СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ПЕРИКАРДИАЛЬНЫХ БИОМАТЕРИАЛОВ ДЛЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ХИРУРГИИ Российский патент 2019 года по МПК A61F2/24 

Изобретение относится к области медицины, в частности, к способам повышения биосовместимости и подавления кальциноза материалов, изготовленных из слоистых биоматериалов, в частности, из перикарда, для реконструктивной хирургии, в первую очередь сердечно-сосудистой хирургии.

Для направленной регенерации тканей в различных областях регенеративной медицины используются биоматериалы, обработанные до имплантации в организм реципиента специальным образом. Различные виды предимплантационной подготовки материалов для реконструктивной и сердечно-сосудистой хирургии направлены на подавление иммунного ответа на материалы, например, путем их децеллюляризации, (Ann. Thorac. Surg. 2001, v. 71 (5 Suppl) p. S428-432; Ann Thorac Cardiovasc Surg 2009; 15: 362-367; J. Heart Valve Disease 2011;v. 20, p. 341-347; Ann Thorac Surg, 2011;92:131-137), на подавление их способности к паталогической кальцификации. Известно, что биосовместимость материалов определяется также свойствами их матрикса, составом и пространственным расположением компонентов матрикса (архитектоникой). В частности, это относится к широко используемым для реконструктивной хирургии фрагментам алло- и ксеногенного перикарда. Серозный слой перикарда (p. serosum) обладает низкой адгезивностью для клеток, а наружный фиброзный слой перикарда (p. fibrosum) имеет повышенную адгезивность для клеток, что имеет важное значение для предотвращения спаечных процессов при использовании этих материалов в сердечно-сосудистой хирургии. Учитывая полярные свойства слоистых биоматериалов, в частности перикарда, разрабатываются способы их обработки, обеспечивающие повышение биосовместимости создаваемых на их основе материалов для реконструктивной хирургии.

Известен способ подготовки биопротезных материалов на основе перикарда, в котором для повышения их биосовместимости производится удаление фиброзного слоя перикарда с помощью лазера или механических приборов, например, дерматома, для уменьшения адгезивности этой части материала и, соответственно, для подавления неблагоприятной фиброзной гиперплазии (патент США, N 8,846,390 В2, 30-09-2014).

Недостатком способа является то, что ни механическая, ни лазерная обработка не позволяют точно удалить только фиброзный слой и сохранить серозный, а надежное удаление фиброзного слоя вместе с частью медиального слоя сопряжено с избыточным уменьшением толщины биомембраны и ее прочностных свойств. Другим недостатком является то, что удаление фиброзного слоя лазером сопряжено с повреждением структуры тканевого матрикса в зоне удаления, а нарушение структуры будет вызывать иммунную реакцию на имплантат, избыточный фиброгенез, асептический кальциноз и деструкцию материала. Тот же недостаток будет проявляться и при механической обработке дерматомом, фрезой и другими механическими средствами, заявленными в этом патенте.

Известен способ подготовки вторично покрытых коллагеном серозных мембран, изготовленных из перикарда, в котором перикард обрабатывается этанолом, затем фиброзный слой перикарда удаляют скребком, после чего материал обрабатывают для удаления клеток, липидов, неколлагеновых белков, затем покрывают различными комбинациями чистого коллагена для подавления адгезии клеток и повышения биосовместимости материала (патент США 2013/0226314 А1, 29-08-2013).

Недостатком этого способа является то, что в этом способе также неясно, как удалить фиброзный слой и сохранить медиальный и серозный слой, поскольку нет критериев такого удаления, а покрытие коллагеном не является определяющим для подавления адгезивности материала для клеток. Другим недостатком является механическое повреждение матрикса при удалении фиброзного слоя скребком, как и в первом аналоге (патент США, N 8,846,390 В2, 30-09-2014). Кроме этого, покрытие неструктурированным нативным коллагеном также способно вызывать тканевую реакцию на имплантат, резорбцию и построение новой фиброзной ткани, и не может подавить реакцию на поврежденный коллаген при столь жестком удалении фиброзного слоя перикарда.

Наиболее близким, принятым за Прототип, является способ обработки тканей для реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии, включающий предварительную инкубацию тканей до имплантации в физиологическом солевом растворе с ЭДТА, с последующей обработкой неионным липофильным детергентом моногидратом дезоксихолата натрия, вызывающим гибель клеток донора, и с последующей отмывкой неионного детергента, в котором предварительную инкубацию биоматериалов выполняют в течение 4-6 часов в физиологическом растворе, содержащем 0,5-2 мМ ЭДТА и органический буфер HEPES при рН 7.0, последующую инкубацию с моногидратом дезоксихолата натрия выполняют в течение 30-48 часов при 37°С, используя физиологический раствор, также содержащий органический буфер HEPES при рН 7.8, а отмывку ткани от дезоксихолата выполняют в физиологическом растворе, содержащем 0,9% хлористый натрий, HEPES (рН 7,8) и 15-25% этилового спирта, в течение 8 суток при 37°С с 2-х кратной сменой среды каждые сутки на свежую, с последующей отмывкой от этилового спирта в течение суток (Патент на изобретение РФ №2499611 от 27.11.2013 г.).

