СОЕДИНЕНИЕ, РЕАГИРУЮЩЕЕ С ТИОЛЬНОЙ ГРУППОЙ АТОМОВ И УГНЕТАЮЩЕЕ ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 2012 года по МПК C07C309/15 A61K31/185 A61P7/02 

Изобретение относится к медицине, к соединениям, которые оказывают противотромботическое действие, а именно к соединениям, угнетающим функции тромбоцитов. В медицине существует потребность в веществах, препятствующих тромбообразованию в артериях, опосредованному тромбоцитами.

Известна антиагрегантная активность ацетилсалициловой кислоты, аспирина (Siller-Matula J.M., Krumphuber J., Jilma B. Pharmacokinetic, pharmacodynamic and clinical profile of novel antiplatelet drugs targeting vascular diseases. British Journal of Pharmacology, 2010, vol.159, pp.502-517). Ацетилсалициловая кислота необратимо угнетает функции тромбоцитов посредством химической реакции, заключающейся в ацилировании циклооксигеназы 1 (синтазы простагландина Н₂). В тромбоците происходит ослабление образования тромбоксана А₂, выступающего в качестве вторичного стимулятора тромбоцитов. Антиагрегантное и тем самым противотромботическое действие ацетилсалициловой кислоты имеет место только в ситуациях, когда активация тромбоцитов протекает с участием циклооксигеназы.

Известны ингибиторы функций тромбоцитов, антиагрегантные соединения тиенопиридиновой природы: прасугрел, клопидогрел (Guerre D.R., Tcheng J.E. Prasugrel: Clinical Development and Therapeutic Application. Adv. Ther. 2009, vol.26, No.11, pp.999-1011). Эти соединения являются предшественниками активного соединения, в кровяном русле антиагрегантную активность проявляет их метаболит, содержащий химически активную тиольную группу. Метаболит благодаря этой группе инактивирует на поверхности тромбоцита пуриновый рецептор за счет химической реакции и таким образом необратимо подавляет агрегацию, вызываемую аденозиндифосфорной кислотой (АДФ). Применение тиенопиридиновых антиагрегантов осложнено тем, что их антиагрегантная активность проявляется в результате метаболических превращений.

Известна группа антиагрегантных соединений, которые представляют собой хлорзамещенные фрагменты белков, а именно N-хлорпроизводные пептидов, аминокислот, иминокислот и некоторых родственных соединений. Химически активной частью этих соединений является хлораминовая или хлориминовая группа атомов (Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Средство для снижения агрегации тромбоцитов. Патент СССР №1834659). Эти вещества образуются в организме при активации фагоцитов. Недостатком указанных веществ является способность взаимодействовать с несколькими серосодержащими активными группами белков тромбоцитов, а также низкая устойчивость, так что срок хранения составляет несколько часов.

Имеется изобретение (Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Сергиенко В.И. Вещество, угнетающее функции тромбоцитов. Патент РФ №2382764), в котором описано антиагрегантное соединение, относящееся к N-алкильным производным N-хлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты. Оно обладает повышенной устойчивостью и выраженной способностью необратимо угнетать функции тромбоцитов за счет химической модификации плазматической мембраны тромбоцитов в результате взаимодействия с серосодержащими группами атомов поверхностных белков. Это соединение имеет недостаток, состоящий в том, что обладает недостаточной химической избирательностью, реагирует эффективно и с тиольными группами остатков цистеина белков, и с тиоэфирными группами остатков метионина. Это приводит к тому, что в крови это вещество способно реагировать с сывороточным альбумином.

Задача изобретения состоит в разработке нового соединения, которое характеризуется более высокой скоростью реакции с тиольной группой атомов по сравнению с тиоэфирной группой и которое эффективно угнетает активность тромбоцитов.

Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании изобретения. "Насыщенное" органическое соединение - соединение, в котором атомы углерода связаны между собой одинарными связями. "Алкил" обозначает насыщенный радикал, полученный удалением атома водорода из С-Н связи. Он представляет собой линейную или разветвленную углеводородную цепь атомов. Разветвленная углеводородная цепь - это цепь, которая имеет один или несколько низших алкильных заместителей. "Ацил" обозначает остаток карбоновой кислоты, имеющей насыщенную линейную или разветвленную углеводородную цепь атомов.

Задача изобретения, во-первых, решается тем, что создают соединение, которое родственно ацил-производному N-хлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ацил-производному хлорамина таурина), относящейся к веществам биологического происхождения. Общая формула заявленного соединения следующая:

.

Здесь символ R означает алкил.

