Применение пептида His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro для профилактики дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе Российский патент 2022 года по МПК A61K38/08 C07K7/06 A61P1/14 A61P25/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, патофизиологии, фармакологии, и может быть использовано для профилактики дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.

Изучение кишечной микробиоты и ее роли в норме и патологии является одним из основных направлений научных исследований в медицине. Развивающиеся или уже имеющиеся нарушения микробиоты приводят к увеличению частоты и тяжести острых инфекционных заболеваний, их торпидному течению и переходу воспалительных процессов в хроническую форму. Микрофлора организма человека выполняет многообразные функции по поддержанию гомеостаза [Воробьев А.А. Дисбактериозы актуальная проблема медицины / А.А. Воробьев, Н.А. Абрамов, В.М. Бондаренко, Б.А. Шендеров // Вестн. РАМН. - 1997. - 3. - С. 4-7. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека. // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - 1. - С. 61-65].

Одним из наиболее значимых этиологических факторов дисбиоза является стресс. В общебиологическом плане стресс является неспецифической психофизиологической реакцией организма на воздействие любых экстремальных факторов физической, биологической и психогенной природы, к числу которых относится и хроническая иммобилизация. Гиподинамия и гипокинезия относятся к актуальным проблемам современной биологии и медицины, что обусловлено рядом физических, физиологических и социальных причин (снижение нагрузки на опорно-двигательный аппарат, пребывание в помещениях малого объема, информационные перегрузки, малоподвижный образ жизни и др.) Кроме того, лечение ряда заболеваний требует соблюдения постельного режима, который ограничивает двигательную активность пациентов. Также длительное ограничение подвижности происходит при травматических повреждениях.

При чрезмерно выраженном или продолжительном воздействии стрессорных факторов происходит перегрузка адаптационных возможностей, что приводит к возникновению стресс-индуцированных заболеваний [Воробьева Е. Эпидемиология неинфекционных заболеваний: задачи на современном этапе / Е. Воробьева, С. Бабанов, И. Агаркова // Профилактическая медицина. - 2002. - 3. - С. 12-14].

Известно, что стресс приводит к альтерациям кишечной микробиоты со снижением уровня полезной составляющей. Например, при частичном снижении или полном отсутствии бактерий Bifidobacterium spp. происходит угнетение иммунитета, нарушаются процессы пищеварения и всасывания в кишечнике, а также всех видов обмена и витаминсинтезирующей функции кишечной микрофлоры. Повышается воздействие факультативной (условно-патогенной) микробиоты, которая отличается от облигатной обменом веществ и многими физиологическими функциями [de Lartigue G. Vagal afferent neurons in high fat diet-induced obesity; intestinal microflora, gut inflammation and cholecystokinin / G. de Lartigue, C.B. de La Serre, H.E. Raybould // Physiol. Behav. - 2011. - 105. - P. 100-105]. Данные нарушения способствуют развитию воспалительной реакции в стенке кишки и нарушению функционирования ЦНС через изменения в импульсации с рецепторов блуждающего нерва и/или спинномозгового нервного пути, что приводит к развитию или обострению психических расстройств [Communication between gastrointestinal bacteria and the nervous system / Bravo J.A., Julio-Pieper M., Forsythe P. et al. // Curr. Opin. Pharmacol. - 2012. - 12. - P. 667-672]. Поэтому высоко актуальным вопросом представляется профилактика дисбиотических расстройств при хроническом стрессе.

В настоящее время их коррекция проводится в соответствии с Отраслевым стандартом [Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». Москва, 2003]. Однако применение пробиотиков не обеспечивает необходимый терапевтический эффект для профилактики или коррекции дисбактериозов, что во многом обусловлено «чужеродностью» для микроорганизмов конкретного человека [Сателлитный симпозиум. Коррекция и профилактика дисбактериоза. Новые подходы терапии заболеваний желудочно-кишечной системы. Под ред. Н.А. Токаревой. Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. 2011. - №3. - С. 77-84. Дармов И.В. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский и др. // Эксперимент. и клин. гастроэнтерол. - 2011. - 3. - С. 6-11. Дармов И.В. Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, А.С. Ердякова и др. // Эксперимент. и клин. гастроэнтерол. - 2011. - 9. - С. 96-101]. При этом иммунитет биопленки практически элиминирует действие пробиотиков.

