СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕКРЕТОМА МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК, СОДЕРЖАЩЕГО ФРАКЦИЮ ЭКЗОСОМ Российский патент 2024 года по МПК A61K35/28 C12N5/775 

Обнаружено, что существует несколько типов клеток-предшественников в костном мозге человека, и среди них, клетки-предшественники, имеющие мультипотентность, называют мезенхимными стромальными клетками (МСК). Известно, что МСК присутствуют не только в костном мозге, но также в большинстве органов, таких как жировая ткань, печень и мышцы.

Известно, что МСК имеют способность к самостоятельной пролиферации, могут дифференцироваться в остеобласты, хондроциты, миоциты, стромальные клетки костного мозга, фибробласты сухожилий/связок, адипоциты и т.п., и имеют противовоспалительную и иммуномодулирующую способность как высоко пролиферативные адгерентные клетки. В частности, МСК имеют иммуносупрессивные эффекты, такие как ингибирование пролиферации и дифференцировки T- и B-лифмоцитов, ингибирование функций дендритных клеток, натуральных киллеров (NK) и макрофагов.

МСК продуцируют различные паракринные/секреторные факторы, такие как хемокины, цитокины, факторы роста и т.п., за счет которых и реализуются эффекты МСК, а не за счет дифференцировки самих МСК. Кроме того, известно, что секретируют МСК не только вышеперечисленные факторы, но также внеклеточные везикулы (EVs), и известно, что внеклеточные везикулы влияют на различные аспекты процесса регенерации посредством межклеточной передачи сигналов.

Среди различных EVs, экзосома представляет собой везикулу, состоящую из липидного бислоя, и служащую для транспорта (передачи) белков, биоактивных липидов и РНК (мкРНК), которые являются внутриклеточными биомолекулами, осуществляющие функциональную роль опосредования коммуникации клетка-клетка и клеточного иммунитета.

Кроме того, известно, что экзосомы, секретированные из МСК, вовлечены в коммуникацию клетка-клетка, и для них показана терапевтическая эффективность в регенеративной медицине, сопоставимая с трансплантацией стволовых клеток, и недавно активно проводились исследования терапевтических эффектов для различных заболеваний с использованием экзосом, секретированных МСК, без использования самих клеток.

Ультрацентрифугирование, наиболее часто используемое среди способов выделения экзосом, имеет то преимущество, что большое количество экзосом можно выделять за один раз, однако, имеет ту проблему, что необходимо дорогостоящее оборудование, выделение экзосом занимает много времени, может происходить механическое повреждение экзосом из-за центрифугирования при крайне высоких скоростях, и в частности, чистота выделенных экзосом уменьшается и т.п.

Из уровня техники (Mansouri N. et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and 10 revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes // JCI insight. - 2019. - Т. 4. - №. 21.) известен способ получения экзосом с помощью коммерческого набора из МСК костного мозга человека, где выделенные экзосомы имеют поверхностные маркеры CD9, CD63, средний размер экзосом составил - 35-150 нм. Однако, описанное в данной работе получение МСК костного мозга является менее перспективным по своей доступности и безопасности для донора.

Также, из уровня техники известен способ получения экзосом с использованием метода ультрафильтрации из секретома МСК жировой ткани мышей C57BL/6, где выделенные экзосомы имеют поверхностные маркеры CD9, CD63, CD81, средний размер экзосом составил - 145 нм и 285 нм. Однако, наличие бимодальности в средних размерах экзосом указывает на присутствие смеси из двух типов частиц, которые могут быть как смесью двух типов внеклеточных везикул, так и результатом загрязнения при анализе размера экзосом.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения получения экзосом, происходящих из МСК, включающий: получение образца МСК; субкультивирование образца клеток в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы; культивирование субкультивированных клеток в субстратной среде, содержащей фермент, ингибирующий синтез белка, и затем получение культурального раствора клеток; и выделение экзосом из культурального раствора клеток (Способ получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, и культурального раствора, продуцированного из них. Ким Д.Я., Чвае Й.Д. Патент на изобретение 2799432 C1, 05.07.2023. Заявка № 2022111154 от 29.06.2020). Таким образом, среди общих признаков данного способа с заявляемым можно выделить схожие методы получения средства (получение МСК из жировой ткани, культивирование МСК в DMEM с низким содержанием глюкозы, включающей 10% эмбриональную бычью сыворотку (FBS), характеристика внеклеточных везикул по размеру и поверхностным маркерам). Однако есть ряд существенных отличий. Во-первых, в данной работе для получения первичной культуры МСК применяли ферментативную дезагрегацию жировой ткани 0,1% коллагеназой типа II, что требует больших затрат времени, влечет за собой риск протеолитического повреждения клеток во время обработки ферментами и приводит к селекции клеток по их устойчивости к протеазам. Во-вторых, в данной работе клетки культивировали в среде DMEM с низким содержанием глюкозы, включающей 10% FBS, дополненной пенициллином и стрептомицином, однако, использование ламинарно-потоковых шкафов и выполнение асептических правил работы делают применение антибиотиков не обязательным и даже вредным в рутинной работе. В-третьих, в данной работе МСК амплифицировали добавлением в среду 5 нг/мл EGF в ходе субкультивирования, а уровень продукции экзосом изменяли в соответствии с соотношением TNFa и циклогексимида, добавленных в субстратную среду, что, в случае применения данного способа для получения секретома МСК человека, затрудняет отнесение полученного продукта к минимально манипулированным продуктам, т.е. продуктам на основе клеток и тканей человека, подвергшихся минимальным процедурам и/или изменениям, не затрагивающим их исходные биологические характеристики.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка нового способа получения секретома МСК, содержащего экзосомы высокой чистоты и концентрации, направленного на решение вышеупомянутых проблем в связанной области техники.

