Усовершенствованный амплификатор Российский патент 2019 года по МПК C12M1/10 C12M1/34 C12Q1/68 B01L7/00 G01N1/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному амплификатору и описано ниже со ссылкой на это применение. В частности, в настоящем документе приведено описание усовершенствованного амплификатора для применения при проведении реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Тем не менее, следует понимать, что изобретение не ограничивается этой конкретной областью применения.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Последующее обсуждение предшествующего уровня техники приведено, чтобы придать изобретению надлежащий технический контекст и обеспечить более полное понимание его преимуществ. Следует иметь в виду, однако, что любое обсуждение предшествующего уровня техники во всем описании не следует рассматривать в качестве явного или неявного признания того, что такой известный уровень техники широко известен или составляет часть общеизвестных знаний в данной области.

Системы, которые требуют нескольких или циклических химических реакций для получения желаемого продукта, часто требуют тщательного управления температурой, а также воспроизводимое и точное управление временем, в течение которого реакция поддерживается при заданной температуре. Такие реакции включают, например, реакции амплификации нуклеиновых кислот, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и лигазная цепная реакция (ЛЦР).

ПЦР представляет собой метод с участием нескольких циклов, которые приводят к геометрической амплификации определенных полинуклеотидных последовательностей каждый раз, когда цикл завершается. Метод ПЦР хорошо известен и описан во многих книгах, в том числе, «ПЦР: Практический подход», МакФерсон и др., IRL Press (1991), «Протоколы ПЦР: Руководство по методам и приложениям», Иннис и др, Academic Press (1990), и «ПЦР-технологии: Принципы и приложения для амплификации ДНК», Х.А. Эрлих, Stockton Press (1989). Метод ПЦР также описан во многих патентах США, в том числе в патентах США №4683195, №4683202, №4800159, №4965188, №4889818, №5075216, №5079352, №5104792. №5023171, №5091310 и №5066584. Содержание этих документов включено в настоящее описание во всей их полноте посредством ссылки.

Предложенный метод ПЦР, как правило, включает стадию денатурации полинуклеотида, с последующей стадией отжига по меньшей мере пары олигонуклеотидных праймеров с денатурированным полинуклеотидом, т.е. гибридизацию праймера с денатурированной полинуклеотидной матрицей. После стадии отжига фермент с полимеразной активностью катализирует синтез новой полинуклеотидной цепи, которая включает олигонуклеотидный праймер и использует исходный денатурированный полинуклеотид в качестве матрицы синтеза. Эта последовательность этапов (денатурация, отжиг праймера и достройка праймера) образует цикл ПЦР.

Поскольку циклы повторяются, количество вновь синтезированного полинуклеотида увеличивается в геометрической прогрессии, так как вновь синтезированные полинуклеотиды более раннего цикла могут служить в качестве матриц для синтеза в последующих циклах. Олигонуклеотидные праймеры обычно выбирают парами, которые могут гибридизироваться с противоположными цепей данной двухцепочечной полинуклеотидной последовательности, так что область между двумя сайтами гибридизации амплифицируется.

Денатурация ДНК, как правило, происходит в пределах от 90 до 95°С, отжиг праймера с денатурированной ДНК, как правило, выполняется в пределах от 40 до 60°С, а этап достройки прошедших отжиг праймеров с полимеразой, как правило, выполняется в пределах от 70 до 75°С. Таким образом, в течение цикла ПЦР температура реакционной смеси должна варьироваться, причем варьироваться многократно в течение мультицикличного эксперимента ПЦР.

Для того чтобы ускорить общее время анализа, существует необходимость обеспечить возможность быстрого доведения реагентов до желаемой температуры, равномерного выдерживания реакции при этой температуре в течение дискретного периода времени, прежде чем перевести реакцию на следующую температуру в цикле. Существует также потребность в точном управлении температурой над реактивами.

Ряд амплификаторов, используемых для амплификации и секвенирования ДНК, описаны в известном уровне техники, в котором один или несколько управляемых температурных элементов или «блоков» удерживают реакционную смесь, и в котором температура блока изменяется с течением времени. Эти устройства страдают тем недостатком, что они медленны в циклическом повторении реакционных смесей, а управление температурой хуже идеального. В попытке преодолеть необходимость циклического повышения и понижения температуры нагревательного блока, было разработано устройство, известное в данной области техники как амплификатор. В этом устройстве несколько блоков с регулируемой температурой поддерживаются при разных температурах, при этом для перемещения реакционных смесей из одного блока к другому используется рука манипулятора. Типичные системы амплификаторов раскрыты в патентах США №5443791, №5656493 и №6656724. Тем не менее, как очевидно, эти системы имеют собственный набор недостатков. Например, они имеют относительно ограниченную пропускную способность, они физически большие, подвержены поломкам, являются дорогостоящими и требуют постоянного регулярного технического обслуживания.

В предшествующем уровне техники предпринимались различные попытки для уменьшения общего времени цикла и/или усовершенствования регулирования температуры и, как правило, касаются указанных выше недостатков. Наиболее распространенными способами являются бесконтактные и полагающиеся на кругооборот горячего воздуха, который осуществляют путем быстрого переключения потоков воздуха при заданной температуре. Однако регулирование и применение горячего воздуха не эффективно или не так легко контролируемо.

Усовершенствования в отношении таких известных устройств было впервые описано в международной патентной публикации №98/49340, в которой раскрыт амплификатор, в котором используется вращающаяся платформа для амплификации и детектирования ДНК-фрагментов. Реагенты загружают в загрузочные лунки вращающейся платформы, и при вращении платформы они смешиваются друг с другом и под действием центробежных сил смещаются в реакционные лунки, которые распределены по периферии платформы. Вращающаяся платформа затем подвергается циклической термообработке. При вращении платформы отдельные реакционные лунки могут находиться под постоянным контролем с помощью неподвижного детектора. Циклическая термообработка платформы осуществляется с помощью обычных способов нагрева, например, путем использования нагревательного элемента для нагрева потока воздуха, который направляют к платформе. Недостаток нагрева всей платформы горячим воздухом заключается в том, что окружающие конструкции в устройстве также нагреваются, и их необходимо охлаждать в охлаждающей фазе цикла, в противном случае они будут продолжать излучать тепло и влиять на температуру реакции, происходящей в реакционных лунках. Нагревание и охлаждение частей устройства, кроме самой платформы, является неэффективным, а регулирование температуры с помощью потока нагретого воздуха хуже идеального. Кроме того, трудно измерить температуру реакционной смеси, которая, следовательно, должен быть оценена. Поскольку разность температур между воздухом и реакционной смесью очень велика, расчетная температура реакции подвержена очень большим ошибкам, а это означает, что регулирование температуры недостаточно хорошее.

Другие способы нагрева, раскрытые в международной патентной публикации №98/49340, включают направление узкого пучка инфракрасного света или микроволновой энергии на части платформы, а затем вращение платформы через или сквозь луч. Таким образом, каждая часть платформы эффективно «импульсно накачивается» энергией и, таким образом, в любой момент времени нагревается лишь небольшая часть платформы. Это может привести к градиенту температуры через платформу. В международной патентной публикации №98/49340 платформа охлаждается путем воздействия на вращающуюся платформу потоком охлаждающей текучей среды, такой как атмосферный воздух, который может и быть охлажденным. В целом, способы нагрева используют некогерентные и несфокусированные источники электромагнитной энергии, которые должны быть высокой мощности, чтобы реакционные лунки могли достичь требуемой температуры. Кроме того, чтобы достичь установки заданной температуры, нагревание реакции этими обычными способами может занять несколько минут.

В свете представленной дискуссии, предпочтительной целью настоящего изобретения является разработка бесконтактного амплификатора, работающего в режиме реального времени, который имеет повышенную скорость циклической термообработки и который, следовательно, снижает общее время цикла.