Таким образом, пробиотики уступают в своей эффективности пребиотикам и метабиотикам, которые не содержат микроорганизмы и лишены вышеотмеченного отрицательного действия.

Прототипом изобретения является способ коррекции дисбиоза, вызванного иммобилизационным стрессом, с использованием экзополисахаридов молочнокислых бактерий - лаксаранов 1596, 1936 и Z [Правдивцева, М.И. Влияние экзополисахаридов лактобацилл на микрофлору толстого отдела кишечника самок крыс при различных видах стресса / М.И. Правдивцева, Л.В. Карпунина, М.Д. Сметанина // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. - 2011. - Т. 11. - № 2. - С. 89-94].

Недостатками данного метода являются недостаточная изученность биологической роли бактериальных экзополисахаридов в макроорганизме, отсутствие влияния на содержание стафилококков и кишечных палочек, а также отсутствие данных о воздействии данных препаратов на состав условно-патогенных представителей кишечного микробиоценоза.

При этом представляет интерес одновременное воздействие препаратов для коррекции стресс-индуцированного дисбиоза на состояние микробиоценоза кишечника и купирование стресса.

До настоящего времени наиболее распространенными средствами лечения тревожных и стресс-ассоциированных расстройств остаются бензодиазепины, эффекты которых осуществляются путей воздействия на сайт связывания бензодиазепина GABA-рецептора. Несмотря на значительный терапевтический потенциал данных соединений, ограничением их применения являются нежелательные побочные эффекты на нервную систему, таких как седация, привыкание и пр. [Вальдман А.В. Модулирующее действие коротких пептидов на моноаминергические процессы мозга как основа их психотропного эффекта // Вопр. мед. хим. - 1984. - 30. - С. 36-63].

Однако в последнее время особый интерес представляют разработанные на основе регуляторных пептидов молекулы, обладающих анксиолитическим эффектом, в частности, His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro. Известно, что регуляторные пептиды обладают широким спектром биологических эффектов, имеющих важное значение в координации функций организма благодаря нейроэндокринным, иммунологическим, клеточным и молекулярным взаимодействиям [Зозуля А.А., Кост Н.В., Соколов О.Ю. и др. Эффективность и значимость регуляторных пептидов возрастает при воздействии негативных факторов окружающей среды. Ашмарин И.П., Стукалов П.В., Ещенко Н.Д. Биохимия мозга. - СПб: Изд-во С.-Петербургского университета, 1999. - 325 с.].

Важными достоинствами препаратов на основе регуляторных пептидов являются отсутствие токсичности и аллергенных свойств.

His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro - гептапептид, являющийся структурной комбинацией участка адренокортикотропного гомона от шестого до девятого аминокислотного остатков (АКТГ_6-9) и глипролина Pro-Gly-Pro (PGP). АКТГ_6-9 - это N-концевой аналог адренокортикотропного гормона, не имеющий гормональной активности, но сохраняющий свойства регуляторного пептида. Глипролин при присоединении к пептидам с С-конца повышает устойчивость молекулы к действию эндопептидаз.

Показано, что His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro ноотропную и проявляет анксиолитическую активность [Ноотропные и анксиолитические эффекты гептапептида АКТГ6-9Pro-Gly-Pro / Н.Г. Левицкая, Н.Ю. Глазова, Е.А. Себенцова и др. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2019. - Т. 105. - № 6. - С. 761-770].

Также введение His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro вызывало выраженное снижение температурной болевой чувствительности с участием супраспинальных механизмов [Изменение температурной болевой чувствительности у крыс после введения N-концевых аналогов адренокортикотропного гормона / С.А. Додонова, И.И. Бобынцев, А.Е. Белых и др. // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2019. - № 6. - С. 35-39], оказывало выраженное стимулирующее влияние на процесс консолидации условного рефлекса [ACTH_6-9-PGP improves memory consolidation processes in rats / S.A. Dodonova, I. I. Bobyntsev, A.E. Belykh, A.O. Vorvul' // Research Results in Pharmacology. - 2021. - Vol. 7. - No 1. - P. 27-32].