Раскрытие изобретения

Конкретные функциональные описания ниже проиллюстрированы только для описания иллюстративных вариантов осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, и иллюстративные варианты осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, могут быть воплощены в различных формах и не должны быть интерпретированы как ограниченные иллюстративными вариантами осуществления, описанными в настоящем описании.

Поскольку иллюстративные варианты осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, могут иметь различные изменения и могут иметь различные формы, конкретные иллюстративные варианты осуществления подробно описаны в настоящем описании. Однако, это не предназначено для ограничения иллюстративных вариантов осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, конкретной описанной формой, и должно быть интерпретировано для включения всех модификаций, эквивалентов и заменителей, в содержание и объем настоящего изобретения.

Термины, используемые в настоящем описании, использованы только для описания конкретных иллюстративных вариантов осуществления и не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Выражение в единственном числе включает выражение во множественном числе, если контекст явно не требует иного.

Если не определено иное, все термины (включая технические и научные термины), используемые в настоящем описании, можно использовать в значении, которое может являться общепринятым в области, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, понятно, что термины, определенные в общеупотребительных словарях, не следует интерпретировать в идеализированном или избыточном смысле, если явно и конкретно указано иное.

Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения секретома МСК, содержащего экзосомы, включающему: получение первичной культуры МСК; субкультивирование МСК в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы; получение культурального раствора клеток; выделение секретома, содержащего экзосомы, из культурального раствора клеток.

В рамках изобретения, термин «центрифугирование» относится к приложению центробежной силы посредством вращения материала вокруг оси при способе выделения с использованием центрифуги. По настоящему изобретению, центрифугирование может представлять собой любое, выбранное из группы, состоящей из дифференциального центрифугирования, центрифугирования в градиенте плотности и газового центрифугирования.

В рамках изобретения, термин «стволовые клетки» относится к клеткам, имеющим способность к дифференцировке в две или более новые клетки, в то же время имеющим способность к самовоспроизведению, и может быть классифицирован на тотипотентные стволовые клетки, плюрипотентные стволовые клетки и мультипотентные стволовые клетки. Чтобы быть распознанными как стволовые клетки, клетки должны постоянно воспроизводиться в недифференцированном состоянии, и должны являться способными к дифференцировке в специфические клетки в специфических условиях культивирования. Вышеописанные стволовые клетки недавно привлекли внимание в качестве кандидата на композицию клеточного лекарственного средства из-за их способности к дифференцировке и способности к самовоспроизведению, проведено множество исследований. Присутствует то преимущество, что является возможным выделять из них экзосомы, содержащие генетическую информацию, белки и факторы роста стволовых клеток.

Стволовые клетки могут представлять собой стволовые клетки костного мозга, стволовые клетки пуповинной крови или происходящие из жировой ткани мезенхимные стромальные клетки, могут представлять собой стволовые клетки человеческого происхождения или животного происхождения, и могут представлять собой, например, происходящие из жировой ткани мыши МСК, но не являются ограниченными ими.

В рамках изобретения, термин «экзосомы» относится к малой везикуле, имеющей мембранную структуру, секретируемую из различных типов клеток, которые играют различные роли, такие как доставка составляющих мембраны, белков и РНК, посредством связывания с другими клетками и структурами.

