СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАКРОФОРМ КРЕАТИНКИНАЗЫ И МАКРОФОРМ МВ-ИЗОФЕРМЕНТА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2019 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, биохимии, а именно к способам лабораторного определения макроформ креатинкиназы и макроформ МВ-изофермента.

Креатинкиназа (или креатинфосфокиназа, КФ 2.7.3.2) является важнейшим ферментом человека и животных, обеспечивающим синтез аденозинтрифосфата (АТФ) в клетках, для которых характерен быстрый переход от состояния покоя к выполнению той или иной работы, требующей затраты АТФ. Наибольшая активность креатинкиназы характерна для скелетных мышц, сердечной мышцы (миокарда) и головного мозга.

Диагностическая роль определения креатинкиназы не подвергается сомнению, а анализ входит в десятку самых распространенных анализов биохимических лабораторий вследствие широкого применения теста в современной терапии таких препаратов, как статины, используемых для снижения уровня холестерола крови. Одним из наиболее опасных осложнений применения статинов является развитие специфической (лекарственной) миопатии/рабдомиолиза с разрушением мышечных клеток и выходом в кровь креатинкиназы. Для ранней диагностики этого грозного осложнения лекарственной терапии врачи проводят контроль активности креатинкиназы.

Биохимикам и специалистам в области лабораторной медицины хорошо, известно, что помимо молекул фермента, состоящего из двух субъединиц М и В, например, ММ, ВВ или MB, в крови у некоторых людей обнаруживаются макроформы креатинкиназы (макро-КК). Макро-КК представляют собой комплексы фермента с иммуноглобулинами классов G и А, размером более 200 kDa. Механизм и причины образования таких комплексов до конца не изучены. Макро-КК являются достаточно стабильными в крови, обладают ферментативной активностью, т.е. способны ускорять реакцию взаимодействия креатина и АТФ. Из литературных данных известно, что макро-КК обнаруживаются у 6% госпитализированных пациентов, в том числе у пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного тракта, печени, у мужчин с патологией предстательной железы, часто у пожилых женщин (Долгов В.В., Козлов А.В., Раков С.С.Лабораторная энзимология. Москва, 2002 г., с. 90). Наличие в крови макро-КК связано с аутоиммунными реакциями организма человека, но не с повреждением сердца и мышечной ткани. Таким образом, выявление макро-КК является важной клинической и диагностической задачей для правильной диагностики и исключения повреждения мышечной ткани у пациентов с повышенной активностью креатинкиназы сыворотки крови, в том числе при мышечной дистрофии, передозировке барбитуратами, этиловым спиртом и т.д.

Известен способ определения макроформ креатинкиназы и макроформ МВ-изофермента в сыворотке крови человека с использованием электрофореза в агарозном геле. Электрофоретический способ определения макроформ подробно описан в инструкции к коммерческим наборам реактивов «Hydragel ISO-СК» фирмы «Sebia», Франция (доступна на сайте www.sebia.com). Согласно этому способу сыворотку крови пациента разделяют на две пробы, в первой пробе определяют активность креатинкиназы пациента энзиматическим стандартизованным методом на биохимическом анализаторе. Вторую пробу сыворотки крови подвергают электрофорезу на агарозном геле (система «HYDRASYS», Франция) с последующим окрашиванием и промывкой от несвязавшегося красителя изоферментов и макроформ креатинкиназы специфическим красителем, входящим в состав набора, и сканируют результаты разделения на денситометре. Расчет активности изоферментов (MM, MB и ВВ) и макроформ креатинкиназы производят в процентах от активности креатинкиназы, определенной на биохимическом анализаторе энзиматическим способом. Результаты и анализ определения макроформ представлены в научной статье авторов Chun-Yu Liu, Yi-Chun Lai, Yi-Chi Wu, Cheng-Hwai Tzeng, Shou-Dong Lee. Macroenzyme Creatine Kinase in the Era of Modern Laboratory Medicine. J Chin Med Assoc. 2010, Vol. 73, №1, p.35-38. Описанный способ является ближайшим аналогом заявленного изобретения.

Однако использование электрофоретического способа выявления макро-КК является малодоступным для клинико-диагностических лабораторий, так как способ требует наличия дорогостоящей аппаратуры для электрофореза в агарозном геле, особо чистых реактивов, а также специально подготовленного высококвалифицированного персонала, помещений и т.д. Кроме того, в последние годы в РФ возникли проблемы с необходимостью использования для выполнения электрофореза специальных буферных растворов (вероналовый буфер) для разделения ферментов крови, т.к. их компоненты являются прекурсорами наркотических веществ, что требует специальных разрешений и делает эти способы труднодоступными для клинико-диагностических лабораторий. Сама процедура определения макроформ креатинкиназы занимает несколько часов времени высококвалифицированного персонала и покупки дорогостоящих импортных реактивов.

