ШТАММ БАКТЕРИЙ Exiguobacterium sp. -ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C02F101/32 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D - деструктор нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Известны штаммы: Pseudomonas putida 36 (1. Авторское свидетельство СССР N 1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.), Acinetronacter sp. НВ-1 (2. Патент RU N 2077579. Штамм бактерий Acinetobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1:01, C12N 1/20, В09С 101:00. Заявка: 94043331/13, 06.12.1994. Опубликовано: 20.04.1997. Заявитель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии. Авторы: Жиркова Н.А., Кобелев B.C., Холоденко В.П. Патентообладатель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии), Pseudomonas alcaligenes Е7 (3. Патент RU N 2134723. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Заявка: 98105707/13, 25.03.1998. Опубликовано: 20.08.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробилогии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробилогии). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (4. Патент RU N 2019527. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений. С1, C02F 3/34, Е02В 15/04, С09К 17/00. Заявка: 93017464/26, 30.04.1993. Опубликовано: 15.09.1994. Заявитель: Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр. Авторы: Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В. Патентообладатель: Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp.ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас. % каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м² (5. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ". Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ").

Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18 +22°C, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+4°C).

В качестве прототипа служит штамм бактерий «Bacillus subtilis Колыма 7/2» (6. Патент RU 2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова СИ., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, то есть уровень нефти от 135143 мг/кг снижается до 645 мг/кг в течение 3 месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +4 до +30°C

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих способностью утилизировать, как нефть, так и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C

Поставленная задача решена тем, что получен штамм Exiguobacterium sp. ВКМ В-2813D - деструктор нефти и нефтепродуктов, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), перспективный для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в широком диапазоне температур (от +4 до +30°C).

Происхождение штамма.

Штамм бактерий Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D выделен из пробы почвенно-гравийной смеси, загрязненной маслом моторным, отобранной для исследований на предприятии ОАО АК «Якутскэнерго», Республика Саха (Якутия).

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером ВКМ B-2813D. Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Грамположительные палочки, расположенные одиночно и небольшими скоплениями. Размер клеток 1,3×0,6 мкм,

Культуральные признаки.

На мясопептонном агаре (МПА) (масс. %): ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2, формирует крупные сметанообразные колонии, желто-оранжевого цвета, диаметром до 3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

На питательном агаре на основе гидролизата рыбной муки (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; pH 7,1-7,5, формирует пастообразные блестящие колонии оранжевого цвета, диаметром 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

На среде Сабуро (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический, гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3, формирует пастообразные блестящие колонии оранжевого цвета, диаметром 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

В мясопептонном бульоне (масс. %): ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2, образует гомогенную муть при взбалтывании.

На минеральной среде Мюнца (7. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5- С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, растет в виде матовых колоний с оранжевато-желтым оттенком, диаметром 1-2 мм.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм облигатный аэроб, растет при температуре от +4 до +30°C. Температурный оптимум +18 +20°C. Растет при pH 4,5-9,0. Оптимум pH 6,8-7,5. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl.

Штамм оксидазаположительный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин. Индолотрицателен.. Сероводород не продуцирует. Активен в отношении инозита. Уреазаотрицателен. Тест с β-галактозидазой - отрицателен. Ферментирует сорбит. Не ферментирует лактозу, глюкозу, цитрат натрия, малонат натрия. Использует в качестве источника энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов.

Штамм устойчив к оксациллину, цефатаксиму, амоксициллину, ампициллину, амоксиклаву, каотиму, пефлоксацину, амосину, левомицетину. Умеренно чувствителен к полимиксину, цефтриаксону, мозивару, бензилпенициллину. Чувствителен к фуразолидону, метранидазолу.

При секвенировании вариабельных участков гена, кодирующего 16S рРНК, получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°C.

Штамм бактерий может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), по адресу: 677980, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, 1.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Exiguobacterium sp. ВКМ В-2813D

Штамм бактерий Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D выделен из пробы почвенно-гравийной смеси, загрязненной маслом моторным, отобранной для исследований на предприятии ОАО АК «Якутскэнерго», Республика Саха (Якутия).

Для этого 1,0 г подготовленной для исследований почвенно-гравийной смеси с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в минеральную среду в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды. Инкубация проводилась в термостатируемых качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°C. Рост бактерий наблюдали уже через 7 дней инкубации по образованию мутной эмульсии с оранжевато-желтым оттенком и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий была получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА (масс. %): ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах от +4 до +30°C. Через 72 ч на поверхности МПА наблюдали появление пастообразных блестящих колоний оранжеватого цвета, диаметром 1-3 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (8. Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p.408.), идентифицированы как штамм Exiguobacterium sp.

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевают на скошенный МПА и инкубируют 48 часов при температуре +20±1°C. Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Для получения препарата готовят жидкую минеральную среду следующего состава (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7Н₂О - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2 и культивируют в колбах в качалочных условиях в течение 48 часов, при температуре 20±1°C, при 200 оборотах/мин. Получают жидкую мутноватую смесь клеток штамма Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D, с титром 1-5×10⁹ клеток/см³, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D

Клетки штамма Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D со скошенного мясо-пептонного агара смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D культивируют в водной среде с минеральным составом (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 008; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10⁹ клеток/см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют при температурах +4°C; +20°C; +30°C в течение 3 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (9. ФР. .31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм уже на 3-и сутки при температуре +4°C утилизирует 4,19-8,76% - нефти и нефтепродуктов; при температуре +30°C - 38,76-49,46%; при температуре +20°C - 49,78-59,4%; в зависимости от типа ксенобиотика (таблица 1).

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре. В воду добавляют 30000 мг нефти и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D (по примеру 1), содержащего 1,0·10⁹ клеток/см³ суспензии. В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 2-х месяцев, поддерживая температуру воды в интервале +15 +20°C.

Полученные результаты (таблица 2) показали, что в воде деструкция нефти под влиянием штамма Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D за 2 месяца составила 44,9%. Деструкция в контрольной емкости существенно не изменилась.

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 3 суток до 2-х месяцев), в широком диапазоне температур от +4 до +30°C и может быть использован для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Exiguobacterium sp. ELA-6, обладающий способностью утилизировать нефть и нефтепродукты, депонирован в ФГБУН ИБФМ РАН под регистрационным номером ВКМ B-2813D и может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C. Изобретение позволяет сократить сроки очистки почвы и водоемов от нефти и нефтепродуктов. 2 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Exiguobacterium sp. ВКМ B-2813D - деструктор нефти и нефтепродуктов.