В рамках изобретения, «среда DMEM» относится к среде Игла в модификации Дульбекко, и является наиболее общеупотребительной средой для культивирования клеток животных. В ходе культивирования клеток животных, используют среду DMEM с низким содержанием глюкозы, однако, среда DMEM не является ограниченной этим, можно использовать также среду DMEM с высоким содержанием глюкозы, и после выращивания клеток в среде с высоким содержанием глюкозы до достижения 80-100% конфлюэнтности, клетки можно культивировать в среде с низким содержанием глюкозы. Когда клетки культивируют в среде, полученной посредством смешивания DMEM с высоким содержанием глюкозы и DMEM с низким содержанием глюкозы, присутствует то преимущество, что клетки можно получать быстро. Концентрация глюкозы в DMEM с низким содержанием глюкозы может составлять 800-1200 мг/л, и кроме того, клетки можно культивировать посредством добавления эмбриональной бычьей сыворотки в среду DMEM с низким содержанием глюкозы, но способ культивирования не является ограниченным этим.

В рамках изобретения, термин «культуральный раствор» относится к супернатанту культуры клеток, в которой МСК культивируют с использованием культуральной среды для МСК. Культуральный раствор МСК содержит различные физиологически активные агенты, секретируемые из клеток в процессе культивирования МСК.

Осадок клеток можно получать посредством центрифугирования суспензии клеток, при 100x g - 500x g в течение 5-30 минут.

Субкультивирование осадков клеток не может включать добавление антибиотиков в культуральную среду. Клетки можно разводить до концентрации 1×10⁵ клеток / 1 мл среды в культуральном флаконе площадью 25 см², и можно культивировать в инкубаторе с 3-10%, конкретно, 5% CO₂ при температуре 30°C - 40°C, конкретно, 37°C. Кроме того, клетки можно культивировать в чашках Петри или роллерных бутылях, в которых клетки можно стабильно поддерживать в течение длительного периода времени, так что присутствует то преимущество, что можно получать большое количество культурального раствора клеток.

Субкультивирование образца осадка клеток в среде можно проводить на протяжении 4-10 пассажей. Существуют те проблемы, что когда клетки подвергаются пролиферации на протяжении 4 или менее пассажей, степень экспрессии может быть низкой, поскольку клетки не пролиферируют, и когда клетки подвергаются пролиферации на протяжении 10 или более пассажей, клетки могут осуществлять сверхэкспрессию.

При субкультивировании образца осадка клеток, является предпочтительным, чтобы клетки культивировали посредством замены среды каждые 70-75 часов по достижении 80% - 100% конфлюэнтности монослоя. Конкретно, является предпочтительным, чтобы клетки культивировали посредством замены среды каждые 72 часа, и когда среду заменяют в пределах 70 часов, существует та проблема, что осадок высокой чистоты невозможно получить, и когда среду заменяют через каждый интервал, превышающий 75 часов, существует та проблема, что осадок высокой концентрации невозможно получить.

Субкультивирование для выделения секретома, содержащего экзосомы высокой чистоты, происходящих из МСК по настоящему изобретению, имеет то преимущество, что МСК подвергаются минимальным процедурам и/или изменениям, не затрагивающим их исходные биологические характеристики, что позволяет отнести полученный продукт к минимально манипулированным продуктам.

«Культуральный раствор» относится к супернатанту культуры клеток, в которой МСК культивируют с использованием культуральной среды для МСК. Культуральный раствор МСК содержит различные физиологически активные МСК, секретируемые из клеток в процессе культивирования МСК.

Субстратная среда может представлять собой бессывороточную субстратную среду или субстратную среду с сывороткой. В качестве субстратной среды, используют среду DMEM с низким содержанием глюкозы, но субстратная среда не ограничена этим, и используют среду DMEM с высоким содержанием глюкозы, или можно использовать среду, включающую как среду DMEM с низким содержанием глюкозы, так и среду DMEM с высоким содержанием глюкозы.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, получение МСК из образца жировой ткани может включать разделение образца на небольшие фрагменты и механическую дезагрегацию ткани с использованием автоматизированной системы гомогенизации тканей и подготовки клеточных суспензии. После центрифугирования при 200-400x g в течение 3-20 минут, образец клеток можно получать посредством отбрасывания супернатанта, экстракции частиц осадка клеток, и суспендирования частиц осадка в FBS и в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM).

