СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОСОМ, ПРОИСХОДЯЩИХ ИЗ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, И КУЛЬТУРАЛЬНОГО РАСТВОРА, ПРОДУЦИРОВАННОГО ИЗ НИХ Российский патент 2023 года по МПК C12N5/775 A61K35/28 A61K8/98 A61K8/14 A61P17/00 

Область техники

По настоящей заявке испрашивается приоритет и преимущество Корейской патентной заявки No. 10-2020-0062365, поданной в Корейское ведомство по интеллектуальной собственности 25 мая 2020 г., полное содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится к способу получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток.

Уровень техники

Обнаружено, что существует несколько типов предшественников в костном мозге человека, и среди них, предшественники, имеющие мультипотентность, называют мезенхимальными стволовыми клетками (MSC). Известно, что мезенхимальные стволовые клетки присутствуют не только в костном мозге, но также в большинстве органов организма, таких как жир, печень и мышца.

Известно, что мезенхимальные стволовые клетки имеют способность к самостоятельной пролиферации, могут дифференцировать в остеобласты, хондроциты, миоциты, стромальные клетки костного мозга, фибробласты сухожилий-связок, адипоциты и т.п., и имеют противовоспалительную и иммуномодулирующую способность как высоко пролиферативные адгерентные клетки. В частности, мезенхимальные стволовые клетки имеют иммуносупрессивные эффекты, такие как ингибирование пролиферации и дифференцировки T-клеток и B-клеток, и ингибирование функций иммуноцитов, таких как дендритные клетки, клетки естественные киллеры (NK) и макрофаги.

Эти мезенхимальные стволовые клетки привлекли внимание из-за различных факторов (паракринных/секреторных факторов), которые мезенхимальные стволовые клетки секретируют, например, хемокины, цитокины, факторы роста и т.п., представляют эффекты стволовых клеток, а не функции дифференцировки самих мезенхимальных стволовых клеток. Кроме того, известно, что мезенхимальные стволовые клетки секретируют не только эти факторы, но также внеклеточные везикулы (EV), и известно, что внеклеточные везикулы влияют на различные аспекты, такие как судьба, функция и дифференцировка клеток, посредством межклеточной передачи сигналов.

Среди различных факторов, экзосома представляет собой везикулу, состоящую из липидного бислоя, и входит в состав материалов, которые клетки секретируют внеклеточно. Известно, что экзосома служит для транспорта (передачи) белка, биоактивного липида и РНК (мкРНК), которые являются внутриклеточными биомолекулами, чтобы осуществлять функциональную роль опосредования коммуникации клетка-клетка и клеточного иммунитета. Эти экзосомы исследовали в качестве биомаркеров для неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, и использовали также для разработки системы доставки лекарственного средства, такой как наноноситель специфического лекарственного средства, благодаря наличию достаточно высокой избирательной способности к проникновению, чтобы проникать через гематоэнцефалический барьер (BBB), который разделяет спинномозговую жидкость и кровь.

Между тем, известно, что экзосомы, секретированные из мезенхимальных стволовых клеток, вовлечены в коммуникацию клетка-клетка, и для них показана терапевтическая эффективность в регенеративной медицине, которую имеют стволовые клетки, и недавно активно проводили исследования терапевтических эффектов для различных заболеваний с использованием экзосом, секретированных мезенхимальными стволовыми клетками, без использования самих мезенхимальных стволовых клеток.

Однако ультрацентрифугирование, наиболее часто используемое среди способов выделения экзосом, имеет то преимущество, что большое количество экзосом можно выделять за один раз, однако, имеет ту проблему, что необходимо дорогостоящее оборудование, много времени занимает выделение экзосом, физическое повреждение может происходить с экзосомами из-за сильного центрифугирования, и в частности, чистота выделенных экзосом уменьшается и т.п. Среди способов облегчения этих проблем, присутствует способ аффинности к PS, который увеличивает чистоту экзосом, выделенных с использованием материала, который специфически связывается с фосфатидилсерином (PS), представляющим собой белок, присутствующий на мембране экзосом, но в то время как этим способом можно выделять экзосомы высокой чистоты, по сравнению со способом ультрацентрифугирования, существует тот недостаток, что выход является низким. Кроме того, способ получения экзосом с использованием хроматографии на колонке опубликован в связанной области техники, однако имеет ту проблему, что липопротеины, имеющие размер и плотность, сходные с экзосомами, суспендированные в растворе культуры клеток или крови, элюируются вместе.

Таким образом, существует необходимость в разработке способа выделения, способного к получению экзосом высокой чистоты в высокой концентрации из мезенхимальных стволовых клеток, без примесей.

Описание

Техническая проблема

Способ получения, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, разработан для решения вышеупомянутых проблем в связанной области техники, и предназначен для выделения экзосом с высокой чистотой и высокой концентрацией из мезенхимальных стволовых клеток, без примесей.

Настоящее изобретение выполнено в попытке предоставления способа получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток.

Настоящее изобретение выполнено в попытке предоставления культурального раствора, включающего экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа получения.

Настоящее изобретение выполнено в попытке предоставления фармацевтической композиции, включающей экзосомы, полученные с использованием данного способа получения, в качестве активного ингредиента.

Настоящее изобретение выполнено в попытке предоставления косметической композиции, включающей экзосомы, полученные с использованием данного способа получения, в качестве активного ингредиента.

