Способ in vitro пролиферации стволовых клеток и применение устройства для усиления пролиферации стволовых клеток in vitro Российский патент 2019 года по МПК C12N5/775 

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии, конкретно, к способу пролиферации стволовых клеток, осуществляемому in vitro, и к устройству для усиления пролиферации стволовых клеток in vitro.

Электротерапия на основе электротермической технологии, известная как емкостно-резистивная передача электрического тока (Cret), представляет собой неинвазивную стратегию, основанную на использовании переменных токов, имеющих частоты в диапазоне от 0,4 МГц до 0,6 МГц (диапазон, входящий в высокочастотный спектр), с целью повышения температуры органов или тканей, которые представляют собой мишень для обработки действием указанных переменных электрических токов. Было показано, что такой тип технологии является эффективным при лечении в реабилитационной, восстановительной и эстетической медицине, например, для регенерации повреждений, вызванных травмой, или дегенеративных повреждений тканей, благодаря уменьшению ассоциированной боли, уменьшению воспаления, улучшению кровообращения, улучшению сосудистого и мышечного тонуса и улучшению рассасывания гематом, отеков и жидкости, скопившейся в суставах и мягких тканях.

В последнее время, когда начато применение электротерапии в области онкологии в комбинации с химиотерапией или радиотерапией, показывается увеличение выживаемости пациентов, которых лечили с помощью одной из указанных комбинированных терапий.

Первоначально считалось, что эффекты электротерапии возникали исключительно из-за ее термического компонента, и не признавалось, что электрический компонент может оказывать воздействие на клетки.

Однако в последние годы были проведены многочисленные исследования и изыскания, основанные на применении электротерапии в субтермических условиях, с целью анализа воздействия электрического компонента на клетки и исключения возможных рисков онкогенеза или развития опухоли. Указанные исследования продемонстрировали, что электрический компонент лечения действительно оказывает воздействие на клетки так, что при его приложении к культурам линий опухолевых клеток наблюдали цитостатический или цитотоксический эффекты. Конкретно, было продемонстрировано, что:

- переменный ток, имеющий частоту 0,57 МГц, прикладываемый в субтермических условиях (5-минутные импульсы при 0,57 МГц и плотности тока 50 мкА/мм², прикладываемые каждые 4 часа в течение от 12 до 24 часов) к культурам клеток клеточной линии HepG2 (зарегистрированной в АТСС (Американской коллекции типовых культур) под № НВ-8065), происходящей из клеток гепатокарциномы человека, оказывает на них цитостатическое воздействие и эффект дифференцировки клеток (, M.L. et al., International Journal of Oncology, 2007, 30, 583-592; , M.L. et al., International Journal of Oncology, 2010, 37, 1399-1405; и , M.L. et al., PLoS ONE, 2014, 9, 1e84636);

- переменный ток, имеющий частоту 0,57 МГц, прикладываемый в субтермических условиях (5-минутные импульсы при 0,57 МГц и плотности тока 50 мкА/мм², прикладываемые каждые 4 часа в течение от 12 до 24 часов) к культурам клеток клеточной линии NB69 (номер по каталогу 99072802 Sigma в Sigma-Aldrich), происходящей из клеток нейробластомы человека, оказывает цитотоксический эффект (, M.L. et al., International Journal of Oncology, 2012, 41, 1251-1259).

Помимо указанных противоопухолевых эффектов, также было раскрыто, что переменный ток, имеющий частоту 0,57 МГц, прикладываемый в субтермических условиях (5-минутные импульсы при 0,57 МГц и плотности тока 50 мкА/мм², прикладываемые каждые 4 часа в течение от 12 до 24 часов) не вызывает какого-либо обнаруживаемого эффекта в культурах мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых доноров, поскольку не наблюдали никаких изменений в выживаемости, некрозе и в распределении субпопуляций клеток после обработки с использованием указанного переменного электрического тока (, M.L. et al., International Journal of Oncology, 2012, 41, 1251-1259).

В результате всесторонних и исчерпывающих экспериментов авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что приложение переменных электрических токов, имеющих частоту в диапазоне от 0,4 до 0,6 МГц, к культурам стволовых клеток усиливает их in vitro пролиферацию без воздействия на их способность к дифференцировке.

При использовании в настоящем документе термин «стволовая клетка» и его множественное число относится к недифференцированным клеткам, обладающим потенциалом превращаться в клетки одного или более других клеточных типов.

При использовании в настоящем документе «усиление пролиферации» относится к генерированию большего количества клеток в конкретный период времени по сравнению с контрольными культурами.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу in vitro пролиферации стволовых клеток, отличающемуся тем, что он включает стадию обработки культуры стволовых клеток с использованием переменного тока, имеющего частоту в диапазоне от 0,4 МГц до 0,6 МГц.

