Способ получения полиакрилата золота, проявляющего противоопухолевую активность Российский патент 2019 года по МПК C08F8/42 C08F20/06 A61K31/78 

Изобретение относится к медицинской химии и онкологии и может быть использовано для получения полиакрилата золота, проявляющего противоопухолевую активность.

Полиакрилат золота, известный, также, под названием аурумакрил, представляет собой продукт взаимодействия полиакриловой кислоты (ПАК) и золотохлористоводородной кислоты HAuCl₄ в водном растворе. По данным [RU 2607519 С1, опубл. 10.01.2017], аурумакрил представляет собой неполную золотую соль полиакриловой кислоты, отвечающую общей формуле (-СН₂-СНСООН-)_n (-CH₂CHCOOAuCl₃H-)_m, где, n = 1100 - 3800, m = 100 - 800; в форме 1,0 - 10%-ного водного раствора предложен в качестве гемостатического средства.

Исследования, проведенные in vivo на солидных опухолях мышей (карцинома легких Льюис, аденокарцинома толстой кишки Акатол, аденокарцинома молочной железы Са-755), выявили способность полиакрилата золота тормозить рост опухолей на 70 - 90% по сравнению с контролем [Л.А. Островская, М.Г. Воронков, Д.Б. Корман, Н.В. Блюхтерова, М.М. Фомина, В.А. Рыкова, К.А. Абзаева, Л.В. Жилицкая «Полиакрилаты благородных металлов как потенциальные противоопухолевые препараты» Биофизика, 2014, том 59, вып. 4, с. 785-789]. В работе также сообщается о низкой токсичности аурумакрила: исследование острой токсичности (мыши BDF1) показало, что при однократном внутрибрюшинном введении препарата срединная летальная доза LD₅₀ (вызывающая гибель 50% животных), и максимально переносимая доза (не приводящая к гибели мышей) составляют 150 и 100 мг/кг соответственно.

Описано цитотоксическое и цитостатическое действие полиакрилата золота на клетки карциномы молочной железы человека линии MCF-7. Препарат не только индуцирует гибель большей части опухолевых клеток, но также снижает пролиферативную способность клеток, выживших после воздействия препарата [Л.А. Островская, А.К. Грехова, Д.Б. Корман, А.Н. Осипов, Н.В. Блюхтерова, М.М. Фомина, В.А. Рыкова, К.А. Абзаева «Клеточные эффекты противоопухолевого препарата аурумакрила» Биофизика, 2017, том 62, вып. 3, с. 598-603].

Полиакрилат золота рассматривается в настоящее время в качестве перспективного противоопухолевого средства и является объектом углубленного изучения.

Исследование физико-химических свойств полиакрилата золота показало, что в УФ-спектрах водных растворов в кислой среде имеется максимум поглощения при λ = 226,5 нм (А_226,5) с коэффициентом экстинкции ε = 3,5×10⁴ л⋅моль^-1⋅см^-1. Это хорошо согласуется с данными для тетрахлораурат-иона - при ν = 44 200 см^-1 ε = 4,0×10⁴ л⋅моль^-1⋅см^-1, приведенными в работе [Макотченко Е.В., Малкова В.И., Белеванцев В.И. «Электронные спектры поглощения галогенидных комплексов золота (III) в водных растворах» Координационная химия. 1999, Т. 25, №4, с. 302-309] и подтверждает, что поглощение растворов аурумакрила в области λ ~ 226 нм в кислых средах связано с присутствием в его молекуле трехвалентного золота Au(III). Экспериментально установленная нами величина коэффициента экстинкции акрилатного звена -СН₂-СНСООН- при λ=226,5 нм составляет <10⁶ л⋅моль^-1⋅см^-1. Таким образом, вклад звеньев ПАК в общее поглощение аурумакрила при λ=226,5 нм не превышает 0,3%. При расчете содержания Au(III) этим вкладом можно пренебречь. Нейтральное золото Au(0), которое, как будет показано ниже, может содержаться в препаратах полиакрилата золота, также не вносит заметного вклада в поглощение в данной области, поэтому величина А_226,5 может быть использована для оценки содержания в получаемых образцах аурумакрила трехвалентного золота.