Техническое решение

Для решения вышеописанных проблем, иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, включающему: получение образца из мезенхимальных стволовых клеток; субкультивирование образца клеток в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы; культивирование субкультивированных клеток в субстратной среде, содержащей фермент, ингибирующий синтез белка, и затем получение культурального раствора клеток; и выделение экзосом из культурального раствора клеток.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, при получении культурального раствора стволовых клеток, субстратная среда может дополнительно включать TNFα.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, TNFα можно включать в концентрации 5-500 нг/мл.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, фермент, ингибирующий синтез белка, может представлять собой любое одно или два, или более, выбранные из группы, состоящей из циклогексимида, анизомицина, ауринтрикарбоновой кислоты, дифтерийного токсина, эдеина, фусидовой кислоты, пактамицина, пуромицина, рицина, фторида натрия, спарзомицина, тетрациклина и триходермы.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, субстратная среда может иметь соотношение TNFα : фермент, ингибирующий синтез белка, 1:10-1:2000.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, время обработки TNFα и ферментом, ингибирующим синтез белка, может составлять 30-100 часов.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, в культуральном растворе клеток, количество экзосом и содержание любого одного или нескольких из происходящего из экзосом белка и происходящей из экзосом РНК может быть увеличено.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, можно выделять 1,1 × 10¹¹ или более экзосом на мл культурального раствора клеток.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, при субкультивировании образца клеток, среда может включать один или несколько, выбранные из группы, состоящей из EGF, FGF-2, GDF11, KGF, HGF, PDGF, VEGF, IGF и TGF-b.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, субкультивирование образца клеток можно проводить на протяжении 4-10 пассажей.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, маркер для экзосом может представлять собой один или несколько, выбранные из группы, состоящей из CD63, CD9, CD81, S1PR1 и S1PR3.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, при получении образца, мезенхимальные стволовые клетки можно получать из жировой ткани или плацентарной ткани.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, стволовая клетка может представлять собой эмбриональную стволовую клетку, взрослую стволовую клетку или индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (IPS).

Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к культуральному раствору, включающего экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа.

Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа, в качестве активного ингредиента.

Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к косметической композиции, включающей экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа, в качестве активного ингредиента.

Обеспечивающие преимущество эффекты

Способ получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, имеет то преимущество, что экзосомы высокой чистоты можно получать с высоким выходом.

Способ получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, имеет то преимущество, что большое количество экзосом можно выделять посредством обработки субстратной среды TNFα и/или ферментом, ингибирующим синтез белка.

Культуральный раствор, включающий экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, имеет то преимущество, что способность к дифференцировке и способность к пролиферации усилены.

Существует то преимущество, что можно предоставлять фармацевтическую композицию или косметическую композицию с использованием культурального раствора, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, и фармацевтическая композиция имеет то преимущество, что вероятность возникновения побочных эффектов против лекарственного средства можно уменьшать, благодаря той характеристике, что экзосомы являются бесклеточными.

Описание рисунков

ФИГ. 1 представляет собой график, показывающий изменения уровня продукции экзосом стволовых клеток, в соответствии с соотношением TNFα и циклогексимида.

ФИГ. 2 представляет собой график, показывающий изменения уровня продукции экзосом с течением времени в мезенхимальных стволовых клетках, обработанных TNFα и циклогексимидом.

ФИГ. 3 представляет собой график, показывающий концентрацию экзосом, в соответствии с примерами и сравнительными примерами по настоящему изобретению, измеренную посредством анализа траекторий движения наночастиц (NTA).

ФИГ. 4 представляет собой график, показывающий концентрацию экзосом, в соответствии с примерами и сравнительными примерами по настоящему изобретению, измеренную посредством анализа Бредфорд.

ФИГ. 5 представляет собой серию графиков, показывающих размер экзосом и гистограмму распределения частиц, в соответствии с размером, для экзосом из примера 14 (a), примера 15 (b) и сравнительного примера 1 (c), для примеров и сравнительных примеров по настоящему изобретению, измеренные посредством NTA.

ФИГ. 6 представляет собой серию графиков, показывающих размер экзосом и гистограмму распределения частиц, в соответствии с размером, для экзосом из сравнительного примера 2 (d), сравнительного примера 3 (e) и сравнительного примера 4 (f), для примеров и сравнительных примеров по настоящему изобретению, измеренные посредством NTA.

ФИГ. 7 представляет собой серию графиков, показывающих размер экзосом и гистограмму распределения частиц, в соответствии с размером, для экзосом из сравнительного примера 5 (g), сравнительного примера 6 (h) и сравнительного примера 7 (i), для примеров и сравнительных примеров по настоящему изобретению, измеренные посредством NTA.

ФИГ. 8 иллюстрирует Вестерн-блоттинг экзосом, в соответствии с примерами и сравнительными примерами по настоящему изобретению.

ФИГ. 9 иллюстрирует экзосомы по настоящему изобретению посредством фотографий просвечивающей микроскопии (TEM).

ФИГ. 10 иллюстрирует график для анализа экзосом по настоящему изобретению посредством способа Exoview.

Способы осуществления изобретения

Далее в настоящем описании, настоящее изобретение описано более подробно.

Конкретные функциональные описания ниже проиллюстрированы только для описания иллюстративных вариантов осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, и иллюстративные варианты осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, могут быть воплощены в различных формах и не должны быть интерпретированы как ограниченные иллюстративными вариантами осуществления, описанными в настоящем описании.

Поскольку иллюстративные варианты осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, могут иметь различные изменения и могут иметь различные формы, конкретные иллюстративные варианты осуществления подробно описаны в настоящем описании. Однако, это не предназначено для ограничения иллюстративных вариантов осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, конкретной описанной формой, и должно быть интерпретировано для включения всех модификаций, эквивалентов и заменителей, в содержание и объем настоящего изобретения.

Термины, используемые в настоящем описании, использованы только для описания конкретных иллюстративных вариантов осуществления и не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Выражение в единственном числе включает выражение во множественном числе, если контекст явно не требует иного.

Если не определено иное, все термины (включая технические и научные термины), используемые в настоящем описании, можно использовать в значении, которое может являться общепринятым в области, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, понятно, что термины, определенные в общеупотребительных словарях, не следует интерпретировать в идеализированном или избыточном смысле, если явно и конкретно указано иное.

Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, включающему: получение образца клеток из мезенхимальных стволовых клеток; субкультивирование образца клеток в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы; культивирование субкультивированных клеток в субстратной среде, содержащей фермент, ингибирующий синтез белка, и затем получение культурального раствора клеток; и выделение экзосом из культурального раствора клеток.

При получении образца клеток из мезенхимальных стволовых клеток, клетки можно получать, позволяя образцу проходить через мембрану для центрифугирования полученного фильтрата. В этом случае, в качестве мембраны, можно использовать нейлон 50 мкм - 200 мкм, но мембрана не является конкретно ограниченной.

В рамках изобретения, термин «центрифугирование» относится к приложению центробежной силы посредством вращения материала вокруг оси при способе выделения с использованием центрифуги. По настоящему изобретению, центрифугирование может представлять собой любое, выбранное из группы, состоящей из дифференциального центрифугирования, центрифугирования в градиенте плотности и газового центрифугирования.

В рамках изобретения, термин «стволовые клетки» относится к клеткам, имеющим способность к дифференцировке в две или более новые клетки, в то же время имеющим способность к самовоспроизведению, и может быть классифицирован на тотипотентные стволовые клетки, плюрипотентные стволовые клетки и мультипотентные стволовые клетки. Чтобы быть распознанными как стволовые клетки, клетки должны постоянно воспроизводиться в недифференцированном состоянии, и должны являться способными к дифференцировке в специфические клетки в специфических условиях культивирования. Вышеописанные стволовые клетки недавно привлекли внимание в качестве кандидата на композицию клеточного лекарственного средства из-за их способности к дифференцировке и способности к самовоспроизведению, и проводили множество исследований. Присутствует то преимущество, что является возможным выделять из них экзосомы, содержащие генетическую информацию, белки и факторы роста стволовых клеток.

Стволовые клетки могут представлять собой стволовые клетки костного мозга, стволовые клетки пуповинной крови или происходящие из жировой ткани стволовые клетки, могут представлять собой стволовые клетки человеческого происхождения или животного происхождения, или растительного происхождения, и могут представлять собой, например, происходящие из жировой ткани человека стволовые клетки, но не являются ограниченными ими.

В рамках изобретения, термин «экзосомы» относится к малой везикуле, имеющей мембранную структуру, секретируемую из различных типов клеток, которые играют различные роли, такие как доставка составляющих мембраны, белков и РНК, посредством связывания с другими клетками и структурами.

В рамках изобретения, «среда DMEM» относится к среде Игла в модификации Дульбекко, и является наиболее общеупотребительной средой для культивирования клеток животных. В ходе культивирования клеток животных, используют среду DMEM с низким содержанием глюкозы, однако, среда DMEM не является ограниченной этим, можно использовать также среду DMEM с высоким содержанием глюкозы, и после выращивания клеток в среде с высоким содержанием глюкозы до достижения 80% - 100% конфлюэнтности, клетки можно культивировать в среде с низким содержанием глюкозы. Когда клетки культивируют в среде, полученной посредством смешивания DMEM с высоким содержанием глюкозы и DMEM с низким содержанием глюкозы, присутствует то преимущество, что клетки можно получать быстро. Концентрация глюкозы в DMEM с низким содержанием глюкозы может составлять 800-1200 мг/л, и кроме того, клетки можно культивировать посредством добавления эмбриональной бычьей сыворотки в среду DMEM с низким содержанием глюкозы, но способ культивирования не является ограниченным этим.

В рамках изобретения, термин «культуральный раствор» относится к супернатанту культуры клеток, в которой мезенхимальные стволовые клетки культивируют с использованием культуральной среды для мезенхимальных стволовых клеток. Культуральный раствор мезенхимальных стволовых клеток содержит различные физиологически активные материалы, секретируемые из клеток в процессе культивирования мезенхимальных стволовых клеток.

Мембрана может составлять 50 мкм - 200 мкм, но не является конкретно ограниченной. Осадки клеток можно получать посредством центрифугирования фильтрата, который получают, позволяя образцу проходить через мембрану, при 100 xg - 500 xg в течение 5 минут - 30 минут. Кроме того, можно использовать мембрану, при условии, что мембрана представляет собой полупроницаемую мембрану, и может конкретно представлять собой нейлоновый мембранный фильтр, но не является конкретно ограниченной.

Субкультивирование осадков клеток может включать антибиотик. Антибиотик может представлять собой пенициллин и/или стрептомицин, но не является ограниченным ими. Клетки можно разводить до концентрации 1×105 клеток/1 мл среды в 100-150 мм чашке Петри для культивирования клеток, и можно культивировать в инкубаторе с 3% - 10%, конкретно, 5% CO₂ при температуре 30°C - 40°C, конкретно, 37°C. Кроме того, клетки можно культивировать даже в бутыли простой формы без использования чашки Петри для культивирования клеток, и клетки можно стабильно поддерживать в течение длительного периода времени, так что присутствует то преимущество, что можно получать большое количество культурального раствора клеток.

Субкультивирование образца осадка клеток в среде можно проводить на протяжении 4-10 пассажей. Существуют те проблемы, что когда клетки подвергаются пролиферации на протяжении 4 или менее пассажей, степень экспрессии может быть низкой, поскольку клетки не пролиферируют, и когда клетки подвергаются пролиферации на протяжении 10 или более пассажей, клетки могут осуществлять сверхэкспрессию.

При субкультивировании образца осадка клеток, среда DMEM может включать любой один или два, или более, выбранные из группы, состоящей из фактора роста и дифференцировки 11 (GDF11), эпидермального фактора роста (EFG), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста кератиноцитов (KGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), трансформирующего фактора роста-бета (TGF-b), фактора роста фибробластов 2 (FGF-2), инсулинового фактора роста (IGF) и фактора роста тромбоцитов (PDGF).

