ИНГИБИТОРЫ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ Российский патент 2019 года по МПК A61K38/16 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США № 61/808966, поданной 5 апреля 2013 года, которая включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к композициям и готовым формам, включающим в себя антитела, молекулы нуклеиновых кислот, полинуклеотиды и пептиды, и способам их применения для профилактики и лечения метастатического рака, особенно для уменьшения, блокирования или ингибирования пролиферации раковых клеток, метастазирования и/или ангиогенеза.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Содержание текстового файла, представленного настоящим в электронном виде, включено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте: копия списка последовательностей машиночитаемого формата (имя файла: BMRK_006_01WO_SubSeqList_ST25.txt, зарегистрированная дата: 12 мая 2014 года, размер файла 58 килобит).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Белок MARCKS (белок, содержащий повышенное количество миристоилированных остатков аланина) представляет собой часто встречающуюся мишень фосфорилирования протеинкиназой C (PKC) (Li et al., Journal of Biological Chemistry 276; 40982 (2002)). MARCKS имеет три эволюционно консервативных области (Aderem et al., Nature 1988; 332:362-364; Thelen et al., Nature 1991; 351:320-322; Hartwig et al., Nature 1992; 356:618-622; Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271:18797-18802): N-конец, домен сайта фосфорилирования (или PSD; также известный как эффекторный домен) и домен множественной гомологии 2 (MH2). N-конец, альфа-аминокислотная последовательность, включающая в себя 24 аминокислотных остатка, вместе с молекулой миристиновой кислоты, присоединенной посредством амидной связи к N-концевому глициновому остатку, участвует в связывании MARCKS с клеточными мембранами (Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271:18797-18802) и, возможно, с кальмодулином (Matsubara et al., J Biol Chem 2003; 278:48898-48902). Данная последовательность из 24 аминокислот известна как пептид MANS. Пептид MANS и родственные пептиды раскрыты в Патентах США №№ 7265088; 7529926; 7544772; 8492518; 8501911; 7918293870 и 8563689; содержание каждого из которых включено посредством ссылки во всей своей полноте.

В данной области существует потребность в новой, безопасной терапии, направленной на профилактику, лечение и ингибирование рака, включая ингибирование метастазирования раковых клеток, пролиферации раковых клеток, роста опухоли и/или ангиогенеза. Настоящее изобретение решает вопросы, связанные с данными и другими потребностями.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к способам и композициям, пригодным для профилактики или лечения рака. В одном варианте осуществления предоставлены способы и композиции для ингибирования метастазирования раковых клеток, пролиферации раковых клеток, роста опухоли или ангиогенеза. В одном варианте осуществления предоставлены способы и композиции для предотвращения и ингибирования метастазирования раковых клеток, пролиферации раковых клеток, роста опухоли или ангиогенеза, включая ингибирование белка, содержащего повышенное количество миристоилированных остатков аланина (MARCKS). В одном варианте осуществления композиции включают в себя соединения, ингибирующие MARCKS, включая пептиды, полипептиды, антитела или их фрагменты, и молекулы нуклеиновых кислот, такие как антисмысловые полинуклеотиды, аптамеры, малые интерферирующие РНК (siRNA), микроРНК (miRNA) и короткая шпилечная РНК (shRNA). «Молекулы нуклеиновых кислот, ингибирующие MARCKS», как используется в данном документе, относится к полинуклеотидам или молекулам нуклеиновых кислот, таким как siRNA, miRNA, shRNA или антисмысловые полинуклеотиды, которые подавляют экспрессию и/или функцию MARCKS. В одном варианте осуществления композиции включают в себя один или более MARCKS-связанных пептидов. В другом варианте осуществления MARCKS-связанные пептиды соответствуют MH2-домену MARCKS. В другом варианте осуществления пептиды представляют собой пептиды, связанные с миристоилированной N-концевой последовательностью (пептид MANS, который представляет собой фрагмент MARCKS из 24 аминокислот) (т.е., «MANS-связанные пептиды»). В дополнительном варианте осуществления MANS-связанные пептиды выбраны из группы, состоящей из: пептида MANS; незамещенных фрагментов MANS, которые содержат четыре или более аминокислот и которые включают в себя такую же последовательность, как и обнаруженная в N-концевой аминокислотной последовательности в пептиде MANS; пептидов, включающих в себя последовательность, по существу идентичную последовательности, обнаруженной в пептиде MANS или фрагменте пептида MANS; пептида MANS или фрагментов пептида MANS с идентичной или по существу идентичной аминокислотной последовательностью, как у пептида MANS, которые представляют собой N-конец, миристоилированный, или N-конец, ацилированный, например, ацетильной группой; и пептида MANS или фрагментов пептида MANS с идентичной или по существу идентичной аминокислотной последовательностью, как у пептида MANS, которые представляют собой химически модифицированный C-конец. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды представляют собой химически модифицированные как N-конец, так и C-конец. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, предоставленные в данном документе, представляют собой антитела или их фрагменты. В одном варианте осуществления антитело или его фрагмент ингибирует функции белка MARCKS. В другом варианте осуществления антитело или его фрагмент связывается с N-концом белка MARCKS или MH2-последовательностью белка MARCKS. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что применение различных типов соединений, ингибирующих MARCKS, демонстрирует ингибирующее действие на миграцию раковых клеток in vitro и ингибирует метастазирование in vivo. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, демонстрируют ингибирующее действие на миграцию клеточных линий агрессивного рака. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, предоставленные в данном документе, ингибируют метастазирование раковых клеток в опухоль у млекопитающего. В дополнительном варианте осуществления опухоль представляет собой солидную опухоль. В другом варианте осуществления опухоль представляет собой несолидную опухоль. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, предоставленные в данном документе, ингибируют метастазирование раковых клеток, ассоциированных с лимфомой или лейкозом.

В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, включают в себя полинуклеотиды, ингибирующие MARCKS, или молекулы нуклеиновых кислот, ингибирующие MARCKS. В дополнительном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, представляют собой полинуклеотиды антисмысловой РНК, siRNA, shRNA или microRNA, которые ингибируют экспрессию и/или функцию MARCKS. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, представляют собой имитаторы белков или полинуклеотидов, которые регулируют экспрессию MARCKS, такие как имитаторы miR21.

В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, представляют собой MARCKS-связанные или MANS-связанные пептиды. В другом варианте осуществления MARCKS-связанные пептиды соответствуют N-концевому миристоилированному домену MARCKS. Таким образом, в одном варианте осуществления, MARCKS-связанные пептиды представляют собой MANS-связанные пептиды. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды и определенные химически модифицированные MANS-связанные пептиды блокируют миграцию клеточных линий агрессивного рака. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды применяют, чтобы оказать ингибирующее действие на метастазирование раковых клеток. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, демонстрируют блокирующее действие на метастазирование раковых клеток in vivo. Участки ингибирования метастатической болезни in vivo включают по меньшей мере легочную ткань, ткань сердца, ткань селезенки, ткань кишки и ткань диафрагмы. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды применяют для лечения или профилактики метастазирования раковых клеток, пролиферации раковых клеток, роста опухолевых клеток или ангиогенеза.

В одном аспекте предоставлены композиции и способы лечения или профилактики рака, включающие введение соединения, ингибирующего MARCKS, в раковые клетки или клетки, которые играют роль в развитии, поддержании, пролиферации или метастазировании раковых клеток. В одном варианте осуществления предоставлен способ ингибирования метастазирования раковых клеток, включающий введение в раковые клетки ингибирующего метастазирование количества соединения, ингибирующего MARCKS. В одном варианте осуществления предоставлен способ ингибирования метастазирования раковых клеток, включающий введение в раковые клетки ингибирующего метастазирование количества MANS-связанного пептида. В другом варианте осуществления предоставлен способ ингибирования метастазирования раковых клеток в опухоли, включающий введение в раковые клетки ингибирующего метастазирование количества пептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 231 (включительно), SEQ ID NO: 234 и SEQ ID NO: 235; при этом N-концевая и/или C-концевая аминокислота пептидной последовательности является необязательно химически модифицированной. В другом варианте осуществления предоставлен способ лечения рака у нуждающегося в этом больного, при этом способ включает введение больному терапевтически эффективного количества MANS-связанного пептида. В другом варианте осуществления предоставлен способ лечения рака у нуждающегося в этом больного, при этом способ включает введение больному терапевтически эффективного количества пептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 231 (включительно), SEQ ID NO: 234 и SEQ ID NO: 235; при этом N-концевая и/или C-концевая аминокислота пептидной последовательности является необязательно химически модифицированной.

В одном варианте осуществления N-концевая аминокислота пептида химически модифицирована посредством ацилирования N-концевой аминокислоты пептида в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида C₂ (ацетил)-C₂₄ алифатической карбоновой кислоты, которая может быть линейной, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной,

амида трифторуксусной кислоты,

амида бензойной кислоты, и

амида C₁-C₂₄ алифатической алкилсульфоновой кислоты; или

N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида может быть алкилирована группой, выбранной из группы, состоящей из:

C₁-C₂₄ алифатической алкильной группы,

линейной 2-(C₁-C₂₄ алифатической алкильной)оксиэтильной группы,

омега-метокси-поли(этиленокси)n-этильной группы, где n составляет от 0 до 10.

В дополнительном варианте осуществления N-концевой амид выбран из группы, состоящей из ацетила и миристоила.

В другом варианте осуществления C-концевая аминокислота пептида химически модифицирована за счет образования амида в C-концевой группе карбоновой кислоты C-концевой аминокислоты пептида в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида аммиака,

амида C₁-C₂₄ алифатического алкильного амина,

амида гидроксилзамещенного C₂-C₂₄ алифатического алкильного амина,

амида линейной 2-(C₁-C₂₄ алифатической алкильной)оксиэтиламиногруппы, и

амида омега-метокси-поли(этиленокси)n-этиламиногруппы, где n составляет от 0 до 10.

В одном варианте осуществления предоставлен способ ингибирования метастазирования раковых клеток или лечения рака, включающий введение MANS-связанного пептида в раковые клетки или больному, соответственно. В одном варианте осуществления пептид выбран из группы, состоящей из N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID No: 2); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID No: 4); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID No: 7); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID No: 11); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID No: 16); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID No: 22); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID No: 29); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID No: 37); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID No: 46); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID No: 56); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID No: 67); N-миристоил-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID No: 79); N-миристоил-GAQFSKTAAKG (SEQ ID No: 92); N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106); N-миристоил-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121); N-миристоил-GAQFSKTA (SEQ ID No: 137); N-миристоил-GAQFSKT (SEQ ID No: 154); N-миристоил-GAQFSK (SEQ ID No: 172), N-миристоил-GAQFS (SEQ ID No: 191), N-миристоил-GAQF (SEQ ID No: 211), N-ацетил-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234), N-ацетил-RGAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 234), N-ацетил-RAKGE (SEQ ID NO: 235) и их комбинации.

В одном варианте осуществления пептид выбран из группы, состоящей из N-ацетил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11006); N-миристоил-AKGE (SEQ ID No: 219; BIO-91200); N-миристоил-GAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 106; BIO-11002); N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11000); N-ацетил-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121; BIO-10901); N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 121; BIO-10900) и N-ацетил-GAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 106). В одном варианте осуществления определенные аминокислоты присутствуют в d-конфигурации. Например, в одном варианте осуществления пептид представляет собой N-ацетил-GAQFS(d)KTAA(d)K (SEQ ID NO: 106; BIO-11037), в котором лизин (K) в позициях 6 и 10 пептида имеют d-конфигурацию.

В некоторых вариантах осуществления MANS-связанные пептиды демонстрируют свойства, которые делают их пригодными для применения в терапевтических целях, например, в лечении рака. Например, в одном варианте осуществления определенные MANS-связанные пептиды, раскрытые в данном документе, демонстрируют улучшенную растворимость по отношению к пептиду MANS или пептидам, не являющимся MANS-связанными пептидами. В другом варианте осуществления определенные MANS-связанные пептиды, предоставленные в данном документе, демонстрируют более длительный период полувыведения из плазмы, чем пептид MANS или пептиды, не являющимся MANS-связанные пептидами.

В одном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженную миграцию раковых клеток. Например, в одном варианте осуществления предварительная обработка раковых клеток MANS-связанным пептидом (например, BIO-11006, BIO11002, BIO10901, BIO10900, BIO11000 или BIO-91200) может редуцировать миграцию раковых клеток, если клетки предварительно обработаны от приблизительно 10 мкм пептида до приблизительно 200 мкм пептида; или предварительно обработаны от приблизительно 20 мкм до приблизительно 200 мкм; или предварительно обработаны от приблизительно 25 мкм пептида до приблизительно 75 мкм пептида. В одном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженную миграцию раковых клеток при введении в концентрациях от приблизительно 1 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 5 мкм до приблизительно 250 мкм, или от приблизительно 10 мкм до приблизительно 200 мкм. В одном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженную миграцию раковых клеток при введении в концентрациях, составляющих приблизительно 1 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 25 мкм, приблизительно 50 мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 150 мкм, приблизительно 200 мкм или приблизительно 500 мкм. В одном варианте осуществления для определения действия пептида раковые клетки обрабатывают пептидом in vitro. В одном варианте осуществления раковые клетки являются производными пациента. В дополнительном варианте осуществления раковые клетки обрабатывают пептидом in vitro, чтобы определить, может ли пациент реагировать на лечение пептидом.