Сравнение цитотоксической активности разных образцов аурумакрила, полученных нами в ходе оптимизации условий заявляемого способа (см. Фиг. 1), показало, что, независимо от конкретных условий получения образца, в широком интервале концентраций наблюдается близкая к линейной зависимость между цитотоксической активностью препарата в отношении клеточной линии MCF-7 рака молочной железы человека и концентрацией Au(III) в растворе, рассчитанной по величине А_226,5. Определение цитотоксической активности в отношении клеток карциномы молочной железы человека MCF-7 выполнено с помощью теста МТТ [Cory АН, Owen ТС, Barltrop JA, Cory JG (July 1991). "Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture" Cancer Communications. 3 (7): 207-212. ISSN 0955-3541], рутинно используемого для оценки выживаемости клеток млекопитающих в культурах. Результаты этих исследований говорят о том, что главным действующим началом, обеспечивающим цитотоксическое действие аурумакрила на клетки РМЖ, является трехвалентное золото, входящее в координационный комплекс с карбоксильной группой полиакрилата. Полиакрилатная цепь, по-видимому, может оказывать косвенное влияние на противоопухолевую активность препарата, экранируя активное трехвалентное золото от присутствующих в биологических средах агентов, способных переводить его в неактивную нейтральную форму Au(0).

Таким образом, определение содержания Au(III) в полиакрилате золота по поглощению водного растворов при λ=226,5 нм в кислой среде, позволяет прогнозировать их цитотоксическую активность на клеточной культуре MCF-7 РМЖ человека in vitro и служить мерой этой активности.

Необходимым условием для проведения комплекса доклинических исследований полиакрилата золота в качестве потенциального противоопухолевого средства является наличие способа его синтеза, обеспечивающего получение хорошо растворимого в воде препарата с высоким содержанием трехвалентного золота, сохраняющего оба эти качества (водорастворимость и биологическую активность) при хранении.

В принятом за прототип патенте на изобретение [RU 2607519 С1, опубл. 10.01.2017] описан способ получения неполной золотой соли полиакриловой кислоты, который характеризуется тем, что к раствору полиакриловой кислоты прибавляют водный раствор золотохлористоводородной кислоты HAuCl₄, реакционную смесь перемешивают 60 минут, полученный раствор высушивают в вакууме при температуре не выше 50°С. В примерах осуществления изобретения для получения препарата используют водные растворы ПАК с молекулярной массой ММ=100 кДа. При этом реагенты вводят в реакцию в количествах, обеспечивающих примерно 30 - 60-кратные мольные избытки мономерного акрилатного звена относительно золотохлористоводородной кислоты. Выход, определенный исходя из количественных соотношений между введенными в реакцию исходными веществами и полученными продуктами, по данным авторов, составляет более 98%. Продукты охарактеризованы результатами элементного анализа.

Оценивая результаты синтеза, необходимо иметь в виду, что содержание активного Au(III) в конечном продукте, и как следствие, противоопухолевая активность препарата, могут снижаться за счет спонтанного частичного восстановления Au(III), что приводит к накоплению в продукте нейтрального металлического золота, не вносящего вклада в противоопухолевую активность полиакрилата золота. Действительно, методом трансмиссионной электронной микроскопии (микроскоп JEM-100 В фирмы JEOL (Япония) с приставкой для рентгенофазового анализа при ускоряющем напряжении 120 кВ), нами показано присутствие в продуктах взаимодействия ПАК с золотохлористоводородной кислотой наночастиц золота размером от 1 до 100 нм. Протекающие параллельно образованию полиакрилата золота восстановительные реакции не только снижают эффективность использования дорогостоящей золотохлористоводородной кислоты, но и приводят к получению образцов с пониженной противоопухолевой активностью.

Таким образом, результаты синтеза полиакрилата золота, как потенциального противоопухолевого средства, целесообразно оценивать не по общему химическому выходу и результатам элементного анализа, как в [RU 2607519 С1, опубл. 10.01.2017], а по содержанию в конечном продукте трехвалентного золота, отвечающего за его цитотоксическую активность, а также - по степени конверсии исходной золотохлористоводородной кислоты в ион HAuCl₃⁺ в составе конечного продукта.

Мольное содержание (М) Au(III) в составе конечного продукта рассчитывают по поглощению А_226,5, используя коэффициент экстинкции ε = 3,5×10⁴ л⋅моль^-1см^-1. Для предотвращения реакции гидролиза тетрахлораурат-иона величину А_226,5 рабочего раствора полиакрилата золота определяют после разведения образца в 100 мМ HCl в 300 раз или более.