При субкультивировании образца осадка клеток, является предпочтительным, чтобы клетки культивировали посредством замены среды каждые 70-75 часов до 80% - 100% конфлюэнтности. Конкретно, является предпочтительным, чтобы клетки культивировали посредством замены среды каждые 72 часа, и когда среду заменяют в пределах 70 часов, существует та проблема, что осадок высокой чистоты невозможно получить, и когда среду заменяют через каждый интервал, превышающий 75 часов, существует та проблема, что осадок высокой концентрации невозможно получить. Субкультивирование для выделения экзосом высокой чистоты, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению, имеет то преимущество, что является возможным усиливать способность к дифференцировке и способность к пролиферации экзосом, с амплификацией в то же время мезенхимальных стволовых клеток.

«Культуральный раствор» относится к супернатанту культуры клеток, в которой мезенхимальные стволовые клетки культивируют с использованием культуральной среды для мезенхимальных стволовых клеток. Культуральный раствор мезенхимальных стволовых клеток содержит различные физиологически активные материалы, секретируемые из клеток в процессе культивирования мезенхимальных стволовых клеток.

Субстратная среда может представлять собой бессывороточную субстратную среду или субстратную среду с сывороткой. В качестве субстратной среды, используют среду DMEM с низким содержанием глюкозы, но субстратная среда не ограничена этим, и используют среду DMEM с высоким содержанием глюкозы, или можно использовать среду, включающую как среду DMEM с низким содержанием глюкозы, так и среду DMEM с высоким содержанием глюкозы.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, фермент, ингибирующий синтез белка, включенный в субстратную среду, может представлять собой любой, выбранный из группы, состоящей из циклогексимида, анизомицина, ауринтрикарбоновой кислоты, дифтерийного токсина, эдеина, фусидовой кислоты, пактамицина, пуромицина, рицина, фторида натрия, спарзомицина, тетрациклина и триходермы, но без ограничения ими, и может быть заменен на любой фермент, ингибирующий биосинтез белка, способный осуществлять такой же механизм. Конкретно, является предпочтительным, чтобы фермент, ингибирующий синтез белка, представлял собой циклогексимид.

При получении культурального раствора клеток из иллюстративного варианта осуществления настоящего изобретения, субстратная среда может дополнительно включать TNFα. TNFα можно включать в концентрации 5-500 нг/мл.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, субстратная среда может иметь соотношение TNFα : фермент, ингибирующий синтез белка, 1:10-1:2000. Соотношение добавления TNFα : фермент, ингибирующий синтез белка, может составлять 1:1-1:2000, конкретно, 1:10-1:1000, и более конкретно, 1:20-1:500, и может составлять 1:50-1:200. Когда доля добавления фермента, ингибирующего синтез белка, ниже, чем доля TNFα, существует та проблема, что размер и количество экзосом, подлежащих экстракции, могут являться маленькими, и когда соотношение добавления TNFα : фермент, ингибирующий синтез белка, составляет более чем 1 : 2000, существует та проблема, что амплификация осадка клеток может быть ингибирована из-за того, что доля фермента, ингибирующего синтез белка, является избыточной. Конкретно, когда включены как TNFα, так и фермент, ингибирующий синтез белка, существует то преимущество, что экзосомы можно экстрагировать с высокой концентрацией и высокой чистотой, поскольку размер и количество экзосом, подлежащих экстракции из стволовых клеток, и содержание происходящего из экзосом белка или происходящей из экзосом РНК увеличены, по сравнению с значениями, когда добавляют только TNFα или добавляют только фермент, ингибирующий синтез белка.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, время обработки TNFα и/или ферментом, ингибирующим синтез белка, может представлять собой культивирование клеток в течение 30-100 часов.

Когда время обработки TNFα и/или ферментом, ингибирующим синтез белка, составляет менее чем 30 часов, существует та проблема, что осадок стволовых клеток может не подвергаться достаточному культивированию, и когда время обработки составляет более чем 100 часов, существует та проблема, что клетки могут осуществлять сверхэкспрессию из-за избыточно длительного времени культивирования.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, выделение экзосом может включать: получение первого супернатанта посредством центрифугирования собранного культурального раствора стволовых клеток при 200-400 xg в течение 5-20 минут; получение второго супернатанта посредством центрифугирования первого супернатанта при 1800-2300 xg в течение 5-30 минут; получение осадка экзосом посредством центрифугирования или ультрацентрифугирования второго супернатанта при 90000-110000 xg в течение 50-100 минут и удаления супернатанта; и суспендирования полученного осадка экзосом в буфере PBS, и выделение частиц экзосом. Когда частицы экзосом выделены, суспензию можно обрабатывать ультразвуковыми волнами.

Когда осадок экзосом получают и суспендируют в буфере PBS, и затем не обрабатывают ультразвуковыми волнами, существует та проблема, что экзосомы высокой чистоты невозможно экстрагировать из-за плотно спрессованного осадка. Таким образом, только когда частицы экзосом выделяют из полученного осадка экзосом, существует то преимущество, что можно экстрагировать частицы экзосом высокой чистоты.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, получение образца клеток из мезенхимальных стволовых клеток может включать разделение образца на небольшие фрагменты и обработку небольших фрагментов в течение 20-40 минут посредством добавления к ним коллагеназы. Затем, ферментную реакцию можно инактивировать посредством добавления в нее DMEM, и в этом случае, является возможным избирательно дополнительно включать 10% эмбриональную бычью сыворотку (FBS). Кроме того, после центрифугирования при 200-400 xg в течение 3-20 минут, образец клеток можно получать посредством отбрасывания супернатанта, экстракции частиц осадка клеток, и суспендирования частиц осадка в FBS и в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM).