Целью настоящего изобретения является преодоление или частичное устранение одного или нескольких недостатков известного уровня техники, или по меньшей мере предоставление полезной альтернативы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к высокоскоростному амплификатору (устройству циклической термообработки), в котором используется источник электромагнитной энергии (ЭМ) для нагрева вращающейся платформы. Устройство также обеспечивает превосходное регулирование температуры в течение всей реакции. Предпочтительно, электромагнитная энергия представляет собой энергию радиочастотного (РЧ) диапазон (между приблизительно 3 кГц и 300 ГГц), и в одном варианте выполнения представляет собой радиочастотную энергию в диапазоне от 50 до 60 кГц. В предпочтительном варианте выполнения источник электромагнитной энергии представляет собой индуктивность, а вращающаяся платформа изготовлена из материала, который выполнен с возможностью индукционного нагрева при контакте с указанной индуктивностью, или находится в тепловом контакте с материалом, который выполнен с возможностью индукционного нагрева при воздействии указанной индуктивности. Предпочтительно, вращающаяся платформа имеет реакционные лунки для размещения в нем реагентов для ПЦР, или выполнена с возможностью содержать соответствующие контейнеры для реакции / образцов, чтобы помещать в них, скажем, реагенты для ПЦР. Каждый реакционный контейнер находится в тепловом контакте с реакционной лункой и вращающейся платформой. Индуктивность окружает значительную часть вращающейся платформы, чтобы нагревать всю платформу одновременно, равномерно и с высокой скоростью, независимо от того, вращается платформа или нет, и независимо от скорости вращения. В одном предпочтительном варианте выполнения индуктор выполнен в виде кольца и полностью окружает вращающуюся платформу. Этот вариант выполнения является особенно предпочтительным, если скорость вращения платформы относительно медленная или равна нулю, так как вся платформа нагревается одновременно. В другом варианте выполнения, если требуется, чтобы скорость вращения платформы была относительно высокой, индуктивность может не полностью окружать платформу, но все же может по-прежнему нагревать всю платформу, по существу одновременно, хотя индуктивность окружает значительную часть вращающейся платформы для того, чтобы нагревать всю платформу одновременно, равномерно и на высокой скорости. Существуют различные преимущества, которые обеспечивает эта конфигурация, как будет рассмотрено ниже.

В соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение относится к амплификатору, содержащему:

вращающуюся платформу, имеющую реакционные лунки и выполненную с возможностью индукционного нагрева под воздействием электромагнитной энергии, и

источник электромагнитной энергии, выполненный с возможностью направления электромагнитной энергии на вращающуюся платформу,

причем источник электромагнитной энергии окружает значительную часть вращающейся платформы для того, чтобы нагревать платформу, по существу, одновременно.

Предпочтительно, вращающаяся платформа и/или реакционные лунки изготовлены, по меньшей мере частично, из материала, который выполнен с возможностью индукционного нагрева в результате воздействия электромагнитной энергии. В альтернативных вариантах выполнения, вращающаяся платформа и/или реакционные лунки находятся в тепловом контакте с материалом, который изготовлен, по меньшей мере частично, из материала, который выполнен с возможностью индукционного нагрева в результате воздействия электромагнитной энергии. Эти варианты будут рассмотрены ниже.

Предпочтительно, реакционные лунки распределены по периферии платформы, которая имеет кольцевую форму. Тем не менее, другие расположения также будут понятны специалисту в данной области техники. Следует принять во внимание, что вся платформа нагревается по существу одновременно.

В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения реакционные лунки выполнены отдельно, но находятся в тепловом контакте с вращающейся платформой, а в других вариантах выполнения реакционные лунки выполнены за одно целое с вращающейся платформой и, поэтому, изготовлены из того же самого материала, что и платформа. В этих вариантах выполнения материал выполнен с возможностью индукционного нагрева под воздействием электромагнитной энергии. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения реакционные лунки соединены вместе с одним или несколькими фланцами по периферии с образованием вращающейся платформы.

В некоторых вариантах выполнения вращающаяся платформа выполнена с возможностью содержать или принимать реакционные контейнеры в реакционных лунках. В одном варианте выполнения каждый реакционный контейнер образован, по меньшей мере частично, из материала, который выполнен с возможностью индукционного нагрева под воздействием электромагнитной энергии. В других вариантах выполнения как платформа, так и реакционные лунки выполнены, по меньшей мере частично, из материала, который выполнен с возможностью индукционного нагрева под воздействием электромагнитной энергии, а реакционные контейнеры выполнены из материала с высокой теплопроводностью.

Предпочтительно, устройство дополнительно содержит приводную систему, выполненную с возможностью вращения вращающейся платформы вокруг оси вращения. Предпочтительно, устройство дополнительно содержит блок управления для вращения вращающейся платформы с заданной регулируемой скоростью вращения, выбираемой пользователем.

Предпочтительно, платформа и реакционные лунки и/или реакционные контейнеры изготовлены из материала, который поглощает электромагнитную энергию и преобразует поглощенную электромагнитную энергию в тепловую энергию. Предпочтительно, платформа и/или реакционные контейнеры изготовлены из материала, который выбран таким образом, что он может поглощать электромагнитную энергию, вырабатываемую и доставляемую источником электромагнитной энергии с достаточной скоростью, чтобы нагревать платформу с заданной скоростью и, таким образом, нагревать реагенты, содержащиеся в реакционных лунках / реакционных контейнерах. Предпочтительно, платформа изготовлена из материала, имеющего достаточную теплопроводность, так что температура всей платформы во время нагревания является равномерной. Высокая теплопроводность является предпочтительной, чтобы обеспечить однородную температуру реактивов или реагентов, содержащихся в реакционных лунках или реакционных контейнерах. В предпочтительных вариантах выполнения масса вращающейся платформы сведена к минимуму, чтобы минимизировать индукционную энергию, необходимую для приведения платформы до заданной температуры.

Некоторые подходящие материалы для платформы и/или реакционных лунок / контейнеров представляют собой проводящие металлы, которые являются магнитными или немагнитными. Подходящие материалы включают, но не ограничиваются ими: сталь, углерод, олово, вольфрам, алюминий, медь, золото, медь и их комбинацию. В альтернативном или в дополнительном варианте выполнения вращающаяся платформа может быть выполнена с возможностью индукционного нагрева опосредованным образом путем присоединения приемника электромагнитной энергии в тепловом контакте с вращающейся платформой. В этом варианте выполнения приемник электромагнитной энергии выполнен из проводящего материала, который может или не может быть магнитным, а платформа выполнена из материала с высокой электропроводностью. Как специалисту в данной области техники должно быть понятно, можно индуктивно нагревать материал, даже если он не является электропроводящим, а за счет магнитных потерь на гистерезис. В этом варианте выполнения выбирается материал со значительной относительной магнитной проницаемостью, т.е. мерой способности материала поддерживать формируемое внутри него самого магнитное поле, или, другими словами, степень намагниченности, которую материал приобретает в ответ на приложенное магнитное поле. Подходящие материалы выбирают из: кобальт-железа, пермаллоя, электротехнической стали, ферритной нержавеющей стали, мартенситной нержавеющей стали, феррита (никель цинк), углеродистой стали, никеля и их комбинации. Другие подходящие материалы также должны быть известны специалисту в данной области техники. Магнитный гистерезис вызывает внутреннее трение, что, в свою очередь, производит тепло, когда магнитные части проходят через индуктивность. Магнитные материалы, естественно, имеют электрическое сопротивление к быстро меняющимся магнитным полям внутри индуктивности.

Предпочтительно, вращающаяся платформа и связанные с ней реакционные лунки изготавливают из алюминия, а платформа предпочтительно вращается таким образом, что реакционные образцы в реакционных лунках (или в реакционных контейнерах) при вращении проходят мимо одного модуля оптического детектирования для обнаружения оптического сигнала от реакции, осуществляемой в лунках / контейнерах, и, таким образом, отслеживается ход реакций. Вращающаяся платформа может быть быстро нагрета, со скоростью приблизительно 15°С в секунду, и предпочтительно охлаждена принудительной струей окружающего воздуха или охлажденного воздуха (2-5°С), хотя возможны и другие способы охлаждения, известные специалисту в данной области техники.

Предпочтительно, источник электромагнитной энергии полностью окружает вращающуюся платформу. Предпочтительно, источник электромагнитной энергии не доставляет тепловую энергию к вращающейся платформе посредством прямого контакта, а, скорее, за счет опосредованного контакта. Предпочтительно, источник электромагнитной энергии обеспечивает электромагнитную энергию непрерывно или периодически, основываясь на различных факторах, например, требуемой температуре реагента(ов) в реакционных лунках или реакционных контейнерах, скорости, с которой тепловая энергия удаляется из реакционных лунок или реакционных контейнеров, и требуемой скорости изменения температуры и т.д. Периодическая подачи энергии может быть осуществлена с помощью импульсов энергии, которые могут иметь одинаковую или разную длительность, или могут представлять собой импульсы то большой, то малой продолжительности, или адаптированы так, чтобы достичь заданной температуры. Периодически доставляемая электромагнитная энергия может быть доставлена в соответствии с заранее установленным графиком, который определяется из начальной процедуры калибровки.