В одном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженное метастазирование раковых клеток при введении пациенту в концентрациях от приблизительно 0,01 мг/кг/день до приблизительно 10 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженное метастазирование раковых клеток при введении пациенту в концентрациях от приблизительно 0,1 мг/кг/день до приблизительно 5,0 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженное метастазирование раковых клеток при введении пациенту в концентрациях от приблизительно 0,5 мг/кг/день до приблизительно 2,5 мг/кг/день. Например, MARCKS-связанный пептид демонстрирует сниженную миграцию раковых клеток при введении пациенту в концентрациях, составляющих приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1,0, приблизительно 1,25, приблизительно 1,5, приблизительно 1,75, приблизительно 2,0, приблизительно 2,25, приблизительно 2,5, приблизительно 2,75, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0, приблизительно 10,0 или более мг/кг/день.

В одном варианте осуществления пептид вводят посредством ингаляции жидкого раствора или суспензии, или посредством ингаляции лекарственной формы сухого порошка пептида. В другом варианте осуществления пептид вводят с помощью инъекции жидкой лекарственной формы или суспензии пептида. В дополнительном варианте осуществления инъекцию выполняют в область первичной опухоли, при этом область содержит раковые клетки. В дополнительном варианте осуществления раковые клетки находятся в опухоли у млекопитающего. В одном варианте осуществления опухоль представляет собой солидную опухоль. В другом варианте осуществления опухоль представляет собой несолидную опухоль. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, предоставленные в данном документе, ингибируют метастазирование раковых клеток, ассоциированных с лимфомой или лейкозом. В другом варианте осуществления жидкая лекарственная форма является изотонической. В другом варианте осуществления жидкая лекарственная форма содержит буферный раствор.

В одном варианте осуществления ингибирующее метастазирование количество пептида находится в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 микромоль на милилитр. В дополнительном варианте осуществления ингибирующее метастазирование количество пептида находится в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 10 микромоль на милилитр. В другом варианте осуществления пептид находится в лекарственной форме, включающей в себя дополнительное лекарственное вещество, пригодное для лечения рака, или приготовлен в виде лекарственной формы для введения с дополнительным лекарственным веществом.

В одном аспекте предоставлен способ лечения или предотвращения рака или ингибирования метастазирования раковых клеток у млекопитающего, при этом способ включает введение указанному млекопитающему соединения, ингибирующего MARCKS. В одном варианте осуществления соединение, ингибирующее MARCKS, представляет собой полинуклеотид или молекулу нуклеиновой кислоты, которая снижает экспрессию или активность MARCKS. В дополнительном варианте осуществления полинуклеотид, ингибирующий MARCKS, представляет собой антисмысловую РНК, siRNA, shRNA или miRNA. В одном варианте осуществления полинуклеотид, ингибирующий MARCKS, вводят в количестве от приблизительно 10 нМ до 10 мкм, или от приблизительно 20 нМ до приблизительно 500 нМ, или от приблизительно 30 нМ до приблизительно 300 нМ, или от приблизительно 40 нМ до приблизительно 200 нМ, или от приблизительно 50 нМ до приблизительно 100 нМ. В одном варианте осуществления полинуклеотид, ингибирующий MARCKS, представляет собой имитатор miRNA, который регулирует экспрессию MARCKS. Например, в одном варианте осуществления полинуклеотид, ингибирующий MARCKS, представляет собой имитатор miR21. В одном варианте осуществления полинуклеотиды и молекулы нуклеиновых кислот вводят вместе со средством доставки, таким как пептид, белок, липид, стерол, полимер, трансфицирующий реагент или любое полинуклеотидное или нуклеиновокислотное средство доставки, известное в данной области.

В одном аспекте предоставлен способ лечения или предотвращения рака или ингибирования метастазирования раковых клеток у млекопитающего, при этом способ включает введение указанному млекопитающему MANS-связанного пептида, при этом указанный пептид демонстрирует индекс миграции, составляющий по меньшей мере приблизительно 1,5, по меньшей мере приблизительно 1,6, по меньшей мере приблизительно 1,7, по меньшей мере приблизительно 1,8, по меньшей мере приблизительно 1,9, по меньшей мере приблизительно 2,0, по меньшей мере приблизительно 2,1, по меньшей мере приблизительно 2,2, по меньшей мере приблизительно 2,3, по меньшей мере приблизительно 2,4, по меньшей мере приблизительно 2,5, по меньшей мере приблизительно 2,6, по меньшей мере приблизительно 2,7, по меньшей мере приблизительно 2,8 по меньшей мере приблизительно 2,9, по меньшей мере приблизительно 3,0 или более, после предварительной обработки клеток немелкоклеточной карциномы легкого (NSCLC). В дополнительном варианте осуществления MANS-связанный пептид присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 или 200 мкмоль указанного пептида. В другом варианте осуществления период миграции составляет 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 15, 20, 21, 22, 23, или 24 часа. В одном варианте осуществления MANS-связанный пептид демонстрирует индекс миграции, составляющий по меньшей мере приблизительно 1,5 после предварительной обработки клеток NSCLC указанным пептидом в концентрации 50 мкмоль, и период миграции, составляющий приблизительно 12 часов. В другом варианте осуществления MANS-связанный пептид демонстрирует индекс миграции, составляющий по меньшей мере приблизительно 2,0 после предварительной обработки клеток NSCLC указанным пептидом в концентрации по меньшей мере приблизительно 100 мкмоль, и период миграции, составляющий приблизительно 12 часов.

В одном аспекте предоставлен способ лечения или профилактики рака, включая метастазирование рака у нуждающегося в этом больного, при этом способ включает введение MANS-связанного пептида больному в дозе от приблизительно 0,01 мг/кг/день до приблизительно 10 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления MANS-связанный пептид вводят в концентрациях от приблизительно 0,1 мг/кг/день до приблизительно 5,0 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления MANS-связанный пептид вводят в концентрациях от приблизительно 0,5 мг/кг/день до приблизительно 2,5 мг/кг/день. Например, MANS-связанный пептид вводят в дозе, составляющей приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1,0, приблизительно 1,25, приблизительно 1,5, приблизительно 1,75, приблизительно 2,0, приблизительно 2,25, приблизительно 2,5, приблизительно 2,75, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0, приблизительно 10,0 или более мг/кг/день для лечения или профилактики рака.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 показывает область подсчета клеток отрицательного контроля после времени миграции, составляющего 12 часов.

Фигура 2A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль пептида MANS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 2B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль пептида MANS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 3A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль пептида RNS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 3B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль пептида RNS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 4A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-11002 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 4B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-11002 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 5A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-10901 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 5B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-10901 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 6A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-91200 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 6B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-91200 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 7A графически изображает количества мигрировавших клеток, полученные через 12 часов после предварительной обработки 50 мкмоль пептида MANS, BIO11002, BIO10901, BIO91200 или пептида RNS, или без пептида (контроль).

Фигура 7B графически изображает количества мигрировавших клеток, полученные через 12 часов после предварительной обработки 100 мкмоль пептида MANS, BIO11002, BIO10901, BIO91200 или пептида RNS, или без пептида (контроль).

Фигура 8A графически изображает индекс миграции клеток клеточных линий агрессивного NSCLC человека, при этом большее значение индекса миграции обозначает меньшую миграцию после предварительной обработки пептидами изобретения при 50 мкмоль с последующими 12 часами обработки в соответствии с протоколом.

Фигура 8B графически изображает индекс миграции клеток клеточных линий агрессивного NSCLC человека, при этом большее значение индекса миграции обозначает меньшую миграцию после предварительной обработки пептидами изобретения при 100 мкмоль с последующими 12 часами обработки в соответствии с протоколом.

Фигура 9 графически изображает соответствующее количество клеток (левая панель) и показатель индекса миграции (правая панель) для MANS, RNS, BIO-11000 или BIO-11006 или контроля (без пептида) в экспериментах с применением 50 мкмоль указанного пептида и клеточной линии агрессивного NSCLC человека.

Фигура 10 графически изображает соответствующее количество клеток (левая панель) и показатель индекса миграции (правая панель) для MANS, RNS, BIO-11000, BIO-11006, BIO-91200 или контроля (без пептида) в экспериментах с применением 100 мкмоль указанного пептида и клеточной линии агрессивного NSCLC человека.

Фигура 11 демонстрирует количества мигрировавших клеток через 12 часов после предварительной обработки клеток A549 без пептида или указанным тестируемым пептидом (MANS, RNS, BIO-11006, BIO-11000, BIO-11002, BIO-91200 или BIO-10901) при 10 мкмоль (верхняя левая панель), при 25 мкмоль (верхняя правая панель) или при 50 мкмоль (нижняя панель) пептида.

Фигура 12 демонстрирует среднее количество опухолей на мышь в левом легком, правом легком, сердце и диафрагме у животных, обработанных BIO-11006. BIO-11006 (100 мкм в PBS) вводили один раз в день ежедневно в течение 22 дней, начиная с 3 дней после инокуляции раковых клеток, посредством интраперитонеальной инъекции (50 мкл) или ингаляции (30 мин, Nebulizer Delivery System, Aeroneb Lab).

Фигура 13 демонстрирует среднее количество опухолей на мышь в левом легком, правом легком, сердце и диафрагме у мыши с введенным BIO-11006 (100 мкм в PBS) посредством ингаляции с применением Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab) в течение 30 дней, один раз в день ежедневно, начиная с 15 дня или с 4 дня относительно инъекции клеток аденокарциномы человека (PC-9).

Фигура 14 демонстрирует общее количество опухолей у мыши с введенным BIO-11006 (100 мкм в PBS) посредством ингаляции с применением Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab) в течение 30 дней, один раз в день ежедневно, начиная с 15 дня или с 4 дня относительно инъекции клеток PC-9.

Фигура 15 отображает количество метастатических узелков, обнаруженных у мыши, обработанной через день контролем средой, аэрозольным BIO-11006, начиная с дня -1 или дня +3 относительно инъекции раковых клеток A549, или аэрозольным MANS, начиная с дня -1 или дня +3 относительно инъекции раковых клеток A549. Аэрозольные пептиды (100 мкм в PBS) вводили посредством ингаляции с применением Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab). *, p<0,05, статистически достоверная по сравнению с контрольной группой; a, статистически недостоверная в сравнении с группами.

Фигура 16 демонстрирует уровень белка MARCKS после введения 100 нМ MARCKS siRNA или контрольной siRNA в клетки PC9.

Фигура 17 демонстрирует уровень белка MARCKS после введения 100 нМ MARCKS siRNA или контрольной siRNA в клетки A549.

Фигура 18 демонстрирует миграцию раковых клеток PC9 после обработки 100 нМ MARCKS siRNA или контрольной siRNA.

Фигура 19 демонстрирует миграцию раковых клеток A549 после обработки 100 нМ MARCKS siRNA или контрольной siRNA.

Фигура 20 демонстрирует экспрессию MARCKS в клетках PC9 посредством вестерн-блоттинга после обработки 50 нМ отрицательного контроля (Среда HiPerfect; полоса A) или 50 нМ ингибитора miR21 (полоса B).

Фигура 21 демонстрирует миграцию раковых клеток PC9 после ингибирования miR21 (50 нМ или 100 нМ ингибитора mir-21) или активации miR21 (50 нМ или 100 нМ имитатора miR-21).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Миристоилированный, богатый аланином субстратный белок протеинкиназы С (MARCKS) ранее был вовлечен в разнообразные клеточные процессы. Например, было показано, что белок MARCKS неотъемлемо задействован в клеточной секреции, дегрануляции, миграции и экспрессии генов. Данные исследования основаны на способности пептида, идентичного миристоилированной N-концевой последовательности белка MARCKS (т.е., пептида MANS) влиять на процессы в разнородных типах клеток, когда клетки предварительно обрабатывали пептидом MANS перед стимуляцией. Во всех этих случаях миссенс-контрольный пептид (состоящий из случайной аминокислотной последовательности аминокислот пептида MANS, и который называется в данном документе пептид RNS) был неэффективным по отношению к активности, продемонстрированной пептидом MANS.

