Способ диагностики скрытых маститов у коров Российский патент 2023 года по МПК G01N33/68 G01N33/04 G01N33/52 A61D99/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности, к ветеринарии, и может быть использовано при диагностике скрытого мастита у коров в лактационный период.

Мастит или воспаление молочной железы является основной причиной ухудшения санитарного качества молока, которое становится непригодным для технологической переработки. В соответствии с Законом РФ от 12 июня 2008 №88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию» требования к производству молока выросли. В тоже время проблема возникновения мастита у животных актуальна и в настоящее время. Для борьбы с маститом коров и снижения ущерба, наносимого этим заболеванием, наибольший интерес представляют методы диагностики, которые позволяют выявить воспалительный процесс в молочной железе на ранней стадии развития заболевания до появления клинических признаков.

Самыми чувствительными из применяющихся в настоящее время способов являются способы, основанные на контроле содержания в молоке соматических клеток, нуклеиновых кислот, АТФ [Kitchen, B.J. Dairy Res., 1981, 48, 167-188]. Но они требуют специальной подготовки образца и не всегда могут дать однозначный ответ: есть или нет воспаление, из-за большого фонового разброса показателей этих параметров у разных животных.

Известен способ, основанный на измерении количества продуктов окисления липидов, количество которых возрастает при воспалении из-за интенсификации этого процесса [патент RU №2182461], а также по содержанию нитрозотиолов и нитрита, увеличение последнего более, чем на 10% указывает на наличие воспаления в молочной железе. Однако эти методы трудоемки и требуют значительных затрат времени и дорогостоящее оборудование.

Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности существенных признаков является способ диагностики мастита по определению в молоке содержание нитрита (NO2 -) и нитрозотиолов (RSNO) (Титов В.Ю., Фисинин В.И. Способ ранней диагностики маститов у коров патент №2371717 от 27.10.2009). Известный способ основан на способности нитрозосоединений (нитрита, RSNO, нитрозильных комплексов железа (НКЖ)) ингибировать фермент каталазу в присутствии галоид-анионов. RSNO, в отличие от нитрита, трансформируются в НКЖ в присутствии закисного железа и тиолов. НКЖ, в свою очередь, теряют способность ингибировать фермент в присутствии разрушающего их хелатора железа (в данном случае - о-фенантролин) и ловушки высвобождающейся NO (в данном случае - оксигемоглобин). При указанном способе анализ должен производиться не позднее одного часа после получения молока на исследование, либо охлаждение пробы до температуры +6°С. Метод определения включает несколько этапов с использованием высокочувствительного сенсора для оценки изменения температуры среды в результате химической реакции. Это требует определенной квалификации от персонала. Следовательно, предлагаемый способ имеет ряд недостатков, которые не позволяют внедрить его в практику животноводства.

Заявляемое изобретение направлено на решение проблемы создания эффективных способов диагностики скрытых маститов у коров, позволяющих определять начало воспаления до проявления клинических признаков.

Технический результат предлагаемого изобретения - обеспечение ранней диагностики мастита, позволяющей определить скрытые формы маститов до проявления у животных клинических признаков, что дает возможность избежать осложнений и сократить сроки лечения мастита.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата в способе диагностики скрытых маститов у коров, включающем отбор проб молока и их последующий анализ, согласно изобретению определяют активность трипсина с субстратом N-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилидом (БАПНА) в свежей пробе молока, полученного от животного, и в сыворотке крови, вычисляют коэффициент здоровья молочной железы (ЗМЖ), который рассчитывают как отношение активности трипсина в сыворотке крови (ТК) к активности трипсина в свежей пробе молока (ТМ):

ЗМЖ=ТК/ТМ, где

ЗМЖ - коэффициент здоровья молочной железы;

ТК - активность трипсина в крови, ед/л;

ТМ - активность трипсина в молоке, ед/л,

и при значении ЗМЖ менее физиологической нормы 1,1 диагностируют мастит.