При этом литературе отсутствуют данные об использовании пептида His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro для профилактики дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе. Данное исследование было проведено впервые.

Технический результат изобретения: применение пептида His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro для профилактики дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.

Технический результат изобретения достигается путем применения пептида His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro для профилактики дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.

Химическая формула данного пептида известна. В работе использован препарат, синтезированный в Институте молекулярной генетики НИЦ «Курчатовский институт». Растворенный в физиологическом растворе пептид вводят экспериментальным животным (крысам) парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 500 мкг/кг массы тела за 15 минут до начала формирования иммобилизационного стресса.

Пример конкретного выполнения

Экспериментальные животные (крысы Вистар) массой 290-320 г были разделены на две группы по 11 особей в каждой. Первая группа представлена животными, которым вводили физиологический раствор и моделировали иммобилизационный стресс, животным второй группы вводили His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro и моделировали иммобилизационный стресс. Животные содержались в помещении при температуре воздуха 22-24°С, световом режиме 12 часов - свет, 12 часов - темнота и получали стандартный гранулированный корм и воду в свободном доступе в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», принципами 3R, изложенными в рекомендациях ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments, 2010). На момент выполнения эксперимента все животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования не выявлено.

Пептид His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro растворяли в физиологическом растворе и вводили экспериментальным животным парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 500 мкг/кг массы тела за 15 минут до начала стрессорного воздействия в объеме из расчета 1 мл на 1 кг массы тела. Контрольным животным вводили эквивалентные объемы физиологического раствора.

Хронический иммобилизационный стресс моделировали помещением крыс в индивидуальные тесные пластиковые боксы с отверстиями для вентиляции ежедневно на 2 часа в течение 14 дней. По истечении указанного срока животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом обескровливанием путем забора крови из правого желудочка сердца.

Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей проводили по методике Л.И. Кафарской и В.М. Коршунова [Богданова, Е.А. Исследование пристеночной микрофлоры желудочно-кишечного тракта крыс при пероральном введении пробиотических препаратов / Е.А. Богданова, Ю.В. Несвижский, А.А. Воробьев // Вестн. РАМН. - 2006. - 2. - С. 6-10]. Биоптаты слизистой оболочки толстого кишечника освобождали от химуса и взвешивали в асептических условиях. После этого материал помещали в стерильный раствор фосфатного буфера в соотношении 1:10 и выдерживали в нем 2 часа для разжижения муцина.

Из подготовленных образцов кишечника готовили разведения материала до концентраций 10^-2-10^-4. По 0,1 мл каждого разведения взвесей засевали газоном на поверхность питательных сред (Эндо, Сабуро, SSA-агар, ЦПХ-агар, желточно-солевой агар, висмут-сульфит агар, лактоагар MRS, бифидоагар) и инкубировали при температуре 37°С в аэробных и анаэробных условиях.

Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью масс-спектрометра Maldi Biotyper Bruker (Германия). Количество микроорганизмов в 1 грамме материала рассчитывали исходя из числа выросших колоний микроорганизмов - колониеобразующих единиц (КОЕ) при посеве из максимального разведения, где отмечался рост не менее 10 колоний, учитывая при этом объем посевного материала. Для расчета использовали формулу: К=Е/(к*v*n), где К - колониеобразующая единица, Е - общее количество бактерий, к - количество внесенного материала, v - количество чашек Петри, n - разведение. Удельное содержание микроорганизмов вычисляли как количество микроорганизмов, выделенных из биопроб, и выражали в lgKOE/г массы биологического материала.

Статистическую обработку полученных данных проводили в программной среде вычислений R. Гипотезу о нормальности распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка, равенстве дисперсий - критерия Левене. Для сравнения двух групп использовался t-критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при p<0,05.

