АНТИТЕЛА, НАПРАВЛЕННЫЕ ПРОТИВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-33 (IL-33) Российский патент 2019 года по МПК C07K16/24 C12N5/10 A61K39/395 A61P35/00 A61P37/00 

Включение посредством ссылки материала, представленного на рассмотрение в электронном виде

[0001] Полностью включен в данное описание посредством ссылки пригодный для считывания компьютером список последовательностей нуклеотидов/аминокислот, представленный на рассмотрение параллельно с данным документом и идентифицируемый следующим образом: файл из 283358 бит ASCII (Text), названный ʺ719408_ST25.txt", созданный 8 января, 2015.

Уровень техники

[0002] Интерлейкин 33 (IL-33), также известный как ядерный фактор (NF) в наружных эндотелиальных венулах (NF-HEV), представляет собой цитокин принадлежащий к суперсемейству IL-1. IL-33 индуцирует хелперные T клетки, тучные клетки, эозинофилы и базофилы для продуцирования цитокинов типа 2. IL-33 опосредует его биологические эффекты посредством взаимодействия с рецепторами ST2 (также известные как IL1RL1) и акцессорным белком рецептора IL-1 (IL1RAP) для активации внутриклеточных молекул в сигнальных путях NF-κB и MAP киназы, которые направляют выработку цитокинов типа 2 (напр., IL-4, IL-5, и IL-13) из поляризованных T-хелперных клеток (Th2) и врожденных лимфоидных клеток группы 2 (ILC2) в коже, легких и желудочно-кишечном тракте. IL-33 действует напрямую на тучные клетки для запуска их активации и стимулирует эозинофилы и базофилы к дегранулированию, вызывающему разрушение ткани. Считается, что индукция цитокинов типа 2 посредством IL-33 in vivo индуцирует тяжелые патологические изменения, наблюдаемые в органах со слизистой после введения IL-33 (см., напр., Schmitz et al., Immunity, 23(5): 479-490 (2005); и Chackerian et al., J. Immunol., 179 (4): 2551-2555 (2007))

[0003] Как профиль in vivo экспрессии IL-33, так и его клеточные мишени предполагают роль для IL-33 в направляемых Th2 патологиях. Например, экспрессия IL-33 была детектирована в воспаленной ткани пациентов с астмой от умеренной до тяжелой, атопическим дерматитом, аллергическим ринитом, пищевыми аллергиями, ревматоидным артритом, множественным склерозом и болезнью Крона. В добавление, функциональные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в дистальной промоторной области ST2 (IL-33R) продемонстрировали значимую связь с атопическим дерматитом (см., напр., Shimizu et al., Hum. Mol. Genet., 14(19): 2919-2927 (2005)). Исследования связей по всему геному (GWAS) также продемонстрировали сильную связь с SNP в генах IL-33 и ST2 (IL-33R) для астмы во множестве исследований этнически различных групп (см., напр., Gudbjartsson et al., Nat. Genet., 41(3): 342-347 (2009); Melén et al., J Allergy Clin. Immunol., 126(3): 631-637 (2010); Moffatt et al., New Engl J. Med., 363(13):1211-1221 (2010); и Torgerson et al., Nat. Genet., 43(9): 887-92 (2011)). IL-33 (возможно в комбинации с IL-25 и TSLP) также активирует врожденные лимфоидные клетки (ILC2 клетки), приводя к Th2 цитокиновой секреции, противопаразитарным ответам и тканевой иммунопатологии.

[0004] Исследования также предполагают, что IL-33 играет непосредственную роль в некоторых раках, экспрессирующих IL-33 рецептор, таких как, например, эпителиальные раки (т.е., карциномы), посредством действия в качестве фактора выживаемости или фактора роста для раковых клеток. Такая реактивность к IL-33 должна содействовать исключению некоторых клеточных типов рака из имеющего в настоящее время стандарта ухода (напр., хроническая гранулоцитная лейкемия (CML), раки молочной железы и желудочно-кишечные раки). Кроме того, IL-33 может играть непрямую роль в прогрессировании рака посредством снижения защитной активности иммунной системы в контроле опухолевых клеток. Другие недавние исследования предполагают, что IL-33 играет роль в патологии фиброза, такого как, например, фиброз кожи, фиброз печени, системный склероз и фиброз легких. В добавление, Mchedlidze et al., Immunity, 39: 357-371 (2013), демонстрируют, что печеночная экспрессия интерлейкина-33 (IL-33) является как обязательной, так и достаточной для тяжелого печеночного фиброза in vivo.

[0005] Следовательно, существует потребность в ингибиторах IL-33 (напр., антитела), которые связывают IL-33 с высокой аффиностью и эффективно нейтрализуют активность IL-33. Изобретение относится к связывающему IL-33 агенту, который связывается с и ингибирует IL-33.

Краткая сущность изобретения

[0006] Изобретение относится к выделенному полипептиду тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит (a) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5-50, или (b) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5-50, SEQ ID NO: 67-140, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178-188 и SEQ ID NO: 206-217.

[0007] Изобретение относится к выделенному полипептиду легкой цепи иммуноглобулина, который содержит (a) аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 51-66, или (b) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 51-66, SEQ ID NO: 141-175, SEQ ID NO: 189-205 и SEQ ID NO: 218-231.

[0008] В добавление изобретение относится к выделенным или очищенным последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим вышеприведенные иммуноглобулиновые полипептиды, векторам, содержащим такие последовательности нуклеиновых кислот, выделенным связывающим IL-33 агентам, содержащим вышеприведенные иммуноглобулиновые полипептиды, последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим такие связывающие IL-33 агенты, векторам, содержащим такие последовательности нуклеиновых кислот, выделенным клеткам, содержащим такие векторы, композициям, содержащим такие связывающие IL-33 агенты или такие векторы с фармацевтически приемлемым носителем, и способам лечения заболевания или нарушения у млекопитающих, которые являются восприимчивыми к ингибированию IL-33 или нейтрализации посредством введения эффективных количеств таких композиций млекопитающим.

Краткое описание некоторых видов на чертежах

[0009] Фигура 1A представляет собой график, который отображает экспериментальные данные, иллюстрирующие определение EC₅₀ для IL-33 стимулирования секреции IL-5 из U812 клеток. Фигура 1B представляет собой график, который отображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что изобретательский связывающий IL-33 агент ингибирует IL-33-опосредованное высвобождение IL-5 из клеток KU812.

[0010] Фигура 2A представляет собой график, который отображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что IL-33-индуцирует экспрессию люциферазы из IL-8 промотора в клетках HEK293-ST2. Фигура 2B представляет собой график, который отображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что изобретательский связывающий IL-33 агент ингибирует IL-33-индуцируемую экспрессию люциферазы из IL-8 промотора в клетках HEK293-ST2.

[0011] Фигура 3 представляет собой график, который отображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что изобретательский связывающий IL-33 агент ингибирует IL-33-опосредованное высвобождение IL-5 в первичных человеческих базофилах. Для APE4909, IC50=2,2 ± 1,1 нМ (N=3); для ST2 мономера, IC50=20 нМ (N=1). Пунктирные линии, обозначенные ʺIL-33ʺ и ʺсредаʺ, представляют концентрацию IL-5, секретированного в отсутствии антитела и в отсутствии IL-33, соответственно. Суффикс.02, прикрепленный к APE4909,относится к партии белка, тестируемого в этих экспериментах.

[0012] Фигура 4 представляет собой график, который отображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что изобретательский связывающий IL-33 агент ингибирует IL-33-опосредованное высвобождение IL-9 из первичных человеческих базофилов. IC₅₀ для APE4909 был измерен при 3 нМ. Пунктирные линии, обозначенные ʺIL-33ʺ и ʺсредаʺ, представляют концентрацию IL-9, секретированного в отсутствии антитела и в отсутствии IL-33, соответственно. Антитело APE0422 представляет изотип контрольного антитела.

[0013] Фигура 5 представляет собой график, который отображает экспериментальные данные, иллюстрирующие аффинность изобретательского APE4909 антитела для человеческого IL-33, как измерено посредством KINEXA™. Результаты указывают KD=1,0 пМ (N=2) с 95% доверительным интервалом (CI) 1,9 пМ - 420 фМ.

[0014] Фигура 6 представляет собой график, который отображает экспериментальные данные, иллюстрирующие аффинность изобретательского антитела APE4909 для IL-33 яванского макака, как измерено посредством KINEXA™.

[0015] Фигура 7 представляет собой график, который отображает экспериментальные данные, иллюстрирующие способность изобретательского антитела APE4909 к ингибированию человеческой IL-33-направляемой эозинофильной экспансии в компартмент периферической крови.

Подробное описание изобретение

[0016] Изобретение относится к выделенному полипептиду тяжелой цепи иммуноглобулина и/или выделенному полипептиду легкой цепи иммуноглобулина, или его фрагменту (напр., антиген-связывающий фрагмент). Термин ʺиммуноглобулинʺ или ʺантителоʺ, как это применено в данном описании, относится к белку, который обнаружен в крови или других физиологических жидких средах позвоночных, который применен иммунной системой для идентифицирования и нейтрализации чужеродных объектов, таких как бактерии и вирусы. Полипептид является ʺвыделеннымʺ таким образом, что он отделен от его натуральной окружающей среды. В предпочтительном варианте осуществления иммуноглобулин или антитело представляет собой белок, который содержит по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR). CDR формируют ʺгипервариабельную областьʺ антитела, которая ответственна за связывание антигена (дополнительно обсуждено далее). Целый иммуноглобулин, как правило, состоит из четырех полипептидов: две идентичные копии тяжелой (H) цепи полипептида и две идентичные копии легкой (L) цепи полипептида. Каждая тяжелых цепей содержит одну N-конечную переменную (V_H) область и три C-конечных константных (C_H1, C_H2, и C_H3) области, и каждая легкая цепь содержит одну N-концевую вариабильную (V_L) область и одну C-концевую константную (C_L) область. Легким цепям антител может быть присвоен один из двух различных типов, или каппа (κ) или лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. В типичном иммуноглобулине каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью дисульфидными связями, и две тяжелые цепи связаны друг с другом дисульфидными связи. Вариабельная область легкой цепи выровнена с вариабельной областью тяжелой цепи, и константная область легкой цепи выровнена с первой константной областью тяжелой цепи. Остальные константные области тяжелых цепей выровнены друг с другом.