Получение образца клеток может дополнительно включать ресуспендирование полученного образца клеток, и затем рассев ресуспендированных клеток. Когда дополнительно включают рассев ресуспендированных клеток, существует то преимущество, что является возможным предотвращать агрегацию частиц осадка клеток в буфере FBS при суспендировании.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, при получении образца, МСК могут быть извлечены из жировой такни.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, можно выделять 3,6 × 10⁹ или более экзосом на мл культурального раствора клеток. Более конкретно, можно выделять 7,3 × 10¹¹ или менее экзосом на мл культурального раствора клеток.

Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к культуральному раствору, включающему экзосомы высокой чистоты, происходящие из МСК, полученные с использованием данного способа.

В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, в культуральном растворе можно увеличивать количество экзосом и содержание любого одного или нескольких из происходящего из экзосом белка и происходящей из экзосом РНК.

Кроме того, для качественного и количественного анализа экзосом, экзосомы можно метить флуоресцентным материалом, так что существует то преимущество, что уровень экстракции можно указывать посредством измерения значения флуоресцентного сигнала экзосом, меченных флуоресцентным материалом, для анализа состояния для качественного и количественного анализа экзосом.

В рамках изобретения, термин «флуоресцентный материал» относится к материалу, который образует свет посредством изменения физических условий и химической обработки. Например, флуоресцентный материал может представлять собой флуоресцентный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и красный флуоресцентный белок (RFP), или может представлять собой фотобелок или люциферазу.

Кроме того, в экзосомах, меченных флуоресцентным материалом, флуоресцентный материал локализован отдельно в экзосомах, или экзосомы, меченные флуоресцентным материалом, могут включать слитый белок, в котором связаны мембранный белок и флуоресцентный материал. Слитый белок имеет то преимущество, что количество и значение сигнала экзосом можно точно идентифицировать, поскольку флуоресцентный материал может связываться с мембранным белком непосредственно или посредством линкера.

Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей экзосомы, происходящие из МСК, полученных с использованием способа, в качестве активного ингредиента.

В фармацевтической композиции по настоящему изобретению, можно использовать общеизвестный и общеупотребительный адъювант, и дополнительный пригодный носитель или разбавитель. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в форме твердого вещества, раствора, эмульсии, диспергирующего вещества, мицеллы, липосомы и т.п., и композиция, полученная в этом случае, включает фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, в качестве активного ингредиента, вместе с органическим или неорганическим носителем или наполнителем, пригодным для энтерального или парентерального введения. Активный ингредиент можно смешивать, например, с обычными нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями для таблеток, гранул, капсул, суппозиториев, растворов, эмульсий, суспензий и любой другой формы, подходящей для использования. Носители, которые можно использовать, включают глюкозу, лактозу, гуммиарабик, желатин, маннит, крахмальный клейстер, трисиликат магния, тальк, кукурузный крахмал, коллоидный диоксид кремния, картофельный крахмал, мочевину, триглицериды со средней длиной цепи, декстран и другие носители, пригодные для использования в изготовлении препаратов, в твердой, полутвердой или жидкой форме. Кроме того, можно использовать вспомогательные, стабилизирующие, загущающие и окрашивающие средства, и ароматизирующие средства.

Фармацевтическую композицию можно использовать посредством составления в форме перорального состава, такого как порошок, гранула, пилюля, капсула, суспензия, эмульсия, сироп и аэрозоль, препарат для наружного применения, суппозиторий и стерильный раствор для инъекций, в соответствии с типичным способом. Конкретно, когда получают фармацевтическую композицию, фармацевтическую композицию можнополучатьсиспользованиемобщеупотребительногоразбавителяилинаполнителя, такого как наполнитель, расширитель, связывающее средство, увлажняющее средство, дезинтегрирующее средство и поверхностно-активное вещество. Твердый состав для перорального введения включает таблетку, пилюлю, порошок, гранулу, капсулу и т.п., и твердый состав можно получать посредством смешивания по меньшей мере одного наполнителя, например, крахмала, карбоната кальция, сахарозы или лактозы, желатина и т.п., с фармацевтической композицией по настоящему изобретению. Кроме того, в дополнение к простым наполнителям, можно использовать также смазывающие средства, такие как стеарат магния и тальк. Жидкий состав для перорального введения соответствует суспензии, жидкости для внутреннего применения, эмульсии, сиропу и т.п., и жидкий состав может включать, в дополнение к воде и вазелиновому маслу, которые являются простыми общеупотребительными разбавителями, различные наполнители, например, увлажняющее средство, подсластитель, ароматизатор, консервант, и т.п. Примеры состава для парентерального введения включают водный стерильный раствор, неводный растворитель, суспензию, эмульсию, лиофилизированный препарат и суппозиторий. В качестве неводного растворителя и суспензии, можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, пригодный для инъекции сложный эфир, такой как этилолеат, и т.п. В качестве основы суппозитория, можно использовать витепсол, макрогол, Tween 61, масло какао, лауриновый жир, глицерожелатин, и т.п.

