Средство для лечения уратного нефролитиаза Российский патент 2021 года по МПК A61K38/05 A61P13/04 

Изобретение относится к медицине, а именно фармакологии, урологии и может быть использовано для профилактики и лечения уратного нефролитиаза.

Частота возникновения уратного нефролитиаза (УН) в современной популяции достигает до 10% от общей заболеваемости мочекаменной болезнью (МКБ), которая относится к числу наиболее распространенных заболеваний мочевыделительной системы.

Данная патология возникает вследствие нарушения обмена мочевой кислоты (МК), гиперурикемии и гиперурикозурии и образования в почках уратных депозитов, что способствует развитию воспалительных и деструктивных процессов в мочевыделительной системе.

Несмотря на то, что важную патогенетическую роль в развитии уратного нефролитиаза, играет активация процессов свободнорадикального окисления (СРО), на данный момент отсутствуют способы фармакологической коррекции данного заболевания, непосредственно влияющие на выраженность оксидативного стресса и воспалительной инфильтрации в почечной ткани.

В связи с этим, является обоснованным изучение возможности фармакологической коррекции УН путем антиоксидантной терапии. Одним из наиболее перспективных "ренальных" антиоксидантов можно рассматривать карнозин - дипептид, состоящий из остатков аминокислот (3-аланина и гистидина.

Наиболее близким прототипом является способ фармакологической коррекции уратного нефролитиаза, при котором в качестве лекарственного средства используется натрия цитрат (Вощула В.И. - Мн.: ВЭВЭР, 2006. - 268 с.). Данный способ обеспечивает антилитогенный эффект благодаря смещению pH мочи в щелочную сторону, а также образованию хелатных комплексов с ионами кальция.

Недостатками данного способа является ощелачивание мочи, повышающее риск образования фосфатных камней в почках, а также узкий спектр фармакологической активности, затрагивающий только одно звено патогенеза уратного нефролитиаза.

Авторы предлагают средство для лечения уратного нефролитиаза, действие которого осуществляется без существенных изменений pH мочи за счет подавления активности процессов свободнорадикального окисления в почках.

Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение ассортимента средств для лечения уратного нефролитиаза.

Технический результат достигается тем, что для лечения уратного нефролитиаза используется пептидный антиоксидант карнозин в дозе 15 мг/кг.

Фармакологические свойства средства для лечения уратного нефролитиаза найдены экспериментальным путем.

Эксперимент проведен на самцах крыс сток Вистар со средней массой от 200 до 320 г, которые содержались в индивидуальных метаболических клетках, приспособленных для сбора мочи. Питание крыс осуществлялось с использованием стандартной лабораторной диеты. Животные были разделены на опытную группу (п=10), а также контрольную группу (п=15), в которых осуществлялось моделирование экспериментального уратного нефролитиаза. Для этого, согласно общепринятой модели (Перфильев В.Ю., Зверев Я.Ф., Жариков А.Ю., Условия развития уратного нефролитиаза и подходы к его моделированию. Нефрология. 2017; 21 (4): 48-54), животным обеих групп ежедневно на протяжении трех недель внутрижелудочно через зонд вводили смесь с содержанием оксониевой кислоты в дозе 500 мг/кг и мочевой кислоты в дозе 1000 мг/кг в течение 3 недель.

С 11-го дня и до конца эксперимента крысы опытной группы ежедневно получали раствор карнозина внутрижелудочно через зонд в дозе 15 мг/кг.

Для определения исходного уровня активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и у-глутамилтрансферазы (ГГТ), за день до начала эксперимента по моделированию уратного нефролитиаза производили сбор суточной мочи каждого животного с последующим определением активности ферментов на автоматическом биохимическом анализаторе DIRUI CS-T240 с использованием оптимизированных кинетических методов. Для определения активности ЛДГ проводили реакцию восстановления 2-оксопропионовой кислоты до 2-гидроксипропионовой. Активность ГТТ определялась по интенсивности окраски 5-амино-2-нитробензоата, который является продуктом реакции транслокации L-гамма-глутамил-3-карбокси-нитроанилида на глицилглицин.

В ходе проведения эксперимента, на, 7-й, 11-й, 14-й, 17-й и 21-й дни также производился сбор суточной мочи, с последующим определением активности ЛДГ и ГТТ по методикам, аналогичным тем, которые применялись для определения исходного уровня ферментов.

По истечении 3 недель эксперимента лабораторных животных подвергали эвтаназии под эфирным наркозом, после чего извлекали почки для оценки показателей активности процессов свободнорадикального окисления (СРО), а также для проведения морфологических исследований.

Оценка активности свободнорадикального окисления проводилось в соответствии с общепринятыми методиками (Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В. и др. Методы доклинического (экспериментального) исследования влияния лекарственных средств на функцию почек. Новосибирск; Гео. 2013; 84 с. ). Определялись концентрация тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП), общая прооксидантная активность (ОПА), общая антиоксидлантная активность, и активность антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО) и каталазы (КАТ). Концентрация ТБРП определялась методом фотоэлектроколориметрии по интенсивности окраски раствора после протекания химической реакции ТБРП с 2-тио-4,6-пиримидиндионом. Активность КАТ измерялась по степени подавления окисления пероксидом водорода натриевой соли молибденовой кислоты.