Недостатком этого способа, принятого за прототип, является то, после обработки таким способом тканей перикарда остается не только серозный, но и фиброзный слои и, следовательно, сохраняется возможность фиброзной гиперплазии с одной из сторон биоматериала, что впоследствии может способствовать резорбции материала и снижению тем самым его биосовместимости и долговечности.

Задачей настоящего изобретения является создание способа подготовки материалов на основе перикарда для реконструктивной и сердечно-сосудистой хирургии с применением моногидрата дезоксихолата натрия, который, вызывая гибель клеток донора и освобождая ткань от иммуногенных и кальциноз-индуцирующих липидных компонентов, не только предотвращает их кальциноз в организме реципиента, но и препятствует фиброзной гиперплазии на одной из сторон материала и повышает биосовместимость слоистых биоматериалов.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе, включающем предварительную инкубацию биомембран, в частности, перикарда, до имплантации в физиологическом солевом растворе с ЭДТА, с последующей обработкой неионным детергентом деоксихолатом натрия, вызывающим гибель клеток донора, и с последующей отмывкой неионного детергента, в котором предварительную инкубацию имплантатов выполняют в течение 4-6 часов в физиологическом растворе, содержащем 0,5-2 мМ ЭДТА и органический буфер HEPES при рН 7.0, последующую инкубацию с 0,5% р-ром моногидрата дезоксихолата натрия выполняют в течение 30-48 часов при 37°С, также используя физиологический раствор, содержащий органический буфер HEPES при рН 7.8, а отмывку ткани от дезоксихолата выполняют в физиологическом растворе, содержащем хлористый натрий (0,9%), HEPES (рН 7,8) и 20% этилового спирта, в течение 8 суток при 37°С с 2-х кратной сменой среды каждые сутки на свежую, согласно предлагаемому изобретению, после указанной обработки выполняют механическое отслоение фиброзного слоя перикарда от серозного и медиального слоев путем его механического натяжения в противоположные стороны перпендикулярно плоскости перикарда.

Применение указанной концентрации ЭДТА, моногидрата дезоксихолата натрия, выбранного режима обработки перикардиальных биомембран, включая их отмывку от применяемых агентов обеспечивает не только подавление способности к кальцификации, децеллюляризацию ткани, удаление липидных компонентов, но и вызывает ослабление связи медиального слоя с фиброзным, что выглядит достаточно неожиданно, и это нельзя было предсказать. Более того, после обработки ткани перикарда способом, принятым за прототип, мы обнаружили увеличение прочностных характеристик мембраны на разрыв в тангенциальном направлении в сравнении с нативным перикардом в 2-4 раза, несмотря на ослаблении связи серозного слоя с фиброзным. До обработки перикарда указанным способом нам не удавалось осуществить механического расслоения фиброзной и серозной частей путем их натяжения в противоположные стороны. Это объясняет, почему в изобретениях, принятых за аналоги, для удаления фиброзного слоя используют лазер, дерматом и другие механические приспособления. Простой обработки спиртом, как в аналоге 2 оказывается недостаточно для отделения фиброзного слоя, не используя при этом скребок. Остается неясным, почему способ обработки, принятый за прототип, обеспечил ослабление связи серозно-медиального и фиброзного слоев. Возможно это связано с хелатированием кальция посредством ЭДТА, что, как мы видим, влияет на прочностные свойства мембран, но почему это влияние так разнонаправленно, остается неясным.

Ниже представлены примеры повышения биосовместимости мембран, изготовленных из перикарда крупного рогатого скота, которое было оценено в модели гетеротопической имплантации экспериментальным животным.

Пример 1.