Способ введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением включает, но без ограничения, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, интракардиальное, чрескожное, подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, энтеральное, местное, подъязычное или ректальное введение. Парентеральное введение является предпочтительным. В рамках изобретения, термин «парентеральное» включает способы подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, интрасиновиальной, интрастернальной, интратекальной, внутриочаговой и интракраниальной инъекции или инфузии.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить посредством любого устройства, так чтобы активный материал можно было переносить в клетку-мишень. Предпочтительным способом введения и составом является инъекция.

Препарат для инъекции можно получать посредством использования водного растворителя, такого как физиологический солевой раствор, раствор Рингера, раствор Хенкса или стерильный водный раствор, растительного масла, такого как оливковое масло, сложного эфира высшей жирной кислоты, такого как этилолеат, неводного растворителя, такого как этанол, бензиловый спирт, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль или глицерин, и т.п., и для трансмукозального введения, можно использовать неинвазивное средство, широко известное в данной области, являющееся пригодным для барьера, через который должна проходить инъекция, и препарат для инъекции, может, кроме того, включать фармацевтический носитель, такой как аскорбиновая кислота, гидросульфит натрия, BHA, токоферол, ЭДТА, и т.п., в качестве стабилизатора для предотвращения дегенерации, эмульгатор, забуферивающее средство для контроля pH и консервант для подавления роста микроорганизмов, такой как нитрат фенил ртути, тимеросал, хлорид бензалкония, фенол и крезол, бензиловый спирт.

Далее в настоящем описании, настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на примеры и сравнительные примеры. Однако, следующие примеры и сравнительные примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и содержание настоящего изобретения не является ограниченным следующими примерами.

1. Выделение и культивирование происходящих из жировой ткани мыши МСК

Выделенную жировую ткань мыши промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Первичные культуры МСК жировой ткани получали двумя путями:

1. После того, как промытую жировую ткань разделяли на небольшие фрагменты, проводили механическую дезагрегацию ткани с использованием автоматизированной системы гомогенизации тканей и подготовки клеточных суспензий BD Machine (BD, США). После центрифугирования при 300 g в течение 10 минут, образец клеток получали посредством отбрасывания супернатанта, экстракции частиц осадка клеток, и суспендирования частиц осадка в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS.

2. Ферментативную дезагрегациюю жировой ткани проводили раствором коллагеназы 200 ЕД/мл (БиолоТ, Россия) при 37°C в течение 4 ч. Полученную суспензию центрифугировали 10 мин при 300 g, удаляли супернатант, осадок ресуспендировали в полной среде.

Клетки культивировали в среде DMEM (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco, США) при концентрации 1×10⁵ клеток / 1 мл среды в культуральных флаконах площадью 25 см² (Thermo Scientific, США) при 37°C и 5% CO₂. Смена среды осуществлялась каждые 3-4 дня. После достижения 80-90% конфлюэнтности монослоя клетки отделяли с помощью 0,25% раствора трипсина (БиолоТ, Россия) и 0,02% раствора Версена (БиолоТ, Россия).

Подсчет клеток и определение жизнеспособности проводили при помощи окрашивания трипановым синим с использованием автоматического счетчика клеток Luna-FL (Logos Biosystems).

2. Получение секретома МСК, содержащего экзосомы

Секретом МСК получали после 3-4 пассажа. Клетки открепляли с использованием 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена, трехкратно промывали стерильным раствором фосфатного буфера, центрифугируя 5 мин при 300 g и комнатной температуре между промывками, после чего вносили по 10⁶ живых клеток в 500 мкл фосфатного буфера в лунки 24-луночного планшета. Планшет инкубировали при комнатной температуре 24 ч, после чего супернатант аспирировали, фильтровали с использованием шприцевого фильтра с диаметром пор 0,2 мкм, и центрифугировали 20 мин при 2000 g.

Фракцию экзосом изолировали при помощи магнитного сепаратора с использованием набора реагентов EV Isolation Kit CD63, mouse (Miltenyi Biotec) в соответствии с рекомендациями производителя.