Предполагается, что указанные стволовые клетки могут быть любого типа, известного в уровне техники. Указанные стволовые клетки могут быть тотипотентными, плюрипотентными или мультипотентными. В предпочтительном воплощении стволовые клетки, используемые в способе пролиферации по настоящему изобретению, выбирают из группы, которая включает мультипотентные стволовые клетки, более предпочтительно стволовые клетки, используемые в способе по настоящему изобретению, представляют собой мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки.

Как известно из уровня техники, указанные мезенхимальные стволовые клетки могут происходить из различных тканей. Для способа по настоящему изобретению указанные мезенхимальные стволовые клетки происходят или получены предпочтительно из жировой ткани, еще более предпочтительно из подкожной жировой ткани. В последнем случае используемые указанные стволовые клетки предпочтительно имеют пассаж от 3 до 6.

Используемые стволовые клетки могут происходить из живого существа любого вида, более предпочтительно указанные стволовые клетки представляют собой стволовые клетки млекопитающего, и еще более предпочтительно указанные стволовые клетки представляют собой стволовые клетки человека. Таким образом, в наиболее предпочтительном воплощении в способе по настоящему изобретению используют мезенхимальные стволовые клетки человека, более предпочтительно происходящие из подкожной жировой ткани.

В уровне техники известны способы выделения разных стволовых клеток из различных тканей, из которых происходят указанные стволовые клетки.

В предпочтительном воплощении переменный ток имеет частоту в диапазоне от 0,4 МГц до 0,5 МГц, еще более предпочтительно указанный переменный ток имеет частоту 0,448 МГц.

Условия для указанной выше стадии обработки в отношении используемых времени обработки и/или плотности тока зависят от многих факторов, таких как, среди прочего, объем культуры, плотность культуры и расстояние между электродами. На основе указанной информации специалист в данной области техники будет способен установить подходящие условия времени обработки и плотности тока.

Предполагается, что указанные условия времени обработки и плотности тока могут быть установлены таким образом, что стадию обработки осуществляют в термических условиях, что означает, что в дополнение к обычному электрическому эффекту прикладываемого тока указанный ток также вызывает повышение температуры.

Однако в предпочтительном воплощении условия времени обработки и плотности тока устанавливают так, чтобы стадию обработки осуществлять в субтермических условиях (что означает, что продуцируется только обычный электрический эффект прикладываемого тока, не вызывая повышения температуры). Предпочтительно стадия обработки длится от 12 до 72 часов, более предпочтительно 48 часов. Кроме того, на указанной стадии обработки ток прикладывается предпочтительно в виде импульсов тока продолжительностью от 1 до 10 минут, более предпочтительно 5 минут, и разделенных паузами (период, в течение которого ток не прикладывается) от 1 до 8 часов, более предпочтительно в 4 часа. В данном воплощении плотность переменного тока составляет предпочтительно от 1 до 100 мкА/мм², еще более предпочтительно 50 мкА/мм².

Таким образом, в наиболее предпочтительном воплощении стадия обработки продолжается в течение 48 часов, и на указанной стадии ток прикладывают с плотностью 50 мкА/мм² с импульсами продолжительностью 5 минут, разделенными паузами продолжительностью 4 часа.

Стадию обработки способа in vitro пролиферации по настоящему изобретению осуществляют, используя пару электродов, изготовленных из подходящего материала (например из нержавеющей стали), подведенных к культуре и подключенных к устройству, генерирующему переменный ток. Предпочтительно подключение электродов к устройству, генерирующему переменный ток, является последовательным или параллельным. Более предпочтительно подключение электродов является последовательным. Примеры устройств, генерирующих переменный ток, представляют собой следующие устройства от Indiba®: модель Activ 902 и модель ELITE.

Предполагается, что способ по настоящему изобретению осуществляют в сосуде или биореакторе любого типа, доступного в уровне техники для культивирования стволовых клеток. В предпочтительном воплощении способ осуществляют в чашке Петри, еще более предпочтительно в чашке Петри диаметром 60 мм.

Способ по настоящему изобретению также включает одну или более стадий из числа стадий, обычно используемых в культивировании стволовых клеток, таких как подсчет клеток, подлежащих посеву, посев точного и подходящего количества клеток, поддержание указанных клеток в культуре (с соответствующими изменениями среды, когда специалист в данной области техники посчитает это уместным или подходящим) и сбор клеток (физические и/или ферментативные стадии для получения клеток, такие как соскабливание и/или трипсинизация). В предпочтительном воплощении способ in vitro пролиферации стволовых клеток по настоящему изобретению отличается тем, что он включает стадии:

а) посева стволовых клеток с плотностью от 725 клеток/см² до 1360 клеток/см²;

б) обработки культуры стволовых клеток с использованием переменного тока, имеющего частоту в диапазоне от 0,4 МГц до 0,6 МГц;

в) поддержания стволовых клеток в культуре; и

г) сбора стволовых клеток.

