Штамм бактерий Lisinibacillus sp. ВКМ В-2814D - деструктор нефти и нефтепродуктов Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм бактерий Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Штамм может быть использован для очистки объектов окружающей среды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в диапазоне температур от +10 до +37±1°С.

Уровень техники.

Бактерии Lisinibacillus - это грамположительные, спорообразующие бактерии семейства Bacillaceae.

Ранее бактерии этого рода рассматривались, как члены рода Bacillus, но таксономический статус этих микроорганизмов был изменен на род Lisinibacillus в 2007 году.

По сравнению c Bacillus, Lisinibacillus содержит лизин и аспартат в пептидогликане клеточной стенки как диагностические кислоты, в отличие от мезо-диаминопимеликовой кислоты рода Bacillus (1. Tanja В. Antimicribial Activity of Bacillus sp. Batural Isolates and Their Potential Use in the Biocontrol of Phytopathogenic Bacteria [Text] / B. Tanja, K. Milan, S. Slavi, T. Ljub, D. Giuliano, M. Michael, V. Vitirio, F. Djordje // Journai - 2011).

Известны штаммы: Lysinibacillus xylantlyticus (2. Борисов В.Д., Калёнов С.В. Изучение ассоциированных с микроводорослью Dunaliella salina культур экстремального галофильного сообщества озера Шотт-Эль-Джерид // Успехи в химии и химической технологии. Том XXIX. 2015. №8. - С. 74-76.), обладающий высокой ферментативной активностью, способный потреблять широкий спектр субстратов, в качестве источника углерода; Lysinibacillus sphaericus (3. Saira A. Genetic, physiological and biochemical characterization of Bacillus sp. Strain RMB7 exhibiting plant growthpromoting and broad spectrum antifungal activities [Text] / A. Saira, H. Sohail, I. Asma, I. Mazhar, L. George // Plant. Microbial Cell Factories - 2014. - V. 144. - N13), способный продуцировать инсекцидный токсин, что может быть использовано при получении биопрепаратов для борьбы с насекомыми; Lysinibacillus fusiformis (4. Литфулин M.T., Мочалова Н.К., Марданова A.M. Поиск бактерий с антагонистической активностью // Материалы Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технология XXI века», 11-12 декабря 2014 г., Казань. - 42 с.), выделенный из почвы, обладающий антагонистической активностью по отношению к отдельным видам бактерий, что делает его перспективным для использования в качестве биопрепарата для подавления роста фитопатогенов.

Однако, у известных видов рода Lysinibacillus не выявлена способность потреблять в качестве источника энергии и питания углеводороды нефти или нефтепродуктов.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis Zb52, предназначенный для биоочистки сточных вод (5. Патент KZ №27045. Штамм бактерий Bacillus subtilis Zb52, предназначенный для биоочистки сточных вод. А4, C12N 1/20, C12N 9/56, C12R 1/125. Заявка: 2012/1351.1. Опубликовано: 14.06.2013, бюл. №6. Авторы: Сармурзина З.С.; Ануарбекова С.С.; Кулмамбетова Г.Н.; Алмагамбетов К.Х. Патентообладатель: Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения "Республиканская коллекция микроорганизмов" Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан).

Недостатком известного штамма бактерий является не изученность окисляющей активности по отношению к нефти и нефтепродуктам, что не позволяет оценить его деструктирующую способность по отношению к нефтяным углеводородам.

Известны штаммы: Serratia odorifera А 36 (6. Патент RU №2157839. Штамм бактерий Serratia odorifera А 36 ГКМ ВИЗР N 100 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/26, B09C 1/10C72/V7/2<5, C12R1:425. Заявка: 99111625/13, 31.05.1999. Опубликовано: 20.10.2000. Патентообладатели: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Сабаляускас Ю., Диджяпетрис А., Янкявичус К. Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И., Чумакова А.Я., Сабаляускас Ю., Диджяпетрис А., Янкявичус K.); Kurthia zopfii 7-204 (7. Патент RU №2270063. Штамм бактерий Kurthia zopfii, обладающий свойством утилизировать нефть, нефтепродукты и ароматические полициклические углеводороды. С2, В09С 1/10, C02F 3/34, C12N1/20, C12R1/01. Заявка:2003106326/13, 07.03.2003. Опубликовано: 20.01.2005. Патентообладатель: ООО ПКФ "БИГОР". Авторы: Бирюков В.В., Биттеева М.Б., Щеблыкин И.Н., Осипова В.Г., Коваленко Н.В., Гайтан В.И., Лобов Ю.А., Стехновская Л.Д., Разживин А.В., Барбот B.C., Васильев В.Н.); Pseudomonas putida 36 (8. Авторское свидетельство СССР №1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.).

Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Известны штаммы: Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 (9. Патент RU 2482179. Штамм бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 - деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/57. Заявка №2012114907/10 от 04.2012 г. Опубликовано 20.05.2013 г. Бюллетень №14. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН) и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 (10. Патент РФ №2525930. Штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 - деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/07. Заявка: 2013113813/10, 27.03.2013. Дата подачи заявки: 27.03.2013. Опубликовано: 20.04.14 г. Бюл. №11. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН), обладающие высокой утилизирующей эффективностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Недостатком известных штаммов является то, что для наращивания биомассы клеток штаммов Bacillus atropheus BKTIM В-10592 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 требуется специальная среда с добавлением перфторуглеродов в виде дефицитного и дорогостоящего препарата «Перфторан», что не экономично и усложняет процедуру накопления клеточной биомассы штаммов, используемых для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, кроме того, не известна их способность утилизировать бензин и керосин авиационный.

В качестве прототипа служит штамм бактерий Bacillus subtilis Колыма 7/2 (11. Патент RU №2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти в почве до 0,48% в течение 3 месяцев летнего периода.

Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), кроме того, не выявлена его способность утилизировать нефть и нефтепродукты вдиапазоне температур от +10 до +37±1°С.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающихутилизирующей способностью по отношению, как к нефти, так и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +10 до +37±1°С, которые могут быть использованы для очистки объектов окружающей среды, как от нефти, так и от нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Поставленная задача решена тем, что полученновый бактериальный штамм бактерий Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Штамм может быть использован для очистки объектов окружающей среды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в диапазоне температур от +10 до +37±1°С), в относительно короткие сроки (7-60 суток).

Заявляемый штамм бактерий Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D (авторский номер LER-10k), выделен из пробы почвенно-гравийной смеси, загрязненной маслом моторным, отобранной с территории ОАО «Якутскэнерго», Республика Саха (Якутия).

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером Lisinibacillus sp. ВКМ В-2814D.

Полученный штамм Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Грамположительные спорообразующие палочки.

Культуральные характеристики.

На мясопептонном агаре (МПА) (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2) и ГРМ агаре (на основе гидролизата рыбной муки), масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; рН 7,1-7,5, формирует крупные, влажные беловатые полупрозрачные, округлой формы колонии, диаметром до 5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

На среде Сабуро (состав, г/л: пептон - 10,0 мальтоза - 40,0; агар - 12,0±2,0; вода очищенная до 1 л), формирует беловатые колонии, диаметром до 5 мм.

На агаризованной среде Мюнца (12. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки -Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, бензин, керосин авиационный) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; К₂ НРО₄ - 0,14; КН₂ PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, рН - 7,2, растет в виде сероватых колоний округлой формы, диаметром 1 мм.

В мясо-пептонном бульоне промышленного производства образует равномерную муть.

Отношение к кислороду: аэробы.

Растет при рН 6,5-8,0э

Растет при температуре от +10 до +37±1°С.

В анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее. При секвенировании вариабельных участков 16SrDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

Результаты определения родовой принадлежности штаммов и процента сходства с ближайшими известными видами, представлены в таблице №1.

Биохимические свойства.

Используемые источники углерода: сорбит.

Проверенные не используемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия.