Степень конверсии (К) исходной золотохлористоводородной кислоты в ион HAuCl₃⁺ в составе полученного полиакрилата золота рассчитывают как отношение А_226,5 для полученного раствора полиакрилата золота к теоретически рассчитанному значению А_226.5 раствора коммерческого препарата золотохлористоводородистой кислоты, полученного при разведении использованной для синтеза навески в объеме 100 мМ HCl, равном объему полученного раствора полиакрилата золота.

Первоначальные попытки использовать примеры осуществления принятого нами за прототип изобретения [RU 2607519 С1, опубл. 10.01.2017] в качестве методики для наработки вещества для проведения доклинических исследований показали, что способ не гарантирует получение продукта, отвечающего требованиям, предъявляемым к соединениям, испытываемым в качестве потенциальной фармакологической субстанции. Было обнаружено, что в условиях способа по прототипу значительная часть введенного в реакцию золота (III) трансформируется в неактивное наноразмерное нейтральное золото Au(0), что приводит к получению препарата со сниженной биологической активностью. Также обнаружено, что при хранении в стандартных условиях снижается растворимость продукта в воде и происходит дальнейшее уменьшение содержания в нем трехвалентного золота. Все это затрудняет или делает невозможным использование препарата, полученного в соответствии с описанием к изобретению [RU 2607519 С1, опубл. 10.01.2017], для проведения биологических испытаний, и тем более - для практического применения в качестве фармакологической субстанции.

Проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в разработке способа получения полиакрилата золота с максимально возможной степенью конверсии золотохлористоводородной кислоты в Au(III) в составе продукта, при этом сохраняющего водорастворимость и цитотоксическую активность в отношении клеток карциномы молочной железы человека линии MCF-7 в процессе хранения в стандартных условиях.

Для решения этой задачи оптимизация условий способа в сравнении с прототипом проведена в следующих направлениях:

- снижение вероятности протекания побочных восстановительных реакций, приводящих к неэффективному использованию дорогостоящей золотохлористоводородной кислоты и снижению содержания в продукте трехвалентного золота, ответственного за проявление его цитотоксической активности;

- подбор мольных количественных соотношений между исходными реагентами, обеспечивающих максимальную степень конверсии Au(III) золотохлористоводородной кислоты в полиакрилат золота в сравнении с прототипом и его устойчивость при хранении;

- оптимизация стадии выделения продукта, обеспечивающая получение препарата, сохраняющего водорастворимость и цитотоксическую активность при хранении.

Проблема решена предлагаемым способом получения полиакрилата золота, включающим взаимодействие водных растворов полиакриловой кислоты и золотохлористоводородной кислоты, отличающимся тем, что перед введением в реакцию исходную полиакриловую кислоту подвергают проточному диализу и последующей лиофильной сушке, водные растворы золотохлористоводородной кислоты и диализованной полиакриловой кислоты вводят в реакцию в количествах, обеспечивающих примерно 6 - 12-кратный мольный избыток мономерного звена (-СН₂-СНСООН-) относительно золотохлористоводородной кислоты, при этом применяют полиакриловую кислоту со средней молекулярной массой, в диапазоне 1,6 - 140 кДа, а полученный продукт подвергают проточному диализу.

Полиакрилат золота, полученный заявляемым способом, устойчив при хранении в стандартных условиях как в растворе, так и в сухой форме, полученной лиофилизацией очищенной диализом реакционной смеси.

На Фиг. 1. показана зависимость цитотоксической активности полиакрилата золота от концентрации препарата, выраженной в мЕд А_226,5 (соответствует содержанию Au(III)). По оси абсцисс отложена концентрация тестируемого раствора образца полиакрилата золота (мЕд А_226,5), по оси ординат - доля (в %) погибших клеток линии MCF-7 карциномы молочной железы человека, определенная с помощью теста МТТ.