Диапазон плотности клеток, приведенный на стадии (а) способа по настоящему изобретению, относится к клеткам, которые растут в адгезивном состоянии (предпочтительно мезенхимальные стволовые клетки человека и еще более предпочтительно мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из подкожной жировой ткани). Однако специалист в данной области техники будет способен экстраполировать или адаптировать указанную плотность к случаю стволовых клеток, растущих в суспензии.

Как отмечалось ранее, предполагается, что способ по настоящему изобретению может быть осуществлен в сосуде или биореакторе любого типа, доступном в уровне техники для культивирования стволовых клеток, более предпочтительно в чашке Петри, еще более предпочтительно в чашке Петри диаметром 60 мм.

Стадия (б) обработки культуры стволовых клеток с использованием переменного тока, имеющего частоту в диапазоне от 0,4 МГц до 0,6 МГц, является такой, как раскрыто выше.

На стадии (в) поддержания стволовых клеток в культуре указанные стволовые клетки обрабатывают согласно стандартным протоколам, известным в уровне техники и в зависимости от применения, для которого получают указанные клетки. Для анализа клеточной пролиферации стволовые клетки собирают и/или обрабатывают непосредственно на покровных стеклах сразу же после заключительного 5-минутного цикла обработки. Для исследований хондрогенной, адипогенной или остеогенной дифференцировки в мезенхимальных стволовых клетках перед их обработкой указанные стволовые клетки выдерживают в течение 14 суток в соответствующих средах для дифференцировки.

На стадии (г) предполагается, что для сбора стволовых клеток используют физические, химические или ферментативные методы либо их комбинации. Например, когда стволовые клетки растут прилипшими к поверхности, для получения клеток можно комбинировать ферментативные методы, такие как трипсинизация, с физическими методами, такими как соскабливание.

Способ по настоящему изобретению обеспечивает возможность усиления пролиферации культивируемых стволовых клеток без негативного воздействия на их способность к дифференцировке. Таким образом, предполагается, что после указанных выше стадий можно добавлять или осуществлять стадию дифференцировки стволовых клеток. Характеристики указанной стадии дифференцировки клеток будут зависеть от типа используемых стволовых клеток, которые будут обладать конкретной возможностью или способностью к дифференцировке.

А именно, когда в способе по настоящему изобретению используют мезенхимальные стволовые клетки человека (предпочтительно полученные из подкожной жировой ткани), указанная выше стадия дифференцировки может представлять собой, среди прочего, стадию адипогенной, хондрогенной или остеогенной дифференцировки так, чтобы указанные стволовые клетки дифференцировались в адипоциты, хондроциты или остеоциты, соответственно.

Условия культивирования, которые способствуют дифференцировке разных стволовых клеток в клетки различных типов, известны из уровня техники. Например, для мезенхимальных стволовых клеток человека (предпочтительно полученных из подкожной жировой ткани), условия осуществления указанных выше способов дифференцировки представляют собой:

- адипогенная дифференцировка: культивирование в присутствии подходящих концентраций 3-изобутил-1-метил ксантина, индометацина, инсулина и дексаметазона, предпочтительно 3-изобутил-1-метилксантина в концентрации 0,25 мМ, индометацина в концентрации 200 мкМ, инсулина в концентрации 10 мкг/мл и дексаметазона в концентрации 1 мкМ;

- хондрогенная дифференцировка: культивирование в присутствии подходящих концентраций 2-фосфата аскорбиновой кислоты, TGF-β1 (трансформирующий ростовой фактор бета-1), инсулина и дексаметазона, предпочтительно 2-фосфата аскорбиновой кислоты в концентрации 150 нМ, TGF-β1 в концентрации 10 нг/мл, инсулина в концентрации 10 мкг/мл и дексаметазона в концентрации 100 нМ;

- остеогенная дифференцировка: культивирование в присутствии подходящих концентраций костного морфогенетического белка 2 (ВМР-2), дексаметазона, 2-фосфата аскорбиновой кислоты и β-глицерофосфата, предпочтительно костного морфогенетического белка 2 (ВМР-2) в концентрации 10 нг/мл, 2-фосфата аскорбиновой кислоты в концентрации 50 мкМ, β-глицерофосфата в концентрации 10 мМ и дексаметазона в концентрации 100 нМ.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения также раскрывается применение устройства для генерирования переменного тока, имеющего частоту в диапазоне от 0,4 МГц до 0,6 МГц, для усиления пролиферации стволовых клеток in vitro.

Режимы применения устройства, генерирующего переменный ток, являются такими, как объясняется выше. Таким образом, в наиболее предпочтительном воплощении устройство, генерирующее переменный ток, используют при частоте 0,448 МГц.

Также предпочтительно, когда указанное устройство, генерирующее переменный ток, используют в течение 48 часов путем приложения импульсов тока продолжительностью 5 минут с 4-х часовыми паузами между указанными импульсами тока и при плотности тока 50 мкА/мм².