Заявленное соединение синтезируют путем введения водного раствора исходного вещества общей формулы

в водный раствор гипохлорита натрия. Смешивание проводят из расчета не более 1 моль активного хлора на 1 моль исходного вещества. Примеры полученного соединения: N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота (синонимы: 2-ацетамидоэтансульфоновая кислота, N-ацетил-N-хлортаурин) (формула 1), N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота (синонимы: 2-пропионамидоэтансульфоновая кислота, N-пропионил-N-хлортаурин) (формула 2).

1. , 2. .

В заявленном соединении химически активной является N-хлорамидная группа атомов (-N(Cl)C(O)-). Группа -С(O)- обеспечивает повышенный парциальный электрический заряд атома хлора. Благодаря этому заявленное соединение в отличие от N-алкильного производного N-хлортаурина обладает химической избирательностью: реагирует с тиольными атомными группами намного быстрее, чем с тиоэфирной или дисульфидной группами.

Задача изобретения также решается тем, что созданное соединение используют в качестве антиагреганта. Благодаря наличию N-хлорамидной атомной группы, в которой атом хлора способен участвовать в реакциях окисления тиольных атомных групп в белках тромбоцита, заявленное соединение угнетает функции тромбоцитов в крови.

На фиг.1 дана иллюстрация спектра поглощения N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и спектра поглощения N-хлор-N-пропион-ил-2-аминоэтансульфоновой кислоты; на фиг.2 дана иллюстрация спектра поглощения смеси N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и 1,4-димеркаптобутан-2,3-диола и спектра поглощения 1,4-димеркаптобутан-2,3-диола; на фиг.3 - иллюстрация степени агрегации тромбоцитов, вызванной аденозиндифосфатом, в смеси с плазмой крови при разных концентрациях N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и степени агрегации тромбоцитов, вызванной аденозиндифосфатом, в смеси с плазмой крови при разных концентрациях N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты; на фиг.4 - иллюстрация степени агрегации тромбоцитов, вызванной коллагеном и хлоридом кальция, в смеси с плазмой крови при разных концентрациях N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и степени агрегации тромбоцитов, вызванной коллагеном и хлоридом кальция, в смеси с плазмой крови при разных концентрациях N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты; на фиг.5 - иллюстрация степени агрегации тромбоцитов в крови при разных концентрациях N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и степени агрегации тромбоцитов в крови при разных концентрациях N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты.

Создание заявленного соединения, характеризующегося повышенной скоростью взаимодействия с тиольными атомными группами и обладающего способностью угнетать агрегационную функцию тромбоцитов, подтверждается следующими примерами.

Пример 1

Путем введения в водный раствор гипохлорита натрия водного раствора исходного соединения N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты либо N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты получили соответственно N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновую кислоту и N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновую кислоту. Смешивание проводили из расчета не более 1 моля активного хлора на 1 моль исходного вещества. Измерили зависимости оптической плотности (D) от длины волны, т.е. спектры поглощения образовавшихся соединений на спектрофотометре DU-720 (Beckman-Coulter, США) (фиг.1, кривая 1 - спектр поглощения N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты, кривая 2 - спектр поглощения N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты). В каждом спектре имеется полоса поглощения 190-230 нм, характерная для N-хлорамидной группы атомов. Максимум этой полосы поглощения располагается при 195-199 нм. Молярные коэффициенты поглощения в максимуме полосы поглощения N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты, N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты равны соответственно 4760±76 и 4700±99 л/(моль·см).

Пример 2

Получили N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновую кислоту, как описано в примере 1. Смешали водные растворы N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и 1,4-димеркаптобутан-2,3-диола (сокращенно дитиотреитол). Конечные концентрации обоих соединений после смешивания были равны 0,5 мМ. Через 5 минут для этой смеси измерили на спектрофотометре DU-720 спектр поглощения в области длин волн 230-330 нм; для сравнения измерили спектр поглощения водного раствора дититреитола в концентрации 0,5 мМ (фиг.2, кривая 1 - спектр поглощения смеси N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и дитиотреитола, кривая 2 - спектр поглощения дитиотреитола). В смеси N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и дитиотреитола содержался 1,2-дитиан-4,5-диол (шестичленный циклический дисульфид) с характерным максимумом поглощения 282-284 нм; он образовался в реакции окисления тиольной группы дитиотреитола под действием N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты. Таким образом, заявленное соединение обладает способностью реагировать с тиольными группами атомов органических соединений.

