СПОСОБ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНЫХ ПОЧВ И ВОДНОЙ СРЕДЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ СПОРООБРАЗУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ BACILLUS VALLISMORTIS Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/07 

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к способам очистки мерзлотных почв и водной среды от нефтезагрязнений. Для очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов в загрязненные субстраты вносят суспензию штамма бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017. Изобретение позволяет за короткие сроки добиться высокой степени очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов (дизельного топлива, газового конденсата.

Уровень техники

Известны штаммы: Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (1. Клюшникова T.M., Смирнова Г.Ф., Куберская С.Л., Слабоспицкая А.Т., Залевский B.C., Касаткина Т.П., Елисеева Г.С. А.с. SU 1493666-A1. Способ очистки подсланцевых сточных вод от нефтепродуктов. Заявка 4280617, 09.07.1987. Опубл. 15.07.1989); Flavobacterium tirrennicum (2. Новожилова М.И., Попова Л.Е., Недоводиева Т.П., Каламкарова Л.И. Штамм бактерий Flavobacterium tirrennicum, используемый для очистки подсланевых и промышленных сточных вод от нефти и нефтепродуктов. А.с. SU 1409594. Заявка 4066152, 24.03.1986. Опубл. 15.07.1988), которые могут разлагать углеводороды нефти. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы: Pseudomonas putida 36 (3. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н. Штамм @ @ 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. А.с. СССР 1076446. Заявка 3474745, 22.07.1982. Опубл. 28.02.1984); Acinetronacter sp.НВ-1 (4. Жиркова Н.А, Кобелев B.C., Холоденко В.П. ШТАММ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент РФ №2077579. Заявка 94043331 от 06.12.1994. Опубл. 20.041997.), Acinetronacter sp.JN-2 (5. Ушков С.Б., Ильинская Н. ШТАММ ACINETOBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент RU N 2064017. Заявка №93009595 от 23.02.1993. Опубл. 20.07.1996.), Pseudomonas alcaligenes E7 (6. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES Е7, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент RU N 2134723, Заявка №98105707 от 25.03.1998. Опубл. 20.08.1999) и Pseudomonas alcaligenes B-1 (7. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев B.C., Акимова Н.А. ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES В-1, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент RU N 2133770. Заявка №98105709 от 25.03.1998. Опубл. 27.07.1999.). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis E-15 (8. Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В. СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЧВ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ. Патент RU №2019527. Заявка №93017464 от 30.04.1993. Опубл. 15.09.1994.), но процесс биодеградации нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

Близким к заявляемому способу является способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis (9. Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова А.М. СПОСОБ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНЫХ ПОЧВ ОТ НЕФТИ СПОРООБРАЗУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ BACILLUS SUBTILIS. Патент RU №2446900. Заявка №2010129158 от 13.07.2010. Опубл. 20.01.2012.), обладающими способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, в течение 3 месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти только в почве, в условиях модельного эксперимента и не способен осуществлять очистку водной среды от нефти и утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +8 до +37°C.

Задачей изобретения является получение способа очистки мерзлотных почв и водной среды, не только от нефти, но также и от нефтепродуктов (дизельное топливо, газовый конденсат, масло моторное) в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +8 до +37°C.

Осуществление изобретения

Решение поставленной задачи достигается путем внесения в загрязненные нефтью или нефтепродуктами (дизельное топливо, газовый конденсат, масло моторное) мерзлотные почвы и водную среду микробного препарата на основе штамма бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ B-11017.

Технический результат изобретения достигается следующим образом.

Используют бактериальную суспензию штамма Bacillus vallismortis ВКПМ B-11017 с содержанием живых клеток в концентрации не менее 1·10⁹ КОЕ/мл.

Штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ B-11017 депонирован во Всероссийской коллекции непатогенных промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика - ВКПМ, 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, 1. Коллекционный номер ВКПМ В-11017. Штамм бактерий является перспективным для восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв и грунтов и очистки воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Штамм бактерий может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), 677890, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, дом 1.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение бактериальной суспензии на основе клеток штамма бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ B-11017

Штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 выращивают на мясопептонном агаре (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) при температуре +30 +37°C в течение 2-х суток, затем смывают в 0,9% растворе NaCl в концентрации не менее 1·10⁹ КОЕ/мл по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича. Полученную таким образом бактериальную суспензию используют для очистки почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов.

Пример 2. Определение нефтеокисляющей способности бактериальной суспензии штамма Bacillus vallismortis ВКПМ B-11017

Бактериальную суспензию штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, полученную способом, описанным в примере 1, вносят в минерализованную водную среду следующего состава (г/дм³): KNO₃ - 4,0; MgSO₄·7H₂O - 0,8; NaCl - 1,0; K₂НРO₄ - 1,4; KH₂PO₄ - 0,6; агар - 20,0; вода дистиллированная - 1,0 дм³, загрязненную нефтью или нефтепродуктами в количестве 1000 мг на 100,0 см³ среды, и экспонируют при температурах +8°C; +20°C; +30°C и +37°C в качалочных условиях в течение 7 суток. Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (10. ФР.1.31.2007.03234. МВИ 01.02.117. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025).