[0017] Вариабильные области каждой пары легкой и тяжелой цепей формируют антиген-связывающий сайт антитела. V_H и V_L области имеют такую же общую структуру как каждая область, содержащая четыре каркасных (FW или FR) области. Термин ʺкаркасная областьʺ, как это применено в данном описании, относится к относительно консервативным аминокислотным последовательностям внутри вариабельной области, которые расположены между гипервариабильной или определяющими комплементарность областями (CDR). Существует четыре каркасные области в каждом вариабильном домене, которые обозначены FR1, FR2, FR3 и FR4. Каркасные области формируют β слои, которые обеспечивают структурный каркас вариабельной области (см., напр., C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)).

[0018] Каркасные области соединены тремя определяющими комплементарность областями (CDR). Как отмечалось выше, три CDR, известные как CDR1, CDR2 и CDR3, формируют ʺгипервариабельную областьʺ антитела, которая ответственна за связывание антигена. CDR формируют петли, соединяющие, и в некоторых случаях, содержащие часть бета-складчатой структуры, сформированной каркасными областями. Хотя константные области легких и тяжелых цепей не задействованы напрямую в связывании антитела с антигеном, константные области могут влиять на ориентацию вариабильных областей. Константные области также проявляют различные эффекторные функции, такие как участие в антителозависимом комплемент-опосредованном лизисе или антителозависимой клеточной токсичности посредством взаимодействий с эффекторными молекулами и клетками.

[0019] Желательно, чтобы выделенный полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина и выделенный полипептид легкой цепи иммуноглобулина по изобретению связывался с IL-33. Как отмечалось выше, интерлейкин-33 (IL-33) (также известный как ядерный фактор (NF) в наружных эндотелиальных венулах (NF-HEV)) представляет собой цитокин семейства IL-1, который также включает воспалительные цитокины IL-1α, IL-1β, и IL-18. Также было продемонстрировано, что IL-33 передает сигнал посредством ST2 рецептора и IL1RAP рецептора. IL-33 сильно экспрессирован в различных тканях, включая желудок, легкое, спинной мозг, головной мозг и кожу, так же как в клетках, включая клетки гладкой мускулатуры и эпителиальные клетки, выстилающие бронхи и малые дыхательные пути. Экспрессия IL-33 индуцируется IL-1β и фактором некроза опухоли-α (TNF-α) в легком и фибробластах кожи и, в меньшей степени, посредством активации макрофагов. Было продемонстрировано, что IL-33 лечение индуцирует Т-хелперные ответы (Th) типа 2 у мышей, на что указывает увеличение выработки Th2 цитокинов и сывороточного иммуноглобулина. Системное лечение мышей с IL-33 приводит в результате к патологическим изменениям в легких и пищеварительном тракте (см., напр., Choi et al., Blood, 114(14): 3117-3126 (2009); and Yagami et al., J. Immunology, 185(10): 5743-5750 (2010)).

[0020] IL-33 продуцирован в виде 30-кДа белка-предшественника, который бывает расщеплен in vitro каспазой-1, высвобождая зрелые 18-кДа формы (см., напр., Schmitz et al., Immunity, 23(5): 479-490(2005)). При связывании с ST2 рецептором, IL-33 стимулирует активацию ядерного фактора (NF)-κB и митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), приводя к повышенной транскрипции Th2 цитокинов (Schmitz et al., supra).

[0021] Антитела, которые связываются с IL-33, и его компонентами, известны в данной области (см., напр., публикации заявок на патент США 2009/0041718 A1 и 2012/0263709 A1). Анти-IL-33 антитела также коммерчески доступны из источников, таких как, например, Abcam (Cambridge, MA).

[0022] Изобретение относится к полипептиду тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5-50, SEQ ID NO: 67-140, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178-188 и SEQ ID NO: 206-217, аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5-50, SEQ ID NO: 67-140, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178-188 и SEQ ID NO: 206-217. В одном варианте осуществления изобретения выделенный полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина содержит, состоит из или по существу состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5-50, SEQ ID NO: 67-140, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178-188 и SEQ ID NO: 206-217. Когда изобретательский полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина по существу состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5-50, SEQ ID NO: 67-140, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178-188 и SEQ ID NO: 206-217, дополнительные компоненты могут содержаться в полипептиде, которые по своей сути не воздействуют на полипептид (напр., белковые группы, такие как биотин, который облегчает очистку или выделение). Когда изобретательский полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5-50, SEQ ID NO: 67-140, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178-188 и SEQ ID NO: 206-217, полипептид не содержит какие-либо дополнительные компоненты (т.е., компоненты, которые не являются эндогенными по отношению к изобретательскому полипептиду тяжелой цепи иммуноглобулина).

[0023] Изобретение относится к выделенному полипептиду тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична (напр., по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична) любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5-50, SEQ ID NO: 67-140, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178-188 или SEQ ID NO: 206-217. ʺИдентичностьʺ последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, как описано в данном описании, может быть определена посредством сравнения нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, представляющей интерес, с референсной нуклеиновой кислотой или аминокислотной последовательностью. Процентная идентичность представляет собой количество нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми (т.е., которые являются идентичными) между последовательностью, представляющей интерес, и референсной последовательностью, разделенное на длину наиболее длинной последовательности (т.е., длина или последовательности, представляющей интерес, или референсной последовательности, в зависимости от того, какая длинней). Существует ряд известных математических алгоритмов для получения оптимального выравнивания и расчета идентичности между двумя или более последовательностей, и они включены в ряд доступных программ из систем программного обеспечения. Примеры таких программ содержат CLUSTAL-W, T-Coffee и ALIGN (для выравнивания последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот), программы BLAST (напр., BLAST 2.1, BL2SEQ и его более поздние версии) и программы FASTA (напр., FASTA3x, FASTM и SSEARCH) (для выравнивания последовательностей и поисков сходства последовательностей). Алгоритмы выравнивания последовательностей также раскрыты, например, в Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997), и Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997)).

[0024] Изобретение относится к полипептиду легкой цепи иммуноглобулина, который содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 51-66, SEQ ID NO: 141-175, SEQ ID NO: 189-205 и SEQ ID NO: 218-231, аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 51-66, SEQ ID NO: 141-175, SEQ ID NO: 189-205 и SEQ ID NO: 218-231. В одном варианте осуществления изобретения выделенный полипептид легкой цепи иммуноглобулина содержит, состоит из или по существу состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 51-66, SEQ ID NO: 141-175, SEQ ID NO: 189-205 и SEQ ID NO: 218-231. Когда изобретательский полипептид легкой цепи иммуноглобулина по существу состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 51-66, SEQ ID NO: 141-175, SEQ ID NO: 189-205 и SEQ ID NO: 218-231, дополнительные компоненты могут содержаться в полипептиде, которые не оказывает существенное влияние на полипептид (напр., белковые компоненты, такие как биотин, который облегчает очистку или выделение). Когда изобретательский полипептид легкой цепи иммуноглобулина состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 51-66, SEQ ID NO: 141-175, SEQ ID NO: 189-205 и SEQ ID NO: 218-231, полипептид не содержит любые дополнительные компоненты (т.е., компоненты, которые не являются эндогенными по отношению к изобретательскому полипептиду легкой цепи иммуноглобулина).

[0025] Изобретение относится к выделенному полипептиду легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична (напр., по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична) любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 51-66, SEQ ID NO: 141-175, SEQ ID NO: 189-205 или SEQ ID NO: 218-231. ʺИдентичностьʺ нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, как описано в данном описании, может быть определена с применением способов, описанных в данном описании.

[0026] Одна или более аминокислот из вышеупомянутых полипептидов тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептидов легкой цепи может быть заменена или замещена другой аминокислотой. Аминокислотная ʺзаменаʺ или ʺзамещениеʺ относится к замене одной аминокислоты в определенном положении или остатке другой аминокислотой в том же положении или остатке в пределах полипептидной последовательности.

[0027] Аминокислоты в широком смысле группируются на ʺароматическиеʺ или ʺалифатическиеʺ. Ароматическая аминокислота включает ароматическое кольцо. Примеры ʺароматическихʺ аминокислот содержат гистидин (H или His), фенилаланин (F или Phe), тирозин (Y или Tyr) и триптофан (W или Trp). Неароматические аминокислоты в широком смысле группируются как ʺалифатическиеʺ. Примеры ʺалифатическихʺ аминокислот содержат глицин (G или Gly), аланин (A или Ala), валин (V или Val), лейцин (L или Leu), изолейцин(I или Ile), метионин (M или Met), серин (S или Ser), треонин (T или Thr), цистеин (C или Cys), пролин (P или Pro), глутаминовую кислоту (E или Glu), аспарагиновую кислоту (A или Asp), аспарагин (N или Asn), глутамин (Q или Gln), лизин (K или Lys) и аргинин (R или Arg).

[0028] Алифатические аминокислоты могут быть подразделены на четыре подгруппы. ʺБольшая алифатическая неполярная подгруппаʺ состоит из валина, лейцина и изолейцина. ʺАлифатическая слегка полярная подгруппаʺ состоит из метионина, серина, треонина и цистеина. ʺАлифатическая полярная/заряженная подгруппаʺ состоит из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, аспарагина, глутамина, лизина и аргинина. ʺПодгруппа с малым остаткомʺ состоит из глицина и аланина. Группа заряженных/полярных аминокислот может быть подразделена на три подгруппы: ʺположительно-заряженная подгруппаʺ, состоящая из лизина и аргинина, ʺотрицательно-заряженная подгруппаʺ, состоящая из глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты и ʺполярная подгруппаʺ, состоящая из аспарагина и глутамина.

[0029] Ароматические аминокислоты могут быть подразделены на две подгруппы: ʺподгруппа с азотным кольцомʺ, состоящая из гистидина и триптофана, и ʺфенильная подгруппаʺ, состоящая из фенилаланина и тирозина.

[0030] Аминокислотная замена или замещение может быть консервативной, полуконсервативной или неконсервативной. Фраза ʺконсервативное замещение аминокислотыʺ или ʺконсервативная мутацияʺ относится к замене одной аминокислоты другой аминокислотой со схожими свойствами. Функциональный путь для определения общих свойств между индивидуальными аминокислотами для анализа нормализованных частот аминокислотных изменений между соответствующими белками гомологичных организмов (Schulz and Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). В соответствии с такими анализами группы аминокислот могут быть определены, когда аминокислоты в пределах группы обмениваются преимущественно друг с другом и, следовательно, имеют сходство друг с другом в основном по их влиянию общую структуру белка (Schulz and Schirmer, supra).

[0031] Примеры консервативных замещений аминокислот содержат замещения аминокислот в пределах подгрупп, описанных выше, например, лизин для аргинина и наоборот, так что позитивный заряд может быть сохранен, глутаминовая кислота для аспарагиновой кислоты и наоборот, так что отрицательный заряд может быть сохранен, серин для треонина, так что свободная -OH может быть сохранена и глутамин для аспарагина, так что свободная -NH₂ может быть сохранена.