Таблица 1. Количественный состав пристеночной микрофлоры кишечника крыс после введения пептида His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro в дозе 500 мкг/кг

Выделенные микроорганизмы Количество микроорганизмов, lgKOE/г (M±m) Группы животных Контроль (введение физиологического раствора стрессированным животным) Введение His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro в дозе 500 мкг/кг стрессированным животным Lactobacillus spp. 8,04±0,58 10,92±0,93* Bifidobacterium spp. 8,46±0,65 11,34±1,08* E.coli с нормальной ферментативной активностью 3,63±0,33 5,05±0,59* E.coli со сниженной ферментативной активностью 1,08±0,38 2,67±0,54* Enterobacter spp. 2,09±0,55 0,46±0,31* Citrobacter spp. 1,66±0,50 0** Proteus spp. 2,55±0,45 1,09±0,47* Klebsiella spp. 2,78±0,47 2,56±0,54 Morganella spp. 1,63±0,42 0,37±0,25* Acinetobacter spp. 1,38±0,38 0,18±0,18* Enterococcus spp. 1,18±0,42 2,42±0,4* Staphylococcus (коагулазоотрицательные) 4,31±0,30 3,21±0,37* Staphylococcus aureus 1,8±0,45 0,71±0,37 Candida spp. 2,96±0,39 1,43±0,41**

Примечание: * - р≤0,05 по сравнению с контрольной группой,

** - р≤0,01 по сравнению с контрольной группой.

При применении пептида His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro содержание таких облигатных представителей микробиоценоза, как лактобактерии и бифидобактерии было в 1,4 раза больше, чем в контрольной группе, при этом lgKOE/г для лактобактерий составил 10,92±0,93 (против 8,04±0,58 в контроле), а для бифидобактерий - 11,34±1,08 (против 8,46±0,65 в контроле).

Число кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью было в 1,4 раза больше, чем в контрольной группе и составило 5,05±0,59 lgKOE/г. При этом отмечалось снижение количества других грамотрицательных микроорганизмов. Так, содержание энтеробактеров уменьшилось с 2,09±0,55 до 0,46±0,31 lgKOE/г (в 4,5 раза), протеев - с 2,55±0,45 до 1,09±0,47 lgKOE/г (в 2,3 раза), морганелл - с 1,63±0,42 до 0,37±0,25 lgKOE/г (в 2,3 раза), ацинетобактеров - с 1,38±0,38 до 0,18±0,18 lgKOE/г (в 7,7 раза). Бактерии рода Citrobacter, встречавшиеся в контроле в количестве 1,66±0,50 lgKOE/г, отсутствовали в опытной группе. При этом содержание энтерококков было в 2,1 раза больше и составило 2,42±0,4 lgKOE/г.

Отмечалось снижение роста коагкулазоотрицательных стафилокков при введении пептида His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro в дозе 500 мкг/кг стрессированным животным в 1,3 раза до 3,21±0,37 lgKOE/г. Однако не выявлено значимого различия между значениями определяемого показателя для золотистого стафилококка.

Таким образом, результаты проведенных экспериментальных исследований показывают, что использование пептида His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro в дозе 500 мкг/кг вызывает выраженный эффект для профилактики дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе, приводя к увеличению количества облигатных представителей кишечной микробиоты и уменьшению содержания условно-патогенных микроорганизмов. Данный способ основан на применении регуляторного пептида, относящегося к классу биологически активных веществ, обладающих выраженным модуляторным эффектом и полифункциональностью, является патогенетически обоснованным, не трудоемкий и не требует использования сложного оборудования.

Изобретение относится к применению пептида His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro для профилактики дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе. Пептид His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro растворяли в физиологическом растворе и вводили экспериментальным животным (крысам) парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 500 мкг/кг массы тела за 15 минут до начала стрессорного воздействия в объеме из расчета 1 мл на 1 кг массы тела. Изобретение обеспечивает повышение эффективности профилактики дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе. 1 табл., 1 пр.

Применение пептида His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro для профилактики дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.