Предпочтительно, источник электромагнитной энергии представляет собой индуктивность, которая магнитным образом соединена с вращающейся платформой и соответствующими реакционными лунками для наведения в них тока и для генерирования тепла. Следует принять во внимание, что наличие источника электромагнитной энергии, по существу окружающего вращающуюся платформу, обеспечивает возможность равномерно нагрева всей платформы с относительно высокой скоростью. В качестве альтернативы, вращающаяся платформа содержит приемник электромагнитной энергии, находящийся в тепловом контакте с реакционными лунками или реакционными контейнерами, причем катушка индуктивности соединена с приемником электромагнитной энергии, чтобы индуцировать в нем ток и генерировать тепло внутри платформы и внутри реакционных лунок / реакционных контейнеров. Предпочтительно, катушка индуктивности магнитным образом соединена с приемником электромагнитной энергии.

Релевантный предшествующий уровень техники, который раскрывает использование вращающейся платформы в устройстве циклической термообработки, предлагает нагревать только часть платформы в любой момент времени, например, путем направления инфракрасного (ИК) света на часть платформы, а затем поворачивая платформу сквозь или через свет. Каждая часть платформы эффективно «накачивается» энергией. В качестве альтернативы, лазер, излучающий видимый или инфракрасный свет, или микроволновый источник направляют на реакционную лунку или реакционный контейнер, который нагревается, когда поворачивается мимо источника энергии. В этих примерах, поскольку источник нагрева фактически представляет собой «точечный источник», платформа должна быть повернута мимо или через точечный источник, для того, чтобы равномерно нагревать платформу и каждый реакционный контейнер / лунку. Другие примеры в известном уровне техники используют магнит, расположенный рядом с вращающейся платформой, причем прохождение платформы мимо магнита и через магнитное поле индуцирует генерацию тепла внутри платформы. В других примерах известного уровня техники предусмотрена пара взаимно противоположных магнитов, и платформа вращается в зазоре между магнитами, чтобы вызвать генерацию тепла внутри платформы. Во всех этих случаях в любой момент времени нагревается лишь небольшая часть платформы и, следовательно, платформа должна вращаться мимо точечного источника нагрева для нагрева всей платформы. Необходимость вращать платформу для равномерного нагрева платформы ограничивает степень контроля над скоростью вращения, что имеет важное значение в некоторых вариантах выполнения и применениях. Настоящее изобретение представляет собой усовершенствование по отношению к предшествующему уровню техники, заключающееся в том, что скорость вращения может быть развязана от возможности равномерного нагрева платформы и на высокой скорости.

Кроме того, предшествующий уровень техники рассматривает использование единственного источника тепла для нагрева небольшой части платформы, причем источник установлен под платформой, чтобы обеспечить однонаправленное тепло, по существу вверх по направлению к платформе. Тепловой источник может, в качестве альтернативы, быть установлен над платформой. В этом известном уровне техники, однонаправленный внешний нагрев вызывает перепад температур внутри и через платформу, таким образом, для выравнивания температуры через платформу требуется дополнительное время. Таким образом, существует необходимость равномерного нагрева платформы, чтобы более точно контролировать температуру реагентов, находящихся в лунках. Настоящее изобретение представляет собой усовершенствование, по отношению к предшествующему уровню техники, в том, что источник электромагнитной (ЭМ) энергии выполнен с возможностью индукционного нагрева платформы одновременно и изнутри, что обеспечивает возможность в значительной степени равномерного нагрева всей платформы и/или камер / лунок. По мере того как индукционное тепло подается для нагрева платформы по существу одновременно, температурные дифференциалы сводятся к минимуму или устраняются, что обеспечивает возможность выполнения реакции за меньшее время.

В других вариантах выполнения изобретения также рассматривается сочетание катушки индуктивности и точечного источника нагрева, такого как лазер, излучающего видимый или инфракрасный свет, или микроволнового источника, направленного на вращающуюся платформу. Этот вариант выполнения сочетает «точечный источник» предшествующего уровня техники для нагрева платформы (импульсная подача энергии) с настоящим изобретением, в котором вся вращающаяся платформа нагревается по существу одновременно.

Как уже обсуждалось выше, изобретение обеспечивает возможность развязки фактора скорости вращения платформы от способности нагревать платформу. Вся платформа может быть нагрета равномерно без вращения платформы, или пока она вращается медленно. Этот аспект представляет собой усовершенствование по отношению к предшествующему уровню техники, так как скорость вращения может быть использована для управления центробежными силами, и, следовательно, управления перемещением текучих сред на платформу и вокруг нее.

В отличие от предшествующего уровня техники, настоящее изобретение может рассматриваться как трансформатор. Изменяющийся / переменный ток в первичной обмотке (катушки индуктивности) создает переменный магнитный поток в сердечнике трансформатора и, тем самым, изменяющийся магнитный поток через вращающуюся платформу (вторичная обмотка), индуцируя циркулирующие электрические токи. Циркулирующие (вихревые) токи протекают на фоне удельного электрического сопротивления металла, создавая точное и локализованное тепло без какого-либо прямого контакта между вращающейся платформой и первичной обмоткой. Следует принять во внимание, что вторичная обмотка представляет собой один единственный короткозамкнутый виток.

Настоящее изобретение служит не только для увеличения скорости, с которой платформа может быть нагрета, и, следовательно, уменьшения общего времени цикла, но и улучшает равномерность нагрева платформы и, поэтому, управление химическими реакциями, протекающими в реакционных лунках или реакционных контейнерах. Заявитель обнаружил, что управление точностью, с которой платформа может быть нагрета, и скорость нагрева платформы, могут уменьшить общее время цикла, что представляет собой важный аспект коммерчески доступных устройств. Кроме того, так как нагревается только платформа, и никакие другие окружающие части устройства не нагреваются, то устройство имеет низкое энергопотребление.

Предпочтительно, система амплификатора, выполненная в соответствии с изобретением, нагревает всю платформу по существу одновременно. Предпочтительно, амплификатор выполнен таким образом, что разница температур между любыми местами платформы поддерживается на уровне ниже 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% во время фазы нагрева и когда платформа находится при постоянной температуре. Предпочтительно, температура реагентов в реакционных лунках или реакционных контейнерах однородна по всей вращающейся платформе, так что максимальная разность температур между любыми 2-мя частями платформы, или внутри реагентов, находящихся в реакционных лунках или реакционных контейнерах, составляет менее 1, 0,75, 0,5, 0,2, 0,1 или 0,01°С. Предпочтительно, источник электромагнитной энергии представляет собой катушку индуктивности, которая по существу окружает вращающуюся платформу. В предпочтительных вариантах выполнения катушка индуктивности полностью окружает вращающуюся платформу, но в других вариантах выполнения окружает более чем приблизительно 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% от общей периферии вращающейся платформы. Следует принять во внимание, что катушка индуктивности может быть выполнена из 2-х или большего количества секций, охватывающих части периферии вращающейся платформы, однако сочетание секций охватывает более чем 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, или 99% от общей периферии вращающейся платформы.

В предпочтительных вариантах выполнения изобретения электромагнитное излучение доставляется на частоте между 35 и 45 кГц или между 50 и 60 кГц, т.е. в радиочастотном диапазоне. Тем не менее, в других вариантах выполнения излучение имеет диапазон от 5 кГц до 100 МГц. В противоположность этому, некоторые известные устройства раскрывают использование электромагнитной энергии в ИК и видимом диапазоне частот, который находится между 300 ГГц и 430 ТГц.

Охлаждающий газ может представлять собой любой из большого количества газов, однако, для удобства и эффективности затрат, в большинстве случаев охлаждающим газом является просто воздух при температуре окружающей среды. Однако, возможно, что в некоторых ситуациях может быть использован охлажденный воздух. Это может быть особенно полезно, когда, после того, как было проведено необходимое количество циклов, требуется охладить образцы до температур ниже температуры окружающей среды.