В одном варианте осуществления композиции включают в себя соединения, ингибирующие MARCKS, например, любой тип ингибиторующего соединения, известного в данной области, включая пептиды, полипептиды, антитела или их фрагменты и полинуклеотиды или молекулы нуклеиновых кислот, такие как антисмысловые полинуклеотиды, аптамеры, малая интерферирующая РНК (siRNA), микроРНК (miRNA) и короткая шпилечная РНК (shRNA). В одном варианте осуществления композиции включают в себя один или более пептидов, связанных с миристоилированным, богатым аланином субстратом протеинкиназы С (MARCKS). В другом варианте осуществления MARCKS-связанные пептиды соответствуют домену MH2 MARCKS. В другом варианте осуществления композиции включают в себя пептиды, ингибирующие MARCKS, включая пептиды, соответствующие N-концевой последовательности.

В одном варианте осуществления соединение, ингибирующее MARCKS, предоставленное в данном документе, представляет собой антитело. Как используется в данном документе, термин «антитело» относится к связывающему белку, имеющему по меньшей мере один антиген-связывающий домен, и включает в себя моноклональные антитела, поликлональные антитела и фрагменты и/или варианты антител, включая рекомбинантные полипептиды, белки слияния и иммуноконъюгаты. Примеры фрагментов антител изобретения включают, но без ограничения, Fab фрагмент, Fc фрагмент, Fv фрагмент, dAb фрагмент, изолированные CDR участки, F(ab')2 фрагменты, бивалентные фрагменты, включающие в себя два связанных Fab фрагмента, и одноцепочечные Fv молекулы (scFv). Специалисту в данной области известно, что антитела или фрагменты, предоставленные в данном документе, могут быть получены от любого вида, включая, но без ограничения, мышь, крысу, кролика, примата, ламу и человека. Специалисту в данной области дополнительно известно, что антитела или фрагменты, предоставленные в данном документе, могут быть химерными, гуманизированными или полностью человеческими.

В одном аспекте предоставлены композиции и способы лечения или профилактики рака. Способы лечения или профилактики рака, раскрытые в данном документе, включают лечение или предотвращение всех аспектов рака, включая, но без ограничения, метастазирование, рост опухоли, пролиферацию раковых клеток и ангиогенез. В одном варианте осуществления предоставлены композиции и способы лечения или профилактики рака, включая введение соединения, ингибирующего MARCKS, в раковую клетку или в клетку, которая играет роль в развитии, поддержании, пролиферации или метастазировании раковых клеток, такую как, например, эндотелиальная клетка.

В одном аспекте предоставлены композиции и способы ингибирования метастазирования раковых клеток, при этом способ включает введение соединений, ингибирующих MARCKS. В одном варианте осуществления соединения, ингибирующие MARCKS, представляют собой пептиды, ингибирующие MARCKS, антитела или их фрагменты, которые связываются с MARCKS или пептидами MARCKS, или полинуклеотиды или молекулы нуклеиновых кислот, включая антисмысловые полинуклеотиды, аптамеры, siRNA, miRNA и shRNA, которые ингибируют функции белка MARCKS. В дополнительном варианте осуществления пептиды представляют собой MANS-связанные пептиды, в котором пептиды ингибируют метастазирование раковых клеток. В одном варианте осуществления предоставлены пептиды, ингибирующие MARCKS, которые ингибируют метастазирование раковых клеток. В другом аспекте предоставлены способы лечения рака, используя композиции, раскрытые в данном документе. В одном варианте осуществления предоставленные способы включают в себя контактирование раковых клеток с пептидом, ингибирующим MARCKS. В дополнительном варианте осуществления раковые клетки присутствуют в опухоли. В одном варианте осуществления пептид, ингибирующий MARCKS, представляет собой MANS-связанный пептид. Как используется в данном документе, термин «MANS-связанный пептид» относится к пептиду MANS или пептиду, по существу идентичному MANS; или фрагменту пептида MANS, который содержит по меньшей мере четыре заменимые аминокислоты, обнаруженные в пептиде MANS, или является по существу идентичным пептиду, содержащему по меньшей мере 4 заменимые аминокислоты, обнаруженных в пептиде MANS. Таким образом, MANS-связанные пептиды имеют от 4 до 24 аминокислот в длину. Как используется в данном документе, термин «по существу идентичный» обозначает, в отношении сравнения аминокислотных последовательностей двух пептидов или сравнения аминокислотных последовательностей двух сегментов пептидов (напр., сегментов контрольной аминокислотной последовательности пептида), что аминокислотная последовательность пептидов или сегментов пептидов имеет по меньшей мере приблизительно 75% идентичность последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичность последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичность последовательности или по меньшей мере приблизительно 95% идентичность последовательности. Предпочтительно, аминокислотная последовательность пептидов имеет по меньшей мере приблизительно 80% идентичность последовательности с пептидом MANS или фрагментом пептида MANS. В одном варианте осуществления MANS-связанный пептид может включать в себя пептид от 4 до 24 аминокислот в длину, который является идентичным или по существу идентичным пептиду MANS и может дополнительно включать в себя одну или более дополнительных аминокислот. Например, в одном варианте осуществления MANS-связанный пептид включает в себя от 4 до 24 заменимые аминокислот, идентичных или по существу идентичных пептиду MANS и дополнительно включает в себя по меньшей мере одну N-концевую аминокислоту, которая не присутствует в пептиде MANS, такую как, например, аргинин.

В одном варианте осуществления пептид, ингибирующий MARCKS, является химически модифицированным. В одном варианте осуществления пептид, ингибирующий MARCKS, представляет собой MANS-связанный пептид, который ацилирован в N-концевой позиции. В дополнительном варианте осуществления MANS-связанный пептид ацилирован ацетильной группой в N-концевой позиции. В другом варианте осуществления MANS-связанный пептид миристоилирован в N-концевой позиции. В другом варианте осуществления MANS-связанный пептид является химически модифицированным в С-концевой позиции. В дополнительном варианте осуществления MANS-связанный пептид является химически модифицированным в С-концевой позиции посредством образования амида с амином (напр., аммиаком). В другом варианте осуществления MANS-связанный пептид является химически модифицированным и в N-концевой, и в C-концевой позиции. Таблица 1 перечисляет пептиды, имеющие отношение к настоящему изобретению, которые являются миристоилированными в их N-концевой позиции, но незамещенными в их C-концевой позиции. Определенные контрольные пептиды (RNS пептиды) перечислены в Таблицах 1 и 2, и являются миристоилированными. Однако, не следует, считать, что пептиды RNS находятся в пределах объема правовых притязаний настоящего изобретения.

Таблица 1
MANS-связанные пептиды изобретения, которые являются миристоилированными на N-конце и которые могут быть дополнительно химически модифицированны в С-концевой позиции, как описано в данном документе Пептид № N–миристоил Аминокислотные последовательности SEQ ID No: пептид 1 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 1 MANS пептид 2 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 2 пептид 4 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 4 пептид 7 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 7 пептид 11 GAQFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 11 пептид 16 GAQFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 16 пептид 22 GAQFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 22 пептид 29 GAQFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 29 пептид 37 GAQFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 37 пептид 46 GAQFSKTAAKGEAAA SEQ ID NO: 46 пептид 56 GAQFSKTAAKGEAA SEQ ID NO: 56 пептид 67 GAQFSKTAAKGEA SEQ ID NO: 67 пептид 79 GAQFSKTAAKGE SEQ ID NO: 79 пептид 92 GAQFSKTAAKG SEQ ID NO: 92 пептид 106 GAQFSKTAAK SEQ ID NO: 106 пептид 121 GAQFSKTAA SEQ ID NO: 121 пептид 137 GAQFSKTA SEQ ID NO: 137 пептид 154 GAQFSKT SEQ ID NO: 154 пептид 172 GAQFSK SEQ ID NO: 172

пептид 191 GAQFS SEQ ID NO: 191 пептид 211 GAQF SEQ ID NO: 211 Пептид 232 GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF SEQ ID NO: 232 RNS

Таблица 2 перечисляет фрагменты MANS-связанных пептидов изобретения, которые могут быть замещенными или химически модифицированными в N-концевой и/или C-концевой позиции. В одном варианте осуществления данные активные фрагменты пептида MANS могут быть миристоилированными в N-концевой позиции, как фрагменты в Таблице 1. В другом варианте осуществления химическое модифицирование в С-концевой позиции включает в себя амидирование, например, образование амида с амином, таким как, например, аммиак. Пептид 234 (SEQ ID NO: 234) представляет собой N-концевой аргинин-замещенный пептидный гомолог пептида 106 (SEQ ID NO: 106; RGAQFSKTAAK), который может быть химически модифицирован на N-конце (напр., N-концевой ацетиловый аналог, Ac-RGAQFSKTAAK), и который также может быть химически модифицирован на его N-конце и его C-конце (напр., N-концевой ацетил-, -C-концевой амид с аналогом аммиака, Ac-RGAQFSKTAAK-NH₂). Пептид 235 (SEQ ID NO: 235) представляет собой N-концевой аргинин-замещенный пептидный гомолог пептида 219, (SEQ ID NO: 219; RAKGE), который может быть химически модифицирован на N-конце (напр., N-концевой ацетиловый аналог, Ac-RAKGE) и который также может быть химически модифицирован на его N-конце и его C-конце (напр., N-концевой ацетил-, -C-концевой амид с аналогом аммиака, Ac-RAKGE-NH₂). Предпочтительные N-концевые модификации или замещения включают миристоиловые и ацетильные группы, а также N-концевые аргининовые группы, N-концевые ацетил-аргининовые группы и N-концевые миристоил-аргининовые группы. Предпочтительная C-концевая модификация включает в себя амидную группу из аммиака.

Таблица 2
Последовательности MARCKS-связанного пептида, которые могут быть химически модифицированными в N-концевой и/или C-концевой позиции, как описано в данном документе Таблица 2 Пептид MANS и активные фрагменты MANS-связанного пептида Пептид № Аминокислотная последовательность SEQ ID No: пептид 1 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 1 MANS пептид 2 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 2 пептид 3 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 3 пептид 4 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 4 пептид 5 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 5 пептид 6 QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 6 пептид 7 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 7 пептид 8 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 8 пептид 9 QFSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 9 пептид 10 FSKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 10 пептид 11 GAQFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 11 пептид 12 AQFSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 12 пептид 13 QFSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 13 пептид 14 FSKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 14 пептид 15 SKTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 15 пептид 16 GAQFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 16 пептид 17 AQFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 17 пептид 18 QFSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 18 пептид 19 FSKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 19 пептид 20 SKTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 20 пептид 21 KTAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 21 пептид 22 GAQFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 22 пептид 23 AQFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 23 пептид 24 QFSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 24 пептид 25 FSKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 25 пептид 26 SKTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 26

пептид 27 KTAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 27 пептид 28 TAAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 28 пептид 29 GAQFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 29 пептид 30 AQFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 30 пептид 31 QFSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 31 пептид 32 FSKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 32 пептид 33 SKTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 33 пептид 34 KTAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 34 пептид 35 TAAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 35 пептид 36 AAKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 36 пептид 37 GAQFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 37 пептид 38 AQFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 38 пептид 39 QFSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 39 пептид 40 FSKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 40 пептид 41 SKTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 41 пептид 42 KTAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 42 пептид 43 TAAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 43 пептид 44 AAKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 44 пептид 45 AKGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 45 пептид 46 GAQFSKTAAKGEAAA SEQ ID NO: 46 пептид 47 AQFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 47 пептид 48 QFSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 48 пептид 49 FSKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 49 пептид 50 SKTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 50 пептид 51 KTAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 51 пептид 52 TAAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 52 пептид 53 AAKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 53 пептид 54 AKGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 54 пептид 55 KGEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 55 пептид 56 GAQFSKTAAKGEAA SEQ ID NO: 56 пептид 57 AQFSKTAAKGEAAA SEQ ID NO: 57 пептид 58 QFSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 58 пептид 59 FSKTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 59 пептид 60 SKTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 60

пептид 61 KTAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 61 пептид 62 TAAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 62 пептид 63 AAKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 63 пептид 64 AKGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 64 пептид 65 KGEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 65 пептид 66 GEAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 66 пептид 67 GAQFSKTAAKGEA SEQ ID NO: 67 пептид 68 AQFSKTAAKGEAA SEQ ID NO: 68 пептид 69 QFSKTAAKGEAAA SEQ ID NO: 69 пептид 70 FSKTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 70 пептид 71 SKTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 71 пептид 72 KTAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 72 пептид 73 TAAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 73 пептид 74 AAKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 74 пептид 75 AKGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 75 пептид 76 KGEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 76 пептид 77 GEAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 77 пептид 78 EAAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 78 пептид 79 GAQFSKTAAKGE SEQ ID NO: 79 пептид 80 AQFSKTAAKGEA SEQ ID NO: 80 пептид 81 QFSKTAAKGEAA SEQ ID NO: 81 пептид 82 FSKTAAKGEAAA SEQ ID NO: 82 пептид 83 SKTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 83 пептид 84 KTAAKGEAAAER SEQ ID NO: 84 пептид 85 TAAKGEAAAERP SEQ ID NO: 85 пептид 86 AAKGEAAAERPG SEQ ID NO: 86 пептид 87 AKGEAAAERPGE SEQ ID NO: 87 пептид 88 KGEAAAERPGEA SEQ ID NO: 88 пептид 89 GEAAAERPGEAA SEQ ID NO: 89 пептид 90 EAAAERPGEAAV SEQ ID NO: 90 пептид 91 AAAERPGEAAVA SEQ ID NO: 91 пептид 92 GAQFSKTAAKG SEQ ID NO: 92 пептид 93 AQFSKTAAKGE SEQ ID NO: 93 пептид 94 QFSKTAAKGEA SEQ ID NO: 94