Для получения полиакрилата золота заявляемым способом используют коммерческие препараты полиакриловой кислоты. Необходимым этапом, обеспечивающим получение конечного продукта, пригодного для исследования в качестве потенциального противоопухолевого средства, является предварительная диализная очистка вводимого в реакцию полимера от содержащихся в нем примесей, присутствие которых в реакционной среде снижает выход и качество конечного продукта. Механизмы побочных реакций, протекающих с участием примесей, не изучены, однако, в модельных экспериментах нами показано, что присутствие ионов Na⁺ в исходном растворе полиакриловой кислоты приводит к снижению содержания Au(III) в конечном продукте на 15 - 50%. Образцы аурумакрила, полученные из ПАК, содержавшей примеси Na⁺, не только характеризуются невысоким содержанием трехвалентного золота, но и быстро теряют свою цитотоксическую активность и водорастворимость при хранении в стандартных условиях. Очистку исходного полимера целесообразно осуществлять с помощью проточного диализа, в процессе которого происходит деионизация исходной полиакриловой кислоты. Так, например, если до проведения диализа электропроводность растворов неочищенных коммерческих препаратов ПАК с ММ = 1,6 кДа и 140 кДа с содержанием сухого вещества 3% (0,42 М полиакрилатного звена с ММ = 72,06 г/моль) составляет от 14,3 до 15,6 мСм/см при 20°С, что соответствует содержанию ионов Na⁺~0,13 М (Ф. Берне, Ж. Кардонье, Водоочистка, Москва, Химия, 1997). На этом основании содержание одновалентных катионов, дающих основной вклад в электропроводность водных растворов при нейтральных рН, может быть оценено как 1 катион щелочного металла на 3 звена ПАГ. то после диализа электропроводность тех же растворов снижается до 69 - 75 мкСм/см при 20°С, т.е. в среднем в 200 раз. Таким образом, остаточное содержание катионов снижается до уровня ~0,6 мМ (1 катион щелочного металла на 600-650 звеньев ПАГ).

В процессе проточного диализа исходный полимер также освобождается от примесей низкомолекулярных реагентов, используемых в процессе получения полиакриловой кислоты (персульфат аммония, N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин) и от других низкомолекулярных продуктов, которые способствуют протеканию восстановительных реакций, приводящих к снижению в продукте содержания активного трехвалентного золота. В результате диализа против воды в течение 12-24 часов при комнатной температуре потеря сухих веществ в исходном полимере составляет до 30%.

Состав и количественное содержание примесей в исходном полимере могут колебаться от партии к партии и отличаться для сырья от различных производителей, однако, предварительная очистка исходного полимера является необходимым условием осуществления изобретения, поскольку присутствующие примеси провоцируют и ускоряют процессы восстановления биологически активного трехвалентного золота в неактивное металлическое золото. Очищенный полимер лиофильно высушивают и далее используют для получения полиакрилата золота.

Взаимодействие между ПАК и золотохлористоводородной кислотой осуществляют в водном растворе при комнатной температуре на воздухе при перемешивании в течение не менее 1 часа.

Эмпирически найдено, что для получения хорошо растворимого в воде продукта, содержащего максимальное количество Au(III), следует использовать примерно 6-12-кратные мольные избытки мономерного акрилатного звена (-СН₂-СНСООН-) относительно золотохлористоводородной кислоты. Уменьшение мольного избытка акрилата приводит к получению продуктов с недостаточной растворимостью в воде, а его увеличение невозможно из-за ограниченной растворимости ПАК в воде. Использование в способе по прототипу (примеры 1 и 2) неоправданно высоких 30 - 60-кратных мольных избытков мономерного акрилата относительно золотохлористоводородной кислоты, наряду с отсутствием процедуры предварительной очистки ПАК, по-видимому, является одной из причин низкой конверсии золотохлористоводородной кислоты в конечный продукт.

Также нами показано, что для получения продукта, отвечающего требованиям хорошей растворимости и максимальной конверсии Au(III) из золотохлористоводородной кислоты в готовый продукт, концентрация полиакрилата золота в исходной реакционной смеси должна составлять от примерно 3 до примерно 10 мг/мл. При более низкой концентрации происходит к снижение величины К (конверсии трехвалентного золота в конечный продукт); применение концентраций выше 10% невозможно из-за ограниченной растворимости ПАК в воде.

Следует отметить, что предварительная диализная очистка исходной полиакриловой кислоты в сочетании с применением оптимальных мольных соотношений между реагентами позволяет получать полиакрилат золота с высоким содержанием Au(III) в широком диапазоне средних молекулярных масс исходного полимера: от 1,6 до 250 кДа. Однако, при увеличении средней молекулярной массы исходного полимера выше 140 кДа наблюдается снижение водорастворимости конечного продукта и снижение величины K, что делает препарат непригодным для испытаний и применения в качестве противоопухолевого средства.