Способ имеет ряд преимуществ:

1) период времени после получения порции молока на исследование может быть увеличен до 3-5 часов, поскольку исследуемый фермент в молоке - трипсин, не подвержен быстрым изменениям и автолизу;

2) для определения активности трипсина в молоке и сыворотке крови предложен экспресс-метод с использованием полуавтоматического биохимического анализатора, который не требует высокой квалификации специалиста и работает с набором реактивов, состоящих из двух компонентов (разбавителя - реактив №1) и субстрата для трипсина (раствора БАПНА - реактив №2);

3) Для пробоподготовки молока для исследования требуется центрифуга с частотой вращения 6000 об/мин для разделения молока на фракции, с использованием для анализа средней фракции более прозрачной и стабильной по сравнению с крайними.

Существенными признаками, характеризующими изобретение, являются способность трипсина проникать в воспаленные ткани, в том числе молочной железы, при этом повышая свою активность в молоке коров при маститах. Изобретение позволяет определить скрытые формы маститов до проявления у животных клинических признаков, по исследованию проб молока разных долей вымени без продолжительной предварительной подготовки пробы молока. Способ основан на определении в молоке фермента трипсина, активность которого увеличивается в период воспалительной реакции. Установлено, что в молоке здоровых коров активность трипсина не превышает 52 ед/л, в сыворотке крови здоровых коров активность трипсина находится в диапазоне 54-60 ед/л. Для подтверждения диагноза необходимо наряду с определением активности трипсина в молоке провести анализ активности фермента в сыворотке крови животных и рассчитать коэффициент здоровья молочной железы. Пример конкретного выполнения.

Исследования проводили на 22 дойных коровах Айрширской породы разного возраста в хозяйстве Бобошино СГЦ «Смена» в 2021-2022 гг. и на 3 дойных коровах Голштинской породы в виварии ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева в 2022 г., при этом у 15 животных диагностировали заболевание маститом, 10 коров являлись здоровыми. Материал получали от здоровых и больных коров в течение нескольких дней в период лечения мастита. Пробу молока из каждой доли вымени собирали в период утреннего доения животных, сдаивая в стерильную пробирку 5-10 мл молока. Анализ выполняли не позднее 3 часов после доения. Контроль за состоянием здоровья молочной железы коров осуществляли при ежедневном клиническом осмотре животных и выполнении кенотеста согласно инструкции по применению.

В лаборатории выполняли центрифугирование пробы молока при 6000 об/мин в течение 3 минут. После центрифугирования в верхней части пробирки образовывалось жировое кольцо, которое аккуратно удаляли с помощью шпателя, после чего отбирали пробу молока на анализ средней фракции в количестве 10 мкл. Определение активности трипсина выполнялось на основе метода, описанного А.Г. Михайловой и др. (2014), приспособленного для полуавтоматического проточного биохимического анализатора SINNOWA BS-3000M (КНР). В пробирки типа «Эппендорф» помещают 450 мкл трис-буферного раствора рН 7,4 (реактив №1), затем добавляют 50 мкл (реактив №2), содержащий субстрат для трипсина. Реактив №2 готовят следующим образом: порошок benzoyl - DL - arginine 4 - nitroanilide hydrochloride из расчета 5 мг растворяли в одном миллилитре диметилсульфоксида. Раствор хранится в холодильнике при температуре плюс 4-5°С не более трех месяцев. Реактивы №1 и №2 тщательно перемешивают, переворачивая закрытую пробирку типа «Эппендорф» 2-3 раза и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 3 минут. После этого добавляют 10 мкл исследуемого материала (сыворотка крови, проба молока) и запускают реакцию определения активности в биохимическом анализаторе кинетическим методом.

Исследования выполняли на проточном полуавтоматическом биохимическом анализаторе SINNOWA BS3000M (КНР) со следующими параметрами метода: кинетика, осн. фильтр - 405 нм, задержка - 15 с, весь период определения - 120 с, температура нагрева пробирки - 37°С. Субстратом для трипсина являлась БАПНА. Активность фермента выражают в единицах в одном литре, что соответствует расщепленному мкмоль субстрата в одном литре за одну минуту (мкмоль/ (л. мин)) (Вертипрахов, В.Г., Грозина, А.А. Оценка состояния поджелудочной железы методом определения активности трипсина в крови птицы. Ветеринария. 2018. 6, 51-54. DOI: 10.30896/0042-4846.2018.21.12.51-54). Результаты опыта по отдельным животным в качестве примера представлены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что использование предлагаемого способа диагностики до появления признаков мастита может показать воспаление в молочной железе на самой ранней стадии, что актуально для диагностики субклинических маститов, которые поражают до 50% поголовья скота.