Активность СОД оценивалась путем определения концентрации нитроформазана, который является продутом взаимодействия супероксидных радикалов с нитротетразолием. Активность ГПО измерялась с помощью проведения взаимодействия восстановленного глутатиона с дитионитробензойной кислотой. Общую прооксидантную активность оценивали в соответствии с зафиксированным уровнем окраски флюоресцентного комплекса, полученного путем взаимодействия тиобарбитуровой кислоты с продуктами реакции твина-80 с пероксидными радикалами. Общую антиоксидантную активность измеряли с помощью фиксации уровня ингибирвания Fe2+/аскорбат-зависимого окисления ТВИН-80 исследуемым образцом гомогената почек.

Для проведения морфологических исследований производили фиксацию почек в 10%-ном растворе формалина, осуществляли проводку исследуемого материала с помощью аппарата TISSUE-ТЕК VIPTM6 (Sakkura, Япония), получали срезы толщиной 5-7 мкм через почечный сосочек на аппарате Accu-Cut SRM (Sakkura, Япония). Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином и рассматривали под увеличением х400 на микроскопе марки Nikon Eclipse Е200 (Китай). Количество уратных депозитов в поле зрения и их размер определяли с использованием пакетов программ ImageJ 1.43 и AxioVision 3.1.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием статистических методов, принятых в экспериментальной фармакологии, в программе Statistica 12.0. (StatSoft, Inc.). Результаты биохимических исследований представлены как медиана (Me) и интраквартильный размах (Q1;Q3), морфологических исследований - в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±SEM). Значимость различий проверяли с помощью непараметрических критериев Манна- Уитни (для независимых выборок) и Вилкоксона (для зависимых выборок). Достоверными считали различия при р<0.05.

Результаты исследований представлены в фигурах 1-3.

Фигура 1 - Показатели активности процесса СРО в гомогенате почек экспериментальных крыс.Вариабельность данных представлена медианой с указанием 25 и 75 перцентилей. ТБРП - тиобарбитуратреактивные продукты; ОПА - общая прооксидантная активность; ОАА - общая антиоксидантная активность, СОД - супероксиддистумтаза, КАТ - каталаза; ГПО -глутатионпероксидаза. ринт - уровень статистической значимости различий в контрольной группе относительно группы интактных крыс; рк - уровень статистической значимости различий в опытной группе относительно контрольной группы

Фигура 2 - Динамика активности маркерных ферментов повреждения почечных тканей в почках экспериментальных крыс. Вариабельность данных представлена медианой с указанием 25 и 75 перцентилей; ЛДГ - лактатдегидрогеназа; ГГТ - γ-глутамилтрансфераза. ри/у - уровень статистической значимости изменения показателя внутри группы относительно исходного уровня; рк - уровень статистической значимости различий в опытной группе относительно контрольной группы; Фигура 3 - Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400. а - уратные депозиты в кистозно-измененном канальце почки у контрольной крысы, 6 - уратный конкремент в почечном канальце опытной крысы. Воспалительная реакция менее выражена.

Установлено, что в опытной группе оксидативный стресс в почках крыс под влиянием карнозина существенно ослаблялся (Фиг. 1). Так, концентрация ТБРП была в 1.4 раза статистически значимо ниже аналогического показателя контрольной группы (р<0.001). Кроме того, у крыс, получавших раствор карнозина, увеличились значения ОАА и активности каталазы в 1.4 и 1.3 раза соответственно (р<0.001). Активность ГПО статистически значимо уменьшилась в 1.3 раза (р=0.037).

По результатам биохимических исследований, с 14-х суток исследования у крыс контрольной группы значимо повышалась активность ЛДГ по сравнению с исходным уровнем, а к концу эксперимента - в 7.5 раз (Фиг. 2). При этом наблюдалось значимое снижение активности ГГТ - к 21- му дню данный показатель был ниже исходного уровня в 3 раза. В опытной группе также статистически значимо увеличивалась активность ЛДГ, но гораздо менее выражение, так как по завершении 3 недели эксперимента этот показатель был в 2 раза ниже такового в контрольной группе. Активность ГГТ у животных опытной группы также снижалась, но в меньшей степени, чем у крыс контрольной группы.

По результатам морфологических исследований, в почках крыс контрольной группы были выявлены уратные депозиты у всех 8 особей. Микролиты разной формы и синеватого цвета отмечали в канальцах коркового слоя и сосочке почки (Фиг. За). Их среднее количество составило 3.2±0.4 в поле зрения, а средний размер - 432.8±41.8 мкм². При этом почечные канальцы были кистозно расширены, имели уплощенный эпителий с ядрами в состоянии пикноза. В строме отмечали явления выраженного воспаления.

На микропрепаратах почек крыс, получавших раствор карнозина, уратные депозиты отмечались у всех 15 животных, но их количество было меньше в 1.6 раза чем в контроле (р=0.01), в среднем - 1.9±0.2. Средний размер конкрементов при этом существенно между группами не различался. Воспалительная реакция в строме была слабо выражена (Фиг. 36).

Таким образом, в результате проведенных экспериментов продемонстрирована возможность эффективного лечения уратного нефролитиаза прямым пептидным антиоксидантом карнозином.

Изобретение относится к медицине и касается применения карнозина в дозе 15 мг/кг в качестве средства для лечения уратного нефролитиаза. Изобретение обеспечивает расширение ассортимента средств для лечения уратного нефролитиаза. 3 ил., 1 пр.

Применение карнозина в дозе 15 мг/кг в качестве средства для лечения уратного нефролитиаза.