Технический результат заявленного изобретения заключается в создании лабораторного способа определения макроформ креатинкиназы и макроформ МВ-изофермента, не требующего дорогостоящей аппаратуры, особо чистых реактивов, а также специально подготовленного высококвалифицированного персонала, помещений и т.д., доступного для клинико-диагностических лабораторий.

Заявленный технический результат достигается в способе определения макроформ креатинкиназы и макроформ МВ-изофермента в сыворотке крови человека, включающем определение активности креатинкиназы и МВ-изофермента энзиматическим методом, в котором макроформы креатинкиназы, в том числе МВ-изофермента, осаждают добавлением к сыворотке равного объема полиэтиленгликоля 6000 в конечной концентрации 12-14% с последующим центрифугированием в течение 20-25 минут при 2000-2200 g, в надосадочной жидкости определяют активность креатинкиназы и МВ-изофермента и рассчитывают активности макроформ в процентах от исходной активности креатинкиназы и ее МВ-изофермента.

Указанные концентрации полиэтиленгликоля 6000, время инкубации и условия центрифугирования, подобранные экспериментально, обеспечивают полное осаждение макроформ креатинкиназы, при этом не макроформы фермента не осаждаются, а остаются в надосадочной жидкости. Используемые реактивы и оборудование входят в оснащение клинико-диагностических лабораторий. Способ не требует специально подготовленного высококвалифицированного персонала и может быть осуществлен врачом клинической лабораторной диагностики. Время проведения исследования составляет менее 60 минут.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Полученную сыворотку крови пациента разделяют на две пробы. Первую пробу помещают в биохимический анализатор для энзиматического определения активности креатинкиназы (А1) и ее МВ-изофермента (А1-МВ). Вторую пробу сыворотки в объеме 0,2 мл помещают в пробирку типа «эпендорф», добавляют 0,2 мл 24-28% водного раствора полиэтиленгликоля 6000 (производство «Sigma»), перемешивают встряхиванием и через 10 минут инкубации центрифугируют при 2000-2200 g в течение 20-25 мин. для осаждения макроформ креатинкиназы.

После центрифугирования пробирку помещают в биохимический анализатор и в надосадочной жидкости определяют активность креатинкиназы и ее МВ-изофермента энзиматическим способом. Результаты определения необходимо умножить на коэффициент 2 для учета фактора разведения пробы (А2). Количество макроформ креатинкиназы выражают в процентах от общей активности креатинкиназы, аналогично определяют макроформы МВ-изофермента креатинкиназы.

Способ иллюстрируется следующим клиническим примером.

Пациентка Г., 72 года, наблюдалась в кардиологической клинике последние 5 лет по поводу ишемической болезни сердца, атеросклероза, в 2016 г. проведена операция стентирования коронарных артерий. В июне 2016 г. при плановом лабораторном обследовании впервые обнаружена повышенная активность креатинкиназы до 600 Ед/л (верхняя граница нормы для женщин составляет 175 Ед/л). В дальнейшем существенной динамики показателя не наблюдалось, однако при углубленном обследовании выявлена повышенная активность МВ-изофермента креатинкиназы - 520 Ед/л, т.е. более чем в 20 раз по отношению к верхней границе нормы. Сердечный тропонин I не был существенно повышен и не имел динамики, характерной для повреждения миокарда. Поскольку пациентка принимала на протяжении последних 24 месяцев препараты группы статинов (розувастатин в дозе 10 мг в сутки), то встал вопрос о необходимости отмены препарата вследствие высокой опасности развития лекарственной миопатии/рабдомиолиза.

В июне 2017 г. пациентке в рамках углубленного клинико-лабораторного обследования было проведено определение макроформ креатинкиназы и макроформ МВ-изофермента по заявленному способу. В первой пробе полученной сыворотки крови была определена активность креатинкиназы (А1) и активность МВ-изофермента креатинкиназы (А1-МВ). При лабораторном исследовании использовали биохимический анализатор «Architect с4000» (Abbott, США), реактивы, контрольные и калибровочные материалы производителя указанного оборудования. Получили следующие значения активности креатинкиназы и ее МВ-изофермента:

А1=555 Ед/л, А1-МВ=620 Ед/л.

Во вторую пробу сыворотки крови пациентки с целью осаждения макроформ креатинкиназы и ее МВ-изофермента был добавлен раствор полиэтиленгликоля 6000 (производства «Sigma - Aldrich», Япония) в конечной концентрации 12%, после инкубации и центрифугирования пробирка была помещена в тот же биохимический анализатор для определения активности креатинкиназы в надосадочной жидкости.