По завершении реакции реакционную смесь подвергают проточному диализу для удаления образовавшейся в процессе реакции соляной кислоты, остатков непрореагировавшей золотохлористоводородной кислоты и других низкомолекулярных примесей. Это обеспечивает получение полиакрилата золота, устойчивого при хранении, как в виде водного раствора, так и в сухом виде после лиофилизации. При этом продукт сохраняет хорошую растворимость в воде и высокое содержание трехвалентного золота.

Изобретение проиллюстрировано примерами осуществления в сравнении с прототипом. В качестве исходных реагентов во всех примерах использованы коммерческие образцы полиакриловой кислоты (SigmaAldrich, США) с разными значениями средних молекулярных масс ММ и золотохлористоводородная кислота HAuCl₄×(3 - 4) H₂O производства ОАО «Аурат».

Пример 1 (сравнительный). Получение полиакрилата золота способом по прототипу. ММ_ПАК = 100 кДа.

Навеску 50 мг полиакриловой кислоты ММ = 100 кДа растворяют в 938 мкл воды при перемешивании при комнатной температуре в течение 12 часов. К полученному 5,7%-ному раствору по каплям добавляют 61 мкл водного раствора, содержащего 8,3 мг золотохлористоводородной кислоты. Мольное соотношение между мономерным акрилатом в составе ПАК и золотохлористоводородной кислотой ~32:1. Реакцию ведут в течение 1 часа при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 60 об/мин. Реакционную смесь высушивают в вакуум-эксикаторе в течение 24 часов при комнатной температуре при остаточном давлении 10-30 мм рт. ст.

Масса сухого продукта 57,8 мг (выход 99,14%).

Растворимость в воде свежеприготовленного образца - более 10 мг/мл, но менее 15 мг/мл.

Определение содержания Au(Ш) и степени конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе полиакрилата золота

Навеску 10 мг сухого препарата растворяют при перемешивании в течение 1 часа в 1 мл воды. Аликвоту объемом 100 мкл смешивают с 2 мл раствора HCl 100 мМ. Поглощение полученного раствора при λ=226,5 А_226,5 = 0,967 Ед.

Содержание в сухом продукте Au(III), рассчитанное, как описано выше, по величине А_226,5: M_Au(III)=12,5 мкмоль/мг общих сухих веществ.

Степень конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе полиакрилата золота, рассчитанная, как описано выше: K = 15,6%.

При хранении до использования в течение 12 часов в стандартных условиях (в закрытых ампулах без доступа света при температуре плюс 4÷6°С) водный раствор полиакрилата золота меняет цвет, наблюдается образование темного осадка, содержание в растворе трехвалентного золота снижается на 18%. Через 14 дней хранения до использования содержание в растворе активного трехвалентного золота уже не превышает 10% от исходного. При хранении в тех же условиях сухого препарата растворимость в воде падает до значений менее 3 мг/мл. Такая нестабильность препарата, полученного в соответствии с описанием к изобретению [RU 2607519 С1, опубл. 10.01.2017], делает его практически непригодным для проведения биологических испытаний, и тем более - для практического применения в качестве фармакологической субстанции.

Приведенные ниже примеры 2-10 описывают различные варианты получения полиакрилата золота заявляемым способом, однако не охватывают всех вариантов, подпадающих под формулу изобретения.

Пример 2. ММ_ПАК = 100 кДа. Мольное соотношение между мономерным акрилатом в составе ПАК и золотохлористоводородной кислотой ~12:1. Начальная концентрация раствора ПАК в реакционной смеси ~3%.

Водный раствор ПАК со средней молекулярной массой ММ = 100 кДа концентрацией ~3% подвергают проточному диализу против воды в диализном мешке MWCO 15000) в течение 12 часов при комнатной температуре. После диализа образец лиофильно высушивают. Потеря сухого вещества составляет 29,3%.

Готовят ~3%-ный раствор очищенного и высушенного, как описано выше полимера. Навеску 50 мг растворяют в 1,67 мл воды в течение 12 часов при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке. К раствору по каплям прибавляют 30 мкл водного раствора, содержащего 23,8 мг золотохлористоводородной кислоты: в исходной реакционной смеси концентрация ПАК равна 2,94%. Мольное соотношение между мономерным акрилатом в составе ПАК и золотохлористоводородной кислотой 11,72:1. Реакцию ведут 12 часов, при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 60 об/мин. Реакционную смесь очищают от низкомолекулярных примесей проточным диализом против воды в течение 12 часов при комнатной температуре с использованием диализного мешка MWCO 15000).