Стволовые клетки также являются такими, как раскрыто выше. Таким образом, в наиболее предпочтительном воплощении указанные стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из подкожной жировой ткани, еще более предпочтительно пассажа от 3 до 6.

Для облегчения его понимания, настоящее изобретение более подробно описывается ниже со ссылкой на прилагаемые графические материалы, которые приведены в качестве примера, и со ссылкой на иллюстративные и неограничивающие примеры.

На Фиг.1 показаны результаты флуоресцентного анализа, выполненного в примере 2 настоящего изобретения. Представленные треугольники и построенная по указанным треугольникам кривая соответствуют культурам мезенхимальных клеток человека, полученным из подкожной жировой ткани, пассажей 2-8, обработанным с использованием переменного тока, имеющего частоту 0,448 МГц. Результаты для числа клеток представлены в виде процентов от числа клеток, полученных в соответствующих контролях. На Фиг. 1 ось ординат (у) соответствует числу клеток, выраженному в виде процентов от числа клеток, наблюдавшихся в соответствующем контроле; а ось абсцисс (х) соответствует номеру пассажа.

На Фиг. 2 показаны результаты, полученные в ХТТ-анализе (анализ с использованием 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолиум-5-карбоксанилида), выполненном в примере 3 настоящего изобретения. Представленные треугольники и построенная по указанным треугольникам кривая соответствуют культурам мезенхимальных клеток человека, полученным из подкожной жировой ткани, пассажей 3-7, обработанным с использованием переменного тока, имеющего частоту 0,448 МГц. Результаты показывают измеренную оптическую плотность при 492 нм в каждом из пассажей в виде процентов от оптической плотности, измеренной в соответствующем контроле. На этой фигуре ось ординат (у) соответствует оптической плотности, измеренной при 492 нм, в виде процентов от наблюдаемой оптической плотности (при той же длине волны) в соответствующем контроле; а ось абсцисс (х) соответствует номеру пассажа.

На Фиг. 3 показаны результаты, полученные в анализе включения бромдезоксиуридина из примера 4 настоящего изобретения. Находящийся слева столбец соответствует результатам, полученным для контрольных культур мезенхимальных клеток, полученных из подкожной жировой ткани; а находящийся справа столбец соответствует результатам, полученным для культур мезенхимальных клеток человека, полученных из подкожной жировой ткани, обработанных с использованием переменного тока, имеющего частоту 0,448 МГц. Результаты для числа клеток представлены в виде процентов от числа клеток, полученных в соответствующих контролях. На этой фигуре ось ординат (у) соответствует числу клеток, выраженному в виде процентов от числа клеток, наблюдавшихся в соответствующем контроле; а ось абсцисс (х) соответствует, как указано выше, анализируемой группе.

На Фиг. 4 показаны результаты анализа клеточного цикла, полученные в примере 5 настоящего изобретения. Все показанные столбцы соответствуют культурам мезенхимальных клеток человека, полученных из подкожной жировой ткани, обработанным с использованием переменного тока, имеющего частоту 0,448 МГц. Находящийся слева столбец относится к фазе G0/G1 клеточного цикла. Центральный столбец соответствует фазе S клеточного цикла. Находящийся справа столбец относится к фазе G2/M клеточного цикла. Результаты представлены в виде процентов по сравнению с контролем. На этой фигуре ось ординат (у) соответствует процентам по сравнению с процентами, наблюдавшимися в контроле; а ось абсцисс (х) соответствует, как указано выше, фазам клеточного цикла.

На Фиг. 5 показаны результаты, полученные в иммунофлуоресцентном анализе, относящемся к экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), для культур мезенхимальных клеток человека, полученных из подкожной жировой ткани, обработанных с использованием переменного тока, имеющего частоту 0,448 МГц, в примере 6 по настоящему изобретению. Результаты представлены в виде процентов по сравнению с контролем. На этой фигуре ось ординат (у) соответствует процентам по сравнению с контролем; а ось абсцисс (х) соответствует, как указано выше, анализируемой группе.

На Фиг. 6 показаны результаты, полученные в анализах по исследованию способности к дифференцировке, выполненных в примере 7 настоящего изобретения. На Фиг. 6A показаны результаты, относящиеся к адипогенной дифференцировке; на Фиг. 6B показаны результаты, относящиеся к хондрогенной дифференцировке; и на Фиг. 6C показаны результаты, относящиеся к остеогенной дифференцировке. На этих трех фигурах находящийся слева столбец соответствует результатам, полученным для контрольных культур мезенхимальных клеток, полученных из подкожной жировой ткани; а находящийся справа столбец соответствует результатам, полученным для культур мезенхимальных клеток человека, полученных из подкожной жировой ткани, обработанных с использованием переменного тока, имеющего частоту 0,448 МГц. На этих трех фигурах ось ординат (у) относится к средней оптической плотности, а ось абсцисс (х), как указано выше, относится к исследуемой группе. Значения оптической плотности получали путем анализа микрофотографических изображений биологических образцов, выполняемого с применением компьютера, используя программу AnalySIS 3.1.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение мезенхимальных стволовых клеток, происходящих из подкожной жировой ткани

Мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из жировой ткани, выделяли из образцов подкожной жировой ткани, полученных во время обычных хирургических процедур от четырех здоровых доноров (двух мужчин возрастом 65 и 69 лет и двух женщин возрастом 29 и 35 лет).

