Устройство для исследования пространственного свертывания крови и ее компонентов Российский патент 2019 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к устройствам для исследования характеристик крови и ее компонентов, в частности их свертываемости, и может быть использовано в биологии и медицине для исследования параметров свертывания крови и ее компонентов как животных, так и человека в клинической диагностике заболеваний, а также при проведении экспериментальных исследованиях крови и ее составных частей.

В настоящее время существует большая проблема исследования динамики сложных биологических систем и происходящих в них процессов, где есть пространственная неоднородность. К таким процессам относятся, в частности, процессы свертывания крови.

Исследования свертывания крови проводят как для фундаментальных исследований тромбоза и гемостаза, так и для прикладных диагностических и фармакологических задач. Такие исследования не только позволяют диагностировать отдельные заболевания, но и оценивать активность препаратов, влияющие на параметры свертывания крови.

Система гемостаза - это сложная биологическая система, основными функциями которой являются: остановка кровотечений путем поддержания структурной целостности стенок кровеносных сосудов и достаточно быстрого их тромбирования при повреждениях и сохранение жидкого состояния крови.

Система гемостаза, отвечающая за остановку кровотечения при повреждении сосудистой системы, одна из жизненно важных и в то же время наиболее уязвимых систем человеческого организма. Большое число нарушений гемостаза обусловлено наследственно. Кроме того, самые разные заболевания и состояния, начиная от травм любого рода и заканчивая онкологическими заболеваниями и сепсисом, часто ведут к опасным нарушениям гемостаза, которые угрожают тромбозами, кровотечениями или внутренними кровоизлияниями. Таким образом, изменения в системе гемостаза оказываются непосредственной причиной смертности или инвалидности в многочисленных случаях, когда заболевание не связано изначально с нарушением работы системы свертывания.

Известны различные способы и устройства для определения параметров свертывания крови in vitro. Однако все известные способы и устройства предназначены для работы с гомогенными системами, в которых образец крови или плазмы равномерно перемешан с активатором, что существенно отличает данные системы от системы in vivo, являющейся сложной гетерогенной средой.

Известны устройства - тромбоэластографы - приборы с графической регистрацией изменений вязкости и упругоэластических свойств образующегося сгустка, предназначенные для измерения времени образования сгустка плазмы в коагулометрических тестах и содержащие кювету, в которую помещается исследуемая проба плазмы и погруженный в нее вибрирующий с определенной частотой и амплитудой стержень. По мере превращения жидкой плазмы в более плотный сгусток, стержень, вибрирующий в загустевающей плазме, испытывает все более нарастающее сопротивление со стороны густеющей жидкости вплоть до полной его остановки. По временной диаграмме движения стержня оценивают время превращения жидкой плазмы в гелеобразный сгусток, характеризующее работу системы свертывания крови пациента. Справочник по гематологии под редакцией А.Ф.Романовой, Кuев, Здоровье, 1997 г

Данное устройство позволяет с высокой производительностью осуществлять исследования большого количества проб плазмы крови, однако при этом оно обладает рядом существенных недостатков, главным из которых является то, что данное исследование проводится в гомогенной системе с постоянным перемешиванием. За счет того что весь объем плазмы от момента начала эксперимента и вплоть до его окончания постоянно перемешивается, все факторы свертывания, образующиеся в процессе образования сгустка плазмы, гомогенно распределяются по всему пространству исследуемой пробы, и поэтому образование сгустка идет одновременно во всем объеме исследуемой пробы. Эта ситуация по своей физиологической сути принципиально отличается от тех условий, в которых сгусток образуется в живом организме. В кровеносной системе человека и животных сгусток пространственно образуется не во всем объеме плазмы крови, а строго локально - только в небольшой зоне повреждения стенки кровеносного сосуда. При этом факторы свертывания закономерным образом распределяются в небольшом объеме плазмы, и лишь в нем и образуется тромб. Это отражает основные защитные механизмы работы системы гемостаза (специально созданные в процессе эволюции) - предотвращение нарушения целостности кровеносного русла за счет образования тромба в месте повреждения.