Результаты определения в надосадочной жидкости с учетом разведения сыворотки составили: А2=200 Ед/л, А2-МВ=25 Ед/л.

Таким образом, в результате проведения анализа выявлено, что у пациентки количество макроформ креатинкиназы составило (555-200):555=64% от активности креатинкиназы, а количество макроформ МВ-изофермента составило (620-25):620=96% от активности МВ-изофермента креатинкиназы.

Полученные данные о содержании макроформ креатинкиназы были подтверждены проведением, согласно прототипу, электрофореза сыворотки с использованием коммерческих реактивов «Hydragel ISO-CK» (Sebia, Франция). После разделения изоферментов креатинкиназы осуществляли их визуализацию с использованием специфического хромогенного субстрата согласно инструкции к наборам. После осаждения макроформ креатинкиназы электрофорез проводили повторно, что позволило подтвердить полноту осаждения макроформ полиэтиленгликолем 6000 заявленным способом.

Таким образом, проведенное определение макроформ креатинкиназы в сыворотке крови позволило исключить у пациентки наличие повреждения миокарда и отказаться от ложного диагноза «лекарственная миопатия». Проведение определения макроформ креатинкиназы и МВ-изофермента согласно заявленному способу составило менее 60 мин. и не требовало наличия дополнительного лабораторного или биохимического оборудования.

По заявленному способу было обследовано 10 пациентов мужского пола в первые сутки после установления диагноза «острый инфаркт миокарда», проходивших лечение в отделении неотложной кардиологии НМИЦ им. В.А. Алмазова. Диагноз острого инфаркта миокарда у всех пациентов подтвержден результатами электрокардиографии и коронарографии, а также лабораторными исследованиями, в том числе количественным определением высокочувствительного тропонина I на анализаторе «Architect 12000» (США) в динамике наблюдения за больными. Активность креатинкиназы в сыворотке крови в момент обследования у указанной группы пациентов была существенно повышена и составила от 510 до 1200 Ед/л. Во всех образцах сыворотки крови определили активность макроформ креатинкиназы. Во всех случаях определения макроформ креатинкиназы согласно заявленному способу процент макроформ от общей активности креатинкиназы в сыворотке крови больных не превысил 10%, а процент макроформ МВ-изофермента составил менее 5% от активности МВ-изофермента, определенной на биохимическом анализаторе «Architect с4000» (США). Эти результаты подтверждают соответствие результатов определения макроформ креатинкиназы заявленным способом литературным данным об отсутствии значимого количества макроформ креатинкиназы, в том числе МВ-изофермента у больных при остром инфаркте миокарда.

Использование заявленного способа позволяет проводить определение макроформ креатинкиназы и макроформ МВ-изофермента в клинико-диагностических лабораториях, не требует дорогостоящей аппаратуры, особо чистых реактивов, а также специально подготовленного высококвалифицированного персонала, помещений и т.д., сокращает время исследования.

Изобретение относится к способам лабораторного определения макроформ креатинкиназы и макроформ МВ-изофермента. Описан способ определения макроформ креатинкиназы и макроформ МВ-изофермента в сыворотке крови человека, включающий определение активности креатинкиназы и МВ-изофермента энзиматическим методом, отличающийся тем, что макроформы креатинкиназы, в том числе МВ-изофермента, осаждают добавлением к сыворотке равного объема полиэтиленгликоля 6000 в конечной концентрации 12-14% с последующим центрифугированием в течение 20-25 минут при 2000-2200 g, в надосадочной жидкости определяют активность креатинкиназы и МВ-изофермента и рассчитывают активности макроформ в процентах от исходной активности креатинкиназы и ее МВ-изофермента. Технический результат – создание лабораторного способа определения макроформ креатинкиназы и макроформ МВ-изофермента, не требующего дорогостоящей аппаратуры, специально подготовленного персонала, сокращенное время исследования. 1 пр.

Способ определения макроформ креатинкиназы и макроформ МВ-изофермента в сыворотке крови человека, включающий определение активности креатинкиназы и МВ-изофермента энзиматическим методом, отличающийся тем, что макроформы креатинкиназы, в том числе МВ-изофермента, осаждают добавлением к сыворотке равного объема полиэтиленгликоля 6000 в конечной концентрации 12-14% с последующим центрифугированием в течение 20-25 минут при 2000-2200 g, в надосадочной жидкости определяют активность креатинкиназы и МВ-изофермента и рассчитывают активности макроформ в процентах от исходной активности креатинкиназы и ее МВ-изофермента.