Исследование и процедуры были оценены и одобрены Комитетом по этике клинических исследований Университетской больницы Ramon у Cajal (Madrid, Spain), и добровольцы согласились на донорство в письменной форме согласно стандартной процедуре информированного согласия.

Кусочки жировой ткани размером 0,5-1 см³, полученные от указанных выше пациентов, очищали, чтобы удалить из них фиброзную ткань, видимые фасции и кровеносные сосуды. Затем указанные кусочки жировой ткани разрезали, используя скальпель, на маленькие кусочки или фрагменты размером 1-2 мм³. Фрагменты подвергали расщеплению, используя коллагеназу А в концентрации 1 мг/мл (Roche Applied Science, Basel, Switzerland) в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) (Hyclone, Sur Logan, Utah, USA) в течение 40 минут при 37°C с осторожным перемешиванием.

Активность коллагеназы А останавливали, используя фетальную бычью сыворотку в культуральной среде DMEM (модифицированная по Дульбекко среда Игла), имеющей высокую концентрацию глюкозы (Biowhittaker, Verviers, Belgium).

Затем присутствующие в этих фрагментах клетки отделяли, используя микропипетку Р1000 и наконечники MultiGuard (Sorenson Bioscience, Salt Lake City, UT, USA). После отделения крупные кусочки ткани и/или неотделившиеся кровеносные сосуды могут быть осаждены в течение 2 минут на дно стерильной центрифужной пробирки и собрана суспензия клеток (супернатант).

Собранную суспензию клеток переносили в другую пробирку и центрифугировали при 300 G в течение 5 минут для получения стромальной сосудистой фракции клеток путем седиментации. После аспирации супернатанта и плавающего слоя жировых клеток осадок или слой на дне повторно суспендировали в культуральной среде MesenPro (MesenPro-RS^®, Gibco, Invitrogen, Camarillo, CA, USA), дополненной 1% глутамина (Gibco, Invitrogen, Camarillo, CA, USA) и 1% смеси пенициллин-стрептомицин (Gibco, Invitrogen, Camarillo, CA, USA) и высевали в 75 см² Т-колбу (Falcon, Corning, USA). Через 48 часа культуру промывали дважды, используя сбалансированный солевой раствор Хенкса для удаления любого остатка и клеток, не прикрепившихся к колбе. После промываний в культуру клеток снова вводили среду MesenPro, как указано выше. Спустя двое суток, на четвертые сутки среду заменяли. На седьмые сутки, когда клеток становились конфлюэнтными, указанные клетки пассировали. Для этого клетки отделяли от колбы, используя 0,05% трипсина и 0,02% EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота, Sigma, Saint Louis, МО, USA) в сбалансированном солевом растворе Хенкса. После получения клетки высевали в новую чашку с плотностью 670 клеток/см². Когда культура достигала конфлюэнтности, клетки собирали, как указано выше, разделяли на аликвоты и указанны ал и квоты замораживали в растворе, состоящем из 10% об. DMSO (диметилсульфоксид, Sigma, Saint Louis, МО, USA) и 90% об. фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Invitrogen, Paisley, Scotland, United Kingdom).

Пример 2. Анализ посредством флуоресцентного окрашивания клеточных ядер усиления пролиферации мезенхимальных стволовых клеток человека, полученных из подкожной жировой ткани, после обработки переменным током

Из стволовых клеток, полученных согласно примеру 1, пять чашек Петри культивировали для обработки переменным током и пять контрольных чашек Петри для каждого из следующих условий: клетки от пассажа 2, от пассажа 3, от пассажа 4, от пассажа 5, от пассажа 6, от пассажа 7 и от пассажа 8, что давало всего 70 чашек Петри. Во всех случаях используемые чашки Петри имели диаметр 60 мм.

Плотность клеточной культуры составляла 725 клеток/см². Через четверо суток после посева указанные чашки обрабатывали переменным током, используя пары электродов из нержавеющей стали, как описано в известном уровне техники (смотри, например, , M.L. et al., International Journal of Oncology, 2007, 30, 583-592), присоединенные последовательно к устройству, генерирующему переменный ток, Indiba Activ 902 (INDIBA^®, Barcelona, Spain). Обработка длилась в течение 48 часов, а устройство настраивали на частоту 0,448 МГц и так, чтобы схема обработки имела вид: 5-минутные импульсы тока с последующими 4-часовыми паузами с плотностью тока 50 мкА/мм².