[0032] ʺПолуконсервативные мутацииʺ содержат замещенные аминокислоты аминокислот в пределах таких же групп, приведенных выше, но не в пределах такой же подгруппы. Например, замещение аспарагиновой кислоты на аспарагин, или аспарагина на лизин, задействует аминокислоты в пределах такой же группы, но различных подгрупп. ʺНеконсервативные мутацииʺ задействуют замещение аминокислот между различными группами, например, лизин для триптофана, или фенилаланин для серина и т.д.

[0033] В добавление, одна или более аминокислот может быть введена в вышеупомянутые полипептиды тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептиды легкой цепи. Любое количество любых пригодных аминокислот может быть введено в аминокислотную последовательность полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептида легкой цепи. С этой точки зрения, по меньшей мере одна аминокислота (напр., 2 или более, 5 или более, или 10 или более аминокислот), но не более чем 20 аминокислот (напр., 18 или менее, 15 или менее или 12 или менее аминокислот), может быть введена в аминокислотную последовательность полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептида легкой цепи. Предпочтительно, 1-10 аминокислот (напр., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 аминокислот) введены в аминокислотную последовательность полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептида легкой цепи. С этой точки зрения, аминокислота(ы) может быть введена в любой из вышеупомянутых полипептидов тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептидов легкой цепи в любом пригодном положении. Предпочтительно, аминокислота(ы) введены в CDR (напр., CDR1, CDR2, или CDR3) полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептида легкой цепи.

[0034] Изобретательский выделенный полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина и полипептиды легкой цепи не ограничены полипептидами, содержащими специфические аминокислотные последовательности, описанными в данном описании. В действительности, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина или полипептид легкой цепи может представлять собой любой полипептид тяжелой цепи или полипептид легкой цепи, который конкурирует с изобретательским полипептидом тяжелой цепи иммуноглобулина или полипептидом легкой цепи для связывания с IL-33. С этой точки зрения, например, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина или полипептид легкой цепи может представлять собой любой полипептид тяжелой цепи или полипептид легкой цепи, который связывается с таким же эпитопом IL-33, распознаваемым полипептидами тяжелой и легкой цепи, описанными в данном описании. Конкурирование между антителами может быть оценено с применением рутинных пептидных конкурентных анализов, которые используют ELISA, Вестерн-блоттинг или иммуногистохимические способы (см., напр., патенты США 4828981 и 8568992; и Braitbard et al., Proteome Sci., 4: 12 (2006)).

[0035] Изобретение относится к выделенному связывающему интерлейкин-33 (IL-33) агенту, содержащему, по существу состоящему из или состоящему из одной или более изобретательских выделенных аминокислотных последовательностей, описанных в данном описании. Под ʺсвязывающим интерлейкин-33 (IL-33) агентомʺ подразумевается молекула, предпочтительно белковая молекула, которая связывается специфически с IL-33. Предпочтительно, связывающий IL-33 агент представляет собой антитело или его фрагмент (напр., иммуногенный фрагмент). Выделенный связывающий IL-33 агент по изобретению содержит, состоит по существу из или состоит из изобретательского выделенного полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и/или изобретательского выделенного полипептида легкой цепи иммуноглобулина. В одном варианте осуществления выделенный связывающий IL-33 агент содержит, состоит по существу из или состоит из изобретательского полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина или изобретательского полипептида легкой цепи иммуноглобулина. В другом варианте осуществления выделенный связывающий IL-33 агент содержит, состоит по существу из или состоит из изобретательского полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и изобретательского полипептида легкой цепи иммуноглобулина.

[0036] Любой аминокислотный остаток изобретательского полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и/или изобретательского полипептида легкой цепи иммуноглобулина может быть замещен, в любой комбинации, другим аминокислотным остатком, или может быть удален или введен, при условии, что биологическая активность связывающего IL-33 агента является увеличенной или улучшенной в результате аминокислотных замен, вставок и/или делеций. ʺБиологическая активностьʺ связывающего IL-33 агента относится, например, к связывающей аффинности на конкретный эпитоп IL-33, нейтрализации или ингибированию связывания IL-33 с его рецептором(ами), нейтрализации или ингибированию активности IL-33 in vivo (напр., IC₅₀), фармакокинетике и перекрестной реактивности (напр., с нечеловеческими гомологами или ортологами белка IL-33, или с другими белками или тканями). Другие биологические свойства или характеристики антиген-связывающего агента, принимаемые во внимание в данной области, содержат, например, авидность, селективность, растворимость, укладку, иммунотоксичность, экспрессию и состав. За вышеупомянутыми свойствами или характеристиками можно наблюдать, их можно измерять и/или оценивать с применением стандартных технологий, включая, но без ограничения ими, ELISA, конкурентный ELISA, анализ поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE™), или KINEXA™, анализы in vitro или in vivo, анализы связывания рецептор - лиганд, анализы выработки цитокинов или фактора роста и/или анализы секреции и анализы передачи сигнала и иммуногистохимические анализы.

[0037] Термины ʺингибироватьʺ или ʺнейтрализоватьʺ, как это применено в данном описании, применительно к активности связывающего IL-33 агента, относятся к способности существенно противодействовать, препятствовать, предотвращать, ограничивать, замедлять, нарушать, изменять, устранять, останавливать или обращать прогрессирование или тяжесть, например, биологической активности IL-33 или заболевания или состояния, связанного с IL-33. Выделенный связывающий IL-33 агент по изобретению предпочтительно ингибирует или нейтрализует активность IL-33 на по меньшей мере приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 100% или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений.

[0038] Выделенный связывающий IL-33 агент по изобретению может представлять собой полное антитело, как описано в данном описании, или фрагмент антитела. Термины ʺфрагмент антителаʺ, ʺфрагмент антителаʺ и ʺфункциональный фрагмент антителаʺ применяются взаимозаменяемо в данном описании для обозначения одного или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (см., обычно, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)). Выделенный связывающий IL-33 агент может содержать любой связывающий IL-33 фрагмент антитела. Желательно, чтобы фрагмент антитела содержал, например, одну или более CDR, вариабельную область (или ее участки), константную область (или ее участки) или их комбинации. Примеры фрагментов антитела содержат, но не ограничены ими, (i) Fab фрагмент, который является моновалентным фрагментом, состоящим из доменов V_L, V_H, C_L и CH₁, (ii) F(abʹ)₂ фрагмент, который представляет собой бивалентный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области, (iii) Fv фрагмент, состоящий из V_L и V_H доменов одного плеча антитела, (iv) Fabʹ фрагмент, который получен в результате разрыва дисульфидного мостика F(abʹ)₂ фрагмента с применением мягких условий восстановления, (v) дисульфид-стабилизированный Fv фрагмент (dsFv) и (vi) домен антитело (dAb), который представляет собой полипептид домена антитела с одиночной вариабельной областью (VH или VL), который специфически связывается с антигеном.

[0039] В вариантах осуществления, где выделенный связывающий IL-33 агент содержит фрагмент полипептида тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, фрагмент может иметь любой размер при условии, что фрагмент связывается с и предпочтительно ингибирует активность IL-33. С этой точки зрения, желательно, чтобы фрагмент полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина содержал между приблизительно 5 и 18 (напр., приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений) аминокислот. Подобным образом, желательно, чтобы фрагмент полипептида легкой цепи иммуноглобулина чтобы содержал между приблизительно 5 и 18 (напр., приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений) аминокислот.

[0040] Когда связывающий IL-33 агент представляет собой антитело или фрагмент антитела, желательно, чтобы антитело или фрагмент антитела содержал константную область тяжелой цепи (F_c) любого пригодного класса. Предпочтительно, антитело или фрагмент антитела содержит константную область тяжелой цепи, которая основана на IgG1, IgG2 или IgG4 антителах дикого типа или их вариантах.

[0041] Связывающий IL-33 агент также может представлять собой одноцепочечные фрагменты антитела. Примеры одноцепочечных фрагментов антитела содержат, но не ограничены ими, (i) одноцепочечный Fv (scFv), который является моновалентной молекулой, состоящей из двух доменов фрагмента Fv (т.е., V_L и V_H), объединенных синтетическим линкером, что позволяет, чтобы два домена были синтезированы в виде одиночной полипептидной цепи (см., напр., Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); и Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)) и (ii) диатело, которое является димерной полипептидной цепью, при этом каждая полипептидная цепь содержит V_H, соединенную с V_L, посредством пептидного линкера, который является слишком коротким для позволения спаривания между V_H и V_L в одной и той же полипептидной цепи, посредством этого направляя спаривание между комплементарными доменами на различных V_H-V_L полипептидных цепях с генерированием димерной молекулы, имеющей два функциональных антиген-связывающих сайта. Фрагменты антитела известны в данной области и описаны более подробно, напр., в публикации заявки на патент США 2009/0093024 A1.

[0042] Выделенный связывающий IL-33 агент также может быть интраантителом или его фрагментом. Интраантитело представляет собой антитело, которое экспрессировано и которое функционирует внутриклеточно. У интраантител, как правило, отсутствуют дисульфидные связи и они являются способными модулировать экспрессию или активность генов-мишеней, посредством их специфической связывающей активности. Интраантитела содержат однодоменные фрагменты, такие как выделенные V_H и V_L домены и scFvs. Интраантитело может содержать субклеточные сигналы переноса, присоединенные к N или C концу антраантитела для позволения экспрессии с высокими концентрациями в субклеточных компартментах, где расположен белок-мишень. При взаимодействии с геном-мишенью, интраантитело мудулирует функцию целевого белка и/или достигается фенотипический/функциональный нокаут посредством механизмов, таких как ускорение деградации белка-мишени и секвестирование белка-мишени в нефизиологическом субклеточном компартменте. Другие механизмы интраантитело-опосредованной инактивации гена могут зависеть от эпитопа, к которому направлено интраантитело, как например, связывание с каталитическим сайтом на белке-мишени или с эпитопами, которые задействованы во взаимодействиях белок-белок, белок-ДНК или белок-РНК.

[0043] Выделенный связывающий IL-33 агент также может быть конъюгатом антитела. С этой точки зрения, выделенный связывающий IL-33 агент может быть конъюгатом (1) антитела, альтернативным каркасом или его фрагментом и (2) белковой или небелковой группой, содержащей связывающий IL-33 агент. Например, связывающий IL-33 агент может быть всем или частью антитела, конъюгированного с пептидом, флуоресцентной молекулой или химиотерапевтическим агентом.