Получение образца клеток может дополнительно включать ресуспендирование полученного образца клеток, и затем рассев ресуспендированных клеток. Когда дополнительно включают рассев ресуспендированных клеток, существует то преимущество, что является возможным предотвращать агрегацию частиц осадка клеток в буфере FBS при суспендировании.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, при получении образца, мезенхимальные стволовые клетки могут быть извлечены из жировой ткани или плацентарной ткани.

Происходящие из жировой ткани стволовые клетки, которые могут быть извлечены из жировой ткани, означают происходящие из жировой ткани стволовые клетки человека, происходящие из жировых клеток человека. Поэтому, существует то преимущество, что является возможным экстрагировать экзосомы, содержащие генетическую информацию, белки и факторы роста из жировых клеток.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, стволовая клетка может представлять собой эмбриональную стволовую клетку, взрослую стволовую клетку или индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (IPS).

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, в культуральном растворе клеток, количество экзосом и содержание любого одного или нескольких из происходящего из экзосом белка и происходящей из экзосом РНК может быть увеличено.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, можно выделять 1,1 × 10¹⁰ или более экзосом на мл культурального раствора клеток. Более конкретно, можно выделять 1,2 × 10¹² или менее экзосом на мл культурального раствора клеток.

Когда экзосомы, выделенные посредством способа, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, обрабатывают ДНКазой I, существует то преимущество, что чистота увеличивается на 10% или более.

Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к культуральному раствору, включающему экзосомы высокой чистоты, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, в культуральном растворе можно увеличивать количество экзосом и содержание любого одного или нескольких из происходящего из экзосом белка и происходящей из экзосом РНК.

Кроме того, для анализа состояния экзосом, экзосомы можно метить флуоресцентным материалом, так что существует то преимущество, что уровень экстракции можно указывать посредством измерения значения флуоресцентного сигнала экзосом, меченных флуоресцентным материалом, для анализа состояния экзосом.

В рамках изобретения, термин «флуоресцентный материал» относится к материалу, который образует свет посредством изменения физических условий и химической обработки. Например, флуоресцентный материал может представлять собой флуоресцентный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и красный флуоресцентный белок (RFP), или может представлять собой фотобелок или люциферазу.

Кроме того, в экзосомах, меченных флуоресцентным материалом, флуоресцентный материал локализован отдельно в экзосомах, или экзосомы, меченные флуоресцентным материалом, могут включать слитый белок, в котором связаны мембранный белок и флуоресцентный материал. Слитый белок имеет то преимущество, что количество и значение сигнала экзосом можно точно идентифицировать, поскольку флуоресцентный материал может связываться с мембранным белком непосредственно или посредством линкера.

Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученных с использованием способа, в качестве активного ингредиента.

В фармацевтической композиции по настоящему изобретению, можно использовать общеизвестный и общеупотребительный адъювант, и дополнительный пригодный носитель или разбавитель. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в форме твердого вещества, раствора, эмульсии, диспергирующего вещества, мицеллы, липосомы и т.п., и композиция, полученная в этом случае, включает фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, в качестве активного ингредиента, вместе с органическим или неорганическим носителем или наполнителем, пригодным для энтерального или парентерального введения. Активный ингредиент можно смешивать, например, с обычными нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями для таблеток, гранул, капсул, суппозиториев, растворов, эмульсий, суспензий и любой другой формы, подходящей для использования. Носители, которые можно использовать, включают глюкозу, лактозу, гуммиарабик, желатин, маннит, крахмальный клейстер, трисиликат магния, тальк, кукурузный крахмал, коллоидный диоксид кремния, картофельный крахмал, мочевину, триглицериды со средней длиной цепи, декстран и другие носители, пригодные для использования в изготовлении препаратов, в твердой, полутвердой или жидкой форме. Кроме того, можно использовать вспомогательные, стабилизирующие, загущающие и окрашивающие средства, и ароматизирующие средства.

Фармацевтическую композицию можно использовать посредством составления в форме перорального состава, такого как порошок, гранула, пилюля, капсула, суспензия, эмульсия, сироп и аэрозоль, препарат для наружного применения, суппозиторий и стерильный раствор для инъекций, в соответствии с типичным способом. Конкретно, когда получают фармацевтическую композицию, фармацевтическую композицию можно получать с использованием общеупотребительного разбавителя или наполнителя, такого как наполнитель, расширитель, связывающее средство, увлажняющее средство, дезинтегрирующее средство и поверхностно-активное вещество. Твердый состав для перорального введения включает таблетку, пилюлю, порошок, гранулу, капсулу и т.п., и твердый состав можно получать посредством смешивания по меньшей мере одного наполнителя, например, крахмала, карбоната кальция, сахарозы или лактозы, желатина и т.п., с фармацевтической композицией по настоящему изобретению. Кроме того, в дополнение к простым наполнителям, можно использовать также смазывающие средства, такие как стеарат магния и тальк. Жидкий состав для перорального введения соответствует суспензии, жидкости для внутреннего применения, эмульсии, сиропу и т.п., и жидкий состав может включать, в дополнение к воде и вазелиновому маслу, которые являются простыми общеупотребительными разбавителями, различные наполнители, например, увлажняющее средство, подсластитель, ароматизатор, консервант, и т.п. Примеры состава для парентерального введения включают водный стерильный раствор, неводный растворитель, суспензию, эмульсию, лиофилизированный препарат и суппозиторий. В качестве неводного растворителя и суспензии, можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, пригодный для инъекции сложный эфир, такой как этилолеат, и т.п. В качестве основы суппозитория, можно использовать витепсол, макрогол, Tween 61, масло какао, лауриновый жир, глицерожелатин, и т.п.