Пример 3

Получили N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновую кислоту и N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновую кислоту, как описано в примере 1. Для сравнения получили N-хлорглицин путем введения в водный раствор гипохлорита натрия водного раствора глицина; смешивание проводили из расчета не более 1 моля активного хлора на 1 моль глицина. Смешали водные растворы N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и дитиотреитола в конечной концентрации 0,5 мМ. Для этой смеси измерили на спектрофотометре DU-720 зависимость от времени (t) оптической плотности при 283 нм, которая прямо пропорциональна концентрации 1,2-дитиан-4,5-диола. Провели такие же измерения для смеси дитиотреитола и других соединений: N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота, N-хлорглицин. Во всех случаях происходило быстрое возрастание оптической плотности вследствие образования 1,2-дитиан-4,5-диола в реакции содержащих активный хлор соединений с тиольной группой дитиотреитола. Для точного количественного описания скорости взаимодействия заявленного соединения с дитиотреитолом определили константы скорости (k) бимолекулярной реакции по данным увеличения оптической плотности после начала реакции. Расчет проводили по формуле

; ,

где C₁ и C₂ обозначают концентрацию заявленного соединения и тиольных групп дитиотреитола; ΔD и ΔC - изменение за период Δt оптической плотности и соответствующее ей изменение концентрации дитиана; ε - молярный коэффициент поглощения дитиана; l - толщина образца раствора. Использовали данные начального изменения оптической плотности в пределах не более 15% от максимального. N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота, N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота характеризуются высокими константами

Таблица 1 Заявленное соединение Константа скорости реакции с тиольной группой 1,4-димеркаптобутан-2,3-диола, М^-1с^-1 N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота 356±4 N-Хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота 296±4,4 N-Хлорглицин 108±3

скорости реакции с тиольной группой, реагируют с тиольной группой с константой скорости, примерно в три раза более высокой, чем аминокслотный хлорамин N-хлорглицин (табл.1). Таким образом, заявленное соединение обладает повышенной способностью реагировать с тиольными группами атомов.

Пример 4

Получили описанным в примере 1 способом N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновую кислоту и N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновую кислоту. Для установления способности заявленного соединения реагировать с тиольной группой N-ацетилцистеина, представляющего собой компонент белков, смешали водные растворы N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты, дитиотреитола и N-ацетилцистеина в конечной концентрации 0,5 мМ. В этой смеси протекала реакция N-ацетилцистеина с N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислотой, конкурирующая с реакцией дитиотреитола с N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислотой. Для сравнения смешали водные растворы N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и дитиотреитола в конечной концентрации 0,5 мМ. Через 5 минут для этих смесей измерили на спектрофотометре DU-720 спектры поглощения в области длин волн 250-330 нм. Точно так же приготовили смесь N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты, дитиотреитола и N-ацетилцистеина и измерили ее спектр поглощения. Рассчитали степень торможения, происходящего вследствие конкурентного взаимодействия N-ацетилцистеина с заявленным соединением, образования дитиана из дитиотреитола; расчет провели по формуле (D_c-D)/D_c, где D_c и D - оптические плотности при 283 нм (пропорциональные концентрации дитиана) соответственно смеси заявленного соединения и дитиотретола и смеси заявленного соединения, дитиотреитола и N-ацетилцистеина. Точно такие же измерения и расчеты проведены для смеси, содержащей заявленное

Таблица 2 Заявленное соединение Степень торможения образования дитиана из дитиотреитола, % N-Ацетилцистеин Восстановленный глютатион Метионин Окисленный глютатион N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота 27±1,3 22±5,4 2±1,3 -5±4 N-Хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота 31±1,3 18±3,5 4±1,7 -1±4

соединение, дитиотреитол и либо восстановленный глютатион, либо метионин, либо окисленный глютатион (табл.2). Реакция заявленного соединения с дитиотреитолом сильно тормозилась N-ацетилцистеином или восстановленным глютатионом, молекулы которых имеют тиольную группу атомов, так что образование дитиана снижалось на 20-30%. Торможение реакции заявленного соединения с дитиотреитолом практически не происходило в присутствии метионина или окисленного глютатиона, молекулы которых содержат соответственно тиоэфирную (-CH₂SCH₃) или дисульфидную (-CH₂SSCH₂-) группы атомов. Таким образом, заявленное соединение обладает химической избирательностью по отношению к тиольным группам атомов в компонентах белков: реагирует с тиольными атомными группами намного быстрее, чем с тиоэфирной или дисульфидной группами.