Для выявления связавшихся с антителами на поверхности магнитных частиц экзосом в пробирки вносили 15 мкл антител к CD44, CD90 (THY1) и CD105, меченных флуоресцентными красителями Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 350 соответственно, и инкубировали 50 мин при 4°С.

Цитофлуориметрия была выполнена на проточном цитометре ACEA Novocyte 3000. В выделенной популяции экзосом анализировали медиану интенсивности флуоресценции (MFI) в сравнении с отрицательным контролем (магнитные частицы с меченными антителами).

Уровень экспрессии CD44, CD90 и CD105 на поверхности экзосом, полученных от МСК жировой ткани, представлен на фиг. 1.

Экспрессия CD44 в группе 1 и группе 2 достоверно превышала контрольные значения, MFI составляла 557,26±30,25 (t=16,469, p<0,001) и 460,53±31,92 (t=12,643, p<0,001) соответственно. При этом, экспрессия CD44 на поверхности экзосом, полученных от клеток, выделенных механической дезагрегацией, была на 17,36% ниже в сравнении с экзосомами клеток, выделенных ферментативным путем, однако, достоверно не отличалась (t=2,199, p>0,05) (фиг. 2).

Экспрессия CD90 в группе 1 и группе 2 достоверно превышала контрольные значения, MFI составляла 701,44±51,24 (t= 12,093, p<0,001) и 614,68±32,30 (t= 16,394, p<0,001) соответственно. При этом, экспрессия CD90 на поверхности экзосом, полученных от клеток, выделенных механической дезагрегацией, была на 12,37% ниже в сравнении с экзосомами клеток, выделенных ферментативным путем, однако, также достоверно не отличалась (t= 1,432, p>0,05) (фиг. 3).

Экспрессия CD105 в группе 1 и группе 2 достоверно превышала контрольные значения, MFI составляла 771,57±73,60 (t=9,176, p<0,001) и 538,66±49,14 (t=9,001, p<0,001) соответственно. При этом экспрессия CD105 на поверхности экзосом, полученных от клеток, выделенных механической дезагрегацией, была достоверно ниже на 30,19% (t=2,632, p<0,05) в сравнении с экзосомами клеток, выделенных ферментативным путем (фиг. 4).

По результатам проведенного исследования показано, что использование описанного в настоящей работе метода позволяет выделить секретом МСК (полученных как в результате ферментативной, так и механической дезагрегации жировой ткани), содержащий фракцию экзосом, которые обладают выраженной экспрессией характерных для МСК поверхностных маркеров CD44, CD90 и CD105.

При этом при использовании механической дезагрегации уровень экспрессии указанных маркеров значительно не отличается от такового при ферментативной дезагрегации.

Полученные данные дают основание проводить дальнейшие исследования новых материалов для направленной тканевой регенерации, содержащих экзосомы минимально манипулированных МСК, полученных путем механической дезагрегации ткани.

Изобретение относится к области молекулярной и клеточной биологии, химии и фармакологии, а именно к способу получения секретома мезенхимных стромальных клеток (МСК), содержащего фракцию экзосом. Предложенный способ включает выделение и культивирование происходящих из жировой ткани мыши МСК, последующее открепление клеток с использованием 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена, трехкратное промывание стерильным раствором фосфатного буфера, центрифугирование 5 мин при 300 g и комнатной температуре между промывками, внесение по 10⁶ живых клеток в 500 мкл фосфатного буфера в лунки 24-луночного планшета с инкубацией при комнатной температуре 24 ч, после чего супернатант аспирируют, фильтруют с использованием шприцевого фильтра с диаметром пор 0,2 мкм и центрифугируют 20 мин при 2000 g. Изобретение обеспечивает разработку нового способа получения секретома МСК, содержащего экзосомы высокой чистоты и концентрации. 4 ил.

Способ получения секретома мезенхимных стромальных клеток (МСК), содержащего фракцию экзосом, включающий выделение и культивирование происходящих из жировой ткани мыши МСК с последующим откреплением клеток с использованием 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена, трехкратным промыванием стерильным раствором фосфатного буфера, центрифугированием 5 мин при 300 g и комнатной температуре между промывками, внесением по 10⁶ живых клеток в 500 мкл фосфатного буфера в лунки 24-луночного планшета с инкубацией при комнатной температуре 24 ч, после чего супернатант аспирируют, фильтруют с использованием шприцевого фильтра с диаметром пор 0,2 мкм и центрифугируют 20 мин при 2000 g.