Способ введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением включает, но без ограничения, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, интракардиальное, чрескожное, подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, энтеральное, местное, подъязычное или ректальное введение. Пероральное или парентеральное введение является предпочтительным. В рамках изобретения, термин «парентеральное» включает способы подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, интрасиновиальной, интрастернальной, интратекальной, внутриочаговой и интракраниальной инъекции или инфузии. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно также вводить в форме суппозитория для ректального введения.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить посредством любого устройства, так чтобы активный материал можно было переносить в клетку-мишень. Предпочтительным способом введения и составом является инъекция. Препарат для инъекции можно получать посредством использования водного растворителя, такого как физиологический солевой раствор, раствор Рингера, раствор Хенкса или стерильный водный раствор, растительного масла, такого как оливковое масло, сложного эфира высшей жирной кислоты, такого как этилолеат, неводного растворителя, такого как этанол, бензиловый спирт, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль или глицерин, и т.п., и для трансмукозального введения, можно использовать неинвазивное средство, широко известное в данной области, являющееся пригодным для барьера, через который должна проходить инъекция, и препарат для инъекции, может, кроме того, включать фармацевтический носитель, такой как аскорбиновая кислота, гидросульфит натрия, BHA, токоферол, ЭДТА, и т.п., в качестве стабилизатора для предотвращения дегенерации, эмульгатор, забуферивающее средство для контроля pH и консервант для подавления роста микроорганизмов, такой как нитрат фенилртути, тимеросал, хлорид бензалкония, фенол и крезол, бензиловый спирт.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может меняться, в зависимости от различных факторов, включая активность конкретного используемого эффективного ингредиента, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения, способа введения, скорости выведения, комбинации лекарственных средств и тяжести конкретного заболевания, подлежащего предотвращению или лечению, и доза фармацевтической композиции меняется, в зависимости от состояния и массы тела пациента, степени заболевания, формы лекарственного средства, способа и длительности введения, но может быть подходящим образом выбрана специалистом в данной области, и может составлять 0,0001-50 мг/кг или 0,001-50 мг/кг ежесуточно. Введение можно проводить один раз в сутки и можно разделять на несколько раз. Доза не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения никаким образом.

Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к косметической композиции, включающей экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа, в качестве активного ингредиента.

Косметическая композиция, в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой любой состав, выбранный из группы, состоящей из лосьона для кожи, смягчающего средства для кожи, тоника для кожи, вяжущего средства, лосьона, косметического молочка, увлажняющего лосьона, питательного лосьона, массажного крема, питательного крема, увлажняющего крема, крема для рук, основы под макияж, эссенции, питательной эссенции, маски, мыла, очищающей пены, очищающего лосьона, очищающего крема, лосьона для тела, очищающего средства для тела, очищающего средства, средства для ухода, косметического раствора, косметической маски, мази, геля, средства для растирания, жидкости, пластыря и спрея, но без ограничения конкретным составом, и может иметь состав типичной косметической композиции.

Добавки также не являются ограниченными каждым составом, и можно добавлять обычные добавки в области косметологии. Примеры обычных добавок в области косметологии включают одно или несколько, выбранные из группы, состоящей из антибиотика, связующего вещества, дезинтегрирующего средства, разбавителя, вещества, способствующего скольжению, стабилизатора, консерванта, отдушки, масла, воды, поверхностно-активного вещества, увлажняющего средства, низшего спирта, загустителя, хелатирующего агента, пигмента и антисептического средства.

Далее в настоящем описании, настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на примеры и сравнительные примеры. Однако, следующие примеры и сравнительные примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и содержание настоящего изобретения не является ограниченным следующими примерами.

1. Выделение и культивирование происходящих из жировой ткани человека мезенхимальных стволовых клеток

Жировую ткань обычно можно получать посредством липосакции, однако способ не является ограниченным этим. Происходящие из жировой ткани человека мезенхимальные стволовые клетки выделяли из жировой ткани, полученной посредством липосакции, следующим образом:

Выделенную жировую ткань промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). После того, как промытую жировую ткань разделяли на небольшие фрагменты, к ним добавляли 0,1% коллагеназу типа II. После обработки ткани при 37°C в течение 30 минут, ферментную реакцию инактивировали посредством добавления в нее 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы (содержащей 10% FBS DMEM с низким содержанием глюкозы), и центрифугирование проводили дважды при 300 xg в течение 10 минут. После отбрасывания супернатанта и суспендирования оставшегося осадка в содержащей 10% FBS DMEM с низким содержанием глюкозы, осадок собирали посредством центрифугирования фильтрата, который пропускали через 100 мкм нейлоновую мембрану, при 300 xg в течение 10 минут.

Далее, после суспендирования осадка клеток в DMEM с низким содержанием глюкозы (полной среде) включающей 10% эмбриональную бычью сыворотку (FBS), дополненную пенициллином и стрептомицином, осадок клеток разводили при концентрации 1 X 10⁵ клеток/1 мл среды в 150-мм чашке Петри для культивирования клеток, и культивировали при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂.

Среду меняли на свежую полную среду каждые 72 часа, клетки выделяли с использованием трипсина-ЭДТА во временной точке, когда концентрация клеток превышала 80%, и затем субкультивировали при концентрации 1 X 10⁵ клеток/1 мл среды в новой 150-мм чашке Петри для культивирования клеток.

2. Амплификация мезенхимальных стволовых клеток

Для выделения экзосом из культивированных стволовых клеток, способность к дифференцировке и способность к пролиферации усиливали посредством субкультивирования мезенхимальных стволовых клеток на протяжении 4-10 пассажей с заменой в то же время среды каждые 72 часа до 80% - 100% конфлюэнтности в полной среде, дополненной 5 нг/мл EGF, в ходе субкультивирования.

3. Изменение уровня продукции экзосом стволовых клеток, в соответствии с соотношением TNFa и циклогексимида, добавленных в субстратную среду

Мезенхимальные стволовые клетки 100% конфлюэнтности (5 × 10⁶ клеток), которые культивировали в 100-мм чашке Петри, промывали три раза с использованием PBS, и субстратную среду заменяли на DMEM с низким содержанием глюкозы. Концентрацию экзосом, выделенных из мезенхимальных стволовых клеток, обработанных совместно с использованием TNFα, измеряли посредством NTA, посредством увеличения концентрации циклогексимида с обработкой в то же время субстратной среды с использованием TNFα при концентрации 50 нг/мл.