Результаты показывают, что молоко от здоровых коров имеет показатель активности трипсина в пределах 35-52 ед/л, повышение активности трипсина в свежем молоке коров более 52 ед/л указывает на наличие воспалительного процесса в молочной железе. В сыворотке крови, наоборот, активность трипсина имеет тенденцию снижаться при воспалительных реакциях. В сыворотке крови коров при снижение активности трипсина ниже 54 ед/л следует считать отклонением от нормы, развитием патологической реакции или уменьшением метаболизма, в частности, появлением мастита (при норме у коров - 54-60 ед/л). Анализ корреляции между показателями активности трипсина в молоке и сыворотке крови у коров показывает, что у здоровых животных эта связь устойчивая положительная (r=0,43), а при патологии молочной железы переходит в отрицательную (r=-0,45). Таким образом, коэффициент здоровья молочной железы для диагностики ранней стадии мастита рассчитывают, как отношение активности трипсина в сыворотке крови к активности трипсина в свежей пробе молока, полученного от животного:

ЗМЖ=ТК/ТМ, где

ЗМЖ - коэффициент здоровья молочной железы;

ТК - активность трипсина в крови, ед/л;

ТМ - активность трипсина в молоке, ед/л.

При показателях коэффициента 1,1 и выше следует считать состояние молочной железы здоровой, при снижении менее 1,1 - наблюдается отклонение от нормы, вызванное воспалительной реакцией в молочной железе.

По сравнению с прототипом предложенный способ диагностики скрытых маститов у коров обеспечит наиболее точное определение доли вымени коров, имеющей воспалительный процесс и своевременно начинать лечение, что дает возможность избежать осложнений и сократить сроки лечения мастита при этом способ может быть осуществлен в период проведения контрольных доек, не нарушая технологического процесса на ферме.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для диагностики скрытых маститов у коров. Проводят отбор проб молока и их последующий анализ. Определяют активность трипсина с субстратом N-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилидом (БАПНА) в свежей пробе молока, полученного от животного, и в сыворотке крови. Вычисляют коэффициент здоровья молочной железы (ЗМЖ), который рассчитывают как отношение активности трипсина в сыворотке крови (ТК) к активности трипсина в свежей пробе молока (ТМ): ЗМЖ=ТК/ТМ, где ЗМЖ - коэффициент здоровья молочной железы; ТК - активность трипсина в крови, ед/л; ТМ - активность трипсина в молоке, ед/л. При значении ЗМЖ менее физиологической нормы 1,1 диагностируют мастит. Способ обеспечивает возможность ранней диагностики мастита, позволяющей определить скрытые формы маститов до проявления у животных клинических признаков, что дает возможность избежать осложнений и сократить сроки лечения мастита, за счет определения активности трипсина в сыворотке крови и в свежей пробе молока, полученного от животного. 2 табл., 7 пр.

Способ диагностики скрытых маститов у коров, включающий отбор проб молока и их последующий анализ, отличающийся тем, что определяют активность трипсина с субстратом N-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилидом (БАПНА) в свежей пробе молока, полученного от животного, и в сыворотке крови, вычисляют коэффициент здоровья молочной железы (ЗМЖ), который рассчитывают как отношение активности трипсина в сыворотке крови (ТК) к активности трипсина в свежей пробе молока (ТМ):

ЗМЖ=ТК/ТМ, где

ЗМЖ - коэффициент здоровья молочной железы;

ТК - активность трипсина в крови, ед/л;

ТМ - активность трипсина в молоке, ед/л,

и при значении ЗМЖ менее физиологической нормы 1,1 диагностируют мастит.