Данные эксперимента показывают, что в минерализованной водной среде штамм Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 на 7-е сутки при температуре +8-(+37)°C утилизирует 18,59-52,82% нефти; 25,46-82,26% дизельного топлива; 28,19-50,04% масла моторного; 56,40-84,73% газового конденсата (табл.1).

Таблица 1 Степень утилизации нефти и нефтепродуктов штаммом Bacillus vallismortis ВКПМ B-11017 в минерализованной водной среде через 7 суток Вариант опыта t, °C Ксенобиотик, мг/дм³ Срок +8 +20 +30 +37 Нефть до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 814,1 425,0 393,0 471,8 % деструкции 18,59 57,5 60,7 52,82 Дизельное топливо до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 745,4 393,7 171,0 177,4 % деструкции 25,46 60,63 82,9 82,26 Масло моторное до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 718,1 682,8 553,0 499,6 % деструкции 28,19 31,72 44,7 50,04 Газовый конденсат до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 436,0 321,2 259,4 152,7 % деструкции 56,4 67,88 74,06 84,73

Пример 3. Очистка мерзлотной почвы от нефти штаммом Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017

Проведен эксперимент по очистке мерзлотной почвы, загрязненной нефтью, с помощью бактериальной суспензии штамма Bacillus vallismortis ВКПМ B-11017. Опыт выполнен в условиях открытой экосистемы на территории аварийного разлива сырой неочищенной нефти. Средняя температура почвы, в течение всего периода постановки эксперимента, на горизонте 20 см составляла в среднем +8°C; на горизонте 10 см - (+14)°C.

Для опыта бактериальную суспензию штамма бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, полученную способом, описанным в примере 1, вносят в почву, загрязненную нефтью, в количестве 1 литр препарата на 1 куб. м нефтезагрязненной почвы. Почву тщательно перемешивают и экспонируют в течение 60 суток.

Для анализа образцы почвы отбирают до начала эксперимента и через 60 суток после его окончания. Эффективность биодеградации нефти штаммом Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 оценивают гравиметрическим методом (11. РД 39-0147098-90. Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома. - 1990).

Результаты исследований показывают, что бактериальная суспензия штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 в течение 60-ти суток, при средней температуре почвы +8-(+14)°C, осуществляет деградацию нефти на 78,3%, в то время как естественные потери нефти при тех же условиях окружающей среды в почве, не обработанной препаратом, составляют 7,32% (табл.2).

Таблица 2 Динамика деструкции нефти в мерзлотных почвах, обработанных микробным препаратом на основе клеток штамма бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 Вариант опыта Содержание нефти до внесения штамма, мг/кг Содержание нефти, через 60 суток после внесения штамма, мг/кг Деструкция нефти за 60 суток, % Почва + нефть + препарат на основе штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 3886 843 78,3 Контроль (почва + нефть) 13771 12762 7,32

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017

В эксикатор, объемом 5,0 дм³ вносили 3,0 дм³ воды и 30,0 см³ бактериальной суспензии штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, полученной по примеру 1. Для создания нефтяной пленки в емкости добавляли 30 000 мг сырой неочищенной нефти. В качестве контроля использовали воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30 000 мг нефти и без внесения микроорганизмов.

Эксперименты проводились в течение 60-ти суток при температуре воды +20±1°C. Биодеградацию нефти определяют спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025» (10. ФР. 1.31.2007.03234. МВИ 01.02.117. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025).

Установлено, что деструкция нефти в воде за 60 суток составила 50,8% (табл.3).

Таблица 3 Динамика деструкци и нефти в воде после внесения препарата на основе штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 Вариант опыта Количество нефти до внесения клеток штамма, мг Количество нефти через 60 суток после внесения клеток штамма, мг Степень утилизации нефти, % Вода + нефть + клетки штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 30 000 14 736,2 50,80 Контроль 30 000 29 334,6 2,21

Таким образом, преимуществом предлагаемого способа является то, что он позволяет утилизировать как нефть, так и нефтепродукты в относительно короткие сроки (от 7 до 60 суток), в широком диапазоне температур от +8 до +37°C и может быть использован как для очистки мерзлотных почв, так и для очистки водной среды от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат). Предлагаемый способ может быть использован для реабилитации нефтезагрязненных территорий в условиях Крайнего Севера.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов. Выращивают штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 и готовят из него суспензию, в которую вносят в мерзлотную почву и водную среду. Выдерживают при заданных параметрах от 7 до 60 суток и определяют количественное содержание нефти и нефтепродуктов в мерзлотной почве и водной среде. Изобретение позволяет сократить сроки денатурации нефти и нефтепродуктов и снизить их концентрацию в мерзлотной почве и водной среде. 3 табл., 4 пр.

Способ очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов, отличающийся тем, что для очистки загрязненных субстратов используют бактериальную суспензию штамма Bacillus vallismortis ВКПМ B-11017.