При фиксированной концентрации 50 нг/мл TNFα, мезенхимальные стволовые клетки обрабатывали с использованием концентрации циклогексимида 50 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:1, 250 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:5, 1000 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:20, 5000 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:100, 25000 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:500, 50000 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:1000, и 100000 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:2000. После культивирования мезенхимальных стволовых клеток в течение 48 часов, культуральный раствор стволовых клеток собирали, и затем чистые экзосомы выделяли следующим образом. Культуральный раствор мезенхимальных стволовых клеток собирали, и затем центрифугировали при 300 xg в течение 10 минут, и супернатант отделяли, и затем отделенный супернатант центрифугировали при 2000 xg в течение 20 минут, и затем супернатант отделяли. После того, как отделенный супернатант снова ультрацентрифугировали при 100000 xg в течение 70 минут, осадок (экзосомы), от которого был удален супернатант, суспендировали в PBS и обрабатывали ультразвуком для выделения частиц экзосом, и концентрацию выделенных экзосом измеряли посредством анализа траекторий движения наночастиц (NTA). Результаты измерений посредством NTA показаны в таблице 1.

Со ссылкой на следующую таблицу 1, можно подтвердить, что можно выделять от 1,58X10⁹±3,2×10⁹ до 1,26×10¹¹±2,8×10⁹ частиц на мл культурального раствора клеток.

Таблица 1 TNFα (нг/мл) Циклогексимид (нг/мл) Соотношение (Циклогексимид/TNFα) Частиц/мл среды Пример 1 50 50 1 1,58X10⁹±3,2×10⁸ Пример 2 50 250 5 3,2X10⁹±3,6×10⁸ Пример 3 50 1000 20 1,2X10¹⁰±2,2×10⁸ Пример 4 50 5000 100 1,26X10¹¹±2,8×10⁹ Пример 5 50 25000 500 1,86X10¹⁰±1,28×10⁹ Пример 6 50 50000 1000 2,2X10¹⁰±1,22×10⁹ Пример 7 50 100000 2000 1,94X10¹⁰±1,18×10⁹

4. Выделение экзосом стволовых клеток, в соответствии с временем обработки TNFa и циклогексимидом, добавленными в субстратную среду

После обработки субстратной среды из примера 3 с использованием TNFα (50 нг/мл) и циклогексимида (5000 нг/мл), экзосомы стволовых клеток выделяли из культурального раствора после культивирования при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂, и концентрация экзосомы измерена посредством анализа траекторий движения наночастиц (NTA) и показана в таблице 2.

Со ссылкой на следующую таблицу 2, можно подтвердить, что когда субстратную среду обрабатывали с использованием TNFα (50 нг/мл) и циклогексимида (5000 нг/мл) в течение 30 часов - 100 часов, выделяли 1,1 × 10¹¹ или более экзосом на мл культурального раствора клеток.

Таблица 2 Время инкубации (часов) Частиц/мл среды Пример 8 12 1,52X10¹⁰±1,28×10⁹ Пример 9 24 8,8X10¹⁰±2,08×10⁹ Пример 10 48 1,14X10¹¹±7,3×10⁹ Пример 11 72 1,12X10¹¹±6,8×10⁹ Пример 12 96 1,12X10¹¹±7,04×10⁹ Пример 13 120 7,36X10¹⁰±6,4×10⁹

5. Выделение экзосом стволовых клеток, в соответствии с типом добавки к субстратной среде

Мезенхимальные стволовые клетки 100% конфлюэнтности (1,5 × 10⁷ клеток), культивированные в 150-мм чашке Петри, промывали три раза с использованием PBS. Мезенхимальные стволовые клетки, культивированные в среде, замененной на DMEM с низким содержанием глюкозы, культивировали в течение 48 часов в среде, в которую добавляли TNFα (50 нг/мл) и циклогексимид (5 мкг/мл) в комбинации (Пример 14), в среде, в которую добавляли циклогексимид (5 мкг/мл) (Пример 15), в среде, в которую добавляли TNFα (50 нг/мл) (Сравнительный пример 1), в среде, в которую добавляли 1 мкМ стауроспорин (Сравнительный пример 2), в среде, в которую добавляли 2 мкМ стауроспорин (Сравнительный пример 3), в среде, в которую добавляли тапсигаргин (5 мкМ) (Сравнительный пример 4), в истощенной по аминокислотам среде (сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS)) (Сравнительный пример 5), в истощенной по глюкозе среде [истощенных по глюкозе средам (Gluc(-))](Сравнительный пример 6) и в субстратной среде (10% PBS, DMEM с низким содержанием глюкозы) (Сравнительный пример 7). Затем, экзосомы выделяли из культуральных сред посредством вышеописанного способа выделения.

Для выделенных экзосом, количество частиц и размер частиц количественно оценивали посредством анализа траекторий движения наночастиц (NTA), и белки количественно оценивали посредством анализа Бредфорд. Кроме того, маркер экзосом измеряли с использованием Вестерн-блоттинга. Количество частиц выделенных экзосом проиллюстрировано на ФИГ. 3 и 4, и показано в следующей таблице 3. Количество белков и размер частиц экзосом показаны на ФИГ. 5-7 и в таблице 4. Кроме того, экспрессия маркеров экзосом CD63, рецептора 1 сфингозин-1-фосфата (S1PR1) и рецептора 3 сфингозин-1-фосфата (S1PR3) проиллюстрирована на ФИГ. 8.