пептид 95 FSKTAAKGEAA SEQ ID NO: 95 пептид 96 SKTAAKGEAAA SEQ ID NO: 96 пептид 97 KTAAKGEAAAE SEQ ID NO: 97 пептид 98 TAAKGEAAAER SEQ ID NO: 98 пептид 99 AAKGEAAAERP SEQ ID NO: 99 пептид 100 AKGEAAAERPG SEQ ID NO: 100 пептид 101 KGEAAAERPGE SEQ ID NO: 101 пептид 102 GEAAAERPGEA SEQ ID NO: 102 пептид 103 EAAAERPGEAA SEQ ID NO: 103 пептид 104 AAAERPGEAAV SEQ ID NO: 104 пептид 105 AAERPGEAAVA SEQ ID NO: 105 пептид 106 GAQFSKTAAK SEQ ID NO: 106 пептид 107 AQFSKTAAKG SEQ ID NO: 107 пептид 108 QFSKTAAKGE SEQ ID NO: 108 пептид 109 FSKTAAKGEA SEQ ID NO: 109 пептид 110 SKTAAKGEAA SEQ ID NO: 110 пептид 111 KTAAKGEAAA SEQ ID NO: 111 пептид 112 TAAKGEAAAE SEQ ID NO: 112 пептид 113 AAKGEAAAER SEQ ID NO: 113 пептид 114 AKGEAAAERP SEQ ID NO: 114 пептид 115 KGEAAAERPG SEQ ID NO: 115 пептид 116 GEAAAERPGE SEQ ID NO: 116 пептид 117 EAAAERPGEA SEQ ID NO: 117 пептид 118 AAAERPGEAA SEQ ID NO: 118 пептид 119 AAERPGEAAV SEQ ID NO: 119 пептид 120 AERPGEAAVA SEQ ID NO: 120 пептид 121 GAQFSKTAA SEQ ID NO: 121 пептид 122 AQFSKTAAK SEQ ID NO: 122 пептид 123 QFSKTAAKG SEQ ID NO: 123 пептид 124 FSKTAAKGE SEQ ID NO: 124 пептид 125 SKTAAKGEA SEQ ID NO: 125 пептид 126 KTAAKGEAA SEQ ID NO: 126 пептид 127 TAAKGEAAA SEQ ID NO: 127 пептид 128 AAKGEAAAE SEQ ID NO: 128

пептид 129 AKGEAAAER SEQ ID NO: 129 пептид 130 KGEAAAERP SEQ ID NO: 130 пептид 131 GEAAAERPG SEQ ID NO: 131 пептид 132 EAAAERPGE SEQ ID NO: 132 пептид 133 AAAERPGEA SEQ ID NO: 133 пептид 134 AAERPGEAA SEQ ID NO: 134 пептид 135 AERPGEAAV SEQ ID NO: 135 пептид 136 ERPGEAAVA SEQ ID NO: 136 пептид 137 GAQFSKTA SEQ ID NO: 137 пептид 138 AQFSKTAA SEQ ID NO: 138 пептид 139 QFSKTAAK SEQ ID NO: 139 пептид 140 FSKTAAKG SEQ ID NO: 140 пептид 141 SKTAAKGE SEQ ID NO: 141 пептид 142 KTAAKGEA SEQ ID NO: 142 пептид 143 TAAKGEAA SEQ ID NO: 143 пептид 144 AAKGEAAA SEQ ID NO: 144 пептид 145 AKGEAAAE SEQ ID NO: 145 пептид 146 KGEAAAER SEQ ID NO: 146 пептид 147 GEAAAERP SEQ ID NO: 147 пептид 148 EAAAERPG SEQ ID NO: 148 пептид 149 AAAERPGE SEQ ID NO: 149 пептид 150 AAERPGEA SEQ ID NO: 150 пептид 151 AERPGEAA SEQ ID NO: 151 пептид 152 ERPGEAAV SEQ ID NO: 152 пептид 153 RPGEAAVA SEQ ID NO: 153 пептид 154 GAQFSKT SEQ ID NO: 154 пептид 155 AQFSKTA SEQ ID NO: 155 пептид 156 QFSKTAA SEQ ID NO: 156 пептид 157 FSKTAAK SEQ ID NO: 157 пептид 158 SKTAAKG SEQ ID NO: 158 пептид 159 KTAAKGE SEQ ID NO: 159 пептид 160 TAAKGEA SEQ ID NO: 160 пептид 161 AAKGEAA SEQ ID NO: 161 пептид 162 AKGEAAA SEQ ID NO: 162

пептид 163 KGEAAAE SEQ ID NO: 163 пептид 164 GEAAAER SEQ ID NO: 164 пептид 165 EAAAERP SEQ ID NO: 165 пептид 166 AAAERPG SEQ ID NO: 166 пептид 167 AAERPGE SEQ ID NO: 167 пептид 168 AERPGEA SEQ ID NO: 168 пептид 169 ERPGEAA SEQ ID NO: 169 пептид 170 RPGEAAV SEQ ID NO: 170 пептид 171 PGEAAVA SEQ ID NO: 171 пептид 172 GAQFSK SEQ ID NO: 172 пептид 173 AQFSKT SEQ ID NO: 173 пептид 174 QFSKTA SEQ ID NO: 174 пептид 175 FSKTAA SEQ ID NO: 175 пептид 176 SKTAAK SEQ ID NO: 176 пептид 177 KTAAKG SEQ ID NO: 177 пептид 178 TAAKGE SEQ ID NO: 178 пептид 179 AAKGEA SEQ ID NO: 179 пептид 180 AKGEAA SEQ ID NO: 180 пептид 181 KGEAAA SEQ ID NO: 181 пептид 182 GEAAAE SEQ ID NO: 182 пептид 183 EAAAER SEQ ID NO: 183 пептид 184 AAAERP SEQ ID NO: 184 пептид 185 AAERPG SEQ ID NO: 185 пептид 186 AERPGE SEQ ID NO: 186 пептид 187 ERPGEA SEQ ID NO: 187 пептид 188 RPGEAA SEQ ID NO: 188 пептид 189 PGEAAV SEQ ID NO: 189 пептид 190 GEAAVA SEQ ID NO: 190 пептид 191 GAQFS SEQ ID NO: 191 пептид 192 AQFSK SEQ ID NO: 192 пептид 193 QFSKT SEQ ID NO: 193 пептид 194 FSKTA SEQ ID NO: 194 пептид 195 SKTAA SEQ ID NO: 195 пептид 196 KTAAK SEQ ID NO: 196

пептид 197 TAAKG SEQ ID NO: 197 пептид 198 AAKGE SEQ ID NO: 198 пептид 199 AKGEA SEQ ID NO: 199 пептид 200 KGEAA SEQ ID NO: 200 пептид 201 GEAAA SEQ ID NO: 201 пептид 202 EAAAE SEQ ID NO: 202 пептид 203 AAAER SEQ ID NO: 203 пептид 204 AAERP SEQ ID NO: 204 пептид 205 AERPG SEQ ID NO: 205 пептид 206 ERPGE SEQ ID NO: 206 пептид 207 RPGEA SEQ ID NO: 207 пептид 208 PGEAA SEQ ID NO: 208 пептид 209 GEAAV SEQ ID NO: 209 пептид 210 EAAVA SEQ ID NO: 210 пептид 211 GAQF SEQ ID NO: 211 пептид 212 AQFS SEQ ID NO: 212 пептид 213 QFSK SEQ ID NO: 213 пептид 214 FSKT SEQ ID NO: 214 пептид 215 SKTA SEQ ID NO: 215 пептид 216 KTAA SEQ ID NO: 216 пептид 217 TAAK SEQ ID NO: 217 пептид 218 AAKG SEQ ID NO: 218 пептид 219 AKGE SEQ ID NO: 219 пептид 220 KGEA SEQ ID NO: 220 пептид 221 GEAA SEQ ID NO: 221 пептид 222 EAAA SEQ ID NO: 222 пептид 223 AAAE SEQ ID NO: 223 пептид 224 AAER SEQ ID NO: 224 пептид 225 AERP SEQ ID NO: 225 пептид 226 ERPG SEQ ID NO: 226 пептид 227 RPGE SEQ ID NO: 227 пептид 228 PGEA SEQ ID NO: 228 пептид 229 GEAA SEQ ID NO: 229 пептид 230 EAAV SEQ ID NO: 230

пептид 231 AAVA SEQ ID NO: 231 Пептид 232 GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF SEQ ID NO: 232 RNS Пептид 233 GKASQFAKTA SEQ ID NO: 233 RNS2 Пептид 234 RGAQFSKTAAK SEQ ID NO: 234 Пептид 235 RAKGE SEQ ID NO: 235

Пептид MANS является миристоилированным (обозначено как MA) и содержит последовательность из 24 аминокислот MA-GAQFSKTAAKGEAAARPGEAAVA. Не желая связывать себя теорией, пептид, как оценивается теоретически, препятствует естественному прикреплению полноразмерного белка MARCKS к клеточной мембране и препятствует фосфорилированию белка MARCKS с помощью протеинкиназы C (PKC).

Пептид MANS, как было показано, обеспечивает значительное уменьшение дегрануляции бокаловидных клеток как in vitro, так и in vivo. MANS также влияет на скорость миграции нейтрофилов и мезенхимальных стволовых клеток. Дегрануляция лейкоцитов человека также ингибируется MANS. В одном аспекте данного изобретения, обработка определенных клеточных линий рака MANS-связанными пептидами уменьшает миграцию данных клеточных линий рака. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды демонстрируют ингибирование метастазирования раковых клеток. Таким образом, в одном варианте осуществления предоставленные MANS-связанные пептиды можно применять для лечения или предотвращения метастатического рака у нуждающегося в этом больного. В некоторых вариантах осуществления MANS-связанные пептиды демонстрируют свойства, которые делают их пригодными для использования в терапевтических вариантах применения, например, при лечении рака. Например, в одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды демонстрируют улучшенную растворимость по отношению к пептиду MANS. В другом варианте осуществления некоторые MANS-связанные пептиды демонстрируют более длительный период полувыведения из плазмы, чем пептид MANS или по отношению к пептидам, не являющимся MANS-связанными пептидами. В одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды могут быть использованы для лечения пролиферации раковых клеток. Например, в одном варианте осуществления MANS-связанные пептиды могут ингибировать пролиферацию и/или миграцию раковых клеток. В другом варианте осуществления некоторые MANS-связанные пептиды могут предоставить более выраженное ингибирование пролиферации и/или миграции раковых клеток в меньших концентрациях, чем пептид MANS или чем другие MANS-связанные пептиды.

В одном аспекте, MANS-связанный пептид выбран из группы, состоящей из:

N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11000)

N-ацетил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11006);

N-миристоил-AKGE (SEQ ID No: 219; BIO-91200);

N-миристоил-GAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 106; BIO-11002);

N-ацетил-GAQFSKTAA (SEQ ID № 121; BIO-10901);

N-ацетил-GAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 106; BIO-11026);

N-ацетил-GAQFS(d)KTAA(d)K (SEQ ID No: 106; BIO-11037) (Lys в позициях 6 и 10 пептида относятся к d-конфигурации;

N-ацетил-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234; BIO-11027);

N-ацетил-RGAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 234; BIO-11028); и

N-ацетил-RAKGE (SEQ ID NO: 235; BIO-91204).

В одном аспекте пептиды, имеющие 4-24 аминокислоты и которые имеют аминокислотные последовательности, которые являются идентичными или по существу идентичными аминокислотным последовательностям, обнаруженным в пептиде MANS, могут быть использованы в одном или более аспектах данного изобретения. Данные пептиды в данном документе именуются MANS-связанные пептиды, и иллюстративные MANS-связанные пептиды перечислены в Таблице 2 как SEQ ID №№ 1-231, 234 и 235. Таблица 2 также включает аминокислотную последовательность пептида № 232 (SEQ ID NO: 232) со случайной последовательностью (RNS), который применяется в качестве контрольного и для демонстрации, что порядок аминокислотной последовательности может иметь отношение к эффективности в данном изобретении, а также контрольного пептида 233 (RNS2; SEQ ID NO: 233) со второй случайной последовательностью. Пептиды 234 и 235 (SEQ ID NO: 234 и 235) представляют собой N-концевые аргинин-замещенные пептидные гомологи пептидов 106 и 219, соответственно. Аргинин может быть ацилированным, например, ацетильной группой или миристоиловой группой.