После 48-часовой обработки клетки фиксировали, используя 4%-ный параформальдегид, пермеабилизировали, используя 0,1%-ный тритон в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), и ядра клеток окрашивали, используя бисбензимид Н 33258 (Sigma, Saint Louis, МО, USA) в концентрации 10^-5 М.

Затем подсчитывали число клеток на поверхности чашек Петри, а именно, на поверхности, расположенной в пределах прямоугольника, ограниченного двумя электродами, использовавшимися для обработки. Подсчет клеток выполняли, используя флуоресцентный микроскоп Olympus IX-70. Использовали объектив с линзами 10х и 24 выбранных случайным образом микроскопических поля (840 мкм × 630 мкм; площадь = 0,5292 мм²), разделенных средним расстоянием 1,25 мм, подсчитывали, выбрав случайным образом, и фотографировали и анализировали. Подсчитывали ядра с по меньшей мере половиной их площади, включенной в поле, и суммарное число клеток на обработанной площади оценивали, исходя из указанного подсчета.

Полученные результаты приведены на Фиг. 1. На указанной фигуре можно видеть увеличение на 5%-25% количества клеток в пассажах от 3 до 6, когда культуру мезенхимальных клеток человека, полученных их подкожной жировой ткани, обрабатывали, используя переменный ток, как указано выше.

Пример 3. Изучение посредством ХТТ-анализа усиления пролиферации мезенхимальных стволовых клеток человека, полученных из подкожной жировой ткани, после обработки переменным током

Результаты примера 2 подтверждали путем выполнения соответствующего эксперимента для измерения пролиферации посредством ХТТ-анализа. Для этого получали культуры так, как раскрыто в указанном примере 2, но в данной ситуации анализировали пассажи от 3 до 7.

Вслед за стадией обработки культивированные клетки в пределах площади обработки (между электродами), как для контрольной группы, так и для обработанной группы, инкубировали с ХТТ солью тетразолия в течение 3 часов при температуре 37°C и атмосфере с 6,5% СО₂. Метаболически активные клетки восстанавливали ХТТ соль, продуцируя интенсивно окрашенные соединения формазана, которые оценивали количественно, используя микропланшет-ридер (TECAN, Mannedorf, Switzerland) при длине волны 492 нм. Полученные значения соотносили непосредственно с числом активных клеток.

Полученные результаты приведены на Фиг. 2. В соответствии с результатами, полученными путем подсчета клеток с использованием флуоресцентного окрашивания ядер, повышение приблизительно на 5%-25% оптической плотности в пассажах от 3 до 6 также демонстрировали, используя ХТТ-анализ, когда культуру мезенхимальных клеток человека, полученных из подкожной жировой ткани, обрабатывали, используя переменный ток. Указанное повышение оптической плотности является результатом увеличения числа клеток (усиления пролиферации).

Пример 4. Изучение, путем анализа включения бромдезоксиуридина, усиления пролиферации мезенхимальных стволовых клеток человека, полученных из подкожной жировой ткани, после обработки переменным током

Пролиферацию мезенхимальных клеток из примера 1 также анализировали посредством анализа включения бромдезоксиуридина. В этом случае анализировали клетки из пассажей от 3 до 5, которые культивировали в чашках Петри в 12 мм покровных стеклах, помещенных в зону, расположенную между электродами. Культивирование и обработку клеток с использованием переменного тока осуществляли, как раскрыто в примере 2, единственное изменение заключалось в том, что в течение последних шести часов обработки культуры инкубировали в присутствии бромдезоксиуридина в концентрации 3 мМ.

После обработки переменным током клетки фиксировали, используя 4%-ный параформальдегид, и пермеабилизировали, используя смесь этанол: уксусная кислота (95:5) в течение 10 минут при 4°C. Клетки в покровных стеклах инкубировали в течение ночи при 4°C с мышиными моноклональными антителами анти-BrdU (разбавление 1:20, Dako, Glostrup, Denmark) с последующим одним часом иммунофлуоресцентного мечения путем инкубации при температуре окружающей среды с антителами против мышиного IgG в комбинации с Alexa Fluor 568 (разбавление 1:500, Molecular Probes, Invitrogen, Camarillo, CA, USA). Ядра клеток подвергали флуоресцентному окрашиванию, используя бисбензимид Н 33258 (Sigma, Saint Louis, МО, USA), как указано ранее в примере 2, за исключением того факта, что в данной процедуре клетки обрабатывали на покровных стеклах, в которых указанные клетки росли.

Покровные стекла анализировали посредством флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse ТЕ300. Выполняли четыре повтора эксперимента, каждый с четырьмя покровными стеклами на экспериментальную группу. Число всех ядер и бромдезоксиуридин-положительных клеток подсчитывали в выбранных полях посредством систематического случайного отбора образцов. Исследовали в общей сложности по 15 полей на покровное стекло. Изображения регистрировали и анализировали, используя программное обеспечение Analysis 3.1 (Soft Imaging Systems GmbH, Munster, Germany).