Известно устройство для исследования пространственной динамики свертывания плазмы крови, позволяющее наиболее полно смоделировать ту пространственную ситуацию, в которой кровь свертывается непосредственно в кровеносном сосуде. В этом устройстве плазма крови помещается в прозрачную полистироловую чашечку, опущенную в термостатируемую камеру, жидкость в которой непрерывно перемешивается. Это необходимо для того, чтобы выровнять температуру по всему объему камеры, в которую помещена чашечка, и полностью исключить конвективные тепловые потоки в тонком слое плазмы на дне помещенной в камеру чашечки. В пробу плазмы, налитой в чашечку, помещают стеклянный шарик. Стекло локально активирует плазму, заставляя ее свертываться только вокруг шарика, что является хорошим аналогом локального повреждения стенки кровеносного сосуда. Микроскопный столик, на котором помещена емкость, позволяет выставить место локального свертывания в центр поля зрения цифровой фотокамеры, при помощи которой осуществляется непрерывная регистрация всей картины роста сгустка. Чашечка снизу через окно в дне термостатируемой емкости подсвечивается светодиодами, а изображегие тромба, растущего вокруг шарика, последовательно кадр за кадром регистрируется цифровой фотокамерой. Оцифрованные файлы изображения каждого кадра передаются в компьютер, где в дальнейшем сравниваются друг с другом и анализируются по определенному алгоритму. Патент РФ на полезную модель №64785.

Такой непрерывный анализ роста фибринового сгустку в пространстве позволяет более детально изучать процесс свертывания крови и более точно осуществлять диагностику работы системы свертывания как в норме, так и при различных патологиях гемостаза.

Недостатком этого устройства является то, что под дном чашечки с плазмой, расположенной в устройстве горизонтально, и объективом камеры находится слой термостатируемой жидкости, где могут образовываться пузырьки воздуха, которые, находясь между фибриновым сгустком и объективом камеры, искажают реальную картину процесса свертывания и результаты компьютерного анализа.

Кроме того, чашечку с налитой плазмой заранее нужно снабдить активатором (стеклянным шариком), герметично закрыть, опустить в термостатируемую камеру, закрепить там и только после этого начинать измерение. При этом из анализа выпадает регистрация начальной фазы свертывания, важной для качественного проведения анализа.

Во время заполнения плазмой горизонтально расположенной чашечки и помещения в нее активатора вся поверхность тонкого слоя плазмы, включая и зоны, непосредственно прилегающие к активатору, открыта для попадания в нее из окружающего воздуха посторонних частиц (например, пыли), которые также могут играть роль паразитных активаторов, искажающих результаты исследования.

Известно устройство для исследования характеристик свертываемости крови и ее компонентов (см., например, RU 2395812), содержащее термостатируемую камеру с узлом термостабилизации, внутри которой размещена емкость с исследуемым образцом и активатором, светодиоды, и регистрирующий модуль с видеокамерой. Термостатируемая камера заполнена жидкостью, имеет окно для съемки; в качестве емкости для исследуемого образца используют кювету удлиненной формы с активатором свертывания, в качестве которого используется тромбопластин (тканевый фактор свертывания), нанесенный на вставку, которую вставляют в кювету. С помощью светодиодов освещают содержимое кюветы и образующийся у активатора сгусток; цифровая камера размещена напротив окна и фиксирует растущий сгусток, а компьютер обрабатывает полученные данные. Кювета размещена в держателе, продольная ось которого расположена под углом 20-40° к вертикали, а стенки кюветы прозрачны для облучающего света.

Устройство работает следующим образом. После того как температура по всему объему плазмы установится одинаковой и конвекционные потоки в плазме прекратятся, в нее медленно погружают вставку, чтобы вещество, способствующее свертыванию и нанесенное на торец вставки, коснулось поверхности плазмы. Одновременно включают цифровую камеру, связанную с компьютером. В камеру через прозрачное окно и объектив начинают поступать изображения растущего у конца вставки фибринового сгустка.

Данное устройство является наиболее близким к предложенному.

Основными недостатками известного устройства являются невысокая достоверность, точность и воспроизводимость проводимых исследований, их низкая производительность.

Полный анализ одного образца может достигать 2 часов. В условиях анализа большой партии образцов, имеющих ограниченный срок хранения, такой подход неприемлим.

Использование водяного термостатирования приводит к усложнению конструкции кюветы, поскольку ее канал должен быть длинным для полного погружения части кюветы с исследуемым образцом в воду, что вызывает проблемы при заполнении кюветы, т.к. образец плазмы плохо затекает в глубокий узкий канал; и к усложнению конструкции устройства, что снижает достоверность проводимых исследований.

При нагреве исследуемых образцов происходит образование пузырьков газа в области регистрации, которые искажают сигнал светорассеяния от фибриново го сгустка.

Регистрация изображения при использовании водяного термостатирования осуществляется сквозь слой термостатируемой жидкости, омывающей кювету, в котором могут находиться движущиеся пузырьки воздуха и другие включения, искажающие полученные данные.

