Способ регенерации нервных волокон кровеносных сосудов Российский патент 2019 года по МПК A61K48/00 A61P9/10 C12N15/861 

Изобретение относится к медицине, касается стимулирования ангиогенеза и может быть использовано в сердечно-сосудистой хирургии для лечения ишемии нижних конечностей с использованием комбинации генов, кодирующих синтез проангиогенных и нейротрофических факторов.

В настоящее время ишемия, в частности хроническая ишемия нижних конечностей, лечится медикаментозным и оперативным путем, однако ни один из применяемых в практической медицине методов в полной мере не устраняет основную причину и не приводит к полному восстановлению микроциркуляции пораженной ткани.

Известно, что при сахарном диабете поражаются сосуды различного калибра, тем самым усиливая процессы атеросклероза, так как часто эти процессы имеют место у одного и того же пациента. В многочисленных исследованиях описано состояние нервных волокон и капилляров в области ишемии при диабете первого типа. В последнее время по данным научной литературы и статей значительная роль в ангиогенезе отводится нейротрофическим факторам, и, в частности, GDNF. В исследовании [Cen et al., " Denervation in femoral artery-ligated hindlimbs diminishes ischemic recovery primarily via impaired arteriogenesis" 2016 Chinese Medical Journal, February 5, 2016, Volume 129, P. 313-319] было выявлена роль денервации в ангиогенезе. Денервация лигированной бедренной артерии в задней конечности ухудшает постишемическое восстановление кровотока из-за нарушения перфузии. Возможными механизмами нарушенной перфузии являются более низкое число коллатералей, более низкая плотность капилляров и, скорее всего, более узкий просвет. Это исследование иллюстрирует важную роль периферических нервов в артериогенезе с использованием моделированной комбинированной ишемии с денервацией в задней конечности. В исследовании [Diao et al.,"Effects of denervation on angiogenesis and skeletal muscle fiber remodeling of ischemic limbs" Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2015 Mar 3; 95 (8): P. 601-605] животные были разделены на 3 группы: контроль, ишемия задней конечности, ишемия+денервация. Оцененные на 28 сутки результаты выявили, что ишемические повреждения, заключающиеся в уменьшении индекса пролиферации эндотелиальных клеток, капиллярной плотности, увеличение индекса секреции NGF, увеличения индекса секреции VEGF были более выраженные в группе ишемия + денервация по сравнению с группой ишемии, что свидетельствует о роли нервных волокон при ишемии.

Таким образом, была показана важная роль нервных волокон в процессе постишемического восстановления кровотока, что утверждает во мнении о необходимости регенерации нервных волокон для более эффективного стимулирования ангиогенеза.

В процессе изучения патентной информации были найдены изобретения, касающиеся проблем ангиогенеза и восстановления нервной ткани. Известен патент РФ на изобретение №2517117 "Способ стимулирования регенерации нерва с помощью наноконструктурированного матрикса и генетических конструкций", однако указанное изобретение относится к регенерации исключительно нерва, и не имеет отношения к росту сосудов.

Известны также изобретения "Способ получения индуцированных стволовых клеток, перепрограммированных из клеток, не являющихся нервными с использованием HMGA2 [см. патент РФ №2646099,опубл. 01.03.2018, БИ №7, МПК C12N 5/0797] и "Система и способ определения места расположения и идентификации функциональных нервов, иннервирующих стенки артерий" [см. патент РФ №2638438, опуб.13.12.2017, БИ №36, МПК А61В 18/14].

Однако эти изобретения прямо не связаны с регенерацией нервных волокон кровеносных сосудов.

Известны также "Композиция и способ для регуляции развития сосудов" [см. патент РФ №2365382, опуб. 27.08.2009, БИ №24, МПК А61К 39/395, А61Р 35/00, 17/00], предусматривающий введение индивидууму антагониста EGFL7-антагониста фактора роста клеток эндотелия сосудов VEGF. Однако данный способ используется для подавления ангиогенеза, а не его стимулирования. Таким образом, более близких аналогов предлагаемого изобретения обнаружено не было.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа, который бы помимо стимулирования ангиогенеза путем добавления ангиогенных факторов (VEGF+ANG), так же оказывал свое действие путем регенерации нервных волокон кровеносных сосудов (nervi vasorum), эффективно стимулируя ангиогенез и создавая устойчивые функциональные кровеносные сосуды.