Полученные результаты приведены на Фиг. 3. Количество пролиферирующих клеток, присутствующих в разных культурах (обработанных или контрольных) анализировали непосредственно, используя этот анализ. Как можно видеть на Фиг. 3, в группе культур, к которым прикладывали переменный ток (обработанные культуры), наблюдали значительное увеличение примерно на 38% числа пролиферирующих клеток по сравнению с контролями.

Пример 5. Анализ нарушения клеточного цикла вследствие влияния стадии обработки переменным током

Клетки, выделенные согласно примеру 1, культивировали и обрабатывали, как указано в примере 2. В этом случае использовали только мезенхимальные стволовые клетки из пассажей 3 и 4.

После стадии обработки клетки, растущие в зоне, находящейся между электродами, собирали, используя трипсин, помещали в пробирки Эппендорфа и фиксировали путем обработки в 1 мл 70%-ного этанола при 4°C в течение ночи. Образцы приблизительно с 1×105 клеток на чашку промывали дважды забуференным фосфатом физиологическим раствором и инкубировали в течение одного часа в темноте при температуре окружающей среды с окрашивающим раствором пропидия йодида с концентрацией 20 мг/мл (Boehringer, Ingelheim, Germany), дополненным РНазой А (200 нг/мл; Boehringer, Ingelheim, Germany) в цитратном буфер в концентрации 3,4 мМ.

Клетки анализировали на проточном цитометре (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Обнаружили десять тысяч событий на образец, используя программное обеспечение CellQuest 3.2 (BD Biosciences).

Полученные результаты приведены на Фиг. 4, который показывает, что в культурах клеток, обработанных с использованием переменного тока, имеет место увеличение числа клеток в фазах S и G2/M клеточного цикла и незначительное снижение числа клеток в фазе G0/G1 клеточного цикла, все в сравнении с контролями. Эти результаты согласуются с результатами, прокомментированными ранее, и свидетельствуют об усилении клеточной пролиферации (наблюдали, что обработка стимулировала прогрессирование клеток на протяжении разных фаз клеточного цикла).

Пример 6. Анализ изменчивости экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) вследствие влияния стадии обработки переменным током

Клетки, выделенные согласно примеру 1, культивировали и обрабатывали, как указано в примере 2. В этом случае использовали только мезенхимальные стволовые клетки из пассажей от 3 до 5, посеянные в покровные стекла, помещенные в чашки Петри диаметром 60 мм.

Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) представляет собой белок, ассоциированный с ДНК-полимеразой, который обычно используют в качестве маркера для клеток, которые находятся в фазах S и G2 клеточного цикла.

После стадии обработки клетки фиксировали, используя 4%-ный параформальдегид, и пермеабилизировали в смеси этанол: уксусная кислота в соотношении 95:5, инкубировали в течение ночи при 4°C в присутствии антитела анти-PCNA (Santa Cruz Biotechnologies, ТХ, USA) и в заключении подвергали флуоресцентному окрашиванию путем инкубирования с антимышиным IgG, скомбинированным с Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Invitrogen, Camarillo, CA, USA) в течение одного часа при температуре окружающей среды. Ядра клеток подсчитывали окрашиванием, используя бисбензимид Н 33258 (Sigma, Saint Louis, МО, USA).

Проценты PCNA-положительных клеток в разных группах (контрольные культуры и обработанные культуры) оценивали, как описано в примере 4 для подсчета числа всех ядер и бромдезоксиуридин-положительных клеток.

Полученные результаты показаны на Фиг. 5. На указанной фигуре можно видеть, что культуры мезенхимальных клеток человека, обработанные с использованием переменного тока, демонстрировали увеличение приблизительно на 35% числа клеток, которые экспрессировали маркер PCNA, по сравнению с контролями. Эти результаты свидетельствовали об усилении пролиферации в культурах мезенхимальных клеток человека, обработанных с использованием переменного тока.

Пример 7. Исследование способности к дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток человека, полученных из подкожной жировой ткани, обработанных с использованием переменного тока

Первичное культивирование и обработку мезенхимальных клеток, полученных согласно примеру 1, выполняли, как указано в примере 2.