Денатурация ДНК, как правило, происходит в диапазоне температур от 90 до 95°С, отжиг праймера до денатурированной ДНК, как правило, выполняют в диапазоне температур от 40 до 60°С, а этап достройки прошедших отжиг праймеров с полимеразой, как правило, выполняют в диапазоне от 70 до 75°С. Таким образом, в течение цикла ПЦР температура реакционной смеси должна изменяться, причем многократно изменяться в течение мультициклического эксперимента ПЦР. Устройство, выполненное в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивает возможность нагрева реагентов, находящихся в реакционных лунках или в реакционных контейнерах, со скоростью 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, а в некоторых случаях, 30°С/сек. Следует принять во внимание, что возможны даже более высокие скорости нагрева, в зависимости от количества энергии, доставляемой в катушку индуктивности от источника электромагнитной энергии и от выбора материалов. Вращающаяся платформа может быть охлаждена со скоростью 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, а в некоторых случаях, 20°С/сек. Чрезвычайно быстрая скорость нагрева, причем точное значение скорости, с которой вращающаяся платформа может быть нагрета, обеспечивает уменьшенное общее время цикла, что представляет собой существенное преимущество для коммерческих устройств.

Настоящее изобретение дополнительно использует термопару или терморезистор, находящийся в тепловом контакте с вращающейся платформой, для того, чтобы непосредственно в режиме реального времени измерять температуру вращающейся платформы и/или реакционных контейнеров / лунок и, следовательно, реагента(ов), находящихся в реакционных контейнерах / лунках. Таким образом, обеспечивается дополнительный контроль за температурой реакции, особенно при доведении реакции до требуемой температуры, а затем проведения реакции при точно заданной температуре в течение заданного времени. Таким образом, нет никакой необходимости иметь времена задержки больше, чем необходимо, что дополнительно снижает общее время цикла. Кроме того, существует улучшенный контроль за температурой реакции, поскольку разница температур между реакционным контейнером и платформой меньше, чем разница температур между реакционным контейнером и нагретым воздухом в случае известных устройств. Это обеспечивает возможность более точного температурного моделирования реакционного контейнера и, тем самым, реактивов, содержащихся в контейнере.

Мониторинг в реальном времени температуры вращающейся платформы означает, что управляющее программное обеспечение может точно настроить количество энергии, подаваемой в катушку индуктивности, и, следовательно, как быстро вращающаяся платформа может быть нагрета. В некоторых случаях, предпочтительно доставлять относительно высокую мощность к первичной обмотке, чтобы вызвать очень быстрый нагрев платформы, а затем управлять температурой в заданной точке, непрерывно регулируя уровень мощности, подаваемой к первичной обмотке. В других предпочтительных вариантах выполнения можно нагревать платформу, одновременно подавая охлаждающий газ, а с помощью тонкой настройки количества энергии, доставляемой к первичной обмотке, можно довести вращающуюся платформу до требуемой температуры быстрее, чем это возможно в известных устройствах. Поскольку вся платформа нагревается одновременно или по существу одновременно, этот уровень управления не представляется возможным при использовании способа нагрева «точечным источником» предшествующего уровня техники, описанного выше.

Предложенный амплификатор особенно подходит для использования в реакциях амплификации нуклеиновых кислот, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и лигазная цепная реакция (ЛЦР). Тем не менее, следует понимать, что устройство может быть использовано в самых разнообразных системах, которые требуют многократных или циклических химических реакций для получения желаемого продукта. В связи с ПЦР, предпочтительно, анализируемая или прореагировавший образец представляет собой нуклеиновую кислоту, такую как ДНК или РНК, содержащую образец. Другие компоненты образца, как правило, включают олигонуклеотидные праймеры, дезоксиаденозин трифосфат (дАТФ), деоксицитидин трифосфат (дЦТФ), дезоксигуанозин трифосфат (дГТФ), дезокситимидин трифосфат (дТТФ) и по меньшей мере одно из: термостабильной ДНК-полимеразы, ее ферментативно активных фрагментов, ее ферментативно активных производных и обратной транскриптазы.

Предпочтительно, время, в течение которого образец поддерживается при заданной температуре, предварительно выбирается и контролируется. В одном варианте выполнения изобретения, в котором используется амплификатор для амплификации нуклеиновых кислот, циклическая термообработка является достаточной для того, чтобы произошли следующие реакции:

(A) денатурация ДНК в ее составные цепи;

(Б) отжиг олигонуклеотидных праймеров до комплементарных последовательностей в ДНК; и

(B) синтез новых цепей ДНК.

Предпочтительно, эти этапы повторяются до тех пор, пока не будет достигнут требуемый уровень амплификации. Амплификатор может также содержать цикл термообработки, который годится для денатурации образца, причем образец обычно денатурируют в течение примерно от 2 до 10 секунд.

Как видно из сказанного выше, предложенное устройство обеспечивает возможность быстрого циклического изменения между температурами, обычно используемыми при проведении полимеразной цепной реакции и других ферментативных реакций. Использование предложенного устройства, следовательно, обеспечивает эффективный способ циклической термообработки реакционной смеси между различными температурами.

В еще одном дополнительном предпочтительном варианте выполнения изобретения предусмотрены средства мониторинга для оценки хода реакции, происходящей в реакционных лунках или в реакционных контейнерах. Как правило, это средство мониторинга представляет собой флуоресцентный детектор, спектрофотометр или фотометр. Это особенно полезно при мониторинге хода ряда ферментативных реакций, где наблюдается изменение оптической плотности или флуоресценции продукта. Такое средство мониторинга представляется очень полезным при мониторинге реакции ПЦР. В этом случае к реакционной смеси добавляют интеркалирующий краситель, такой как бромид этидия или SYBR®Green. Когда краситель связывается с двухцепочечной ДНК, появляется флуоресценция. Соответственно, путем мониторинга степени флуоресценции в реакционной смеси, может быть сделана оценка в отношении числа произошедших удвоений. В качестве альтернативы, могут быть использованы флуоресцентно меченые зонды, которые гибридизируются с ДНК. Специалисту в данной области техники должны быть известны и другие способы.

Специалисту будет понятно, что циклическое изменение между различными заданными температурами может быть автоматизировано. Это включает одно или несколько из следующего: приведения в действие катушки индуктивности, выключение или возбуждение импульсами катушки индуктивности, увеличение скорости вращающейся платформы, уменьшение скорости вращающейся платформы, поддержание скорости вращения вращающейся платформы постоянной, уменьшение скорости вращения платформы до нуля или близко к нулю, впуск охлаждающего газа для охлаждения платформы, уменьшение потока охлаждающего газа до нуля, управление температурой платформы до заданной температуры, изменение температуры платформы от одной заданной температуры до другой (либо от более холодной до более горячей, либо наоборот), и т.д. Кроме того, в ситуации, когда предусмотрены средства мониторинга и реакция достигла подходящей точки, охлажденный газ может быть закачен в камеру, охлаждая, таким образом, реакционную смесь до температуры ниже температуры окружающей среды.

В одном варианте выполнения вращающаяся платформа выполнена с возможностью снятия с устройства, но в других вариантах выполнения платформа жестко установлена в устройстве. В одном варианте выполнения реагенты или реактивы вводят в реакционные лунки и подвергают циклической термообработке. В этом случае не существует никаких требований для реакционных контейнеров. Тем не менее, в альтернативном варианте выполнения реакционные контейнеры загружаются в реакционные лунки, которые выполнены с возможностью приема реакционных контейнеров. Реагенты или реактивы вводят в реакционные контейнеры и подвергают циклической термообработке.

В первом варианте выполнения вращающейся платформы, пригодной для использования в устройстве, выполненном в соответствии с изобретением, платформа изготовлена из алюминия и выполнена с возможностью размещения 48-ми реакционных контейнеров. Тем не менее, следует принимать во внимание, что платформа может быть выполнена с возможностью приема как меньшего количества, так и большего количества реакционных контейнеров, чем 48, как требуется, например, 96, 192 или 384 реакционных контейнеров. Следует принять во внимание, что платформа может быть выполнена с любым количеством реакционных контейнеров / лунок, в соответствии с требованиями соответствующего применения. Платформа предпочтительно выполнена в виде кольцевого массива стаканов для размещения соответствующих реакционных контейнеров, причем стакан представляет собой реакционную лунку. Стакан выполнен с возможностью размещения в нем контейнера. В одном варианте выполнения стаканы расположены под углом приблизительно 80 градусов от горизонтали и имеют открытое отверстие в своих основаниях для того, чтобы устройства оптического детектирования для оптического мониторинга реакции, протекающей в реакционной трубке, удерживались внутри стакана. Конструкционный материал для реакционного контейнера выбирается таким, чтобы он был оптически прозрачным на длине волны света, на которой работает устройство оптического детектирования. Стаканы могут быть наклонены под любым углом от такого небольшого как 30 градусов от горизонтали, до вертикального. Внутри платформа также предпочтительно содержит один или несколько датчиков температуры, чтобы точно измерять температуру алюминия.

