. Соединение общей формулы

,

где R означает насыщенную разветвленную или линейную углеводородную цепь атомов.

2. Применение соединения по пункту 1 для угнетения агрегации тромбоцитов.