[0044] Выделенный связывающий IL-33 агент может представлять собой или может быть получен из человеческого антитела, нечеловеческого антитела или химерного антитела. Под ʺхимернымʺ подразумевается антитело или его фрагмент, содержащие как человеческие, так и нечеловеческие области. Предпочтительно, выделенный связывающий IL-33 агент представляет собой гуманизированное антитело. ʺГуманизированноеʺ антитело представляет собой моноклональное антитело, содержащее каркас человеческого антитела, и по меньшей мере одну CDR, полученную или производную из нечеловеческого антитела. Нечеловеческие антитела содержат антитела, выделенные из любого животного кроме человека, такого как, например, грызун (напр., мышь или крыса). Гуманизированное антитело может содержать, одну, две или три CDR, полученных или производных из нечеловеческого антитела. В одном варианте осуществления изобретения, CDRH3 изобретательского связывающего IL-33 агента представляет собой полученное или производное из мыши моноклональное антитело, тогда как остальные вариабильные области и константные области изобретательского связывающего IL-33 агента являются полученными или производными из человеческого моноклонального антитела.

[0045] Человеческое антитело, нечеловеческое антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело может быть получено посредством любого средства, включая посредством in vitro источников (напр., гибридома или клеточная линия, продуцирующая антитело рекомбинантно) и in vivo источников (напр., грызуны). Способы для генерирования антител известны в данной области и описаны, например, в Köhler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); и Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело или химерное антитело может быть генерировано с применением трансгенного животного (напр., мыши), при этом один или более эндогенных иммуноглобулиновых генов заменены с одним или более человеческих иммуноглобулиновых генов. Примеры трансгенных мышей, в которых гены эндогенного антитела эффективно заменены с генами человеческого антитела, содержат, но не ограничены ими, Medarex HUMAB-MOUSE™, the Kirin TC MOUSE™ и Kyowa Kirin KM-MOUSE™ (см., напр., Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005), и Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008)). Гуманизированное антитело может быть генерировано с применением любого пригодного способа, известного в данной области (см., напр., An, Z. (ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey (2009)), включая, напр., трансплантацию нечеловеческих CDR в каркас человеческого антитела (см., напр., Kashmiri et al., Methods, 36(1): 25-34 (2005); и Hou et al., J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008)). В одном варианте осуществления гуманизированное антитело может быть продуцировано с применением способов, описанных, напр., в публикации заявки на патент США 2011/0287485 A1.

[0046] В одном варианте осуществления CDR (напр., CDR1, CDR2, или CDR3) или вариабельная область полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептида легкой цепи иммуноглобулина, описанных в данном описании, может быть трансплантирована (т.е., привито) в другую молекулу, такую как полипептид антитела или не из антитела, с применением или химии белков, или технологии рекомбинантных ДНК. В связи с этим, изобретение относится к выделенному связывающему IL-33 агенту, содержащему по меньшей мере одну CDR тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептида легкой цепи, как описано в данном описании. Выделенный связывающий IL-33 агент может содержать одну, две или три CDR тяжелой цепи иммуноглобулина и/или вариабельной области легкой цепи, как описано в данном описании. Например, для полипептидов тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащих любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 5-50, CDR1 расположен между аминокислотными остатками 26 и 35, включительно; CDR2 расположен между аминокислотными остатками 50 и 59, включительно (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2) или между аминокислотными остатками 50 и 66, включительно (SEQ ID NO: 5-50); и CDR3 расположен между аминокислотными остатками 99 и 102, включительно (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2) или между аминокислотными остатками 99 и 111, включительно (SEQ ID NO 5-50). Применительно к полипептидам легкой цепи иммуноглобулина, содержащим любую из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 51-66, например, CDR1 расположена между аминокислотными остатками 24 и 39, включительно (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4) или между аминокислотными остатками 24 и 34, включительно (SEQ ID NO: 51-66); CDR2 расположен между аминокислотными остатками 55 и 61, включительно (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4) или между аминокислотными остатками 50 и 56, включительно (SEQ ID NO: 51-66); CDR3 расположен между аминокислотными остатками 94 и 102, включительно (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4) или между аминокислотными остатками 89 и 97, включительно (SEQ ID NO: 51-66).

[0047] В предпочтительном варианте осуществления связывающий IL-33 агент связывается с эпитопом IL-33, который блокирует связывание IL-33 с рецепторами ST2 (также известными как IL1RL1) и/или IL-1 рецептор акцессорный белок (IL1RAP) и ингибирует IL-33 опосредованную передачу сигнала. Изобретение также относится к выделенному или очищенному эпитопу IL-33, который блокирует связывание IL-33 с рецепторами ST2 и IL1RAP непрямым или аллостерическим образом.

[0048] Изобретение также относится к одной или более выделенных или очищенных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые кодируют изобретательский полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, изобретательский полипептид легкой цепи иммуноглобулина и изобретательский связывающий IL-33 агент.

[0049] Подразумевается, что термин ʺпоследовательность нуклеиновой кислотыʺ охватывает полимер ДНК или РНК, т.е., полинуклеотид, который может быть однонитевым или двухнитевым и, который может содержать неприродные или измененные нуклеотиды. Термины ʺнуклеиновая кислотаʺ и ʺполинуклеотидʺ, как это применено в данном описании, относятся к полимерным формам нуклеотидов любой длины, или рибонуклеотидам (РНК), или дезоксирибонуклеотидам (ДНК). Эти термины относятся к первичной структуре молекулы и таким образом содержат двух- и однонитевые ДНК и двух- и однонитевые РНК. Термины содержат, в качестве эквивалентов, аналоги их РНК или ДНК, изготовленные из нуклеотидных аналогов и модифицированных полинуклеотидов, таких как, но без ограничения ими, метилированные и/или кэпированные полинуклеотиды. Нуклеиновые кислоты, как правило, связаны посредством фосфатных связей для формирования последовательностей нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов, хотя многие другие связи известны в данной области (напр., фосфотиоаты, боранофосфаты и тому подобное).

[0050] Изобретение дополнительно относится к вектору, содержащему одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих изобретательский полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, изобретательский полипептид легкой цепи иммуноглобулина и/или изобретательский связывающий IL-33 агент. Вектор может представлять собой, например, плазмиду, эписому, космиду, вирусный вектор (напр., ретровирусный или аденовирусный) или фаг. Пригодные векторы и способы приготовления вектора хорошо известны в данной области (см., напр., Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)).

[0051] В добавление к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей изобретательский полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, изобретательский полипептид легкой цепи иммуноглобулина и/или изобретательский связывающий IL-33 агент, вектор предпочтительно содержит контролирующие экспрессию последовательности, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы транскрипции, участки внутренней посадки рибосомы (IRES) и тому подобное, которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяина. Иллюстративные контролирующие экспрессию последовательности известны в данной области и описаны, например, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

[0052] Большое количество промоторов, включая конститутивные, индуцируемые и репрессируемые промоторы, из множества различных источников хорошо известны в данной области. Репрезентативные источники промоторов содержат например, промоторы вирусов, млекопитающих, насекомых, растений, дрожжей и бактерий и пригодные промоторы из этих источников являются легко доступными, или могут быть изготовлены синтетически, на основании последовательностей, общедоступных, например, из депозиториев, таких как ATCC, а также из других коммерческих или индивидуальных источников. Промоторы могут быть однонаправленными (т.е., инициировать транскрипцию в одном направлении) или двухнаправленными (т.е., инициировать транскрипцию как в 3ʹ, так и в 5ʹ направлении). Неограничивающие примеры промоторов содержат, например, бактериальную T7-экспрессирующую систему, бактериальную экспрессирующую систему pBAD (araA), промотор цитомегаловируса (CMV), промотор SV40, промотор RSV. Индуцируемые промоторы содержат, например, систему Tet (патенты США 5464758 и 5814618), Экдизон-индуцируемую систему (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351 (1996)), систему T-REX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), систему LACSWITCH™ (Stratagene, San Diego, CA) и Cre-ERT тамоксифен-индуцируемую рекомбиназную систему (Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); патент США 7112715; и Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144 (2005)).

[0053] Термин ʺэнхансерʺ, как это применено в данном описании, относится к последовательности ДНК, которая увеличивает транскрипцию, например, последовательность нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Энхансеры могут быть расположены на много тысяч пар оснований от кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты и могут опосредовать связывание регуляторных факторов, модели метилирования ДНК или изменения в структуре ДНК. Большое количество энхансеров из множества различных источников хорошо известно в данной области и не доступно в виде или внутри клонированных полинуклеотидов (напр., из депозиториев, таких как ATCC, а также других коммерческих или индивидуальных источников). Ряд полинуклеотидов, содержащих промоторы (такие как широко применяемый CMV промотор), также содержит энхансерные последовательности. Энхансеры могут быть расположены раньше, в или после кодирующих последовательностей.

[0054] Вектор также может содержать ʺселектируемый маркерный генʺ. Термин ʺселектируемый маркерный генʺ, как это применено в данном описании, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая позволяет, чтобы клетки, экспрессирующие последовательность нуклеиновой кислоты, были селективно выбраны на или против, при наличии соответствующего селективного агента. Пригодные селектируемые маркерные гены известны в данной области и описаны, напр., в публикации международной заявки на патент WO 1992/008796 и WO 1994/028143; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567-3570 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527-1531 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150: 1-14 (1981); Santerre et al., Gene, 30: 147-156 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223-232 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026-2034 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817-823 (1980); и патентах США 5122464 и 5770359.

[0055] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой ʺэписомальный экспрессионный векторʺ или ʺэписомуʺ, которая способна реплицироваться в клетке-хозяина и продолжает существовать в виде экстрахромосомного сегмента ДНК в клетке-хозяина при наличии соответствующего селективного давления (см., напр., Conese et al., Gene Therapy, 11: 1735-1742 (2004)). Репрезентативные коммерчески доступные эписомальные экспрессионные векторы содержат, но не ограничены ими, эписомальные плазмиды, которые используют ядерный антиген вируса Эпштейна-Барра 1 (EBNA1) и точку начала репликации (oriP) вируса Эпштейна-Барра (EBV). Векторы pREP4, pCEP4, pREP7 и pcDNA3.1 от Invitrogen (Carlsbad, CA) и pBK-CMV от Stratagene (La Jolla, CA) представляют неограничивающие примеры эписомального вектора, который применяет T-антиген и точку начала репликации SV40 вместо EBNA1 и oriP.