Запуск реакции свертывания путем введения в кювету вставки с иммобилизованном на ее торце активатором свертывания является дополнительным источником образования пузырьков воздуха, но уже непосредственно в измерительной кювете.

Еще один недостаток известного устройства был выявлен уже в процессе исследования данных больных, страдающих различными патологиями сердечнососудистой системы. В некоторых случаях рост фибринового сгустка происходил не только в зоне локализации активатора, а спонтанно в разных точках кюветы. Причина этого явления точно неизвестна, но, по-видимому, связана с геометрией кюветы, когда фибриновый сгусток растет сверху вниз и стремится оторваться от вставки под действием силы тяжести. Во многих случаях, когда наступает фаза лизиса фибринового сгустка, наиболее слабым местом сгустка становится его точка прикрепления к вставке. Именно в этой точке начинают проявляться первые признаки начинающегося лизиса, а фибриновый сгусток или его фрагменты утрачивает связь с неподвижной вставкой, и падают на дно кюветы. Результаты исследований становятся неопределенными.

Технической проблемой, решаемой посредством предлагаемого устройства, является расширение функциональных возможностей прибора.

Технический результат состоит в повышении производительности и увеличении точности проводимых анализов, снижении трудоемкости исследования и себестоимости анализа.

Для решения вышеуказанной проблемы предложено устройство для исследования пространственного свертывания крови и ее компонентов, содержащее термос татируемую камеру с узлом термостабилизации, внутри которой размещена емкость с исследуемым образцом и активатором, светодиоды, и регистрирующий модуль с видеокамерой, при этом, емкость с исследуемым образцом представляет собой планшет с лунками, на боковую поверхность которых нанесен активатор, а дно выполнено плоским и прозрачным, регистрирующий модуль размещен в термостатируемой камере под лунками планшета с возможностью перемещения в горизонтальной плоскости по двум перпендикулярным направлениям и снабжен узлом круговой подсветки донышка лунки, представляющим собой диск с центральным отверстием и концентрически установленными на нем светодиодами и пластину с соосным отверстием, формирующим световой конус под донышком лунки, при этом термостатирование выполнено воздушным, а внутренняя поверхность термостатируемой камеры имеет рифленое покрытие из светопоглощающего материала.

Узел термостабилизации может быть выполнен разными способами, но предпочтительно, что он содержит тепловой насос на основе элемента Пельтье, термодатчики и вентилятор.

При этом, устройство снабжено кнопкой, размещенной на его корпусе, для обеспечения синхронизации момента впрыска исследуемого образца и точки отсчета для анализа кинетических кривых.

При этом, предпочтительно, что длина волны светодиодов составляет (425-560) нм.

Выполнение емкости с исследуемым образцом в виде планшета с лунками, на боковую поверхность которых нанесен активатор, а дно выполнено плоским и прозрачным, размещение регистрирующего модуля в термостатируемой камере под лунками планшета с возможностью перемещения в горизонтальной плоскости по двум перпендикулярным направлениям позволяет наблюдать рост фибринового сгустка практически в «чистом виде», в присутствии незначительной прослойки жидкой фазы между сгустком и средством наблюдения за ним. Данная прослойка не обладает экранирующими свойствами, что приводит к возможности надежного определения параметров роста сгустка в цельной крови, что недостижимо в известных устройствах. Возможно использование в качестве кюветы стандартного 96 луночного планшета, допускающего работу с многоканальными пипетками.

При этом, выполнение емкости с исследуемым образцом в виде планшета с лунками позволяет работать с очень маленькими объемами плазмы или цельной крови (от 25 мкл для 96-луночного планшета), что расширяет диапазон используемых образцов. Эта возможность особенно актуальна при работе с кровью новорожденных или мелких лабораторных животных.

Нанесение активатора свертывания только на внутреннюю боковую поверхность лунок, под которыми размещен регистрирующий модуль, включающий в себя видеокамеру, сфокусированную на внутренней стенке донышка лунки; а также то, что регистрирующий модуль установлен с возможностью перемещения в горизонтальной плоскости по двум перпендикулярным направлениям и снабжен узлом круговой подсветки донышка лунки, представляющим собой диск с центральным отверстием и концентрически установленными на нем SMD светодиодами и пластину с соосным отверстием, формирующим световой конус под донышком лунки для наблюдения за растущим сгустком методом темного поля позволяет повысить точность и воспроизводимость проводимых анализов, посредством увеличение протяженности граничной линии между фибриновым сгустком и жидкой фазой, по сравнению с традиционными способами нанесения активатора на шариковый носитель или торцевую поверхность стрипа. Поскольку видеоанализу подвергается в первую очередь состояние граничной линии, ее удлинение, при прочих равных условиях, означает получение большего количества информации, что увеличивает точность анализа (в статистическом смысле).