В некоторых предпочтительных вариантах выполнения вращающаяся платформа сконструирована так, чтобы иметь минимальную массу, так, чтобы реакционные контейнеры вставлялись в реакционные лунки только на уровне максимального объема текучей среды реакционного контейнера. В некоторых вариантах выполнения изобретения максимальный объем текучей среды составляет 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500 или 1000 мл, а толщина и диаметр реакционной лунки выполнены с возможностью подходить для реакционного контейнера, который выбирают таким образом, что максимальная высота текучей среды реакционного контейнера совпадает с верхней поверхностью реакционных лунок. Другими словами, весь реакционный контейнер не должен быть нагрет / охлажден - только его часть, которая содержит реактивы. Часть реакционного контейнера, которая находится выше максимального объема текучей среды, не должна быть в контакте с вращающейся платформой или реакционной лункой. Это обеспечивает возможность еще большего повышения скорости работы устройства, поскольку время и энергия не расходуется на нагрев / охлаждение частей реакционного контейнера, которые не вступают в контакт с реагентом / реактивом. В этом случае, если внутри ненагретой верхней части реакционного контейнера происходит конденсация, то после каждого цикла нагрева скорость вращения платформы может быть в достаточной степени увеличена, чтобы обеспечить возможность втягивания обратно конденсата, вниз к основанию реакционного контейнера и в основную часть реагентов. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения скорость платформы может быть увеличена до величины, более чем 1500 оборотов в минуту, чтобы под действием центробежных сил принудительно переместить конденсат обратно к основанию реакционного контейнера, например, достигая 3000 оборотов в минуту. Другие скорости вращения также известны специалисту.

Во втором варианте выполнения вращающейся платформы для использования в предложенном устройстве платформа изготовлена из пластмассы, которая является оптически прозрачной на длине волны света, на которой работает устройство оптического детектирования. Платформа предпочтительно имеет диаметр приблизительно 130 мм и толщину 1 мм, и по сути представляет собой тонкую круглую пластину. Пластина содержит радиально внутренние загрузочные лунки и радиально наружные реакционные лунки, причем каждая из лунок соединена узким проходом. Узкий проход сформирован или выполнен таким образом, что текучая среда будет протекать из внутренних к внешним лункам только при достаточном вращении платформы (генерируется достаточная центробежная сила). Каждая радиально внутренняя загрузочная лунка также соединена с одной или несколькими радиально внешними реакционными лунками проходом. Реакционные лунки предпочтительно имеют диаметр приблизительно 6 мм, и «загружаются» центробежным способом через загрузочные лунки. Следует принять во внимание, что первый реагент может быть загружен в радиально внутренние загрузочные лунки, а второй реагент загружают в радиально внешние реакционные лунки, и при центрифугировании первый реагент вводят в контакт со вторым реагентом. В этом варианте выполнения пластина зажата между одним или несколькими плоскими приемником электромагнитной энергии, которые предпочтительно имеют одинаковую массу. Приемники электромагнитной энергии могут представлять собой алюминиевые диски. Нижний диск «закреплен» и выполнен с возможностью вращения внутри устройства, тогда как верхний диск является съемным, чтобы обеспечить пользователю возможность получения доступа к загрузочным и реакционным лункам. Закрепленный алюминиевый диск имеет вращающийся датчик температуры, установленный внутри него, чтобы точно измерять его температуру. Верхний съемный алюминиевый диск идентичен по массе с закрепленным алюминиевым диском таким образом, что он поглощает ту же самую индукционную энергию, что и закрепленный диск. Следует принять во внимание, что алюминий может быть заменен на другой материал, выполненный с возможностью индукционного нагрева. Температура фактической текучей среды в реакционной лунке может быть смоделирована и точно управляема. Использование верхнего диска и, возможно, более низкого закрепленного диска (или наоборот), которые выполнены с возможностью индукционного нагрева, пластина выполнена с возможностью нагрева как от верхней, так и от нижней поверхности одновременно, чтобы обеспечить очень быстрое повышение температуры реагентов / реактивов в реакционных / загрузочных лунках. В альтернативном варианте выполнения система может работать только с нижним закрепленным диском, выполненным из алюминия, при этом верхний диск выбирают из пластмассы. Тем не менее, скорость повышения температуры будет немного меньше, чем когда используются оба диска, выполненные из алюминия. В альтернативном варианте выполнения платформа изготовлена из материала, выполненного с возможностью индукционного нагрева.

Как уже обсуждалось выше, вращающаяся платформа предпочтительно изготовлена из алюминия или из пластмассы и имеет расположенный с ней в тепловом контакте приемник электромагнитной энергии, так что платформа выполнена с возможностью нагрева в ответ на воздействия электромагнитной энергией, которая предпочтительно является энергией РЧ диапазона. В качестве альтернативы, или в дополнительном варианте выполнения, вращающаяся платформа изготовлена из полимерного материала, имеющего по меньшей мере один наполнитель, который улучшает теплопроводность. Такие теплопроводные полимеры могут обеспечить теплопроводность от 2 Вт/мК (аналог стекла) до 100 Вт/мК (аналог литого алюминия) тогда как стандартный полипропилен обычно имеет теплопроводность, составляющую приблизительно 0,2 Вт/мК. Могут быть использованы различные наполнители, которые, как правило, основаны на углероде или графите, или нитридах, таких как нитрид алюминия и/или бора. Другие наполнители также известны специалисту в данной области техники. Использование полимеров с высокой теплопроводностью оказывает содействие в обеспечении равномерного нагрева и более быстрой доставки тепла к реагентам, поскольку реагенты в данном варианте выполнения находятся в непосредственном контакте с теплопроводной пластмассой.

В родственном варианте выполнения наполнитель представляет собой ферромагнитные частицы. Полученная пластмассовая платформа может быть нагрета при помещении в индукционное поле за счет потерь на гистерезис, непосредственно нагревая, тем самым, вращающуюся платформу. В этом варианте выполнения возможны скорости нагрева от 5 до 20°С/сек.

В еще одном дополнительном родственном варианте выполнения изобретение относится к системе, которая исключает использование двух алюминиевых дисков, между которыми зажата вращающаяся пластина за счет формования диска с наполнителями, которые увеличивают теплопроводность и обеспечивает возможность его индукционного нагрева. Путем формования диска таким образом, форма и размер лунок также могут быть оптимизированы в отношении нагрева и общего размера диска. Дополнительным преимуществом является то, что для оптики требуется только небольшое смотровое отверстие, еще больше улучшая теплопередачи, поскольку все другие стороны реакционной лунки могут быть нагреты одновременно.

Приведенные выше варианты выполнения обеспечивают равномерный нагрев, поскольку ферромагнитные частицы равномерно распределены по всей вращающейся платформе. Тем не менее, в этих вариантах выполнения требуется альтернативный метод измерения температуры. Специалисту должно быть понятно, какие варианты будут доступны, например, термистор может быть отлит внутри вращающейся платформы.

В соответствии со вторым аспектом, изобретение относится к способу циклической термообработки реакционной смеси между заданными температурами, при этом способ включает этапы, на которых:

размещают амплификатор, выполненный в соответствии с первым аспектом;

размещают указанную реакционную смесь в одной или нескольких реакционных лунках, и циклически:

приводят в действие катушку индуктивности для нагрева реакционной лунки и, тем самым, нагрева реакционной смеси до первой заданной температуры, и

вводят в контакт вращающуюся платформу с охлаждающей текучей средой для охлаждения реакционной смеси до второй заданной температуры, отличной от первой заданной температуры,

таким образом, реакционную смесь подвергают циклической термообработке.

Следует принять во внимание, что реакционная смесь, в качестве альтернативы, может содержаться в реакционном контейнере, который расположен в реакционной лунке.

Способ дополнительно включает этап приведения в действие катушки индуктивности для циклической термообработки реакционной смеси (вращающейся платформы / реакционного контейнера(ов) / реакционной лунки(ок)) между заданными температурами.

В предпочтительных вариантах выполнения до введения вращающейся платформы в контакт с охлаждающей текучей средой катушку индуктивности выключают или ее мощность снижают, с тем, чтобы прекратить или уменьшить нагревание платформы.