[0056] Другие пригодные векторы содержат интегрирующие экспрессионные векторы, который могут рандомно интегрироваться в ДНК клетки-хозяина, или могут содержать рекомбинациинный сайт для позволения специфической рекомбинации между экспрессионным вектором и хромосомой клетки-хозяина. Такие интегрирующие экспрессионные векторы могут использовать контролирующие эндогенную экспрессию последовательности хромосом клетки-хозяина для оказания эффекта на экспрессию заданного белка. Примеры векторов, которые интегрируются сайт специфическим образом содержат, например, компоненты системы flp-in от Invitrogen (Carlsbad, CA) (напр., pcDNA™5/FRT), или системы cre-lox, такие как обнаруживаемые в векторах pExchange-6 Core от Stratagene (La Jolla, CA). Примеры векторов, которые рандомно интегрируют в клеточные хромосомы хозяина содержат, например, pcDNA3.1 (когда введен в отсутствии T-антигена) от Life Technologies (Carlsbad, CA), UCOE от Millipore (Billerica, MA) и pCI или pFN10A (ACT) FLEXI™ от Promega (Madison, WI).

[0057] Также могут быть применены вирусные векторы. Репрезентативные коммерчески доступные вирусные экспрессионные векторы содержат, но не ограничены ими, систему на основе аденовируса Per.C6, доступная у Crucell, Inc. (Leiden, The Netherlands), на основе лентивируса pLP1 от Invitrogen (Carlsbad, CA) и ретровирусные векторы pFB-ERV плюс pCFB-EGSH от Stratagene (La Jolla, CA).

[0058] Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие изобретательские аминокислотные последовательности, могут быть доставлены в клетку в одном и том же векторе (т.е., в cis). Однонаправленный промотор может быть применен для контроля экспрессии каждой последовательности нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления комбинация двунаправленных и однонаправленных промоторов может быть применена для контроля экспрессии множественных последовательностей нуклеиновых кислот. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие изобретательские аминокислотные последовательности альтернативно могут быть доставлены в популяцию клеток на отдельных векторах (т.е., в trans). Каждая из последовательностей нуклеиновой кислоты в каждом из отдельных векторов может содержать одинаковые или различные контролирующие экспрессию последовательности. Отдельные векторы может быть доставлены в клетки одновременно или последовательно.

[0059] Вектор(ы), содержащие нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую изобретательские аминокислотные последовательности могут быть введены в клетки-хозяина, которые способны к экспрессированию полипептидов, кодируемых посредством этого, включая любую пригодную прокариотическую или эукариотическую клетку. Как таковое, изобретение относится к выделенной клетке, содержащей изобретательский вектор. Предпочтительные клетки-хозяина, являются такими, что они могут быть легко и надежно выращены, имеют обоснованно быстрые скорости роста, имеют хорошо охарактеризованные экспрессионные системы и могут быть трансформированы или трансфицированы легко и эффективно.

[0060] Примеры пригодных прокариотических клеток содержат, но не ограничены ими, клетки из рода Bacillus (такие как Bacillus subtilis и Bacillus brevis), Escherichia (такие как E. coli), Pseudomonas, Streptomyces, Salmonella и Erwinia. Особенно пригодные прокариотические клетки содержат различные штаммы Escherichia coli (напр., K12, HB101 (ATCC No. 33694), DH5α, DH10, MC1061 (ATCC No. 53338) и CC102).

[0061] Предпочтительно, вектор введен в эукариотическую клетку. Пригодные эукариотические клетки известны в данной области и содержат, например, клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Примеры пригодных клеток дрожжей содержат клетки рода Kluyveromyces, Pichia, Rhino-sporidium, Saccharomyces и Schizosaccharomyces. Предпочтительные клетки дрожжей содержат, например, Saccharomyces cerivisae и Pichia pastoris.

[0062] Пригодные клетки насекомого описаны, например, в Kitts et al., Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 (1993); и Lucklow et al., J. Virol., 67: 4566-4579 (1993). Предпочтительные клетки насекомого содержат Sf-9 и HI5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[0063] Предпочтительно, в изобретении использованы клетки млекопитающих. Количество пригодных млекопитающих клеток-хозяина известны в данной области и многие доступны из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, VA). Примеры пригодных клеток млекопитающих содержат, но не ограничены ими, клетки Яичника китайского хомячка (CHO) (ATCC No. CCL61), CHO DHFR-клетки (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220 (1980)), человеческие эмбриональные клетки почек (HEK) 293 или клетки 293T (ATCC No. CRL1573) и клетки 3T3 (ATCC No. CCL92). Другими пригодными млекопитающими клеточными линиями являются обезьяньи COS-1 (ATCC No. CRL1650) и клеточные линии COS-7 (ATCC No. CRL1651), а также клеточная линия CV-1 (ATCC No. CCL70). Дополнительно иллюстративные млекопитающие клетки-хозяина содержат клеточные линии приматов и клеточные линии грызунов, включая трансформированные клеточные линии. Нормальные диплоидные клетки, клеточные штаммы производные из in vitro культуры первичной ткани, а так же из первичных эксплантатов, также пригодны. Другие пригодные клеточные линии млекопитающих содержат, но не ограничены ими, N2A клетки нейробластомы мыши, HeLa, мышиные клетки L-929 и BHK или хомячьи клеточные линии HaK, все из которых доступны у ATCC. Способы отбора пригодных млекопитающих клеток-хозяина и способы для трансформации, культивирования, амплификации, скринирования и очистки клеток известны в данной области.

[0064] Наиболее предпочтительно млекопитающая клетка представляет собой человеческую клетку. Например, млекопитающая клетка может быть человеческой лимфоидной или полученной из лимфоидной клеточной линией, такой как клеточная линия пре-В-лимфоцитного происхождения. Примеры человеческих линий лимфоидных клеток содержат, без ограничения, RAMOS (CRL-1596), Daudi (CCL-213), EB-3 (CCL-85), DT40 (CRL-2111), 18-81 (Jack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1581-1585 (1988)), клетки Raji (CCL-86) и их производные.

[0065] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей изобретательскую аминокислотную последовательность, может быть введена в клетку посредством ʺтрансфекцииʺ, ʺтрансформацииʺ или ʺтрансдукцииʺ. ʺТрансфекцияʺ, ʺтрансформацияʺ или ʺтрансдукцияʺ, как это применено в данном описании, относятся к введению одного или более экзогенных полинуклеотидов в клетки-хозяина с применением физических или химических способов. Многие технологии трансфекции известны в данной области и содержат, например, совместное осаждение ДНК с фосфатом кальция (см., напр., Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Protocols, Humana Pres (1991)); DEAE-декстран; электропорацию; опосредованную катионной липосомой трансфекцию; микрочастичную бомбардировку с частицами вольфрама (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и совместное осаждение ДНК с фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Фаг или вирусные векторы могут быть введены в клетки-хозяина, после роста инфекционных частиц в пригодных упаковывающих клетках, многие из которых коммерчески доступны.

[0066] Изобретение относится к композиции, содержащей эффективное количество изобретательского полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина, изобретательского полипептида легкой цепи иммуноглобулина, изобретательского связывающего IL-33 агента, изобретательской последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей любое из вышеприведенного, или изобретательского вектора, содержащего изобретательскую последовательность нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, композиция является фармацевтически приемлемой (напр., физиологически приемлемой) композицией, которая содержит носитель, предпочтительно фармацевтически приемлемый (напр., физиологически приемлемый) носитель и изобретательские аминокислотные последовательности, антиген-связывающий агент или вектор. Любой пригодный носитель может быть применен в контексте изобретения и такие носители хорошо известны в данной области. Выбор носителя будет определен, отчасти, конкретным сайтом, к которому может быть введена композиция, и конкретным способом, примененным для введения композиции. Композиция необязательно может быть стерильной. Композиция может быть заморожена или лиофилизирована для хранения и ресуспендирована в пригодном стерильном носителе перед применением. Композиции могут быть генерированы в соответствии с общепринятыми технологиями, описанными, напр., в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001).

[0067] Изобретение дополнительно относится к способу лечения заболевания или нарушения у млекопитающего, которое восприимчиво к ингибированию IL-33 или нейтрализации. Способ содержит введение вышеупомянутой композиции млекопитающему, имеющему заболевание или нарушение, которое является восприимчивым к ингибированию или нейтрализации IL-33, вследствие чего заболевание или нарушение у млекопитающего подвергается лечению. Заболевание или нарушение, которое является ʺвосприимчивым к IL-33 ингибированиюʺ или ʺвосприимчивым к IL-33 нейтрализацииʺ, относится к любому заболеванию или нарушению, в котором понижение уровней или активности IL-33 обладает терапевтической выгодой для млекопитающего, предпочтительно людей, или неправильная экспрессия (напр., сверхэкспрессия) или повышенная активность IL-33 вызывает или вносит вклад в патологические эффекты заболевания или нарушения. Заболевания или нарушения, которые являются восприимчивыми к ингибированию или нейтрализации IL-33, содержат, например, воспалительные нарушения, аутоиммунные заболевания, некоторые раки (напр., эпителиальные раки (карциномы), хроническую гранулоцитную лейкемию (CML), раки молочной железы и желудочно-кишечные раки) и любое атопическое нарушение. Воспалительные нарушения содержат, например, аллергическое воспаление кожы, легких и желудочно-кишечного тракта, атопический дерматит (также известный как атопическая экзема), астму (аллергическую и неаллергическую), фиброз (напр., идиопатический легочный фиброз, склеродермию, фиброз почки и рубцевание), хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), аллергический ринит, пищевые аллергии (напр., аллергии на арахис, яйца, молочные продукты, моллюски, лесные орехи и т.д.), сезонные аллергии и другие аллергии. Аутоиммунные заболевания содержат, например, Болезнь Крона, ревматоидный артрит, псориаз, анкилозирующий спондилоартрит, красную волчанку и склеродермию. Термин ʺатопическийʺ, как это применено в данном описании, относится к наследственной предрасположенности к развитию некоторых реакций гиперчувствительности (напр., экзема (атопический дерматит), сенная лихорадка (аллергический ринит) и индуцируемая аллергией астма (аллергическая астма)), которая, как правило, опосредована чрезмерной выработкой IgE.

[0068] Как это применено в данном описании, термины ʺлечениеʺ ʺподвергание лечениюʺ и тому подобное относятся к получению требуемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Предпочтительно, эффект является терапевтическим, т.е., эффект частично или полностью исцеляет заболевание и/или неблагоприятный симптом, присущий заболеванию. В связи с этим, изобретательский способ содержит введение ʺтерапевтически эффективного количестваʺ связывающего IL-33 агента. ʺТерапевтически эффективное количествоʺ относится к количеству, эффективному с дозировками и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в соответствии с факторами, такими как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивидуума и способность связывающего IL-33 агента вызывать требуемый ответ у индивидуума. Например, терапевтически эффективное количество связывающего IL-33 агента по изобретению представляет собой количество, которое понижает IL-33 биоактивность у человека.