Поставленная задача решается способом регенерации нервных волокон кровеносных сосудов генным стимулированием ангиогенеза, заключающийся во введении в область ишемии комбинации генов, кодируемых аденовирусом (Ad) Ad-VEGF + ANG + GDNF, причем в дистальную часть икроножной мышцы вводят 60 мкл. NACl, содержащего комбинацию Ad-VEGF + ANG + GDNF, с количеством вирусных частиц 2*10¹⁰.

Заявляемый способ иллюстрируется следующими исследованиями: исследование проведено на 60 крысах-самцах линии Wistar массой 220-280 г. Все вмешательства соответствовали правилам, утвержденным локальным этическим комитетом Казанского медицинского университета. В экспериментах использовали аденовирусный вектор (Ad) с встроенной экспрессионной конструкцией, несущей комбинацию генов сосудистого эндотелиального фактора роста 165 (VEGF 165) + ангиогенин (ANG) + глиальный нейротрофический фактор (GDNF) - Ad-VEGF + ANG + GDNF. Крыс наркотизировали путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г, Sigma). Ишемию задней конечности создавали путем наложения на бедренную артерию, непосредственно у места отхождения от подвздошной артерии, двух лигатур. Участок между лигатурами рассекали. После операции животные получали инъекцию по 1 мл разведенного в физиологическом растворе цефтриаксона в мышцу бедра на контралатеральной конечности. Срок ожидания хронической ишемии составил 14 дней с момента операции. Спустя 14 дней крысы были разделены на 3 группы. Животным первой группы (n=20) вводили Ad-VEGF + ANG без добавления GDNF в 60 мкл. NaCl в дистальную часть икроножной мышцы. Животным второй группы (n=20) вводили 60 мкл. NaCl с комбинацией генов Ad-VEGF + ANG + GDNF, в том же объеме и в те же точки. Животным третьей, контрольной, группы (n=20) инъецировали физиологический раствор в том же объеме и в те же точки. Забор биоматериала осуществляли на 14 сутки после введения генного материала. Для оценки результата были произведены следующие исследования: иммуногистохимическое исследование биоматериала для оценки количества кровеносных сосудов, имеющих иммунопозитивное окрашивание против CD31, С034-антигенов.

Результаты ИГХ следующие: по количеству иммунопозитивных клеток на CD 31 группа Ad-VEGF + ANG + GDNF показала в 3,3 увеличение количества сосудов по сравнению с группой Ad-VEGF + ANG, и в 4,1 раз по сравнению с контролем, в 3,6 раза по количеству иммунопозитивных клеток на CD 34 группа Ad-VEGF + ANG + GDNF больше по сравнению с группой Ad-VEGF+ANG и в 4,7 больше по сравнению с группой контроля.

По сравнению с терапией, предполагающей введение комбинации из двух генов (VEGF+ANG), введение GDNF стимулирует ангиогенез, создавая дополнительные функциональные сосуды и тем самым значительно усиливая перфузию ишемизированной ткани. Данный способ технически прост, доступен и может быть воспроизведен в иной лаборатории. Результаты данного изобретения при широком внедрении в практическую медицину позволят эффективнее лечить такие заболевания как хроническая ишемия нижних конечностей, диабетическая ангиопатия, также полинейропатия различного генеза.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ регенерации нервных волокон кровеносных сосудов генным стимулированием ангиогенеза. В дистальную часть икроножной мышцы крысы в область ишемии вводят в 60 мкл NaCl комбинацию Ad-VEGF + ANG + GDNF с количеством вирусных частиц 2⋅10¹⁰. Изобретение обеспечивает эффективное лечение хронической ишемии нижних конечностей, диабетической ангиопатии, полинейропатии различного генеза.

Способ регенерации нервных волокон кровеносных сосудов генным стимулированием ангиогенеза, заключающийся в введении в область ишемии комбинации генов, кодируемых аденовирусом (Ad) Ad-VEGF + ANG + GDNF, причем в дистальную часть икроножной мышцы крысы вводят в 60 мкл NaCl комбинацию Ad-VEGF + ANG + GDNF с количеством вирусных частиц 2⋅10¹⁰.