В одном варианте осуществления пептиды, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, состоящей из синтетических пептидов, имеющих аминокислотные последовательности, перечисленные в Таблице 2 (за исключением пептидов случайной последовательности 232 и 233).

В другом варианте осуществления пептиды, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, могут быть выбраны из пептидов аминокислотных последовательностей, как перечисленных в Таблице 2 (SEQ ID NO: 1-231 (включительно), 234 и 235), так и которые необязательно являются химически модифицированными на N-конце и/или C-конце.

Предпочтительные независимые N-концевые химические модификации пептидов, перечисленных в Таблице 2, включают модификацию N-концевой аминогруппы посредством ацилирования N-концевой аминокислоты пептида в форме амида, выбранной из группы, состоящей из:

амида C₂ (ацетил)-C₂₄ алифатической карбоновой кислоты, которая может быть линейной, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной,

амида трифторуксусной кислоты,

амида бензойной кислоты, и

амида C₁-C₂₄ алифатической алкилсульфоновой кислоты; или

N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида может быть алкилирована группой, выбранной из группы, состоящей из:

C₁ (метил)-C₂₄ алифатической алкильной группы,

линейной 2-(C₁-C₂₄ алифатической алкильной)оксиэтильной группы,

омега-метокси-поли(этиленокси)n-этильной группы, где n составляет от 0 до 10.

Предпочтительные независимые C-концевые химические модификации пептидов, перечисленные в Таблице 2, включают образование амида в C-концевой группе карбоновой кислоты C-концевой аминокислоты пептида в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида аммиака,

амида C₁-C₂₄ алифатического алкильного амина,

амида гидроксилзамещенного C₂-C₂₄ алифатического алкильного амина,

амида линейной 2-(C₁-C₂₄алифатической алкильной)оксиэтиламиногруппы, и

амида омега-метокси-поли(этиленокси)n-этиламиногруппы, где n составляет от 0 до 10.

В дополнение, C-концевая группа карбоновой кислоты C-концевой аминокислоты пептида необязательно находится в форме сложного эфира, выбранного из группы, состоящей из:

сложного эфира C₁-C₂₄ алифатического алкилового спирта,

сложного эфира 2-(омега-метокси-поли(этиленокси)n)-этанольной группы, где n составляет от 0 до 10, и

сложного эфира линейного PEG-амина, PEG компонент молекулярной массы от 1000 до 25000 Дальтон.

В одном варианте осуществления, алифатические участки групп такие как группы карбоновых кислот и группы сульфоновых кислот и спиртовые и аминогруппы могут содержать кольцо по меньшей мере из C₃ (т.е., по меньшей мере циклопропиловое кольцо).

В одном варианте осуществления, пептид может быть модифицирован на N-конце, например, ацетильной группой или миристоиловой группой, как N-концевой амид, такой как ацетил-GAQFSKTAAK (N-концевой ацетил SEQ ID No: 106) и миристоил-GAQFSKTAAK (N-концевой миристоил SEQ ID No: 106), соответственно. В другом варианте осуществления пептид может быть модифицирован на С-конце (например, амидом с аммиаком), таким как GAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 106 C-концевой амид). В другом варианте осуществления пептид может быть модифицирован на N-конце и модифицирован на С-конце, например, в виде N-ацетил-пептид-C-амида (с аммиаком), такого как Ацетил-GAQFSKTAAK-NH₂, (N-концевой ацетил SEQ ID No: 106 C-концевой амид), и Миристоил-GAQFSKTAAK-NH₂ (N-концевой миристоил SEQ ID No: 106 C-концевой амид). Данные пептиды могут использоваться в способах данного изобретения и чтобы определить их способность ингибировать метастазы раковых клеток.

В одном варианте осуществления пептид, который может найти применение в данном изобретении, может быть выбран из группы пептидов, которые имеют в своем составе аминокислотную последовательность AKGE (SEQ ID No: 219). Такие пептиды содержат SEQ ID No: 1 - SEQ ID No: 54, SEQ ID No: 56 - SEQ ID No: 64, SEQ ID No: 67 - SEQ ID No: 75, SEQ ID No: 79 - SEQ ID No: 87, SEQ ID No: 93 - SEQ ID No: 100, SEQ ID No: 108 - SEQ ID No: 114, SEQ ID No: 124 - SEQ ID No: 129, SEQ ID No: 141 - SEQ ID No: 145, SEQ ID No: 159 - SEQ ID No: 162, SEQ ID No: 178 - SEQ ID No: 180, SEQ ID No: 198, SEQ ID No: 199, SEQ ID No: 219, и SEQ ID NO: 235. В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления, данные пептиды миристоилированы или ацетилированы в N-концевой аминогруппе.

В одном варианте осуществления данное изобретение раскрывает способ ослабления метастазирования раковых клеток в сторону увеличения градиента концентрации хемотаксического агента в текучей среде или ткани, при этом способ включает обработку указанных раковых клеток ингибирующим миграцию количеством модулирующего миграцию пептида и инкубирование указанных клеток с указанным пептидом для образования раковых клеток с ингибированной миграцией, при этом пептидом является MANS-связанный пептид.

В одном аспекте модулирующий миграцию пептид выбран из группы, состоящей из MANS-связанных пептидов. В другом аспекте MANS-связанный пептид включает в себя аминокислотную последовательность GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106).

В другом аспекте MANS-связанный пептид выбран из группы, состоящей из N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID No: 1) N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID No: 2); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID No: 4); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID No: 7); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID No: 11); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID No: 16); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID No: 22); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID No: 29); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID No: 37); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID No: 46); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID No: 56); N-миристоил-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID No: 67); N-миристоил-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID No: 79); N-миристоил-GAQFSKTAAKG (SEQ ID No: 92); N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106); N-миристоил-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121); N-миристоил-GAQFSKTA (SEQ ID No: 137); N-миристоил-GAQFSKT (SEQ ID No: 154); N-миристоил-GAQFSK (SEQ ID No: 172), N-миристоил-GAQFS (SEQ ID No: 191), N-миристоил-GAQF (SEQ ID No: 211), N-ацетил-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234), N-ацетил-RGAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 234), N-ацетил-RAKGE (SEQ ID NO: 235) и их комбинаций.

В другом аспекте MANS-связанный пептид выбран из группы, состоящей из:

N-миристоил-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID No: 1; пептид MANS);

N-миристоил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11000);

N-ацетил-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11006);

N-ацетил-GAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 106; BIO-11026);

N-миристоил-AKGE (SEQ ID No: 219; BIO-91200);

N-миристоил-GAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 106; BIO-11002);

N-ацетил-GAQFSKTAA (SEQ ID № 121; BIO-10901)

N-ацетил-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234; BIO-11027)

N-ацетил-RGAQFSKTAAK-NH₂ (SEQ ID No: 234; BIO-11028), и

N-ацетил-RAKGE (SE Q ID NO: 235; BIO-91204).

В одном аспекте ингибирующая метастазирование доза пептида данного изобретения может быть в диапазоне от приблизительно 0,01 мг/кг/день до приблизительно 10 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления ингибирующая метастазирование доза пептида составляет от приблизительно 0,1 мг/кг/день до приблизительно 5,0 мг/кг/день. В дополнительном варианте осуществления, ингибирующая метастазирование доза пептида составляет от приблизительно 0,5 мг/кг/день до приблизительно 2,5 мг/кг/день. Например, ингибирующая метастазирование доза пептида данного изобретения составляет приблизительно 0,01, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1,0, приблизительно 1,25, приблизительно 1,5, приблизительно 1,75, приблизительно 2,0, приблизительно 2,25, приблизительно 2,5, приблизительно 2,75, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0, приблизительно 10,0 или более мг/кг/день.

В одном варианте осуществления данное изобретение предоставляет способ ингибирования метастазирования раковых клеток, в котором введение происходит посредством перорального, внутривенного, интраперитонеального, внутримышечного, ингаляционного путей или посредством суппозиториев. В другом варианте осуществления данное изобретение раскрывает способ ингибирования метастазирования раковых клеток, в котором введение происходит посредством ингаляции лекарственной формы соединения, ингибирующего MARCKS, в виде жидкого раствора или суспензии или сухого порошка. В одном варианте осуществления предоставлен способ лечения рака, в котором соединение, ингибирующее MARCKS, вводят нуждающемуся в этом больному посредством ингаляции лекарственной формы соединения, ингибирующего MARCKS, в виде жидкого раствора или суспензии или сухого порошка. Например, в одном варианте осуществления, MANS-связанный пептид вводят нуждающемуся в этом больному посредством ингаляции лекарственной формы MANS-связанного пептида в виде жидкого раствора или суспензии или сухого порошка. В другом варианте осуществления MANS-связанный пептид вводят посредством внутривенного, интраперитонеального введения или посредством внутримышечной инъекции или посредством перорального введения или посредством суппозиториев.

В другом аспекте данное изобретение раскрывает способ ингибирования метастазирования раковых клеток или лечения рака у нуждающегося в этом больного, в котором MANS-связанный пептид вводят с помощью инъекции жидкой лекарственной формы пептида, и в котором жидкая лекарственная форма является изотонической, и в котором жидкая или суспензионная лекарственная форма содержит буферный раствор, и в котором инъекции выполняют больному систематически. В другом варианте осуществления инъекцию выполняют в область опухоли. В другом варианте осуществления инъекцию выполняют в опухоль.

В другом аспекте данное изобретение раскрывает способ ингибирования метастазирования раковых клеток, в котором раковые клетки находятся в млекопитающем. В одном варианте осуществления предоставлен способ лечения рака, в котором MANS-связанный пептид вводят нуждающемуся в этом больному, и в котором у больного имеется опухоль. Пептиды данного изобретения могут быть приготовлены в виде лекарственной формы с применением одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов или ингредиентов для предоставления фармацевтических композиций, пригодных для введения в раковые клетки, такие как раковые клетки в первичной опухоли. Такие композиции могут представлять собой как растворы, так и суспензии в жидком, преимущественно в буферном растворе, в котором фосфатный буфер является пригодным, когда введение с помощью инъекции или посредством ингаляции является пригодным. Изотонические растворы или суспензии являются предпочтительными вариантами осуществления.

Ожидается, что введение композиции антител, полинуклеотидов, молекул нуклеиновой кислоты или пептидов данного изобретения млекопитающим, таким как собачьи, кошачьи и пациенты-люди, может быть эффективным, если оно проводится с помощью инъекции в область первичной опухоли (напр., непосредственно в первичную опухоль, или в край первичной опухоли, или в кровеносный сосуд, питающий первичную опухоль) у млекопитающего, при этом инъекция делают через равные интервалы (например, от каждого 1 до каждых 72 часов), необязательно в комбинации или раздельно с одним или более другими или дополнительными химиотерапевтическими препаратами.

В дополнение к лекарственной форме с антителами, ингибирующими MARCKS, полинуклеотидами, молекулами нуклеиновой кислоты или пептидами перед, во время или после введения пептида могут быть введены один или более дополнительных терапевтических агентов, включая химиотерапевтические препараты и раковоспецифические антитела. Иллюстративные химиотерапевтические препараты включают, но без ограничения, карбоплатин, цисплатин, оксалиплатин, циклофосфамид, дакарбазин, темозоломид, гемцитабин, капецитабин, кладрибин, клофарабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гидроксимочевина, метотрексат, пеметрексед, пентостатин, тиогуанадин, даунорубицин, доксирубицин, эпирубицин, идарубицин, топотекан, иринотекан, этопозид, энипозид, колхицин, винкристин, винбластин, винорелбин, паклитаксел и доцетаксел. Иллюстративные раковоспецифические агенты и антитела включают, но без ограничения, Афатиниб, Альдеслейкин, Алемтузумаб, Акситиниб, Белимумаб, Бевацизумаб, Бортезомиб, Босутиниб, Брентуксимаб ведотин, Кабозантиниб, Канакинумаб, Карфилзомиб, Цетуксимаб, Кризотиниб, Дабрафениб, Дазатиниб, Деносумаб, Эрлотиниб, Эверолимус, Гефитиниб, Ибритумомаб тиуксетан, Ибрутиниб, Иматиниб, Ипилимумаб, Лапатиниб, Нилотиниб, Обинутузумаб, Офатумумаб, Панитумумаб, Пазопаниб, Пертузумаб, Понатиниб, Регорафениб, Ритуксимаб, Ромидепсин, Руксолитиниб, Сипулейцел-T, Сорафениб, Темсиролимус, Тоцилизумаб, Тофацитиниб, Тозитумомаб, Траметиниб, Трастузумаб, Вандетаниб, Вемурафениб, Висмодегиб, Вориностат и Зив-афлиберцепт.