[0069] Альтернативно фармакологический и/или физиологический эффект может являться профилактическим, т.е., эффект полностью или частично предотвращает заболевание или его симптом. С этой точки зрения, изобретательский способ содержит введение ʺпрофилактически эффективного количестваʺ связывающего IL-33 агента. ʺПрофилактически эффективное количествоʺ относится к количеству, эффективному с дозировками и в течение периодов времени, необходимых, для достижения требуемого профилактического результата (напр., предотвращение начала заболевания).

[0070] Типичная доза может лежать, например, в диапазоне от 1 пг/кг до 20 мг/кг массы тела животного или человека; однако, дозы ниже или выше этого иллюстративного диапазона находятся в пределах объема изобретения. Ежесуточная парентеральная доза может составлять приблизительно от 0,00001 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг общей массы тела (напр., приблизительно 0,001 мкг/кг, приблизительно 0,1 мкг/кг, приблизительно 1 мкг/кг, приблизительно 5 мкг/кг, приблизительно 10 мкг/кг, приблизительно 100 мкг/кг, приблизительно 500 мкг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений), предпочтительно от приблизительно 0,1 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг общей массы тела (напр., приблизительно 0,5 мкг/кг, приблизительно 1 мкг/кг, приблизительно 50 мкг/кг, приблизительно 150 мкг/кг, приблизительно 300 мкг/кг, приблизительно 750 мкг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений), более предпочтительно от приблизительно 1 мкг/кг до 5 мг/кг общей массы тела (напр., приблизительно 3 мкг/кг, приблизительно 15 мкг/кг, приблизительно 75 мкг/кг, приблизительно 300 мкг/кг, приблизительно 900 мкг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений) и даже более предпочтительно от приблизительно 0,5 до 15 мг/кг массы тела в сутки (напр., приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 2,5 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 6 мг/кг, приблизительно 9 мг/кг, приблизительно 11 мг/кг, приблизительно 13 мг/кг, или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений). За терапевтической или профилактической эффективностью можно наблюдать посредством периодической оценки подвергнутых лечению пациентов. Для повторяющихся введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение может быть повторено до тех пор, пока происходит требуемая супрессия симптомов заболевания. Однако другие режимы дозирования могут быть пригодны и охватываются объемом изобретения. Требуемая дозировка может быть доставленной одиночным болюсным введением композиции, множественными болюсными введениями композиции, или непрерывным введением композиции вливанием.

[0071] Композиция, содержащая эффективное количество изобретательского полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина, изобретательского полипептида легкой цепи иммуноглобулина, изобретательского связывающего IL-33 агента, изобретательской последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей любое из вышеприведенного, или изобретательского вектора, содержащего изобретательскую последовательность нуклеиновой кислоты, может быть введена млекопитающему с применением стандартных технологий введения, включая оральное, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, внутриносовое, букальное, подъязычное или суппозиторное введение. Композиция предпочтительно пригодна для парентерального введения. Термин ʺпарентеральноеʺ, как это применено в данном описании, включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное и внутрибрюшинное введение. Более предпочтительно композиция введена млекопитающему с применением периферической системной доставки посредством внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.

[0072] После введения млекопитающему (напр., перекрестно реактивный человек) биологическая активность изобретательского IL-33-связывающиего агента может быть измерена любым пригодным способом, известным в данной области. Например, биологическая активность может быть оценена определением стабильности конкретного связывающего IL-33 агента. В одном варианте осуществления изобретения, связывающий IL-33 агент (напр., антитело) имеет in vivo время полужизни между приблизительно 30 минутами и 45 днями (напр., приблизительно 30 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 2 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 6 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 1 день, приблизительно 5 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 15 дней, приблизительно 25 дней, приблизительно 35 дней, приблизительно 40 дней, приблизительно 45 дней или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений). В другом варианте осуществления связывающий IL-33 агент имеет in vivo время полужизни между приблизительно 2 часами и 20 днями (напр., приблизительно 5 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 2 дня, приблизительно 3 дня, приблизительно 7 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 14 дней, приблизительно 17 дней, приблизительно 19 дней, или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений). В другом варианте осуществления связывающий IL-33 агент имеет in vivo время полужизни между приблизительно 10 днями и приблизительно 40 днями (напр., приблизительно 10 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 16 дней, приблизительно 18 дней, приблизительно 20 дней, приблизительно 23 дня, приблизительно 26 дней, приблизительно 29 дней, приблизительно 30 дней, приблизительно 33 дня, приблизительно 37 дней, приблизительно 38 дней, приблизительно 39 дней, приблизительно 40 дней или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений).

[0073] Биологическая активность конкретного связывающего IL-33 агента также может быть оценена определением его связывающей аффинности с IL-33 или его эпитопом. Термин ʺаффинностьʺ относится к константе равновесия для обратимого связывания двух агентов и выражен в виде константы диссоциации (K_D). Аффинность связывающего агента с лигандом, такая как аффинность антитела к эпитопу, может составлять, например, от приблизительно 1 фемтомолярной (фМ) до приблизительно 100 микромолярной (мкМ) (напр., от приблизительно 1 фМ до приблизительно 1 пикомолярной (пМ), от приблизительно 1 пМ до приблизительно 1 наномолярной (нМ), от приблизительно 1 нМ до приблизительно 1 микромолярной (мкМ) или от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 100 мкМ). В одном варианте осуществления связывающий IL-33 агент может связываться с IL-33 белком с K_D, меньшей чем или равной 1 наномолярной (напр., 0,9 пМ, 0,8 пМ, 0,7 пМ, 0,6 пМ, 0,5 пМ, 0,4 пМ, 0,3 пМ, 0,2 пМ, 0,1 пМ, 0,05 пМ, 0,025 пМ, 0,01 пМ, 0,001 пМ или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений). В другом варианте осуществления связывающий IL-33 агент может связываться с IL-33 с K_D, меньшей чем или равной 200 пМ (напр., 190 пМ, 175 пМ, 150 пМ, 125 пМ, 110 пМ, 100 пМ, 90 пМ, 80 пМ, 75 пМ, 60 пМ, 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 25 пМ, 20 пМ, 15 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 1 пМ или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеприведенных значений). Аффинность иммуноглобулина к антигену или эпитопу, представляющему интерес, может быть измерена с применением любого признаваемого в данной области анализа. Такие способы содержат, например, сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS), разделяемые шарики (напр., магнитные шарики), поверхностный плазмонный резонанс (SPR), конкурирование в фазе раствора (KINEXA™), антигенный пэннинг и/или ELISA (см., напр., Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing, New York, NY, 2001).

[0074] Связывающий IL-33 агент по изобретению может быть введен одиночно или в комбинации с другими лекарственными средствами (напр., в виде адъюванта). Например, связывающий IL-33 агент может быть введен в комбинации с другими агентами для лечения или предотвращения заболеваний или нарушений, раскрытых в данном описании. С этой точки зрения связывающий IL-33 агент может быть применен в комбинации с по меньшей мере одним другим противоспалительным агентом, включая, например, кортикостероиды (напр., преднизон и флутиказон) и нестероидные противоспалительные лекарственные средства (NSAID) (напр., аспирин, ибупрофен и напроксен).

[0075] В добавление к терапевтическим применениям связывающий IL-33 агент, описанный в данном описании, может быть применен в диагностических или исследовательских приложениях. С этой точки зрения, связывающий IL-33 агент может быть применен в способе для диагноза заболевания или нарушения, которое восприимчиво к ингибированию или нейтрализации IL-33. Подобным образом, связывающий IL-33 агент может быть применен в анализе для наблюдения за уровнями IL-33 белка у объекта, тестируемого на заболевание или нарушение, которое восприимчиво к ингибированию IL-33 или нейтрализации. Исследовательские приложения содержат, например, способы, которые используют связывающий IL-33 агент и метку для детектирования белка IL-33 в образце, напр., в человеческих жидких средах организма или в клеточном или тканевом экстракте. Связывающий IL-33 агент может быть применен с или без модификации, такой как ковалентное или нековалентное мечение с детектируемой группой. Например, детектируемая группа может представлять собой радиоизотоп (напр., ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S или ¹²⁵I), флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение (напр., флуоресцинизотиоцианат, родамин или луциферин), фермент (напр., щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза хрена) или протетические группы. Любой способ, известный в данной области, может быть задействован для отдельного конъюгирования антиген-связывающего агента (напр., антитело) с детектируемой группой в контексте изобретения (см., напр., Hunter et al., Nature, 194: 495-496 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219-230 (1981); и Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)).

[0076] Уровни белка IL-33 могут быть измерены с применением изобретательского связывающего IL-33 агента любым пригодным способом, известным в данной области. Такие способы содержат, например, радиоиммуноанализ (RIA) и FACS. Нормальные или стандартные значения экспрессии IL-33 могут быть установлены с применением любой пригодной технологии, напр., посредством комбинирования образца, содержащего или возможно содержащего, IL-33 с IL-33-специфическим антителом при условиях, пригодных для формирования комплекса антиген-антитело. Антитело непосредственно или опосредованно мечено с детектируемым веществом для облегчения детекции связанного или несвязанного антитела. Пригодные детектируемые вещества содержат различные ферменты, протетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы (см., напр., Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). Количество полипептида IL-33, экспрессированного в образце, затем сравнивают со стандартной величиной.

[0077] Связывающий IL-33 агент может быть представлен в наборе, т.е., упакованная комбинация реагентов в заранее определенных количествах с инструкциями для выполнения диагностического анализа. Если связывающий IL-33 агент является меченным с ферментом, набор по желанию включает субстраты и кофакторы, требуемые для фермента (напр., предшественник субстрата, который относится к детектируемому хромофору или флуорофору). В добавление, в наборе могут содержаться другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (напр., блокирующий буфер или лизирующий буфер) и тому подобное. Относительные количества различных реагентов могут варьироваться для предоставления концентраций в растворе реагентов, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. Реагенты могут быть представлены в виде сухих порошков (как правило, лиофилизированных), включая наполнители, которые при растворении будут обеспечивать раствор реагента, имеющий соответствующую концентрацию.

[0078] Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение но, без сомнения, не должны истолковываться, как каким-либо образом ограничивающие его объем.

Пример 1

[0079] Этот пример описывает анализы, примененные для определения функциональной активности изобретательских полипептидов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина.

IL-33-опосредованное высвобождение IL5 из клеток KU812.