В отличие от специализированной кюветы в известных приборах, рост фибринового сгустка в предложенном устройстве происходит от стенки лунки планшета к ее центру, как в кровеносном сосуде при повреждении его стенки. Рост сгустка происходит в горизонтальной плоскости планшета. При этом отсутствует сила, стремящаяся оторвать сгусток от стенки лунки с активатором. В результате анализ становится более точным.

Использование регистрирующего модуля, размещенного под донышком лунки и воздушного термостатирования, в отличие от водяного в известных устройствах, позволяет устранить паразитарное влияние пузырьков воздуха, особенно при работе с цельной кровью. Случается, что при добавлении жидкой фазы в лунку происходит захват пузырьков воздуха. Однако, поскольку видеокамера регистрирующего модуля сфокусирована на внутренней стенке донышка лунки, всплывшие пузырьки воздуха незначительно влияют на точность измерений. При этом, исключена возможность образования пузырьков между планшетом и регистрирующим модулем.

Как оказалась, длина волны излучающих светодиодов должна быть - (425-560) нм., что близко к максимуму поглощения гемоглобина. Это повышает контрастность изображения при работе с цельной кровью. Цельная кровь для таких длин волн является хорошей световой ловушкой, при том, что сам фибриновый сгусток в этом диапазоне длин волн отлично рассеивает свет, и хорошо виден. Это также повышает точность исследований.

В прототипе в качестве теплоносителя использована оптически прозрачная жидкость. Ее основное достоинство - высокая теплоемкость, способствующая быстрому и равномерному прогреву измерительной кюветы. Однако на этом ее достоинства и заканчиваются. Жидкостной теплоноситель является источником пузырьков воздуха и грязи (при длительной эксплуатации) в камере.

Выполнение узла термостабилизации воздушным и содержащим тепловой насос на основе элемента Пелтье, термодатчики и вентилятор повышает точность проводимых анализов и удобство эксплуатации устройства в целом. Более низкая теплоемкость воздуха по сравнению с жидкостной средой, а значит и пониженная способность к прогреву образцов, компенсируется интенсивной принудительной циркуляцией воздуха по всему объему термостатированной камеры. Температура воздуха непрерывно контролируется термодатчиками в разных точках камеры, а наличие ПИД- регулятора позволяет поддерживать температуру на заданном уровне.

Кроме того, возможность воспользоваться при анализе многоканальной пипеткой и одномоментное заполнение множества лунок при точном соотнесении времени впрыска проб в лунки с началом реакции свертывания за счет снабжения устройства кнопкой размещенной на его корпусе, для синхронизации момента впрыска пробы и точки отсчета для анализа кинетических кривых также повышает точность анализа.

Увеличение производительности производимых анализов по сравнению с аналогами происходит за счет следующего:

регистрирующий модуль последовательно сканирует каждую лунку планшета. Интервал между просмотрами лунок составляет около 1 секунды. При использовании 96-луночного планшета и 8-ми канальной автоматической пипетки на просмотр стрипа планшета уйдет всего 8 секунд, а на просмотр всех стрипов планшета около 96 секунд. Это максимальный период дискретизации при построении кинетических кривых анализа при условии полной загруженности планшета. При среднем времени анализа около 3 часов каждая кинетическая кривая будет построена по 112 точкам, что вполне приемлемо. При меньшей загрузке планшета точность апроксимации кинетических кривых будет еще выше. Таким образом, по сравнению с аналогами, производительность устройства почти на два порядка выше.

Предлагаемое устройство показано на чертежах, где на фиг. 1 схематично показана блок-схема устройства, на фиг. 2 - схематично - регистрирующий модуль, размещенный под донышком лунки.

Устройство для исследования локально-активированного свертывания крови и ее компонентов включает корпус 1, внутри которого размещена термостатируемая сам ера 2, блок питания 3 и микропроцессорный блок управления 4, подсоединенный к персональному компьютеру 5.

Термостатируемая камера 2 имеет узел термостабилизации, который содержит тепловой насос 6 на основе элемента Пельтье, термодатчики 7, вентилятор 8; плгншет 9 с лунками 10, на боковую поверхность которых в нижней части нанесен активатор 11 (например, тромбопластин). Дно 12 лунок 10 выполнено плоским и прозрачным.

Термостатируемая камера 2 имеет регистрирующий модуль 13 с видеокамерой 14. который установлен с возможностью перемещения в горизонтальной плоскости по двум перпендикулярным направлениям под лунками 10 планшета 9 с помощь о блока перемещения 15.