Сравнивали фиброзную гиперплазию фрагментов бычьего перикарда, обработанных способом, принятым за прототип, и заявляемым способом, в котором после обработки перикарда удаляли фиброзный слой. Фрагменты перикарда, согласно флуоресцентному микроскопическому анализу, содержали до обработки живые клетки. Перед обработкой фрагменты инкубировали при +4°С в течение 2 суток в питательной среде ДМЕ при рН 7.4, с антибиотиками гентамицином (400 мг/л) и флуканазолом (20 мг/л). После стерилизации фрагменты делили на три группы. Первую группу фрагментов обрабатывали способом, взятым за прототип, включая предварительную инкубацию в течение 4 ч в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 0,5 мМ ЭДТА, органический буфер HEPES рН 7,0, затем инкубировали 40 ч в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия и 0,5% моногидрата дезоксихолата натрия, органический буфер HEPES рН 7,8, после чего фрагменты отмывали в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, органический буфер HEPES рН 7,8, 20% этилового спирта в течение 8 суток с 2-х кратной сменой среды на свежую каждые сутки, а два раза в течение последующих суток отмывали от этилового спирта раствором 0,9% хлористого натрия, рН 7.2. После обработки фрагменты помещали в физиологический раствор Дальбекко, в который были добавлены антибиотики гентамицин (50 мг/л) и флуканазол (5 мг/л). Вторую группу фрагментов перикарда быка вначале обрабатывали также, как первую, а после завершения обработки удаляли фиброзный слой путем расслоения фрагментов и помещали в физиологический раствор Дальбекко, в который были добавлены гентамицин (50 мг/л) и флуканазол (5 мг/л). Третью группу составляли не обработанные фрагменты перикарда быка. Биосовместимость и фиброзную гиперплазию на поверхности материалов изучали в модели подкожной имплантации крысам линии Wistar. Для этого фрагменты имплантировали с использованием модели полного межтканевого контакта, при этом образцы имплантировались без внешних камер в три подкожных кармана, сформированных вдоль позвоночника крысы (по 1 образцу в один карман билатерально) под золетил/ксилазиновым наркозом. Через 13 недель после имплантации материалы эксплантировали, измеряли в них содержание минерализованного кальция методом абсорбционной спектроскопии, а также выполняли их гистологический анализ. Фрагменты, обработанные предлагаемым способом, и способом, принятым за прототип, не кальцифицировались (0,5±0,5 мг кальция на 1 г. сухого веса фрагмента. Необработанные фрагменты перикарда содержали значительное количество минерализованного кальция (25,7±6,13 мг кальция на 1 гр сухого веса фрагмента). Гистологическое исследование показало фиброзную гиперплазию на фиброзном слое перикарда и отсутствие такого разрастания на серозном слое перикарда в контрольных фрагментах, которые перед имплантацией обрабатывали способом, принятым за прототип (Фиг. 1а, б). Во фрагментах, обработанных заявленным способом мы не обнаружили фиброзной гиперплазии ни на одной из сторон материала (Фиг. 1в, г). Таким образом, заявляемый способ полностью подавляет не только кальцификацию, но и фиброзную гиперплазию на обеих сторонах листового материала, изготовленного из перикарда заявленным способом, повышая тем самым его биосовместимость и перспективы применения в реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии.

Пример 2.

Сравнивали репопуляцию клетками реципиента фрагментов перикарда, обработанных способом, принятым за прототип, и заявленным способом. Фрагменты обрабатывали также, как в примере 1, а репопуляцию оценивали также в модели подкожной имплантации крысам линии Wistar. Гистологическое исследование показало, что репопуляция в материале, полученном из фрагментов перикарда предложенным образом, осуществляется более активно (Фиг. 2б), чем в материале, полученном с применением способа, принятого за прототип (Фиг. 2а).

Таким образом, приведенные примеры показывают, что заявляемый способ обеспечивает повышение биосовместимости изготовленных из перикарда материалов для реконструктивной и сердечно-сосудистой хирургии в сравнении со способом, принятым за прототип.

Изобретение относится к способу повышения биосовместимости материалов, изготовленных из перикарда для реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии, состоящему в том, что имплантируемые ткани предварительно инкубируют в физиологическом растворе, содержащем хлористый натрий 0.9%, ЭДТА (0,5-2 мМ), органический буфер HEPES (5-20 мМ) при рН 7.0 в течение 4-6 часов, затем продолжают инкубацию в физиологическом растворе, содержащем хлористый натрий 0.9%, HEPES 5-20 мМ (рН 7.8), дезоксихолат натрия 0,5% в течение 30-48 ч, после чего ткани отмывают от дезоксихолата натрия в растворе, содержащем хлористый натрий 0,9%, HEPES 5-20 mM (рН 7,8) и 20% этилового спирта в течение 8 суток с 2-кратной сменой среды каждые сутки на свежую с последующей отмывкой от этилового спирта в течение суток, и после такой обработки выполняют механическое отслоение фиброзного слоя перикарда от серозного слоя путем его механического натяжения в противоположные стороны перпендикулярно плоскости перикарда. Технический результат- предотвращение кальцификации материалов, понижение их токсичности для клеток и иммунной реакции организма, подавление фиброзной гиперплазии на обеих сторонах перикардиального материала, ускорение его репопуляции клетками реципиента. 2 ил., 2 пр.

Способ повышения биосовместимости перикардиальных биоматериалов для реконструктивной хирургии, включающий предварительную инкубацию тканей до имплантации в физиологическом солевом растворе с ЭДТА с последующей обработкой неионным липофильным детергентом моногидратом дезоксихолата натрия, вызывающим гибель клеток донора, и с последующей отмывкой неионного детергента, в котором предварительную инкубацию трансплантатов выполняют в течение 4-6 часов в физиологическом растворе, содержащем 0,5-2 мМ ЭДТА и органический буфер HEPES при рН 7.0, последующую инкубацию с моногидратом дезоксихолата натрия выполняют в течение 30-48 часов при 37°С, используя физиологический раствор, также содержащий органический буфер HEPES при рН 7.8, а отмывку ткани от дезоксихолата выполняют в физиологическом растворе, содержащем хлористый натрий 0,9%, HEPES (рН 7,8) и 20% этилового спирта, в течение 8 суток при 37°С с 2-кратной сменой среды каждые сутки на свежую, с последующей отмывкой от этилового спирта в течение суток, отличающийся тем, что после такой обработки выполняют механическое отслоение фиброзного слоя перикарда (p.fibrosum) путем его механического натяжения в противоположные стороны перпендикулярно плоскости перикарда.