Введение может происходить, например, посредством ингаляции в виде аэрозоля или спрея, жидкости или сухого порошка, например, в дыхательные пути больного раком, причем данный спрей может сформировать покрытие на ткани, содержащей раковые клетки, или в виде жидкости для инъекции в текучую среду или ткань, содержащую или контактирующую с раковыми клетками перед метастазированием. Для содействия солюбилизации и трасмембранному поглощению MANS-связанного пептида предусматривается применение мягкого поверхностно-активного агента, такого как фосфолипид. Введение может также происходить, например, посредством сухого порошка, предпочтительно состоящего из наночастиц или микрочастиц порошка, применяемого посредством распыления на ткань, содержащую раковые клетки. Добавление в препарат пептида микрогранулированного углеводного носителя будет облегчать ингаляционную доставку наночастиц пептида в зону дыхательных путей и эпителиальной ткани.

Предпочтительный способ применения композиции антитела, ингибирующего MARCKS, полинуклеотида, молекулы нуклеиновой кислоты или пептида включает в себя инъекцию в ткань в опухоль или проксимальнее опухоли, причем данная опухоль содержит раковые клетки перед метастазированием.

Как используется в данном документе, фраза «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к нетоксическому, но достаточному количеству композиций, применяемому при осуществлении изобретения, которое является эффективным для достижения желаемого эффекта, т.е., ингибирования метастазирования и/или пролиферации раковых клеток, и/или для ингибирования, лечения или предотвращения рака у нуждающегося в этом больного. Таким образом, активность, предполагаемая настоящими способами включает в себя как медицинское терапевтическое, так и/или профилактическое лечение, в зависимости от ситуации, включая, например, уменьшение и/или облегчение признаков, симптомов или случаев рака. Терапевтически эффективным количеством соединения данного изобретения обычно является такое количество, что при его введении в композиции с физиологически приемлемыми эксципиентами, оно является эффективным для достижения эффективной внутриклеточной концентрации и локальной концентрации в ткани.

"Рак" в данном документе относится к или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое типично характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. Примеры рака включают, но без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому (включая липосаркому, остеогенную саркому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, фибросаркому, миксосаркому, хондросаркому), остеокластому, нейроэндокринные опухоли, мезотелиому, хордому, синовиому, шванному, менингиому, аденокарциному, меланому и лейкоз или лимфонеоплазии. Более конкретные примеры данных видов рака включают плоскоклеточный рак (напр., эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, мелкоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, включая гастроинтестинальный рак, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочных желез, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, карциному эндомметрия или матки, карциному слюнных желез, рак почек, или ренальный рак, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, карциному ануса, карциному полового члена, рак яичек, рак пищевода, опухоли билиарного тракта, опухоль Юинга, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечноклеточную карциному, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональный рак, опухоль Вильмса, опухоль яичка, карциному легкого, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, невриному слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому, ретинобластому, лейкоз, лимфому, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, миелодиспластическую болезнь, болезнь тяжелых цепей, нейроэндокринные опухоли, шванному и другие карциномы, рак головы и шеи, миелоидные неоплазии, такие как острые миелоидные лейкозы, включая AML с созреванием, AML без дифференцировки, острый промиелоцитарный лейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз и острые моноцитарные лейкозы, миелодиспластические синдромы и хронические миелопролиферативные заболеваниы, включая хронический миелогенный лейкоз, опухоли центральной нервной системы, напр., опухоли головного мозга (глиому, нейробластому, астроцитому, медуллобластому, эпендимому и ретинобластому), солидные опухоли (назофарингеальный рак, базальноклеточную карциному, рак поджелудочной железы, рак желчных протоков, саркому Капоши, рак яичек, матки, влагалища или рак шейки матки, рак яичников, первичной рак печени или рак эндометрия, опухоли сосудистой системы (ангиосаркому и гемангиоперицитому), гематологические новообразования и опухолеподобные состояния например, ходжкинскую лимфому; неходжкинские лимфомы (лимфому Беркитта, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому/ хронический лимфоцитарный лейкоз, фунгоидный микоз, лимфому из клеток мантии, фолликулярную лимфому, диффузную гигантскую В-клеточную лимфому, лимфому маргинальной зоны, волосатоклеточный лейкоз и лимфоплазмоцитарный лейкоз), опухоли клеток-предшественников лимфоцитов, включая B-клеточный острый лимфобластный лейкоз/лимфому, и T-клеточный острый лимфобластный лейкоз/лимфому, тимому, опухоли зрелый T- и NK-клеток, включая периферические T-клеточные лейкозы, Т-клеточный лейкоз взрослых /T-клеточные лимфомы и лейкоз из больших зернистых лимфоцитов, остеолитический рак кости и метастазирование в кость.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрировано посредством ссылки на следующие примеры. Однако следует заметить, что данные примеры, подобно вариантам осуществления, описанным выше, являются иллюстративными и никоим образом не должны истолковываться в качестве ограничения объема правовых притязаний изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Влияние пептидов на миграцию клеточных линий рака

Протокол анализа миграции

Клетки CL1-5, клеточная линия с агрессивным метастазированием, полученная из аденокарциномы человека, культивировали в среде RPMI 1640 с 10% FBS, 37°C при 95% Кислорода/5% CO₂ до готовности для применения. Для проведения анализа миграции использовали планшеты трансвел (24-луночные, с размером пор 8 мкм; Costar, Cambridge, MA, USA). Нижние камеры планшетов трансвел наполняли 600 мкл базовой среды, содержащей 10% FBS. Клетки (1×10⁵) предварительно обрабатывали 50 или 100 мкм указанного тестируемого пептида в течение 30 мин, а затем суспендировали в 100 мкл базовой среды, содержащей 1% BSA и добавляли в верхнюю камеру, а затем клетки инкубировали при 37°C в течение 12 часов. Клетки на верхней поверхности фильтров удаляли с использованием ватных тампонов, а клетки, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров, промывали, фиксировали и окрашивали гематоксилином и подсчитывали под микроскопом. Процентное изменение миграции определяли посредством подсчета количества клеток, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров. На мембрану обсчитывали по меньшей мере 3 отдельных поля зрения микроскопа (n=4).

АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПОСОБ ТРАНСВЕЛ

Первичные клетки CL1-5 происходили из аденокарциномы рака легкого человека. Для проведения анализа миграции использовали планшеты трансвел с 24 лунками, размером пор 8 мкм (Costar, Cambridge, MA, USA). Нижние камеры планшетов трансвел наполняли 600 мкл базовой среды, содержащей 10% FBS. Клетки (1-2×10⁵) суспендировали в 100 мкл базовой среды, содержащей 1% BSA. Тестируемый пептид добавляли в верхнюю камеру в необходимой концентрация непосредственно или после предварительного инкубирования с раковыми клетками. Затем планшеты инкубировали при 37°C в течение 12 часов. Клетки на верхней поверхности фильтров удаляли с использованием ватных тампонов. Клетки, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров, промывали, фиксировали и окрашивали гематоксилином и подсчитывали под микроскопом. По меньшей мере пять отдельных полей зрения микроскопа подсчитывали на мембрану (n=3). Процентное изменение миграции определяли посредством подсчета количества клеток, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров.

Подсчет означает фактическое количество клеток, которые мигрировали в нижнюю камеру, и подсчитывали с помощью светового микроскопа при 40× увеличении, представляли в виде среднего количества клеток в 10 случайно выбранных полях для каждой обработки.

«Индекс» вычисляли посредством деления количества клеток, которые мигрировали в присутствии пептидов, на количество клеток, которые мигрировали случайно (контрольная группа). Индекс = количество контрольных клеток/количество обработанных клеток. Данный расчет может отражать степень, в которой миграция клеток была заблокирована 30 минутной предварительной обработкой MANS-связанными пептидами.

Фигура 1 показывает область подсчета клеток отрицательного контроля после времени миграции, составляющего 12 часов.

Фигура 2A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль пептида MANS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 2B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль пептида MANS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 3A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль пептида RNS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 3B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль пептида RNS с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 4A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-11002 (N-миристоил – SEQ ID NO: 106 – NH₂) с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 4B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-11002 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 5A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-10901 (N-ацетил – SEQ ID NO: 121) с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 5B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-10901 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 6A показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 50 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-91200 (N-миристоил – SEQ ID NO: 219) с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 6B показывает область подсчета клеток, полученную после предварительной обработки 100 мкмоль MANS-связанного пептида BIO-91200 с последующим временем миграции, составляющим 12 часов.

Фигура 7A показывает количества мигрировавших клеток, полученные через 12 часов после предварительной обработки 50 мкмоль пептида MANS, пептида RNS и MANS-связанных тестируемых пептидов BIO-11002 (SEQ ID NO: 6), BIO-10901 (SEQ ID NO: 121) и BIO-9120 (SEQ ID NO: 219), и контроля (без пептида). Для пептида MANS количество клеток составляло приблизительно 40; для пептида RNS количество клеток составляло приблизительно 95; для BIO-11002 (SEQ ID NO: 106) количество клеток составляло приблизительно 50); для BIO-10901 (SEQ ID NO: 121) количество клеток составляло приблизительно 60; и для BIO-91200 (SEQ ID NO: 219) количество клеток составляло приблизительно 65. Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11002, BIO-10901 и BIO-91200 продемонстрировал значительно сниженные количества мигрировавших клеток клеточной линии агрессивного NSCLC человека (CL1-5) по отношению к контролю и к пептиду RNS со случайной последовательностью.

Фигура 7B показывает количества мигрировавших клеток, полученные через 12 часов после предварительной обработки при 100 мкмоль пептида MANS, пептида RNS и MANS-связанных тестируемых пептидов BIO-11002 (SEQ ID NO: 106), BIO-10901 (SEQ ID NO: 121) и BIO-91200 (SEQ ID NO: 219), и контроля (без пептида). Для пептида MANS количество клеток составляло приблизительно 20); для пептида RNS количество клеток составляло приблизительно 90; для BIO-11002 (SEQ ID NO: 106) количество клеток составляло приблизительно 25; для BIO-10901 (SEQ ID NO: 121) количество клеток составляло приблизительно 35; и для BIO-91200 (SEQ ID NO: 219) количество клеток составляло приблизительно 40; для контроля (без пептида) количество клеток составляло приблизительно 90. Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11002, BIO-10901 и BIO-91200 продемонстрировал значительно сниженные количества мигрировавших клеток клеточной линии агрессивного NSCLC человека (CL1-5) по отношению к контролю и к пептиду RNS со случайной последовательностью.

Фигура 8A показывает индекс миграции клеток клеточных линий агрессивного NSCLC человека, в которых большее значение индекса миграции обозначает меньшую миграцию после предварительной обработки пептидом или пептидной композицией изобретения при 50 мкмоль с последующими 12 часами обработки в соответствии с протоколом. Далее приведены значения индексов миграции: контроль = 1; пептид MANS = приблизительно 2,5; пептид RNS = приблизительно 1,1; BIO-11002 = приблизительно 2,7; BIO-10901 = приблизительно 1,75; и BIO-91200 = приблизительно 1,7. Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11002, BIO-10901 и BIO-91200 продемонстрировал значительно повышенные показатели индекса миграции по отношению к контролю и к пептиду RNS.

Фигура 8B показывает индекс миграции клеток клеточных линий агрессивного NSCLC человека, в которых большее значение индекса миграции обозначает меньшую миграцию после предварительной обработки пептидом или пептидной композицией изобретения при 100 мкмоль с последующими 12 часами обработки в соответствии с протоколом. Далее приведены изображенные значения индексов миграции: контроль = 1; пептид MANS = приблизительно 4,3; пептид RNS = приблизительно 1; BIO-11002 = приблизительно 3,8; BIO-10901 = приблизительно 2,7; и BIO-91200 = приблизительно 2,4, Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11002, BIO-10901 и BIO-91200 продемонстрировал значительно повышенные показатели индекса миграции по отношению к контролю и к пептиду RNS.

Фигура 9 графически изображает расположенные рядом соответствующие количества клеток и результаты показателей индекса миграции предварительной обработки пептидом при 50 мкмоль в экспериментах с использованием клеточной линии агрессивного NSCLC человека (CL1-5). Контроль без предварительной обработки пептидом дает количество клеток приблизительно 105; а показатель индекса миграции = 1,0. Результаты после предварительная обработка пептидом MANS при 50 мкмоль с последующими 12 часами в соответствии с протоколом дают количество клеток приблизительно 45; а индекс миграции приблизительно 2,5. Результаты после предварительной обработки пептидом RNS при 50 мкмоль дают количество клеток приблизительно 90; а индекс миграции приблизительно 1,3. Результаты после предварительной обработки BIO-11000 при 50 мкмоль дает количество клеток приблизительно 70; а индекс миграции приблизительно 1,5. Результаты после предварительной обработки BIO-11006 при 50 мкмоль дают количество клеток приблизительно 50; а индекс миграции приблизительно 2. Результаты демонстрируют, что большие значения индекса миграции связаны с меньшей миграцией, а меньшая миграция связана с большими значениями индекса миграции. Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11000 и BIO-11006 продемонстрировал уменьшенные количества мигрировавших клеток и повышенные показатели индекса миграции по отношению к контролю и к пептиду RNS.