Регистрирующий модуль 13 снабжен узлом круговой подсветки донышка 12 лунки 10, представляющим собой диск 16 с центральным отверстием 17 и концентрически установленными на нем светодиодами 18. Регистрирующий модуль 13 имеет пластину 22 с соосным отверстием 19, формирующим световой конус под донышком 12 лунки 10.

Внутренняя поверхность термостатируемой камеры 2 имеет рифленое покрытие 20 из светопоглощающего материала, выполняющее роль световой ловушки.

Устройство имеет кнопку 21 для обеспечения синхронизации момента впрыска исследуемого образца и точки отсчета начала анализа.

Работает устройство следующим образом.

В термостатируемую камеру 2 устройства помещают планшет 9 с лунками 10. на боковую поверхность которых нанесен активатор 11; предварительного прогревают его в течении заданного времени. Затем с помощью многоканальной пипетки в лунки 10 планшета 9 добавляют испытуемые образцы крови или ее компонентов и фиксируют этот момент нажатием на кнопку 21. Образцы крови или ее компонентов также предварительно прогревают до рабочей температуры. С момента нажатия кнопки 21 осуществляют непрерывный просмотр всех лунок 10 за счет перемещения регистрирующего модуля 13, собирают видеоданные, анализируют их. Просмотр лунки означает захват видеокамерой 14 нескольких кадров плоского донышка 12 лунки 10 и передачи этих кадров в персональный компьютер для последующего видеоанализа. Видеоанализу подвергается весь кадр. Результатам видеоанализа является получение количественных и качественных характеристик роста фибринового сгустка и его лизиса. Обычно определяют лаг-период, начальную и максимальную скорости роста сгустка, время начала проявления признаков фибринолиза, наличие в жидкой фазе спонтанных сгустков фибрина и еще ряд других характеристик. Заключительным этапом анализа является формирование отчета о характеристиках свертывания в каждой лунке.

Таким образом, предлагаемое устройство позволяет расширить функциональные возможности прибора, повысить производительность и увеличить точность, проводимых на приборе анализов, при снижении трудоемкости исследования и себестоимости анализа.

Изобретение относится к области исследования характеристик крови и ее компонентов, в частности их свертываемости. Устройство для исследования пространственного свертывания крови и ее компонентов содержит термостатируемую камеру с узлом термостабилизации, внутри которой размещена емкость с исследуемым образцом и активатором, светодиоды, и регистрирующий модуль с видеокамерой. При этом емкость с исследуемым образцом представляет собой планшет с лунками, на боковую поверхность которых нанесен активатор, а донышко выполнено плоским и прозрачным, регистрирующий модуль размещен в термостатируемой камере под лунками планшета с возможностью перемещения в горизонтальной плоскости по двум перпендикулярным направлениям и снабжен узлом круговой подсветки донышка лунки, представляющим собой диск с центральным отверстием и концентрически установленными на нем светодиодами и пластину с соосным отверстием, формирующим световой конус под донышком лунки, при этом термостатирование выполнено воздушным, а внутренняя поверхность термостатируемой камеры имеет рифленое покрытие из светопоглощающего материала. Изобретение обеспечивает повышение производительности и увеличение точности проводимых анализов, снижение трудоемкости исследования и себестоимости анализа. 3 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Устройство для исследования пространственного свертывания крови и ее компонентов, содержащее термостатируемую камеру с узлом термостабилизации, внутри которой размещена емкость с исследуемым образцом и активатором, светодиоды, и регистрирующий модуль с видеокамерой, отличающееся тем, что емкость с исследуемым образцом представляет собой планшет с лунками, на боковую поверхность которых нанесен активатор, а донышко выполнено плоским и прозрачным, регистрирующий модуль размещен в термостатируемой камере под лунками планшета с возможностью перемещения в горизонтальной плоскости по двум перпендикулярным направлениям и снабжен узлом круговой подсветки донышка лунки, представляющим собой диск с центральным отверстием и концентрически установленными на нем светодиодами и пластину с соосным отверстием, формирующим световой конус под донышком лунки, при этом термостатирование выполнено воздушным, а внутренняя поверхность термостатируемой камеры имеет рифленое покрытие из светопоглощающего материала.

2. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что узел термостабилизации содержит тепловой насос на основе элемента Пельтье, термодатчики и вентилятор.

3. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что оно снабжено размещенной на его корпусе кнопкой для обеспечения синхронизации момента впрыска исследуемого образца и точки отсчета начала анализа.

4. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что длина волны светодиодов составляет (425-560) нм.