[0080] Клетки KU812, человеческая подобная базофилу клеточная линия CML (ATCC No. CRL-2099) (см., напр., Tare et al., Exp. Cell Res., 316(15): 2527-37 (2010); Lefrancais et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109(5): 1673-1978 (2012)), отвечают на IL-33 стимулирование посредством секретирования IL-5. Клетки KU812 суспендировали в культуральной среде RPM1+10% FBS и 500000 клеток в расчете на лунку высеивали слоем на 96-луночные планшеты с плоским дном. Стоковый раствор 30 мкг/мл для антитела, представляющего интерес, последовательно разводили для генерирования 8 концентраций с интервалами с логарифмом отношения соседних значений 0,5. Разбавленные образцы добавляли рядами в клетки и инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Затем в каждую лунку добавляли IL-33-his6-bio (C-терминально меченный с 6 His и биотинилированный со средним от 1 до 2 биотинов на молекулу) (3 нг), и планшеты инкубировали при 37°C в течение 48 часов. Супернатанты затем удаляли и выдерживали при 4°C до тестирования посредством ELISA. Супернатанты тестировали с применением набора IL-5 DuoSet ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) и оценивали на считывателе для микрпланшетов SPECTRAMAX™ (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA) с применением программного обеспечения для получения и анализа данных с микропланшета SOFTMAX PRO ™ (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA) для определения выработки IL-5.

IL-33-опосредованная экспрессия люциферазы в клетках HEK293-ST2

[0081] HEK/ST2-стабильную клеточную линию генерировали первым высеиванием слоем интактных клеток HEK при 3×10³ клеток/колба T75 колба в DMEM/10%FBS и инкубировали в течение ночи при 37 °C. На следующий день клетки трансфицировали смешиванием 500 мкл Optimem (Life Technologies, Carlsbad, CA)+24 мкл БХ FUGENE™ (Promega, Madison, WI) и оставляли инкубироваться при комнатной температуре в течение пяти минут. ДНК, кодирующую ST2-Fc (4 мкг), добавляли в смесь FUGENE™ и оставляли инкубироваться при комнатной температуре в течение 25 минут. Смесь ДНК/FUGENE™ затем распределяли по клеткам HEK и оставляли инкубироваться в течение ночи при 37 °C, 5% CO₂. Через 24 часа после трансфекции клетки расщепляли и проводили гигромициновый отбор в течение периода 3-4 недели до стабильной селекции.

IL-8 Репортерный люциферазный анализ

[0082] Клетки 4×10⁶ HEK293/ST2-Fc высеивали в колбу T-75 в течение ночи при 37 °C, 5% CO₂. На следующее утро конструкт ДНК AB4111, который кодирует человеческий IL-8 промотор, направляющий экспрессию репортерного гена люциферазы, трансфицировали в клетки посредством смешивания 500 мкл Optimem+24 мкл БХ FUGENE™ и оставляли инкубироваться при комнатной температуре в течение пяти минут. IL-8 промотор реагирует на каскад передачи сигнала, инициируемый стимулированием комплекса ST2-IL-1RAcP рецептор посредством задействования IL-33. AB4111 (2 мкг) добавляли к смеси FUGENE™ и оставляли инкубироваться при комнатной температуре в течение 25 минут. Смесь ДНК/FUGENE™ распределяли по клеткам HEK/ST2 и оставляли инкубироваться в течение 8 часов. Клетки собирали с ACCUTASE™ и высеивали в 96-луночный, планшет с плоским дном, с 2,0×10⁴ клеток в расчете на лунку в 0,1 мл DMEM/10%FBS. Планшеты инкубировали в течение 15-18 часов при 37 °C, 5% CO₂. На следующее утро планшеты осторожно переворачивали на бумажные полотенца для удаления сред. 50 мкл/лунку свежей DMEM/10%FBS добавляли в каждую лунку. Клетки стимулировали с предварительно образованным комплексом IL-33/ST2-Fc или IL-33/Ат в течение 20 минут при комнатной температуре и затем добавляли к клеткам и оставляли инкубироваться в течение дополнительных 5 часов при 37 °C. После 5 часов определяли люциферазную активность с применением системы для анализа Steady Glo-Luciferase (Promega, Madison, WI) посредством добавления люциферазного реагента с 1:1 об./об. в каждую лунку. Лунки перемешивали и 150 мкл/лунку переносили планшеты с черными стенками и прозрачным дном и считывали на считывателе для планшетов ENVISTION™ (PerkinElmer, Waltham, MA) с применением программы Люминесценция (60-с задержка). Данные анализировали с применением 4 параметрической кривой, подобранной с программным обеспечением GraphPad Prism 5 (GraphPad, San Diego, CA).

Способы поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

[0083] Кинетику связывания и аффинности анти-IL33 антитела определяли посредством SPR на инструменте BIACORE™ T200 (GE Healthcare). Каждый из четырех потоков клеток на чипе Series S CM5 иммобилизовывали с ~10000 RU анти-человеческого IgG (Fc). Антитела (~1 мкг/мл) улавливали в течение 60 секунд при скорости потока 10 мкл/мин. Мономерный IL-33 разбавляли в подвижном буфере (HBS-EP+, pH 7,6), начиная с приблизительно 100-кратно более высокой концентрации, чем KD каждого антитела. Каждую концентрацию IL-33 пропускали через все протекающие клетки в течение 180 секунд при 30 мкл/мин, затем оставляли диссоциироваться в течение 1800 секунд. Поверхности регенерировали с 3 M MgCl₂ в течение 60 секунд. Кинетические константы асссоциации и диссоциации (k_on и k_off) и аффинность в стационарном состоянии (KD) получали по результатам сенсограмм с применением программного обеспечения для оценки BIACORE T200 версия 1.0.

[0084] Результаты вышеприведенных анализов по отношению к нескольким из IL-33-связывающих агентов, описанных в данном описании, показаны на фигурах 1A, 1B, 2A и 2B.

Пример 2

[0085] Этот пример описывает эксперименты, демонстрирующие функциональную активность изобретательского связывающего IL-33 агента.

[0086] Полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136 спаривали с полипептидом легкой цепи иммуноглобулина, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 171. Полученное в результате антитело обозначали APE4909. Способность APE4909 к ингибированию IL-33-опосредованного высвобождения IL-5 и IL-9 в первичных человеческих базофилах оценивали, как описано ниже.

[0087] Единицы редукционной лейкоцитарной системы (LRS), полученные из донорной цельной крови, получали из банка крови San Diego. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обрабатывали стандартными способами с применением разделения центрифугированием с фиколлом. Как правило, получали приблизительно 10⁹ PBMC из единицы LRS. Базофилы выделяли из PBMC с применением набора для выделения человеческих базофилов II (Miltenyi Biotec cat#130-092-662, San Diego, CA). Общий выход базофилов составлял приблизительно 10⁶.

[0088] Базофилы разбавляли до плотности 2 x10⁶/мл в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллин/стрептомицин (P/S) и 25 нг/мл рекомбинантного человеческого IL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN). 100 мкл разбавленных клеток в расчете на лунку высеивали слоем на стандартные плоскодонные 96-луночные тканевые культуральные планшеты с конечной клеточной плотностью 2×10⁵ в расчете на лунку. Наружные лунки наполняли с 200 мкл PBS/лунку для мимнимизации эффектов неравномерного испарения. Клетки культивировали в течение ночи в 5% CO₂ в инкубаторе 37 °C.

[0089] На следующий день APE4909 и мономерный человеческий белок ST2 (hST2 - обозначаемый как APE3906) добавляли в концентрации, варьирующейся от 30 до 0 мкг/мл, последовательно разбавляли с интервалами с логарифмом отношения соседних значений 0,5 в RPMI+10% FBS+P/S, содержащем 50 нг/мл IL-33. Приблизительно через 18 часов планшеты центрифугировали при 300 x g в течение 3 минут. Супернатанты удаляли, переносили в чистый планшет и хранили при -80°C в ожидании анализа.

[0090] Уровни IL-5 и/или IL-9 в клеточных супернатантах оценивали посредством ELISA с применением набора DUOSET™ ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) в соответствии с предполагаемым производителем протоколом. Антитело APE4909 ингибировало опосредованное IL-33 высвобождение IL-5 и IL-9 в первичных человеческих базофилах, как показано на фигурах 3 и 4.

[0091] Результаты этого примера демонстрируют, что изобретательский связывающий IL-33 агент может ингибировать активность IL-33.

Пример 3

[0092] Этот пример демонстрирует аффинность изобретательского связывающего IL-33 агента в отношении IL-33.

[0093] Способность антитела APE4909, описанного в примере 2, взаимодействовать с IL-33, анализировали биофизически с применением биосенсорной платформы KINEXA™ 3200 от Sapidyne Instruments (Boise, ID). Эксперименты связывания для человеческого IL-33 и IL-33 яванского макака (cynoIL-33) проводили, как описано ниже и их осуществляли два раза независимо. Условия для первого эксперимента показаны не в скобках, тогда как условия для второго эксперимента представлены в скобках.

APE4909/человеческий IL-33

[0094] Твердую фазу готовили с применением покрытых азлактоном шариков, покрытых с применением раствора 50 мкг/мл гистидин-меченного человеческого IL-33. Эксперименты связывания выполняли в 1X PBS pH 7,4, 0,1% BSA. Антитело APE4909 с конечной концентрацией 10 пМ (или 20 пМ) инкубировали с конечными концентрациями IL-33 от 200 пМ до 3,4 фМ (или 400 пМ до 6,7 фМ) в течение 3 (или 4) дней при 4 °C. 5 мл (или 10 мл) каждой смеси наносили на шарики, покрытые с IL-33 со степенью 0,25 мл/мин в течение 1200 секунд (или 2400 секунд). Свободное антитело детектировали с ALEXAFLUOR™ 647-(Life Technologies, Carlsbad, CA), меченное ослиное анти-человеческое антитело. Все данные адаптировали с применением стандартного программного обеспечения KINEXA™.