После очистки диализом раствор полиакрилата золота лиофильно высушивают.

Масса сухого продукта 50,8 мг.

Растворимость в воде 29,3±3,3 мг/мл.

Определение содержания Au(III) и степени конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе полиакрилата золота проводят аналогично примеру 1. Поглощение раствора с концентрацией сухих веществ 29,3±3,3 мг/мл при λ = 226,5 А_226,5 = 1,53 Ед.

Содержание Au(III) в сухом продукте М _Au(III)=21,1±0,6 мкмоль/мг общих сухих веществ.

Степень конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе полиакрилата золота К = 38,2%.

При хранении сухого препарата до использования в стандартных условиях (без доступа света и воздуха температура +4°С) в течение 44 суток растворимость вещества в воде остается неизменной, а содержание Au(III) составляет М _Au(III)=20,9±0,6 мкмоль/мг общих сухих веществ.

Таким образом, сравнение результатов, полученных в примерах 1 и 2, показывает, что при одной и той же средней молекулярной массе исходного полимера введение в способ стадии диализной очистки исходного полимера и уменьшение мольного избытка акрилатного звена по отношению к исходной золотохлористоводородной кислоте на стадии взаимодействия исходных компонентов, даже при использовании более низкой концентрации полимера в реакционной смеси позволяет более, чем вдвое увеличить в конечном продукте содержание активного трехвалентного золота и получить сухой препарат, устойчивый при хранении до использования в стандартных условиях.

Пример 3. ММ_ПАК = 1,6 кДа. Мольное соотношение между мономерным акрилатом в составе ПАК и золотохлористоводородной кислотой ~12:1. Начальная концентрация раствора ПАК в реакционной смеси ~3%

В качестве исходного полимера используют ПАК со средней молекулярной массой ММ_ПАК = 1,6 кДа. Очистку исходного полимера и дальнейшее получение полиакрилата золота проводят, как описано в Примере 2.

Определение содержания Au(III) и степени конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе полиакрилата золота проводят аналогично примеру 1.

Поглощение раствора при λ = 226,5 А_226,5 = 3,0 Ед.

Содержание Au(III) в сухом продукте М _Au(III)=41,1±0,8 мкмоль/мг общих сухих веществ.

Степень конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе аурумакрила К = 74,6%.

При хранении полученного раствора в стандартных условиях (без доступа света и воздуха температура +4°С) до использования в течение 44 суток не наблюдается каких-либо визуальных изменений, содержание Au(III) в нем остается практически неизменным: 41,2±0,5 мкмоль/мг общих сухих веществ.

Приведенный пример показывает, что полиакрилат золота, полученный заявляемым способом из исходной ПАК с относительно невысокой степенью полимеризации (средняя молекулярная масса ММ = 1,6 кДа), характеризуется высоким содержанием трехвалентного золота, высокой степенью конверсии Au(III) в состав полимерного полиакрилата и устойчивостью при хранении до использования в растворе.

Пример 4. ММ_ПАК = 100 кДа. Мольное соотношение между мономерным акрилатом в составе ПАК и золотохлористоводородной кислотой ~12:1. Начальная концентрация раствора ПАК в реакционной смеси ~10%.

В качестве исходного полимера используют ПАК со средней молекулярной массой ММ_ПАК = 100 кДа. Очистку исходного полимера проводят, как описано в Примере 2. Навеску 50 мг очищенного полимера растворяют в 1,67 мл воды в течение 12 часов при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке. К раствору по каплям прибавляют 30 мкл водного раствора, содержащего 23,8 мг золотохлористоводородной кислоты. В исходной реакционной смеси концентрация ПАК равна 2,94%. Мольное соотношение между мономерным акрилатом в составе ПАК и золотохлористоводородной кислотой 11,72:1. Реакционную смесь очищают от низкомолекулярных примесей проточным диализом против воды в течение 12 часов при комнатной температуре в диализном мешке MWCO 15000.

Определение содержания Au(III) и степени конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе аурумакрила проводят аналогично примеру 1.

Поглощение раствора при λ=226,5 А_226,5 = 1,53 Ед.