Частицы размера с значением моды 141,6±58,4 нм индуцированы из мезенхимальных стволовых клеток в условиях обработки с использованием TNFα (50 нг/мл) и циклогексимида (5 мкг/мл) из примера 14, и показаны в таблице 4 и ФИГ. 5A. Со ссылкой на ФИГ. 9, частицы экзосом были окружены липидной бислойной мембраной, и экспрессию CD63, который является маркером для экзосом, подтверждали посредством трансмиссионной электронной микроскопии (TEM). Со ссылкой на ФИГ. 10, в тесте экспрессии поверхностного маркера экзосом с использованием Exoview, для экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, показаны маркеры экзосом из числа кластера дифференцировки 63 (CD63), кластера дифференцировки 9 (CD9) и кластера дифференцировки 81 (CD81).

Таблица 3 Условия Частиц/мл среды Частиц/10 ⁷ клеток Пример 14 TNFα(50 нг/мл), циклогексимид (5 мкг/мл) 1,144X10¹¹±7,304×10⁹ 2,288X10¹²±1,461×10¹¹ Пример 15 Циклогексимид(5 мкг/мл) 1,900X10¹⁰±1,140×10⁹ 3,800X10¹¹±2,280×10¹⁰ Сравнительный пример 1 TNFα(50 нг/мл) 3,400X10⁸±1,740×10⁷ 6,800X10¹⁰±3,480×10⁹ Сравнительный пример 2 Стауроспорин(1 мкМ) 2,450X10⁹±2,650×10⁸ 4,900X10¹⁰±5,300×10⁹ Сравнительный пример 3 Стауроспорин(2 мкМ) 5,500X10⁹±7,000×10⁸ 1,100X10¹¹±1,400×10¹⁰ Сравнительный пример 4 Тапсигаргин(5 мкМ) 5,000X10⁸±1,050×10⁸ 1,000X10¹⁰±2,100×10⁹ Сравнительный пример 5 HBSS 3,350X10⁸±4,800×10⁷ 6,700X10⁹±9,600×10⁸ Сравнительный пример 6 Gluc(-) 5,500X10⁸±4,750×10⁷ 1,100X10¹⁰±9,500×10⁸ Сравнительный пример 7 10% PBS, DMEM с низким содержанием глюкозы 1,200X10⁸±1,040×10⁷ 2,400X10⁹±2,080×10⁸

Таблица 4 Условия мкг белка/мл среды Размер в диаметре (значение моды±SD) Пример 14 TNFα(50 нг/мл), Циклогексимид(5 мкг/мл) 69,847±0,841 141,6±58,4 Пример 15 Циклогексимид(5 мкг/мл) 16,667±0,135 141,7±56,3 Сравнительный пример 1 TNFα (50 нг/мл) 2,982±0,024 129,8±55,2 Сравнительный пример 2 Стауроспорин (1 мкМ) 0,780±0,025 145,7±62,3 Сравнительный пример 3 Стауроспорин(2 мкМ) 2,950±0,050 136,3±64,4 Сравнительный пример 4 Тапсигаргин(5 мкМ) 0,600±0,025 145,6±63,8 Сравнительный пример 5 HBSS 0,291±0,025 148,2±59,2 Сравнительный пример 6 Gluc(-) 3,630±0,125 139,8±82,7 Сравнительный пример 7 10% PBS, DMEM с низким содержанием глюкозы 0,105±0,006 141,6±58,4

Следует понимать, что вышеуказанное является иллюстрацией настоящего изобретения, и его не следует рассматривать как ограниченное конкретными описанными вариантами осуществления, и что модификации описанных вариантов осуществления, так же как другие варианты осуществления, предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения. Изобретение определено посредством следующей формулы изобретения, с включенными в нее эквивалентами пунктов формулы изобретения.

Изобретение относится к клеточной биологии, а именно к способу получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток и культуры клеток, полученной из них, включающему стадии: получения образца клеток из мезенхимальных стволовых клеток и его субкультивирования; культивирования субкультивированных клеток в субстратной среде, содержащей фермент, ингибирующий синтез белка, для получения культуры клеток; и отделения экзосом от культуры клеток. Преимущество способа получения экзосом по настоящему изобретению заключается в том, что можно выделять экзосомы в высокой концентрации с высокой чистотой. 8 з.п. ф-лы, 10 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Способ получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, включающий: предоставление образца клеток, полученных из мезенхимальных стволовых клеток;

субкультивирование образца клеток в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы;

культивирование субкультивированных клеток в субстратной среде, содержащей циклогексимид, и затем получение культурального раствора клеток; и

выделение экзосом из культурального раствора клеток,

где при получении культурального раствора клеток, субстратная среда дополнительно содержит TNFα, и

где субстратная среда имеет соотношение TNFα : циклогексимид 1:10-1:2000.

2. Способ по п.1, где TNFα содержится при концентрации 5-500 нг/мл.

3. Способ по п.1, где время обработки TNFα и ферментом, ингибирующим синтез белка, составляет 30-100 часов.

4. Способ по п.1, где в культуральном растворе клеток,

количество экзосом и содержание любого одного или нескольких из происходящего из экзосом белка и происходящей из экзосом РНК увеличено.

5. Способ по п.1, где выделяют 1,1 × 10¹¹ или более экзосом на мл культурального раствора клеток.

6. Способ по п.1, где при субкультивировании образца клеток,

среда содержит один или несколько, выбранные из группы, состоящей из EGF, FGF-2, GDF11, KGF, HGF, PDGF, VEGF, IGF и TGF-b, и

субкультивирование образца клеток проводят на протяжении 4-10 пассажей.

7. Способ по п.1, где экзосома представляет собой один или несколько маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD63, CD9, CD81, S1PR1 и S1PR3.

8. Способ по п.1, где при получении образца,

мезенхимальные стволовые клетки получают из жировой ткани или плацентарной ткани.

9. Способ по п.8, где стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку, взрослую стволовую клетку или индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (IPS).