Фигура 10 графически изображает расположенные рядом соответствующие количества клеток и результаты показателей индекса миграции в течение предварительной обработки пептидом при 100 мкмоль в экспериментах с использованием клеточной линии агрессивного NSCLC человека (CL1-5). Контроль без предварительной обработки пептидом дает количество клеток приблизительно 105; а показатель индекса миграции = 1,0, Результаты после предварительной обработки пептидом MANS при 100 мкмоль с последующими 12 часами в соответствии с протоколом дает количество клеток приблизительно 35; а индекс миграции приблизительно 3,5. Результаты после предварительной обработки пептидом RNS при 100 мкмоль дает количество клеток приблизительно 95; а индекс миграции приблизительно 1,2. Результаты после предварительной обработки BIO-11000 при 100 мкмоль дают количество клеток приблизительно 50; а индекс миграции приблизительно 2,3. Результаты после предварительной обработки BIO-11006 при 100 мкмоль дают количество клеток приблизительно 50; а индекс миграции приблизительно 2,1. Результаты после предварительной обработки BIO-91200 при 100 мкмоль дает количество клеток приблизительно 55; а индекс миграции приблизительно 2,1. Результаты демонстрируют, что большие значения индекса миграции связаны с меньшей миграцией клеток, и меньшая миграция клеток связана с большими значениями индекса миграции. Каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11000, BIO-11006 и BIO-91200 продемонстрировал уменьшенные количества мигрировавших клеток и повышенные показатели индекса миграции по отношению к контролю и к пептиду RNS.

ПРИМЕР 2. Ингибирование метастазирования рака легкого с помощью пептида MANS или BIO-11006 с использованием ортотопической ксенографической модели инъекции в легкое.

Метастатическую активность раковых клеток in vivo после обработки пептидом MANS или BIO-11006 оценивали в ортотопической ксенографической модели инъекции в легкое. После предварительной обработки либо PBS, либо PBS+MANS, либо BIO-11006 (SEQ ID NO: 106), либо контрольным пептидом RNS при 100 мкм в течение 4 часов клетки PC-9 инъецировали в левую долю легкого бестимусной мыши. Спустя семь дней этих мышей подвергали системной обработке либо только PBS (Con), RNS (дополнительный контрольный пептид), MANS, либо BIO-11006 при 50 наномоль на интраперитонеальную инъекцию один раз каждые три дня. На 25 день (6 инъекций) после посева данных опухолевых клеток мышей умерщвляли и подсчитывали количество метастазированных опухолевых узлов в противоположном легком и других органах. Как показано ниже в таблице 3, обработанные MANS, RNS или BIO-11006 группы не показали отличия в среднем размере опухоли на участке инъекции по сравнению с обработанными PBS или друг с другом, предполагая, что данные обработки не влияют на онкогенез. Однако у мышей, обработанных MANS и BIO-11006, отмечалось значительное уменьшение метастатических узелков в противоположном легком и в других органах по сравнению с группами, обработанными PBS или RNS; в действительности, лечение пептидами MANS или BIO-11006 по существу полностью блокировало все метастазы от опухоли в другие участки легкого, а также в другие органы.

Таблица 3
Ингибирующее действие MARCKS-связанных пептидов на метастазирование рака in vivo Группа Размер Опухоли
(мм) № метастатических узелков в легких Метастазы (пораженных мышей/
всего мышей) Среднее ±СО Среднее ±СО
(L’t; R’t) Сердце Селезенка Кишечник Диафрагме PBS (n=3) 1,50±0,26 1,67±0,29; 5,67±0,77 1/1 2/3 1/3 2/3 RNS (n=4) 1,72±0,41 1,00±0,40; 5,75±2,01 3/4 2/4 1/4 3/4 MANS (n=4) 1,48±0,54 0;0 0/4 0/4 0/4 0/4 BIO-11006 (n=2) 1,61±0,37 0;0 0/2 0/2 0/2 0/2

Данные результаты in vivo подтверждают концепцию, что ингибирование функции MARCKS MANS-связанными пептидами может уменьшить распространение метастазов раковых клеток легкого in vivo.

ПРИМЕР 3. Влияние пептидов на миграцию раковых клеточных линий A549

Альвеолярную эпителиальную клеточную линию A549, полученную из аденокарциномы человека (инвазивную клеточную линию), получили из американской коллекции типовых культур (ATCC) и культивировали в RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, в 75 см² колбах с тканевой культурой. Клетки достигали слияния на третий день культивирования при 37°C в атмосфере из 95% воздуха и 5% CO₂ и поддерживали посредством серийного пассажа.

Тестируемые пептиды (MANS, RNS, BIO-11006, BIO-11000, BIO-11002, BIO-91200 и BIO-10901) растворяли в PBS при pH, равном 7,0; медленно перемешивая с завихрениями в течение приблизительно двух часов помогали растворяемости.

Для проведения анализа миграции использовали планшеты трансвел (24-луночные, с размером пор 8 мкм; Costar, Cambridge, MA, USA). Нижние камеры планшетов трансвел наполняли 600 мкл базовой среды, содержащей 10% FBS. Клетки (1×10⁵) суспендировали в 100 мкл базовой среды, содержащей 1% BSA, и добавляли в верхнюю камеру, и планшеты инкубировали при 37°C с 5% CO₂ в течение 12 часов в PBS (контроль), или указанные тестируемые пептиды при 10, 25 или 50 мкм. Клетки на верхней поверхности фильтров удаляли с использованием ватных тампонов. Клетки, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров, промывали, фиксировали и окрашивали гематоксилином и подсчитывали под микроскопом. Процентное изменение миграции определяли посредством подсчета количества клеток, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров. По меньшей мере четыре отдельных поля зрения микроскопа подсчитывали на мембрану, всего с тремя параллельными экспериментами для каждой концентрации. Для анализа данных использовали статистическое программное обеспечение «Prizm».

Как показано на фигуре 11, лечение каждым из тестируемых пептидов привело к уменьшенному количеству клеток после обработки относительно контроля (без пептида) или пептида RNS. При 50 мкм, каждый из MANS-связанных пептидов MANS, BIO-11006, BIO-11000, BIO-11002, BIO-91200 и BIO-10901 продемонстрировал уменьшенные количества мигрировавших клеток и повышенные показатели индекса миграции по отношению к контролю и к пептиду RNS. В меньших концентрациях действие нескольких MANS-связанных пептидов значительно различалось даже по сравнению с пептидом MANS. В частности, при 25 мкм, лечение BIO-11006, BIO-11002 или BIO-91200 приводило к значительно сниженным количествам клеток по сравнению с контролем (без пептида) или с контрольным пептидом RNS, а также по сравнению с пептидом MANS (Фигура 11).

Взятые вместе, результаты исследований показали, что MANS-связанные пептиды могут блокировать миграцию клеточных линий агрессивного рака, и что несколько различных MANS-связанных пептидов продемонстрировали воздействие на миграцию по меньшей мере трех различных клеточных линий рака. Результаты исследований также показали, что по меньшей мере два различных MANS-связанных пептида были способны блокировать или ингибировать метастазирование раковых клеток, инъецированных млекопитающим (т.е. мышам).

ПРИМЕР 4. Воздействия пептида BIO-11006 на имплантацию рака легкого

В данном исследовании оценивали ингибирование метастазирования рака легкого с помощью пептида BIO-11006 в ортотопической модели имплантации рака легкого у мышей SCID. Клетки аденокарциномы человека (PC-9) (1-2×10⁵) суспендировали в 40 мкл PBS, pH 7,4, содержащей 0,5 мг/мл Matrigel™ (BD Bioscience), и инъецировали в левое легкое мышей SCID (n=3) с использованием шприца с иглой 29 калибра. BIO-11006 (100 мкм, в PBS) вводили либо (a) посредством интроперитонеальной инъекции (50 мкл) ежедневно в течение 22 дней, начиная с 3 дня после инокуляции раковых клеток, либо (b) посредством аэрозольной ингаляции с применением Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab) в течение 30 мин ежедневно в течение 22 дней, начиная с 3 дня после инокуляции раковых клеток. Результаты исследования отображены на фигуре 12, которая графически изображает среднее количество опухолей в правом легком, сердце и диафрагме в качестве функции пути введения тестируемого соединения (интроперитонеальная инъекция против ингаляции). Как интроперитонеальная, так и аэрозольное введение BIO-11006 понижало метастазирование раковых клеток более чем на 50% в правом легком и сердце и на 100% в диафрагме. Таким образом, оба пути введения имели значительное ингибирующее действие на метастазирование раковых клеток.

ПРИМЕР 5. Ингибирование метастазирования рака легкого

В данном исследовании ингибирование метастазирования рака легкого посредством BIO-11006 исследовали в ортотопической модели ималнтации рака легкого у мышей SCID. Клетки аденокарциномы человека (PC-9) (1-2×10⁵) суспендировали в 40 мкл PBS, содержащего 0,5 мг/мл Matrigel™ (BD Bioscience) и инъецировали в левое легкое мышей SCID (n=3) с использованием иглы 29 калибра. BIO-11006 вводили, начиная либо с 4 дней, либо 15 дней после инокуляции раковых клеток посредством аэрозоля с использованием 100 мкм раствора в PBS с помощью Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab) в течение 30 мин ежедневно в течение 25 дней после инокуляции раковых клеток. В конце эксперимента мышей умерщвляли и собирали ткани легких, сердца и диафрагмы и измеряли количество опухолевых узлов в каждой ткани. Результаты данного эксперимента графически представлены на фигурах 13 и 14. Фигура 13 демонстрирует, что, когда лечение начинали через 4 дня после инокуляции раковых клеток, метастазирование опухоли ингибировалось на 60-90% в левом легком, сердце и диафрагме, и на 100% в правом легком. Когда лечение инициировали через 15 дней после инокуляции раковых клеток, ингибирование метастазирования опухоли в легких, сердце и диафрагме составляло приблизительно 50%. Фигура 14 отображает общее количество опухолевых узлов, обнаруженных во всех тканях, когда лечение пептидом начинали через 15 дней после инокуляции раковых клеток или 4 дней после инокуляции раковых клеток. Как показано на фигуре 14, лечение пептидом, начиная с 15 дней после инокуляции раковых клеток, привело к уменьшению опухолевых узлов, а лечение пептидом, начиная с 4 дней после инокуляции, привело даже к дополнительному уменьшению опухолевых узлов.

ПРИМЕР 6. Антиметастатическая эффективность пептидов

Данный пример демонстрирует антиметастатическую эффективность тестируемого соединения изобретения у мышей SCID, имеющих клетки аденокарциномы легких человека. Самок мышей Mus musculus NOD.CB17-Prkdcscid/NCrHsd (Harlan, Netherlands), посаженных в отдельно вентилируемые камеры, рандомизировали на шесть групп по восемь мышей в каждой. Клетки A549 (2,5×10⁶) инъецировали мышам через хвостовую вену. Контрольная группа получала аэрозольный носитель PBS; тогда как группы 2 и 3 получали аэрозольное тестируемое соединение BIO-11006 либо от -1 дня перед инъекцией раковых клеток (группа 2), либо от +3 дня после инъекции раковых клеток (группа 3) через день в течение 7 недель через небулайзер (Aeroneb Lab). Группы 4 и 5 получали аэрозольное тестируемое соединение пептида MANS либо от -1 дня перед инъекцией клеточной линии рака (группа 4), либо от +3 дней после инъекции клеточной линии (группа 5) через день в течение 7 недель через небулайзер (Aeroneb Lab). Для аэрозольной доставки готовили раствор каждого тестируемого соединения (100 мкм) в PBS, pH 7,0. Для каждой обработки 5 мл раствора тестируемого соединения распыляли в виде аэрозоля в течение 30 минут в камеру, содержащую четыре мыши одновременно. Мониторинг массы тела мышей проводили через день в течение 7 недель.