После стадии обработки чашки выдерживали в течение 14 суток в соответствующей дифференциаторной среде, выполняли три повтора эксперимента, каждый с четырьмя обработанными чашками и четырьмя контрольными чашками на повтор и дифференциаторную среду:

- исследование способности к адипогенной дифференцировке: использовали базальную среду (DMEM, имеющая высокую концентрацию глюкозы, 20% фетальной бычей сыворотки, 1% глутамина и 1% смеси пенициллин-стрептомицин), в которую добавляли 3-изобутил-1-метилксантин в концентрации 0,25 мМ, индометацин в концентрации 200 мкм, инсулин в концентрации 10 мкг/мл и дексаметазон в концентрации 1 мкМ;

- исследование способности к хондрогенной дифференцировке: использовали базальную среду (DMEM, имеющая высокую концентрацию глюкозы, 20% фетальной бычьей сыворотки, 1% глутамина и 1% смеси пенициллин-стрептомицин), в которую добавляли 2-фосфат аскорбиновой кислоты в концентрации 150 нМ, TGF-β1 в концентрации 10 нг/мл, инсулин в концентрации 10 мкг/мл и дексаметазон в концентрации 100 нМ;

- исследование способности к остеогенной дифференцировке: использовали базальную среду (DMEM, имеющая высокую концентрацию глюкозы, 20% фетальной бычьей сыворотки, 1% глутамина и 1% смеси пенициллин-стрептомицин), в которую добавляли костный морфогенетический белок 2 (ВМР-2) в концентрации 10 нг/мл, 2-фосфат аскорбиновой кислоты в концентрации 50 мкМ, β-глицерофосфат в концентрации 10 мм и дексаметазон в концентрации 100 нМ.

Такой же процесс выполняли в параллели для соответствующих контролей.

Затем культуры фиксировали и окрашивали, используя масляный красный О (Sigma, Saint Louis, МО, USA) для анализа адипогенной дифференцировки, используя альциановый синий для анализа хондрогенной дифференцировки и используя ализариновый красный для анализа остеогенной дифференцировки.

Полученные результаты в отношении количественного определения окрашивания показаны на Фиг. 6.

На Фиг. 6А видно, что отсутствует разница в окрашивании масляным красным О между культурами, обработанными с использованием переменного тока, и контролями. В силу этого был сделан вывод, что стадия обработки с использованием переменного тока не влияет на способность к адипогенной дифференцировке указанных мезенхимальных клеток человека.

На Фиг. 6B видно, что отсутствует разница в окрашивании альциановым синим между культурами, обработанными с использованием переменного тока и контролями. В силу этого был сделан вывод, что стадия обработки с использованием переменного тока не влияет на способность к хондрогенной дифференцировке указанных мезенхимальных клеток человека.

На Фиг. 6С видно, что отсутствует разница в окрашивании ализариновым красным между культурами, обработанными с использованием переменного тока и контролями. В силу этого был сделан вывод, что стадия обработки с использованием переменного тока не влияет на способность к остеогенной дифференцировке указанных мезенхимальных клеток человека.

Хотя изобретение было описано со ссылкой на предпочтительные воплощения, указанные воплощения не следует рассматривать в качестве ограничения изобретения, которое определено путем самой широкой интерпретации следующей формулы изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к in vitro пролиферации стволовых клеток, полученных из подкожной жировой ткани, и применению устройства для генерирования переменного тока для усиления пролиферации стволовых клеток in vitro. Способ включает стадию обработки культуры стволовых клеток с использованием переменного тока, имеющего частоту в диапазоне от 0,4 до 0,6 МГц. Изобретение позволяет осуществить пролиферацию стволовых клеток, полученных из подкожной жировой ткани. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 6 ил., 7 пр.

1. Способ in vitro пролиферации стволовых клеток, полученных из подкожной жировой ткани, отличающийся тем, что он включает стадию обработки культуры стволовых клеток с использованием переменного тока, имеющего частоту в диапазоне от 0,4 до 0,6 МГц.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из подкожной жировой ткани.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из жировой ткани, представляют собой клетки пассажа от 3 до 6.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что высокочастотный ток имеет частоту в диапазоне от 0,4 до 0,5 МГц.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что высокочастотный ток имеет частоту 0,448 МГц.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что стадия обработки длится 48 часов.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что обработка прикладывается в виде импульсов продолжительностью 5 минут и разделенных паузами продолжительностью 4 часа.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что плотность высокочастотного тока составляет 50 мкА/мм².

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что он включает стадии:

а) посева стволовых клеток с плотностью от 725 до 1360 клеток/см²;

б) обработки культуры стволовых клеток с использованием переменного тока, имеющего частоту в диапазоне от 0,4 до 0,6 МГц;

в) поддержания стволовых клеток в культуре; и

г) сбора стволовых клеток.

10. Применение устройства для генерирования переменного тока, имеющего частоту в диапазоне от 0,4 до 0,6 МГц, для усиления пролиферации стволовых клеток in vitro.

11. Применение по п. 10, отличающееся тем, что устройство, генерирующее переменный ток, используют при частоте 0,448 МГц.

12. Применение по любому из пп. 10 или 11, отличающееся тем, что высокочастотное генерирующее устройство используют в течение 48 часов посредством приложения импульсов тока продолжительностью 5 минут с паузами продолжительностью 4 часа между указанными импульсами тока и при плотности тока 50 мкА/мм².

13. Применение по любому из пп. 10-12, отличающееся тем, что стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из подкожной жировой ткани, пассажа от 3 до 6.