В предпочтительном варианте выполнения изобретение относится к способу проведения амплификации нуклеиновых кислот с использованием устройства, выполненного в соответствии с изобретением, причем используют полимеразную цепную реакцию, лигазную цепную реакцию или любую другую технологию амплификации. Предпочтительно, ДНК денатурируют на составные цепи; олигонуклеотидные праймеры подвергают отжигу до комплементарных последовательностей в ДНК; и синтезируют новые цепи ДНК. Предпочтительно, эти этапы повторяют до тех пор, пока не будет достигнут требуемый уровень амплификации.

Способ включает этапы, на которых загружают реакционную смесь в реакционную лунку или реакционный контейнер, и подвергают реакционную смесь циклической термообработке до тех пор, пока не будет достигнут требуемый уровень амплификации. Во время циклической термообработки реакционную смесь предпочтительно контролируют с помощью средства детектирования.

Предпочтительно, реакционные лунки имеют такую форму и конфигурацию, чтобы удерживать объем текучей среды от 25 до 2500 мкл, в частности, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1250, 1500, 2000 или 2500 мкл. Глубина / высота и диаметр реакционной лунки может иметь любое значение, в соответствии с применением. Тем не менее, в качестве примера, возможны диаметры от 2 до 40 мм и желательны глубины от 5 до 50 мм.

Любые скорости вращения попадают в область изобретения. Тем не менее, в качестве примера, возможны скорости вращения 10, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 100, 1250, 1500, 1750, 200, 300, 400 или 5000 оборотов в минуту. Если реагенты дозируются в реакционную лунку / контейнер, то скорости вращения от 10 до 500 оборотов в минуту являются предпочтительными. Чтобы принудительно снизить конденсацию в основной загрузке реагентов в реакционной лунке / контейнере, могут потребоваться скорости вращения свыше 1500 оборотов в минуту, например, скорости 2000, 2500, 3000, 3500 или 4000 оборотов в минуту. Предпочтительно, при тестировании реакционной смеси в реакционных лунках / контейнерах платформа вращается со скоростью от 500 до 1000 оборотов в минуту.

В соответствии с третьим аспектом, изобретение относится к применению предложенного амплификатора для проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты, выбранной из полимеразной цепной реакции (ПЦР) и лигазной цепной реакции (ЛЦР).

Специалисту будет понятно, что изобретение включает варианты выполнения и признаки, раскрытые в данном документе, а также все комбинации и/или перестановки раскрытых в настоящем документе вариантов выполнения и признаков.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Предпочтительные варианты выполнения настоящего изобретения будут теперь описаны исключительно посредством примера со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых:

Фиг. 1 изображает вид сбоку в разрезе устройства, выполненного в соответствии с настоящим изобретением;

Фиг. 2 изображает вид в аксонометрии вращающейся платформы, применяемой в устройстве, выполненном в соответствии с Фиг. 1;

Фиг. 3 изображает вид в аксонометрии устройства, выполненного в соответствии с Фиг.1, изображающий крышку в открытом положении для получения доступа к вращающейся платформе, изображенной на Фиг. 2; и

Фиг. 4 изображает вид сверху альтернативной вращающейся платформы для использования в предложенном устройстве.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В описании и формуле изобретения используется следующая терминология в соответствии с определениями, изложенными ниже. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, приведена исключительно в целях описания конкретных вариантов выполнения изобретения и не предназначена для его ограничения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, обычно понимаемое обычным специалистам в данной области техники, к которой относится изобретение.

Если контекст не требует иного, во всем описании и формуле изобретения слова «содержит», «содержащий» и тому подобное должны быть истолкованы в инклюзивном смысле, в отличие от исключительного или исчерпывающего смысла, т.е. в смысле «в том числе, но не ограничивается этим».

Кроме рабочих примеров или где указано иначе, все числа, выражающие количества ингредиентов или условий реакции, используемых в данном описании, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином «приблизительно». Примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. В дальнейшем, или где указано иначе, «%» означает «весовой %», «соотношение» означает «весовое соотношение» и «части» означает «весовые части».

Термины «преимущественно» и «по существу», используемые в настоящем документе, означают содержащий более 50% по весу, если не указано иное.

Указание числового диапазона с использованием конечных точек включает в себя все числа, входящие в этот диапазон (например, от 1 до 5 включает 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5 и т.д.).

Термины «предпочтительный» и «предпочтительно» относятся к вариантам выполнения изобретения, которые могут давать определенные преимущества при определенных обстоятельствах. Тем не менее, также могут быть предпочтительными и другие варианты выполнения, при тех же самых или других обстоятельствах. Кроме того, перечисление одного или нескольких предпочтительных вариантов выполнения не подразумевает, что другие варианты выполнения не являются полезными, и не предназначено для исключения других вариантов выполнения из объема настоящего изобретения.

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЙ ВАРИАНТ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение будет описано со ссылкой на следующие примеры, которые следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие.

На Фиг. 1 показан вид сбоку в разрезе устройства 1 амплификатора, выполненного в соответствии с изобретением. Устройство 1 содержит приводной двигатель 2 для вращения вращающейся платформы 3 с заданной пользователем скоростью. Вращающаяся платформа 3 имеет круговую конструкцию и выполнена с возможностью размещения большого количества пластмассовых или стеклянных реакционных контейнеров 4 в реакционных лунках 5. Вращающаяся платформа дополнительно может быть с возможностью съема прикреплена к ступени 20, соединенной с приводным двигателем 2. Платформу 3 окружает катушка 6 индуктивности для одновременного нагрева всей платформы 3, независимо от того, вращается ли платформа 3, или независимо от скорости ее вращения. Катушка 6 индуктивности предпочтительно выполнена в виде кольца. Амплификатор 1, выполненный в соответствии с изобретением, является «высокоскоростным», в том смысле, что он способен нагревать платформу 3 со скоростью по меньшей мере 15°С в секунду, а предпочтительно 25°С/сек. Предложенное устройство обеспечивает быструю передачу энергии с помощью индукционного нагрева.

Конфигурация, описанная выше, лучше всего может быть описана как трансформатор, в котором неподвижная катушка 6 индуктивности представляет собой первичную обмотку, а платформа 3 представляет собой вторичную обмотку трансформатора, которая эффективно имеет один короткозамкнутый виток. Катушка 6 индуктивности предпочтительно также содержит ферритовый материал (не показан), выше и ниже себя, чтобы лучше направлять магнитный поток во платформу 3.

Схема используется для генерации энергии в радиочастотном (РЧ) диапазоне (35-45 кГц или 50-60 кГц) для нагрева контейнеров 4 в тепловом контакте с лунками 5 и платформой 3, с индуктивной связью, очень похожей на описанную в патенте США №6046442, который включен во всей полноте в настоящий документ посредством ссылки. Тем не менее, следует принимать во внимание, что могут быть использованы и другие конфигурации схемы.

В варианте выполнения, показанном на Фиг. 1, датчик температуры (не показан) встроен в платформу 3 для того, чтобы непосредственно контролировать температуру платформы 3 во время фазы тепловой индукции. Температурные данные передаются через инфракрасный порт (не показан) к неподвижной электронике (не показана) в корпусе устройства 1 амплификатора. Тепловая модель контейнера 4 может быть рассчитана таким образом, что температура внутри контейнера 4 может быть точно определена в режиме реального времени. В одном не ограничивающем примере тепловая модель представляет собой модель 1-го или 2-го порядка, связывающую температуру реакции с температурой платформы 3. Константы модели могут изменяться в зависимости от того, нагревается или охлаждается вращающаяся платформа. Следует принять во внимание, что для того, чтобы связать температуру реакции с температурой платформы 3, могут быть использованы другие математические модели.

Устройство 1 также содержит высокоскоростной вентилятор 7 для направления высокоскоростной охлаждающей текучей среды в виде окружающего воздуха в устройство 1, в котором установлена платформа 3. Окружающий воздух может быть охлажден перед его введением в устройство 1, с тем, чтобы быстрее снизить температуру реагентов в контейнерах 4.

Устройство 1 амплификатора дополнительно содержит модуль 10 оптического детектирования для определения хода реакции, протекающей в контейнерах 4. Платформа 3 вращается таким образом, что контейнеры 4 проходят через область обнаружения, при этом платформа 3 вращается с достаточной скоростью, так что каждый из контейнеров 4 может быть контролироваться индивидуально.