Одна группа мышей (n=7) служила в качестве здоровой контрольной группы. Это были необработанные мыши, ранее не подвергавшиеся экспериментам, используемые для проведения мониторинга состояния здоровья мышей во время периода исследования. Все животные из всех групп были умерщвлены на 53 день. Результаты предоставлены в таблице 4 и фигуре 15. Фигура 15 сравнивает количество метастатических узелков в легких после соответствующего введения BIO-11006 и пептида MANS на 53 день после инъекции клеток A549. Таблица 4 демонстрирует количество метастатических узелков в легких, а также количество животных с фокальными опухолевыми узлами и/или отдаленных метастазов. В общем, тестируемые пептиды продемонстрировали значительное ингибирование метастазирования опухоли (70-80%) у животных при введении им BIO-11006 или пептида MANS, начиная с дня -1 или дня +3 относительно инъекции клеток A549 (Фигура 15). Более того, количество метастатических узелков у обработанных мышей было значительно снижено относительно реципиентов контрольной среды, и ни одна из обработанных мышей не продемонстрировала достоверные отдаленные метастазы (Таблица 4). Имелось несколько фокальных опухолевых узлов у 7/8 мышей, обработанных пептидом BIO-11006, начиная либо с дня -1, либо дня +3 по отношению к инъекции клеток A549.

Таблица 4
Метастатические узлы и отдаленные метастазы у мышей, обработанных BIO-11006 или MANS Группа № метастатических узелков в легких
Среднее ± SEM Примечания Контроль средой 97±21 Мультифокальные опухолевые узлы у всех животных (8/8)
Достоверность отдаленных метастазов в диафрагме и грудине(2/8) Пептид BIO-11006
(группа обработки
день -1) 34±14 Несколько фокальных опухолевых узлов у 7/8 животных
Нет отдаленных метастазов

Пептид BIO-11006
(группа обработки
день +3) 21±6 Несколько фокальных опухолевых узлов у 7/8 животных
Нет отдаленных метастазов Пептид MANS
(группа обработки
день -1) 22±7 Несколько фокальных опухолевых узлов у 4/8 животных
Нет отдаленных метастазов Пептид MANS
(группа обработки
день +3) 13±4 Несколько фокальных опухолевых узлов у 7/8 животных
Нет отдаленных метастазов

ПРИМЕР 7. Антиметастатическая активность MANS-связанных пептидов при меланоме у мышей

В данном исследовании определяли относительную антиметастатическую активность MANS-связанных пептидов, вводимых посредством четырех различных путей введения, с применением сингенной мышиной модели. Клетки клеточной линии меланомы мышей B16F10 2×10⁶ в 200 мкл суспензии клеток в среде DMEM инъецировали в подушечки лап или между кожей и хрящом на задней стороне уха либо с помощью внутривенной, внутримышечной, либо интраперитонеальной инъекции.

Через два дня после инокуляции клеток животных рандомизировали и разделили на группы, состоящие из n=10 в каждой группе. Животным в различных группах вводили MANS-связанный пептид посредством интраперитонеального (ip), внутривенного (iv) или внутримышечного (im) способа введения соответственно в дозе, составляющей приблизительно 6,25 мг/кг. В некоторых группах животных обрабатывали посредством ингаляционного пути введения (5 мл 0,1 мМ MANS-связанного пептида в PBS) с применением профилактического небулайзера (Aeroneb Lab; Aerogen). Одна группа мышей служила в качестве контрольной группы, получающей среду, и ее обрабатывали PBS посредством im способа введения. Пептиды вводили через день в течение 6 недель.

Еженедельно делали бальную оценку опухоли. После 6 недель лечения всех животных гуманно умертвили, а образцы лимфатических узлов & других тканей собрали, зафиксировали в формалине и подвергли патогистологическому анализу для оценки присутствия метастатических меланомных клеток. Клинические неблагоприятные признаки и симптомы оценивали в течение 6 недель периода введения. Опухолевую массу и летальность оценивали в конце периода исследования. Результаты исследования покажут, что MANS-связанные пептиды ингибируют метастазирование опухоли в модели меланомы мышей.

ПРИМЕР 8: siRNA нокдаун MARCKS в раковых клетках

Данное исследование провели, чтобы определить действие нокдауна siRNA экспрессии MARCKS на миграцию раковых клеток. Клетки рака легких человека PC-9 или A-549 засеяли в пластиковые лунки и культивировали, пока клетки не достигали 70% слияния. Затем клетки транфицировали 100 нМ MARCKS siRNA или контрольной siRNA (100 нМ) от Ambion (Austin, TX) посредством применения реагента DharmaFECT DuoTransfection (Dharmacon, Lafayette, CO). После 72 часов клетки собирали и отделяли эквивалентные количества белков посредством SDS/PAGE для иммуноблот-анализа с использованием MARKS-специфических антител. Вестерн-блоттинг выполняли для подтверждения siRNA-индуцированной угнетающей регуляции эндогенного MARCKS. Как показано на фигурах 16 и 17, активность белка MARCKS была изменена приблизительно на 60% в клетках PC9 (Фигура 16) и приблизительно на 50% в клетках A549 (Фигура 17) по сравнению с клетками, обработанными контрольной siRNA.

Действие нокдауна MARCKS посредством siRNA на миграцию клеток определяли с использованием трансвел анализа. После siRNA нокдауна клетки PC-9 или A549 культивировали в среде RPMI 1640 с 10% FBS при 37°C, с 5% CO₂. Для анализа миграции использовали Трансвел® планшеты (24-луночные, размер пор 8 мкм). Нижние камеры содержали 600 мкл базовой среды+10% FBS. Клетки (1×10⁵) суспендировали в 100 мкл базовой среды+1% BSA и добавляли в верхнюю камеру; планшеты инкубировали в течение 12 часов. Клетки, которые мигрировали в нижнюю поверхность фильтров, окрашивали гематоксилином и подсчитывали. На мембрану обсчитывали по меньшей мере 3 отдельных поля зрения микроскопа.

Результаты исследования показаны на Фигурах 18 и 19. Обработка MARCKS siRNA в значительной степени ингибировало миграцию как клеток PC-9, так и A549. siRNA нокдаун MARCKS привел к 90%-ному уменьшению миграции клеток для клеточной линии PC9 (Фигура 18) и привело приблизительно к 50%-ному умньшению миграции клеток для клеточной линии A549 (Фигура 19). Вследствие этого ингибирование экспрессии MARCKS приводит к значительному уменьшению миграции раковых клеток.

ПРИМЕР 9. Ингибирование microRNA21 повышает MARCKS и усиливает миграцию раковых клеток

MicroRNA21 (miR21) регулирует уровни MARCKS в клетках. В данных исследованиях PC9 клетки рака легких человека трансфицировали 50 нМ или 100 нМ ингибитора miR21 или имитатора mir21 или отрицательным контролем только со средой. Уровни MARCKS измеряли через 48 часов посредством вестерн-блоттинга. Лечение ингибитором miR21 (50 нМ) повышало уровни MARCKS в клетках в ~2,5 раза (Фигура 20). Данные значения коррелируют со способностью к миграции клеток при помещении в миграционные камеры в течение 12-часового периода. Клетки, обработанные 50 или 100 нМ ингибитора miR21, показали улучшенную миграцию, коррелирующую с повышенными уровнями MARCKS, тогда как клетки, обработанные имитатором miR21, показали уменьшенную миграцию, коррелирующую с уменьшенными уровнями MARCKS (Фигура 21). Клетки, обработанные контрольной средой HiPerfect, продемонстрировали такой же уровень миграции по отношению к необработанным клеткам PC9 (Фигура 21). Результаты исследования показали, что повышение экспрессии MARCKS через ингибирование miR21 повышает миграцию раковых клеток. Более того, активация miR21 привела к уменьшению миграции клеток PC9.

Взятые вместе, исследования показали, что миграция раковых клеток и метастазирование раковых клеток могут быть ингибированы посредством выделения MARCKS с использованием нескольких различных средств ингибирования MARCKS, включая MANS-связанные пептиды и ингибиторы microRNA, т.е., имитатор miR21.

Eсли не определено иное, все технические и научные термины в данном документе имеют такие же значения, которые обычно понимаются квалифицированным специалистом в области, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то, что в практике или тестировании настоящего изобретения могут использоваться любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные способам и материалам, описанным в данном документе, здесь описаны предпочтительные способы и материалы. Все публикации, процитированные в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки с целью раскрытия и описания конкретных аспектов изобретения, для которых цитируется публикация.

Несмотря на то, что изобретение описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, должно быть понятно, что оно допускает дополнительные модификации, и данная заявка предназначена охватывать любые варианты, способы применения и адаптации изобретения, в целом следующие принципам изобретения, и в том числе такие отклонения от представленного раскрытия, которые попадают в пределы известной или общепринятой практики в области техники, к которой относится изобретение, и которые могут быть применимы к существенным признакам, изложенным ранее, и как следует в объеме правовых притязаний приложенной формулы изобретения.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для ингибирования метастазирования раковых клеток у нуждающегося в этом больного. Для этого осуществляют введение в раковые клетки ингибирующего метастазирование количества лекарственной формы пептида, выбранного из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 106, 121 и 219, где N-концевая и/или С-концевая аминокислота пептидной последовательности может быть химически модифицированной. Также предложен способ лечения рака. Группа изобретений обеспечивает профилактику и лечение рака у пациента путем ингибирования метастазирования раковых клеток. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 4 таб., 21 ил., 9 пр.

1. Способ ингибирования метастазирования раковых клеток, включающий введение в раковые клетки ингибирующего метастазирование количества лекарственной формы пептида, выбранного из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 106, 121 и 219; где N-концевая и/или С-концевая аминокислота пептидной последовательности необязательно химически модифицирована.

2. Способ лечения рака у нуждающегося в этом больного, при этом способ включает введение терапевтически эффективного количества пептида, выбранного из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 106, 121 и 219; где N-концевая и/или С-концевая аминокислота пептидной последовательности необязательно химически модифицирована.

3. Способ по п.2, где способ лечения или профилактики рака включает в себя лечение, предотвращение или ингибирование метастазов, пролиферации раковых клеток, роста опухоли или ангиогенеза.

4. Способ по п.1 или 2, где N-концевая аминокислота пептида химически модифицирована посредством ацилирования N-концевой аминокислоты пептида в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида C2 (ацетил)-C24 алифатической карбоновой кислоты, которая может быть линейной, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной,

амида трифторуксусной кислоты,

амида бензойной кислоты и

амида C1-C24-алифатической алкилсульфоновой кислоты; или

N-концевая аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида может быть алкилирована группой, выбранной из группы, состоящей из:

С1-С24-алифатической алкильной группы,

линейной 2-(С1-С24-алифатической алкильной)оксиэтильной группы,

омега-метокси-поли(этиленокси)n-этильной группы, где n составляет от 0 до 10.

5. Способ по п.4, где N-концевой амид выбран из группы, состоящей из ацетила и миристоила.

6. Способ по п.1 или 2, где пептид включает в себя замещение d-конфигурации аминокислот.

7. Способ по п.1 или 2, где С-концевая аминокислота пептида является химически модифицированной посредством образования амида в С-концевой группе карбоновой кислоты С-концевой аминокислоты пептида в форме амида, выбранного из группы, состоящей из:

амида аммиака,

амида C1-C24 алифатического алкильного амина,

амида гидроксилзамещенного С2-С24 алифатического алкильного амина,

амида линейной 2-(С1-С24 алифатической алкильной) оксиэтиламиногруппы и

амида омега-метокси-поли(этиленокси)n-этиламиногруппы, где n составляет от 0 до 10.

8. Способ по п.1 или 2, где пептид выбран из группы, состоящей из N-ацетил-GAQFSKTAAK-OH (SEQ ID NO: 106), N-миристоил-GAQFSKTAAK-OH (SEQ ID NO: 106), N-миристоил-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 106), N-ацетил-RGAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 234), N-ацетил-GAQFSKTAA-OH (SEQ ID NO: 121) и N-миристоил-AKGE-OH (SEQ ID NO: 219) и их комбинации.

9. Способ по п.8, где пептид представляет собой N-миристоил-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106) или N-ацетил-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106).

10. Способ по п.1 или 2, где пептид вводят в дозе от 0,01 мг/кг/день до 10 мг/кг/день.

11. Способ по п.10, где пептид вводят в дозе от 0,5 мг/кг/день до 2,5 мг/кг/день.

12. Способ по п.1 или 2, в котором введение происходит посредством ингаляции лекарственной формы пептида в виде жидкого раствора или суспензии или посредством ингаляции сухой порошкообразной композиции пептида.

13. Способ по п.1 или 2, где введение осуществляют посредством инъекции жидкой композиции пептида.

14. Способ по п.1 или 2, где пептид вводят субъекту посредством внутривенной, внутримышечной или интраперитонеальной инъекции или посредством перорального введения или посредством введения с помощью суппозиториев.

15. Способ по п.14, где инъекцию производят в опухоль, содержащую раковые клетки.

16. Способ по п.15, где опухоль представляет собой солидную опухоль.

17. Способ по п.15, где опухоль представляет собой несолидную опухоль.

18. Способ по п.14, где инъекция является системной.

19. Способ по п.1 или 2, где способ дополнительно включает введение дополнительного лекарственного средства, пригодного для лечения рака.