Пример 5

Получили кровь кролика из краевой вены уха, стабилизированную 3,8% раствором цитрата натрия (9:1 по объему), и центрифугировали при 460g в течение 15 мин. Супернатант, представляющий собой смесь тромбоцитов и плазмы (богатая тромбоцитами плазма - сокращенно БТП) крови, использовали для исследования агрегации тромбоцитов. Для этого применяли турбидиметрический агрегометр фирмы Chrono-Log (США). Измерили кинетическую кривую агрегации тромбоцитов в виде зависимости коэффициента светопропускания (Т) от времени в контроле и аналогичные кинетические кривые агрегации при действии N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты в трех концентрациях: 0,25, 0,50, 1,00 мМ; ее получили, как описано в примере 1. Агрегацию вызывали аденозиндифосфорной кислотой (АДФ) в конечной концентрации 4,27 мкг в 1 мл. N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновуюй кислоту инкубировали 5 мин с богатой тромбоцитами плазмой до введения АДФ. Провели такие же измерения с введением в богатую тромбоцитами плазму крови N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты в трех концентрациях. Это соединение получили, как описано в примере 1. Количественным показателем агрегации тромбоцитов служило изменение коэффициента светопропускания образца БТП через 5 мин после введения АДФ. Степень агрегации тромбоцитов при действии заявленного соединения характеризовали величиной ΔТ/ΔТ₀, где ΔT и ΔТ₀ - изменение коэффициента светопропускания соответственно богатой тромбоцитами плазмы, содержащей заявленное соединение, и контрольного образца. N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота, введенная в богатую тромбоцитами плазму в конечных концентрациях 0,25, 0,50 и 1,00 мМ, значительно снижала агрегационную активность тромбоцитов: степень агрегации составляла соответственно 86±3,3, 79±5, 29±7,6% от контроля (фиг.4, кривая 1). Приблизительно такое антиагрегантное действие оказывала N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота (фиг.4, кривая 2). Таким образом, заявленное соединение обладает антиагрегантной активностью в тесте с богатой тромбоцитами плазмой крови при стимуляции клеток агонистом АДФ.

Пример 6

Получили смесь тромбоцитов и плазмы и измерили кинетическую кривую агрегации тромбоцитов в контроле и при введении заявленного соединения, как описано в примере 5. Агрегацию вызывали последовательным введением коллагена в конечной концентрации 14 мкг в 1 мл и затем хлорида кальция в конечной концентрации 2 мМ. Рассчитали степень агрегации тромбоцитов при действии заявленного соединения согласно процедуре, описанной в примере 5. N-Хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота, введенная в богатую тромбоцитами плазму в конечных концентрациях 0,25, 0,50 и 1,00 мМ, значительно снижала агрегационную активность тромбоцитов: степень агрегации составляла соответственно 61±4,1, 44±10,7 и 31±24,8% от контроля (фиг.5, кривая 2). Приблизительно такое антиагрегантное действие оказывала N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота (фиг.5, кривая 1). Таким образом, заявленное соединение обладает антиагрегантной активностью в тесте с богатой тромбоцитами плазмой крови в условиях стимуляции клеток коллагеном.

Пример 7

Получили кровь кролика способом, описанным в примере 5. Разбавили ее в 2 раза физиологическим раствором и использовали для анализа агрегации тромбоцитов с помощью импедансного агрегометра фирмы Chrono-Log (США). Измерили кинетическую кривую агрегации тромбоцитов в виде зависимости сопротивления переменному току Z крови от времени в контроле и аналогичные кривые агрегации при действии N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты в трех конечных концентрациях: 0,25, 0,50 и 1,00 мМ; ее получили, как описано в примере 1. N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновую кислоту инкубировали с кровью 5 мин до введения коллагена и хлорида кальция. Провели такие же измерения с добавкой в кровь N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты. Это соединение получили, как описано в примере 1. Количественным показателем агрегации тромбоцитов служило максимальное изменение электрического сопротивления образца крови через 6 мин после введения хлорида кальция. Степень агрегации тромбоцитов при действии заявленного соединения характеризовали величиной ΔZ/ΔZ₀, где ΔZ и ΔZ₀ - изменение импеданса соответственно крови, содержащей заявленное вещество, и контрольного образца. N-Хлор-N-ацетил-2-этансульфоновая кислота, введенная в кровь в конечных концентрациях 0,25, 0,50 и 1,00 мМ, значительно снижала агрегационную активность тромбоцитов, степень агрегации составляла соответственно 83±6,9, 54±6,6, 39±3,1% от контроля (фиг.5, кривая 1). Приблизительно такое антиагрегантное действие оказывала N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота при введении в кровь (фиг.5, кривая 2). Таким образом, заявленное соединение обладает антиагрегантной активностью в образцах крови.

Изобретение относится к соединению общей формулы

, где R представляет собой насыщенную линейную или разветвленную углеводородную цепь атомов. Соединение характеризуется химической избирательностью в отношении тиольных групп атомов и угнетает агрегацию тромбоцитов. Техническим результатом изобретения является получение новых антиагрегантов, обладающих способностью путем химической реакции угнетать функции тромбоцитов. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 7 пр.

1. Соединение общей формулы
,
где R означает насыщенную разветвленную или линейную углеводородную цепь атомов.

2. Применение соединения по п.1 для угнетения агрегации тромбоцитов.