Следует принять во внимание, что устройство 1, как показано в настоящем документе, не должно вращаться, чтобы обеспечивать индукционный нагрев платформы 3, поскольку магнитный поток от первичной обмотки одновременно нагревает всю платформу 3, так как оно по существу окружает платформу 3. Платформа 3 вращается, чтобы определять ход реакций в реакционных контейнерах 4 и, поскольку имеется один модуль 10 оптического детектирования, каждый образец в реакционном контейнере должен при вращении пройти через эту точку, чтобы получить оптический сигнал. Платформа 3 также может вращаться, чтобы перемещать текучие среды на платформу, и для того, чтобы начинать, приостанавливать или прекращать химическую реакцию.

Платформа 3, показанная на Фиг. 1, содержит ряд реакционных лунок 5, расположенных в круговом массиве, и содержит круговое кольцо, соединенное с платформой 3. Кольцо образовано из теплоизолирующего материала, так что единственным элементом, который нагревается / охлаждается, является платформа 3 с лунками 5 и контейнерами 4. Предпочтительно, чтобы общая нагреваемая / охлаждаемая масса сведена к минимуму, чтобы максимизировать скорость охлаждения / нагрева.

Фиг. 2 представляет собой вид в аксонометрии платформы 3, пригодной для использования в устройстве 1, изображенном на Фиг. 1. Платформа 3 изготовлена из алюминия и выполнена с возможностью размещения 48-ми реакционных контейнеров 4. Тем не менее, следует принимать во внимание, что платформа 3 может быть также выполнена с возможностью размещения меньшего или большего количества, чем 48 реакционных контейнеров. Каждая из реакционных лунок 5 выполнена в виде стаканов, которые расположены под углом примерно 80 градусов к горизонтали и имеют открытое отверстие в своем основании, для того, чтобы модуль 10 оптического детектирования мог оптически контролировать реакцию, протекающую в реакционных контейнерах 4, размещенных в стаканах. Конструкционный материал для реакционных контейнеров 4 выбирают так, чтобы он был оптически прозрачным при длине волны света, при которой работает модуль 10 оптического детектирования. Стаканы могут быть наклонены под любым углом от такого небольшого, как 30 градусов от горизонтали, до вертикального.

На Фиг. 3 показан вид в аксонометрии устройства, выполненного в соответствии с Фиг. 1, показывающий крышку амплификатора 1 открытой для обеспечения доступа к платформе 3. Предложенное устройство 1 также содержит систему сбора и управления данными на основе ПК (не показан), в которой пользователь может выбирать заранее заданную процедуру циклической термообработки, скорости вращения и т.д.

Фиг. 4 представляет собой вид сверху альтернативного диска 21 для образцов, для использования в предложенном устройстве 1. В одном варианте выполнения диск 21 выполнен из пластмассы, которая является оптически прозрачной при длине волны света, на которой работает модуль 10 оптического детектирования. Диск 21 имеет диаметр приблизительно 130 мм и толщину 1 мм, и фактически представляет собой пластину. Диск для образцов содержит радиально внутренние загрузочные лунки 15 и радиально внешние реакционные лунки 16, которые соединены с сужающимся проходом 17. Реакционные лунки 16 имеют диаметр приблизительно 6 мм. Реакционные лунки 16 могут быть загружены центробежным способом через загрузочные лунки 15. Следует принять во внимание, что первый реагент может быть загружен в радиально внутренние загрузочные лунки 15, а второй реагент может быть загружен в радиально внешние реакционные лунки 16, и при центрифугировании первый реагент вступает в контакт со вторым реагентом. В альтернативном варианте выполнения диск 21 изготовлен, по меньшей мере частично, из материала, который выполнен с возможностью индукционного нагрева, когда он подвергается воздействию электромагнитной энергии.

В примере, показанном на Фиг. 4, плоский вращающийся диск 21 для образцов зажат между парой плоских алюминиевых дисков (не показаны), которые предпочтительно имеют одинаковую массу. Нижний диск «закреплен» и выполнен с возможностью вращения внутри устройства, тогда как верхний диск является съемным, чтобы обеспечить пользователю возможность получения доступа к лункам 15 и 16. Закрепленный диск имеет установленный внутри него вращающийся датчик температуры, для точного измерения температуры закрепленного диска. Верхний съемный диск идентичен по массе закрепленному диску, так что он поглощает ту же самую индукционную энергию, что и закрепленный диск. Температура фактической текучей среды в реакционной лунке 16 может быть смоделирована и точно контролироваться путем управления выходной энергией катушки 6 индуктивности. С помощью такой конструкции, состоящей из верхнего диска и нижнего закрепленного диска, диск 21 для образцов может быть нагрет одновременно со стороны верхней поверхности и со стороны нижней поверхности, что обеспечивает еще более быстрое увеличение температуры образца, по сравнению с вариантом выполнения, изображенным на Фиг. 2. Устройство может также работать, однако, только с нижним неподвижным диском, изготовленным из алюминия, при этом верхний-диск может быть выбран из пластмассы, однако, в этом случае скорость повышения температуры будет немного меньше. В этом примере платформа 3 представляет собой комбинацию из нижнего алюминиевого диска и диска 21, или же представляет собой диск 21, если он выполнен, по меньшей мере частично, из материала, который нагревается при воздействии на него электромагнитной энергии.

В других вариантах выполнения платформа 3 изготовлена из полимерного материала или стекла, а реакционные лунки 5 покрыты приемником электромагнитной энергии, или же платформа 3 выполнена из пластмассы и реакционные контейнеры 4 также выполнены из пластмассы, которая покрыта приемником электромагнитной энергии. В дополнительных вариантах выполнения платформа 3 выполнена из пластмассы, имеющей по меньшей мере один наполнитель, который улучшает теплопроводность и обеспечивает возможность его индукционного нагрева. В других вариантах выполнения изобретения наполнитель представляет собой ферромагнитные частицы, которые обеспечивают возможность нагрева пластмассовой платформы 3 при ее помещении в индукционное поле, за счет потерь на гистерезис, непосредственно нагревая, тем самым, платформу 3.

Несмотря на то, что изобретение было описано со ссылкой на конкретные примеры, специалистам в данной области техники будет понятно, что изобретение может быть реализовано во многих других формах. В отношении конкретных признаков любого из различных описанных примеров, они могут быть представлены в любой комбинации в любом из других описанных примеров.

Изобретение относится к амплификатору, содержащему вращающуюся платформу, имеющую реакционные лунки и/или выполненную с возможностью приема реакционных контейнеров. Вращающаяся платформа и/или реакционные лунки выполнены, по меньшей мере частично, из материала, который способен индукционно нагреваться под воздействием электромагнитной энергии. Предусмотрен источник электромагнитной энергии, выполненный с возможностью направления электромагнитной энергии на вращающуюся платформу. Источник электромагнитной энергии полностью окружает значительную часть вращающейся платформы для нагревания платформы по существу одновременно. Изобретение включает способ циклической термообработки реакционной смеси между заданными температурами с использованием усовершенствованного амплификатора, выполненного в соответствии с изобретением, а также применение усовершенствованного амплификатора для проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и лигазная цепная реакция (ЛЦР). Бесконтактный усовершенствованный амплификатор имеет повышенную скорость циклической термообработки, что позволяет снизить общее время цикла. 3 н. и 42 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Амплификатор, содержащий:

вращающуюся платформу, имеющую реакционные лунки и выполненную с возможностью индукционного нагрева при воздействии на нее электромагнитной энергии, и

катушку индуктивности, выполненную с возможностью направления электромагнитной энергии на вращающуюся платформу,

причем катушка индуктивности представляет собой первичную обмотку в трансформаторе, а вращающаяся платформа представляет собой вторичную обмотку, которая представляет собой один короткозамкнутый виток,

причем катушка индуктивности полностью окружает периферию вращающейся платформы для того, чтобы нагревать платформу по существу одновременно.

2. Амплификатор по п. 1, в котором реакционные лунки выполнены с возможностью размещения в них соответствующих реакционных контейнеров.

3. Амплификатор по п. 2, в котором каждый реакционный контейнер изготовлен из материала, который способен индукционно нагреваться под воздействием электромагнитной энергии.

4. Амплификатор по п. 3, в котором реакционный контейнер выполнен из пластмассы, имеющей наполнитель из ферромагнитных частиц, так что контейнер выполнен с возможностью индукционного нагрева.

5. Амплификатор по п. 1, в котором вращающаяся платформа имеет круглую форму, а реакционные лунки распределены по периферии платформы.