Содержание Au(III) в сухом продукте М _Au(III)=21,2±0,7 мкмоль/мг общих сухих веществ.

Степень конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе полиакрилата золота К = 38,2%.

При хранении раствора до использования в стандартных условиях (без доступа света и воздуха температура +4°С) в течение 44 суток не наблюдается каких-либо визуальных изменений, содержание Au(III) в нем остается практически неизменной: 21,1±0,3 мкмоль/мг общих сухих веществ.

Приведенный пример показывает, что полиакрилат золота, полученный заявляемым способом из исходной ПАК с относительно со степенью полимеризации, идентичной прототипу (средняя молекулярная масса ММ = 100 кДа), характеризуется высокой степенью конверсии Au(III), в 2,4 раза превосходя показатель препарата, полученного способом по прототипу. Полученный полиакрилат золота устойчив при хранении в растворе в течение 44 суток в стандартных условиях.

Примеры 5-7. ММ_ПАК = 1,6 кДа, 11,5 и 140 кДа. Мольное соотношение между мономерным акрилатом в составе ПАК и золотохлористоводородной кислотой 5:1. Начальная концентрация раствора ПАК в реакционной смеси ~10%.

В качестве исходного полимера используют ПАК со средними молекулярными массами ММ_ПАК = 1,6 кДа, 11,5 и 140 кДа. Очистку исходных полимеров проводят, как описано в Примере 2. Навеску 50 мг очищенного полимера растворяют в 500 мкл воды в течение 12 часов при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке. К раствору по каплям прибавляют 60 мкл водного раствора, содержащего 47,6 мг золотохлористоводородной кислоты. Мольное соотношение между мономерным акрилатом в составе ПАК и золотохлористоводородной кислотой составляет 5:1. Реакционную смесь очищают от низкомолекулярных примесей проточным диализом против воды в течение 12 часов при комнатной температуре в диализном мешке MWCO 15000.

Определение содержания Au(III) и степени конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе полиакрилата золота проводят аналогично примеру 1.

Содержание Au(III) в сухом продукте M _Au(III) составляет:

для ПАК ММ=1,6 кДа - 8,68 мкмоль/мг общих сухих веществ;

для ПАК ММ=11,5 кДа - 10,3 мкмоль/мг общих сухих веществ

для ПАК ММ=140 кДа - 11,63 мкмоль/мг общих сухих веществ

Степень конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе готового полиакрилата золота K составляет:

для ПАК ММ=1,6 кДа - 74,4% от теоретического;

для ПАК ММ=11,5 кДа - 88,4% от теоретического;

для ПАК ММ=140 кДа - 99,8% от теоретического.

Сравнение приведенного примера с данными примеров 1 и 4 показывает, что полиакрилат золота, полученный заявляемым способом при условии использования для синтеза ПАК в концентрации 10% вместо 5,3% (по прототипу) м 3% (пример 4) позволяет повысить степень конверсии Au(III) в готовый продукт практически до теоретического максимума (99,8%).

Примеры 8-10 ММ_ПАК = 1,6 кДа, 11,5 и 140 кДа. Мольное соотношение между мономерным акрилатом в составе ПАК и золотохлористоводородной кислотой ~10:1. Начальная концентрация раствора ПАК в реакционной смеси ~10%

В качестве исходного полимера используют ПАК со средними молекулярными массами ММ_ПАК = 1,6 кДа, 11,5 и 140 кДа. Очистку исходных полимеров проводят, как описано в Примере 2. Навеску 50 мг очищенного полимера растворяют в 500 мкл воды в течение 12 часов при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке. К раствору по каплям прибавляют 30 мкл водного раствора, содержащего 23,8 мг золотохлористоводородной кислоты. Мольное соотношение между мономерным акрилатом в составе ПАК и золотохлористоводородной кислотой составляет 10:1. Реакционную смесь очищают от низкомолекулярных примесей проточным диализом против воды в течение 12 часов при комнатной температуре в диализном мешке MWCO 15000.

Определение содержания Au(III) и степени конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе полиакрилата золота проводят аналогично примеру 1.

Содержание Au(III) в сухом продукте М _Au(III) составляет:

для ПАК ММ = 1,6 кДа - 11,66 мкмоль/мг общих сухих веществ;

для ПАК ММ = 11,5 кДа - 9,96 мкмоль/мг общих сухих веществ;

для ПАК ММ=140 кДа - 12,06 мкмоль/мг общих сухих веществ.