Другие исследуемые тесты: оксидаза-положительный, каталаза-положительный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин, индол-отрицательный, сероводород не продуцирует, активен в отношении инозита, уреаза-отрицательный, тест с β-галактозидазой - отрицателен, в полужидком (1,5%) агаре подвижный.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм не патогенен для растений (проверка на фитотоксичность проведена на семенах овса посевного ( sativa) сорт «Скакун», пшеницы (Triticum) сорт «Приленская-19» и клевера лугового (Trifolium pretense).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 14 дней) на скошенном МПА или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.

Штамм может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), по адресу: 677980, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, 1.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D Штамм бактерий Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D выделен изпочвенно-гравийной смеси, загрязненной маслом моторным, методом накопительных культур на минеральной среде с нефтью, с последующим пересевом на МПА.

Для этого, соблюдая правила асептики, 1 г измельченной и предварительно просеянной почвенно-гравийной смеси, растирают в ступке и вносят в колбы емкостью 250 мл, с содержанием 100 мл, заранее подготовленной минеральной средой следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное, рН 7,2; в качестве единственного источника углерода и энергии используют нефть, которую вносят в среду в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды.

Инкубация проводится в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°С; рост бактерий наблюдают через 7 суток инкубации по образованию эмульсии и дезинтеграции нефти.

Чистая культура бактерий получена путем культивирования при вышеперечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА (масс. %): ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах (+10, +20, +30 и +37 (±1)°С).

Через 72 ч., при культивировании штамма при температурах от +10 до +37°С, на поверхности МПА наблюдали появление влажных беловатых полупрозрачных, округлой формы колоний, диаметром до 5 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SpPHK и ключевых фенотипических признаков, согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (13. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.). идентифицированы, как штамм Lisinibacillus sp.

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевают на скошенный МПА и инкубируют 48-72 часов при температуре +20±1°С.

Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Для получения препарата готовят жидкую минеральную среду с нефтью (нефтепродуктами) следующего состава (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; К₂НРО₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; нефть (нефтепродукты) - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2 и культивируют в колбах в качалочных условиях в течение 48-72 часов, при температуре плюс 20±1°С, при 200 об/мин.

Получают жидкую мутноватую смесь клеток штамма Lisinibacillus sp. ВКМ В-2814Dc титром 1-5×10⁹ клеток/см³, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы или воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Lisinibacillus sp. BKMB-2814D

Клетки штамма Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного МПА (по примеру 2), готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D культивируют в водной среде с минеральным составом (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти (нефтепродуктов).

Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1×10⁹ клеток/см³.

В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь.

Опыт проводят в трех повторностях.

Колбы культивируют при температурах +10°С; +20°С; +30°С; +37±1°С в течение 7 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-0,25» (14. ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117. Методка выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-0,25»).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D на 7-е сутки культивирования в условиях постоянной аэрации утилизирует от 9,36 до 10,0% - нефти и нефтепродуктов при температуре +10°С; от 47,8 до 49,4% - при температуре +20°С; от 53,4 до 57,6% - при температуре +30°С; от 68,75 до 70,0% - при температуре +37°С (таблица 2).

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Lisinibacillu ssp.ВКМ B-2814D

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре.

В воду добавляют 30000 мг сырой нефти (нефтепродукта) и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D, приготовленного по примеру 2, содержащего 1,0-10⁹ клеток/см³ суспензии.

В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти (нефтепродукта) и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 60 суток, поддерживая температуру воды в интервале +15+20°С.

Полученные результаты (таблица 3) показали, что в воде, деструкция нефти под влиянием штамма Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D за 60 суток составила 67,55% для нефти и 67,58% для дизельного топлива.

Деструкция в контрольной емкости существенно не изменилась.

Таким образом, показано, что штамм Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, керосин авиационный, бензин).

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Lisinibacillus sp.ELA – 10к, обладающий способностью утилизировать нефть и нефтепродукты, депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ B-2814D. Штамм бактерий Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D может быть использован для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. Изобретение позволяет повысить степень очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов при широком диапазоне температур от +10 до +37±1°С. 3 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Lisinibacillus sp. ВКМ B-2814D - деструктор нефти и нефтепродуктов.