Фармакологическое средство для лечения мочекаменной болезни Российский патент 2019 года по МПК C07K5/83 A61K38/06 A61P13/04 

Изобретение относится к медицине, а именно фармакологии, урологии и может быть использовано для профилактики и лечения мочекаменной болезни.

По современным данным, эпидемиология мочекаменной болезни (МКБ) сопоставима с таковой для сахарного диабета - каждый 11-й житель развитых стран страдает нефролитиазом, а затраты на комплекс лечебных, профилактических и реабилитационных мероприятий только в США ежегодно превышает 10 млрд. долларов. При этом, несмотря на достижения современной урологии, основным методом литолиза почечных камней остается литотрипсия в различных ее вариантах, которая является весьма травматичным методом и сопровождается рядом серьезных побочных эффектов. На этом фоне фармакологическое сопровождение терапии МКБ в основном носит вспомогательный характер. Средств, обладающих специфической активностью при нефролитиазе, практически не существует.

Одним из наиболее современных подходов к разработке новых эффективных атилитогенных средств является так называемый протеомный подход, согласно которому мишенью для фармакологического литолиза уролита или профилактики его формирования является органическая матрица почечных камней. Учитывая белковую природу основных структурных и функциональных элементов матрицы, считается, что внешним лигандом, обладающим аффинитетом к данному типу «субстрата» (или процессам, определяющим его формирование), могут являться особые протеиновые и аминокислотные молекулы. На поиске таких молекул основана разработка новых антилитогенных средств.

Наиболее близким по достигаемому результату прототипом является пептидное средство, обладающее антилитогенным действием, получаемое путем уксуснокислой экстракции из свиных почек (патент РФ 2652339). Его вводят внутрь в дозе 15 мг. Способ обеспечивает антилитогенный эффект, выражающийся в 100%-ном разрушении крупных и средних камней в почках на фоне оксалатного нефролитиаза.

Недостатками названного средства являются невозможность точно установить биологически активные вещества, входящих в его состав и определяющих его лечебный эффект при мочекаменной болезни, а также наличие в составе средства значительного количества сопутствующих веществ.

Авторы предлагают новое фармакологическое средство для лечения мочекаменной болезни, обладающее высоким антилитогенным действием на фоне оксалатного нефролитиаза.

Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение ассортимента средств для лечения мочекаменной болезни.

Технический результат достигается тем, что для лечения мочекаменной болезни используется трипептид Leu-Ile-Lys (лейцин - изолейцин - лизин).

Фармакологические свойства средства для лечения мочекаменной болезни найдены экспериментальным путем.

Эксперименты по изучению эффективности средства для лечения мочекаменной болезни были проведены на 30 самцах крыс Wistar средней массой 130 г), разделенных поровну на 2 группы: контрольная (моделирование оксалатного нефролитиаза) и подопытная (моделирование оксалатного нефролитиаза + введение трипептида Leu-Ile-Lys (лейцин - изолейцин - лизин).

На протяжении эксперимента животные находились в индивидуальных клетках, приспособленных для сбора мочи, в условиях стандартного лабораторного рациона. По условиям эксперимента крысы были разбиты на 2 группы по 15 животных в каждой. В первой (контрольная группа) с целью моделирования экспериментальной мочекаменной болезни на протяжении 6 недель крысам предоставлялся в качестве питья в свободном доступе 1%-ный раствор этиленгликоля. Во второй (подопытная группа) крысы также 6 недель получали в свободном доступе 1%-ный раствор этиленгликоля, но при этом, начиная с 4-й недели, вплоть до конца эксперимента им ежедневно вводилось внутрь трипептид Leu-Ile-Lys в дозе 11,5 мг/кг.

Каждые 7 дней производился сбор суточного объема мочи, в которой определялась активность маркерных ферментов повреждения почечных тканей - лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и γ-глютамилтрансферазы (ГГТ). Активность ЛДГ определяли оптимизированным кинетическим методом, в основе которого лежит реакция восстановления пирувата до молочной кислоты. Активность ГГТ определяли оптимизированным кинетическим методом, в основе которого лежит реакция переноса L-γ-глутамил-3-карбокси-п-нитроанилида на глицилглицин под действием γ-глутамилтрансферазы с образованием окрашенного 5-амино-2-нитробензоата.

По окончании эксперимента крыс подвергали эвтаназии под эфирным наркозом и изучали активность процесса свободнорадикального окисления в гомогенате почечных тканей, а также морфометрически оценивали картину оксалатного нефролитиаза в почках экспериментальных животных.

Активность процесса свободнорадикального окисления в почечной ткани оценивали по совокупности прооксидантных и антиоксидантных показателей. К первым были отнесены содержание тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП) и общая прооксидантная активность (ОПА), а ко вторым - активность антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы (ГПО), супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) и общую антиоксидантную активность (ОАА).