Степень конверсии золотохлористоводородной кислоты в трехвалентное золото в составе аурумакрила К составляет:

для ПАК ММ = 1,6 кДа - 90,9% от теоретического;

для ПАК ММ = 11,5 кДа - 77,7% от теоретического;

для ПАК ММ = 140 кДа - 94,1% от теоретического.

Результаты получения полиакрилата золота по примерам осуществления изобретения в сравнении с прототипом представлены в Таблице 1.

Данные примеров 1 и 2, отраженные в таблице 1 показывают, что введение стадии предварительной диализной очистки ПАК до введения в синтез повышает конверсию золотохлористоводородистой кислоты в полиакрилат золота в 2 и более раза. При этом достигается увеличение растворимости в 3 и более раз. Кроме того, как указано в Примере 2, достигается повышение сохранности полиакрилата золота при хранении: после хранения в течение 44 суток препарат полностью сохраняет растворимость и содержание Au(III), достигнутые в момент окончания синтеза, чего не наблюдается для полиакрилата золота, полученного согласно способу по прототипу.

Сравнение Примера 2 с Примером 1 показывает, что использование лиофильной сушки вместо высушивания под вакуумом также вносит вклад в повышение растворимости готового продукта - полиакрилата золота.

Сравнение Примера 3 с Примером 2 позволяет сделать вывод о том, что использование ПАК со средней молекулярной массой 1,6 кДа при соотношении звена ПАК к HAuCl₄ в момент синтеза 12:1 вместо 32:1 (по прототипу) позволяет поднять показатель конверсии К с 38,2: до 74,6%. При этом большая эффективность использования низкомолекулярных вариантов ПАК с ММ=1,6 кДа по сравнению с ММ=100 кДа наблюдается при сравнении данных Примеров 3 и 4.

Данные Примеров 5-10 в сравнении с данными Примеров 2, 3 и 4 показывают, что использование при синтезе полиакрилата золота максимально концентрированного раствора ПАК (10% мас.) позволяет добиваться существенного повышения показателя конверсии К по сравнению с использованием менее концентрированных растворов (3 и 5,3%). Этот принцип соблюдается при использовании для синтеза ПАК с любой ММ.

При этом оптимальное молярное соотношение звена ПАК к HAuCl₄ в момент синтеза может варьироваться в зависимости от ММ полимера. Для полимера с ММ=1,6 кДа наилучший результат достигнут при соотношении 10:1, а для полимера с ММ=140 кДа более выгодным является соотношение 5:1.

Изобретение относится к способу получения полиакрилата золота. Способ включает взаимодействие водных растворов полиакриловой кислоты и золотохлористоводородной кислоты. Перед введением в реакцию исходную полиакриловую кислоту подвергают проточному диализу и последующей лиофильной сушке. Водные растворы золотохлористоводородной кислоты и полиакриловой вводят в реакцию в количествах, обеспечивающих 5-10-кратный мольный избыток мономерного звена (-СH₂-СНСООН-) относительно золотохлористоводородной кислоты, при этом применяют полиакриловую кислоту со средней молекулярной массой в диапазоне 1,6-140 кДа. Полученный продукт подвергают проточному диализу. Способ обеспечивает получение хорошо растворимого в воде полиакрилата золота с повышенным содержанием Au(III), отвечающего за его цитотоксическую активность. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 10 пр.

1. Способ получения полиакрилата золота, включающий взаимодействие водных растворов полиакриловой кислоты и золотохлористоводородной кислоты, отличающийся тем, что перед введением в реакцию исходную полиакриловую кислоту подвергают проточному диализу и последующей лиофильной сушке, водные растворы золотохлористоводородной кислоты и полиакриловой вводят в реакцию в количествах, обеспечивающих 5-10-кратный мольный избыток мономерного звена (-СH₂-СНСООН-) относительно золотохлористоводородной кислоты, при этом применяют полиакриловую кислоту со средней молекулярной массой в диапазоне 1,6-140 кДа, а полученный продукт подвергают проточному диализу.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию проводят в растворе, содержащем 3-10 мас.% полиакриловой кислоты.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после проточного диализа раствор готового полиакрилата золота подвергают лиофильной сушке и хранят до использования в сухом состоянии.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после проведения проточного диализа раствор готового полиакрилата золота хранят до использования в виде раствора.