6. Амплификатор по п. 5, в котором вращающаяся платформа содержит 48, 96, 192 или 384 реакционные лунки.

7. Амплификатор по п. 1, в котором реакционные лунки выполнены в виде кольцевого массива стаканов, выполненных с возможностью размещения в них реакционных контейнеров.

8. Амплификатор по п. 7, в котором стаканы расположены под углом примерно 80 градусов к горизонтали и имеют открытое отверстие в своем основании для оптического контроля реакции, протекающей в реакционном контейнере, расположенном внутри стакана.

9. Амплификатор по п. 1, в котором вращающаяся платформа находится в тепловом контакте с материалом, который способен индукционно нагреваться под воздействием электромагнитной энергии.

10. Амплификатор по п. 9, в котором платформа представляет собой кольцевой диск диаметром приблизительно 130 мм и толщиной 1 мм, а также содержит радиально внутренние загрузочные лунки и радиально наружные реакционные лунки, причем каждая из радиально внутренних загрузочных лунок соединена с одной или несколькими радиально наружными лунками с помощью узкого прохода.

11. Амплификатор по п. 10, в котором реакционные лунки имеют диаметр приблизительно 6 мм.

12. Амплификатор по п. 11, в котором платформа находится в тепловом контакте с одним или несколькими плоскими дисками, выполненными из указанного материала.

13. Амплификатор по п. 12, в котором указанные один или несколько плоских дисков, выполненных из указанного материала, содержат верхний диск и нижний диск, причем нижний диск закреплен и расположен с возможностью вращения в устройстве амплификатора, а верхний диск является съемным для обеспечения пользователю возможности доступа к загрузочным и реакционным лункам.

14. Амплификатор по п. 9, в котором вращающаяся платформа выполнена из материала, выбранного из стали, углерода, олова, вольфрама, алюминия, меди, золота, латуни, кобальт-железа, пермаллоя, электротехнической стали, ферритной нержавеющей стали, мартенситной нержавеющей стали, феррита (никель цинк), углеродистой стали, никеля и их комбинаций.

15. Амплификатор по п. 1, в котором платформа и/или реакционные лунки содержат материал, имеющий достаточную теплопроводность для того, чтобы во время нагревания или охлаждения платформы температура всей платформы являлась однородной.

16. Амплификатор по п. 1, в котором катушка индуктивности выполнена в форме кольца.

17. Амплификатор по п. 1, в котором электромагнитное излучение доставляется на частоте в диапазоне от 5 до 100 кГц.

18. Амплификатор по п. 1, в котором катушка индуктивности выполнена с возможностью доставки непрерывной энергии или импульсов энергии, которые могут иметь одинаковую продолжительность или разные продолжительности, во время фазы нагрева.

19. Амплификатор по п. 1, который выполнен таким образом, что разница температур между любыми местами платформы составляет меньше 1%, когда платформа нагрета.

20. Амплификатор по п. 1, в котором разница температур между любыми двумя частями платформы, или внутри реагентов, содержащихся в реакционных лунках или в реакционных контейнерах, составляет менее 1°С, когда платформа нагрета.

21. Амплификатор по п. 1, в котором платформа выполнена с возможностью индукционного нагрева со скоростью больше чем 15°С/сек.

22. Амплификатор по п. 1, содержащий термопару или термистор, установленный в тепловом контакте с вращающейся платформой для непосредственного измерения температуры вращающейся платформы и/или реакционных лунок.

23. Амплификатор по п. 1, содержащий приводную систему, выполненную с возможностью приведения вращающейся платформы во вращение вокруг оси вращения, и блок управления для вращения вращающейся платформы с заданной управляемой, программируемой пользователем скоростью вращения.

24. Амплификатор по п. 1, содержащий модуль оптического детектирования для обнаружения оптического сигнала от реакции, протекающей в реакционной лунке/контейнере, и тем самым отслеживания хода реакции.

25. Амплификатор по п. 24, в котором конструкционный материал реакционного контейнера выбран таким, что он является оптически прозрачным на длине(ах) волн(ы) света, на которой(ых) работает устройство оптического детектирования.

26. Амплификатор по п. 1, содержащий охлаждающее устройство, выполненное с возможностью охлаждения платформы с помощью охлаждающей текучей среды.

27. Амплификатор по п. 26, в котором охлаждающая текучая среда представляет собой охлажденный воздух при температуре 5°С.

28. Амплификатор по п. 1, содержащий точечный источник нагрева, выбранный из лазера, излучающего видимое или ИК-излучение, или источника микроволнового излучения.

29. Амплификатор по любому из пп. 1-28, содержащий средство мониторинга для оценки хода реакции, протекающей в реакционных лунках или в реакционных контейнерах.

30. Амплификатор по п. 29, в котором средство мониторинга представляет собой флуоресцентный детектор, спектрофотометр или фотометр.

31. Амплификатор по любому из пп. 1-28, в котором вращающаяся платформа жестко установлена в устройстве.

32. Амплификатор по любому из пп. 2-8, в котором реакционный контейнер выполнен с возможностью вмещения объема текучей среды в диапазоне от 50 до 1000 мкл.

33. Амплификатор по п. 32, в котором реакционная лунка и реакционный контейнер выполнены таким образом, что максимальная высота текучей среды в реакционном контейнере совпадает с верхней поверхностью реакционной лунки.

34. Применение амплификатора по любому из пп. 1-33 для проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты, выбранной из полимеразной цепной реакции (ПЦР) и лигазной цепной реакции (ЛЦР).

35. Способ циклической термообработки реакционной смеси между заданными температурами, включающий этапы, на которых:

используют амплификатор по любому из пп. 1-33,

помещают указанную реакционную смесь в одну или несколько реакционных лунок и циклически:

приводят в действие катушку индуктивности для нагрева реакционной лунки и тем самым нагрева реакционной смеси до первой заданной температуры, и

вводят в контакт вращающуюся платформу с охлаждающей текучей средой для охлаждения реакционной смеси до второй заданной температуры, отличной от первой заданной температуры,

выполняя тем самым циклическую термообработку реакционной смеси.

36. Способ по п. 35, в котором реакционную смесь загружают в реакционный контейнер, расположенный внутри реакционной лунки.

37. Способ по п. 35, в котором осуществляют мониторинг реакционной смеси с использованием средства детектирования.

38. Способ по п. 35, в котором после каждого цикла нагрева увеличивают скорость вращения платформы в достаточной степени, так чтобы любой конденсат в верхней части реакционного контейнера под действием центробежных сил перемещался обратно вниз в направлении основания реакционного контейнера.

39. Способ по п. 38, в котором скорость вращения имеет значение между 1500 оборотов в минуту и 3000 оборотов в минуту.

40. Способ по п. 35, в котором реакционная смесь содержит реагенты, пригодные для осуществления полимеразной цепной реакции или лигазной цепной реакции.

41. Способ по п. 40, в котором выполняют циклическую термообработку в достаточной степени, так что имеют место следующие реакции:

(A) денатурация ДНК в ее составные цепи;

(Б) отжиг олигонуклеотидных праймеров с комплементарными последовательностями в ДНК; и

(B) синтез новых цепей ДНК.

42. Способ по п. 41, в котором этапы (А)-(В) повторяют до тех пор, пока не будет достигнут требуемый уровень амплификации.

43. Способ по п. 41, в котором температуру реакции варьируют приблизительно от 90 до 95°С для денатурации ДНК, от 40 до 60°С для отжига праймера с денатурированной ДНК и приблизительно от 70 до 75°С для достройки прошедших отжиг праймеров с полимеразой.

44. Способ по п. 35, в котором вращают платформу со скоростью от 500 до 1000 оборотов в минуту при опробовании реакционной смеси в реакционных лунках/контейнерах.

45. Способ по любому из пп. 35-44, в котором выполняют один или несколько из следующих этапов:

приводят в действие катушку индуктивности,

выключают или импульсно включают-выключают катушку индуктивности,

увеличивают скорость вращающейся платформы,

уменьшают скорость вращающейся платформы,

поддерживают скорость вращения платформы постоянной,

уменьшают скорость вращения платформы до нуля или близко к нулю,

впускают охлаждающий газ для охлаждения платформы,

уменьшают поток охлаждающего газа до нуля,

управляют температурой платформы до заданной температуры,

изменяют температуру платформы от одной заданной температуры до другой (либо от более холодной до более горячей, или наоборот).