Тиобарбитуратреактивные продукты (ТБРП) определяли колориметрическим методом, измеряя интенсивность окраски раствора в ходе химической реакции ТБРП с тиобарбитуровой кислотой. Общую прооксидантную активность (ОПА) оценивали по накоплению продуктов перекисного окисления ТВИН-80, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Для определения активности глутатионпероксидазы (ГПО) измеряли концентрацию восстановленного глутатиона в цветной реакции с реактивом Эллмана. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определялась по подавлению образования нитроформазана - окрашенного продукта окисления нитротетразолия супероксидными радикалами, образующимися при взаимодействии феназинметасульфата и никотинамддинуклеотида (НАДН). Активность каталазы (КАТ) оценивали по подавлению ферментом окисления молибдата натрия пероксидом водорода. Общую антиоксидантную активность оценивали по степени ингибирования Fe²⁺/аскорбат-индуцированного окисления ТВИН-80 гомогентаом ткани.

Для проведения морфологических исследований почки фиксировались в 10%-ном растворе формалина, обрабатывались по стандартной методике, и изготавливался поперечный срез толщиной 6 мкм через почечный сосочек. Полученные срезы окрашивались гематоксилином и эозином, метенамин-серебром. Кальциевые депозиты идентифицировались гистохимическим методом Косса и при помощи компьютерной программы на снимках подсчитывалось количество кальциевых депозитов в поле зрения и определялся их размер. Морфометрические исследования проводили с использованием программных пакетов ImageJ 1.43 и AxioVision 3.1.

Статистическую обработку проводили с помощью программы «Statistica for Windows 12.0». Рассчитывали медиану и интерквартильный размах (25%; 75%) для биохимических показателей, среднее значение и ошибку среднего - для морфометрических показателей. Для выявления достоверности межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.

Результаты исследований представлены в примерах.

Пример 1.

В контрольной группе при моделировании оксалатного нефролитиаза фиксировались характерные признаки развития патологии. Так, активность ЛДГ к концу 6 недели эксперимента увеличилась в 13,1 раза, а активность ГГТ - в 6,6 раза (табл. 1). Это свидетельствовало о значительном повреждении клеток почечных канальцев.

Кроме того, наблюдались отчетливые признаки развития оксидативного стресса в почечной ткани. Так, концентрация ТБРП относительно показателя здоровых животных увеличилась в 1,3 раза, ОАА уменьшилась в 3,5 раза, активность СОД увеличилась в 1,4 раза (табл. 2).

При гистохимическом окрашивании на кальций по методу Косса в канальцах почек крыс контрольной группы отмечали распложенные по одиночке или группами, кристаллы депозитов камней коричневато-черного цвета различной формы и размера. Число депозитов в просветах канальцев варьировало от 3 до 7 и в среднем составляло 4,6±0,2 в поле зрения при увеличении ×400, при модальном значении 4. При проведении компьютерной морфометрии площадь депозитов камней составила от 31,5 мкм² до 567,9 мкм² и в среднем составляет 171,9±27,6 мкм².

Пример 2.

У животных подопытной группы активность ЛДГ в моче не претерпевала достоверно значимых изменений относительно исходного уровня. Активность ГГТ увеличилась к концу 3 недели в 2,8 раза, но затем на фоне лечения уменьшилась практически до исходного уровня (табл. 1).

Концентрация ТБРП уменьшилась в 1,3 раза относительно контроля заболевания и не отличалась от показателей здоровых крыс. ОПА снизилась относительно контрольной группы в 1,8 раза, активность ГПО увеличилась в 1,8 раза, активность КАТ снизилась в 2,3 раза (табл. 2).

У крыс подопытной группы почечная ткань животных находилась в состоянии гистологической нормы. При окраске гематоксилином и эозином и при окраске по Коссу отложений депозитов камней в просветах канальцев не определялось. Апикальный край клеток и щеточная кайма были видны отчетливо. Явлений воспаления и нефросклероза не определялись. Сосуды были слабо или умеренно полнокровны.

Заявляемое средство в эксперименте проявило выраженное антилитогенное действие при мочекаменной болезни, проявившееся в ослаблении повреждении почечных тканей, ослаблении оксидативного стресса в почках и 100%-ном разрушении почечных камней.

Примечание: n - количество проб мочи для анализа;

Р_и/у - показатель достоверности относительно исходного уровня

Примечание: Р_инт - показатель достоверности относительно интактных крыс;

Р_к - показатель достоверности в подопытной группе относительно контрольной группы;

Изобретение относится к применению трипептида Leu-Ile-Lys (лейцин – изолейцин – лизин) в качестве фармакологического средства для лечения мочекаменной болезни. Преимуществами заявленного изобретения являются высокая антилитогенная активность. 2 табл., 2 пр.

Применение трипептида Leu-Ile-Lys, лейцин - изолейцин - лизин, в качестве фармакологического средства для лечения мочекаменной болезни.