APE4909/Cyno IL-33 (cIL-33)

[0095] Эксперименты выполняли, как описано выше для человеческого IL-33, за исключением того, что APE4909 антитело c конечной концентрацией 20 пМ и 100 пМ инкубировали с cIL-33 при конечной концентрации от 3нМ до 315 фМ в течение 24 часов при 4 °C. Каждую смесь наносили на шарики, покрытые с cIL-33 со скоростью 0,25 мл/мин в течение 500 секунд (для 20 пМ) или 2120 секунд (для 100 пМ). Свободное антитело детектировали с меченным ослиным анти-человеческим антителом ALEXAFLUOR™ 647-(Life Technologies, Carlsbad, CA). Две кривые комбинировали с применением анализа N-кривой и все данные адаптировали с применением программного обеспечения KINEXA™. Для подтверждения эксперимент повторяли при концентрации антитела APE4909 200пМ с применением подобным образом приготовленной твердой фазы, буферов и детекционных реагентов. Антитело APE4909 инкубировали с cIL-33 при конечной концентрации от 15нМ до 250 фМ в течение 24 часов при 4°C и наносили на шарики, покрытые с cIL-33 со скоростью 0,25 мл/мин в течение 180 секунд. Эти данные адаптировали с применением стандартного программного обеспечения KINEXA™.

[0096] Аффинности APE4909 в отношении человеческого IL-33 и cynoIL-33 показаны на фигуре 5 и фигуре 6, соответственно. Результаты этого примера демонстрируют, что изобретательский связывающий IL-33 агент связывается как с человеческим IL-33, так и с IL-33 примата кроме человека с высокой аффинностью.

Пример 4

[0097] Этот пример демонстрирует, что некоторые изобретательские связывающие IL-33 агенты конкурируют с ST2 рецептором за связывание с человеческим IL-33.

[0098] За IL-33 связыванием наблюдали с применением системы BIACORE™ T200 (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK). Связывание IL-33 с различными IL-33 антителами, раскрытыми в данном описании, или человеческим ST2 рецептором рассматривали посредством улавливания антитела и обозревания связывающего ответа фиксированных концентраций IL-33 в комбинации с увеличивающимися количествами ST2. Анти-человеческий IgG (Fc-специфический, ~10000 RU) иммобилизовывали на чипе BIACORE™ CM5 с применением химии EDC-активированного сопряжения аминов. Затем изобретательские IL-33 антитела или человеческие ST2, слитые с Fc областью человеческого IgG1 (2,0 мкг/мл, время контакта 1 минута при скорости потока 10 мкл/мин), улавливали при 25°C (~300 RU) на этой поверхности. Затем раствор аналита (предварительно инкубированного в течение больше чем 30 минут), содержащий мономерный растворимый человеческий немеченый IL-33 (1 пМ) и немеченый человеческий ST2 (10, 3,3, 1,1 или 0,37 пМ), пропускали над захваченными лигандами в течение 2 минут со скоростью 30 мкл/мин и за диссоциацией наблюдали в течение дополнительных 2 минут. Поверхность сенсорного чипа регенерировали после каждого цикла с применением 3M MgCl₂ (60 секунд при 30 мкл/мин).

[0099] Второй набор экспериментов выполняли, как описано выше, но со следующими изменениями: (1) сенсорный чип иммобилизовывали с анти-мышиным IgG (Fc-специфический, ~7500 RU); (2) человеческие ST2, слитые с мышиным IgG2aFc (1,0 мкг/мл), улавливали на чипе со временем контакта 4 минуты; и (3) предварительно инкубированный раствор аналита содержал мономерный растворимый человеческий немеченый IL-33 (10 пМ) и или изобретательское IL-33 антитело, или мономерный немеченный человеческий ST2 (100 пМ, 25 пМ, 6,3 нМ или 1,6 пМ). Раствор аналита продолжали инкубировать в течение приблизительно 30 минут, тогда как устройство выполняло стартовые циклы. Улавливание и связывание аналита выполняли в подвижном буфере HBS-EP+ (10 мМ HEPES, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% Surfactant P-20; Teknova).

[0100] ST2 связывание с таким же эпитопом IL-33, как у изобретательского антитела, было связано с потерей связывающего ответа, так как предварительно инкубирование ST2 с IL-33 может препятствовать доступу антитела к эпитопу. ST2 связывание с другим эпитопом IL-33 позволяет IL-33 связываться с уловленным изобретательским антителом, что наблюдали в виде увеличения в связывающем ответе, так как связывающий ответ непосредственно прямопропорционален массе аналита/комплекса. Результаты этих экспериментов представлены далее в таблице 1.

Таблица 1

Изобретательское антитело Ответ Вывод APE00986 нет ответа в отсутствии ST2 Не связывается с IL-33 APE02718 ответ понижается по мере того как [ST2] возрастает ST2 связывается с таким же/перекрывающимся эпитопом APE03833 ответ понижается по мере того как [ST2] возрастает ST2 связывается с таким же/перекрывающимся эпитопом APE04269 ответ понижается по мере того как [ST2] возрастает ST2 связывается с таким же/перекрывающимся эпитопом APE05492 ответ возрастает по мере того как [ST2] возрастает ST2 связывается с другим эпитопом

[0101] Результаты этого примера демонстрируют, что некоторые изобретательские связывающие IL-33 агенты связываются с IL-33 эпитопом, который является подобным или идентичным эпитопу, связанному ST2 рецептором.

Пример 5

[0102] Этот пример демонстрирует, что изобретательский связывающий IL-33 агент ингибирует человеческую IL-33-направляемую экспансию периферических эозинофилов.

[0103] IL-33 индуцирует повышенную экспрессию и высвобождение IL-5 из CD4⁺ TH2 клеточных популяций, врожденных лимфоидных клеток типа-2 (ILC2 клетки) и базофилов. IL-5 представляет собой цитокин, который играет ключевую роль в дифференциации, экспансии и выживании эозинофилов, популяции клеток, которая, как известно, опосредует некоторые аспекты признаков атопического заболевания, такие как астма и ринит. В предварительном исследовании человеческий IL-33 был инъецирован внутрибрюшино мышам дикого типа Balb/c в течение шести последовательных дней с дозой 5 мкг в расчете на животное. Последующий анализ FACS по завершению этого первоначального 6-дневного исследования указывал на то, что подвергшиеся лечению с человеческим IL-33 мыши имели повышенные количества эозинофилов в периферической крови (как определено посредством анализа с высоким боковым светорассеянием и CCR3 Siglec-F и экспрессии CD16/CD32) по сравнению с подвергшимися лечению с носителем (PBS) мышами.

[0104] В качестве продолжения вышеприведенного исследования мыши дикого типа Balb/c были снова инъецированы с 5 мкг человеческого IL-33 раза в сутки в течение 6-дней в общем (дней 1-6) и анти-человеческое антитело IL-33 APE04909 (описанное выше) вводили в дни -2 и +2 исследования с дозой 10 мг/кг каждые сутки. Схожим группам мышей, подвергаемым лечению с человеческим IL-33 с дозой 5 мкг раз в сутки, вводили или контрольное человеческое мАт изотипа IgG (обозначенное APE00987), или человеческий ST2-hFc слитый белок (обозначенный APE027180), который представляет человеческую IgG1 Fc-слитую димерную версию растворимого IL-33 рецептора (ST2). Оба из этих контрольных белков также вводили с дозами 10 мг/кг только в дни -2 и +2 исследования, как описано для антитела APE04909.

[0105] Как показано на фигуре 7, анти-IL-33 APE04909 антитело существенно ингибировало человеческую IL-33-направляемую эозинофильную экспансию в компартмент периферической крови. При сравнении, человеческий ST2-hFc белок не мог значительно снижать количества эозинофилов крови у мыши, подверженной обработке с человеческим IL-33, и не демонстрировал сниженный уровень эозинофильных количеств выше, чем детектируемый у мышей, подвергаемых лечению с контрольными мАт IgG (APE00987).

[0106] Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, цитированные в данном описании, посредством настоящего включены путем ссылки в той же степени, как если бы для каждой ссылки было бы индивидуально и конкретно указано, что она включена путем ссылки, и они были бы полностью приведены в данном описании.

[0107] Применение терминов в единственном числе и формулировки ʺпо меньшей мере одинʺ и подобные обозначения в контексте описания изобретения (особенно в контексте последующей формулы изобретения) должны рассматриваться, как охватывающие как единственное и множественное число, если в данном описании не указано иное или контекст не противоречит однозначно этому. Применение термина ʺпо меньшей мере одинʺ с последующим списком одного или более элементов (например, ʺпо меньшей мере один из A и Bʺ) должно быть истолковано для обозначения одного элемента, выбранного из перечисленных элементов (A или B), или любой комбинации двух или более из перечисленных элементов (A и B), если не указано иное в данном описании или этому не противоречит однозначно контекст. Термины ʺсодержащийʺ, ʺимеющийʺ и ʺвключающийʺ должны быть истолкованы как неограничивающие термины (т.е., обозначающие ʺвключая, но без ограничения имиʺ), если не обозначено иное. Подразумевается, что перечисление диапазонов значений в данном описании служит просто в качестве сокращенного способа ссылки индивидуально на каждое отдельное значение, попадающее в диапазон, если не указано иное в данном описании и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было индивидуально приведено в данном описании. Все способы, описанные в данном описании, могут быть выполнены в любом пригодном порядке, если не указано иное в данном описании или это не противоречит однозначно иным образом контексту. Подразумевается, что применение любого и всех примеров, или иллюстративного языка (напр., ʺтакой какʺ), представленное в данном описании, предназначено просто для лучшего разъяснения изобретения и не накладывает ограничение на объем по изобретению, если иное не представлено в формуле изобретения. Никакие формулировки в описании не должны рассматриваться как указывающие, что какой-либо не заявленный элемент является необходимым для воплощения изобретения на практике.

[0108] Предпочтительные варианты осуществления этого изобретения описаны в данном описании, включая наилучший известный изобретателям для осуществления изобретения. Вариации этих предпочтительных вариантов осуществления могут стать очевидными специалисту в данной области при прочтении вышеприведенного описания. Изобретатели предполагают, что опытные специалисты задействуют такие вариации соответствующим образом, и изобретатели подразумевают, что изобретение может быть воплощено на практике отлично от того, как конкретно описано в данном описании. Соответственно, это изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта патентования, приведенного в формуле изобретения, прилагаемой к описанию, как это допускается применяемым законодательством. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных их вариациях охвачена изобретением, если не указано иное в данном описании или это иным образом не противоречит однозначно контексту.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены выделенные антитела, способные специфически связывать IL-33. Также рассмотрены молекула нуклеиновой кислоты, композиция и клетка. Кроме того, описан способ лечения нарушения, которое является восприимчивым к ингибированию IL-33. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии различных состояний, в частности аутоиммунных заболеваний и рака. 6 н. и 19 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 5 пр.

1. Выделенное антитело IL-33, содержащее (a) CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 136 и (b) CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 171.

2. Выделенное антитело IL-33, содержащее (a) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 136 и (b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 171.

3. Выделенное антитело IL-33 по п. 1 или 2, которое представляет собой фрагмент антитела, выбранный из F(ab')₂, Fab', Fab, Fv, scFv, dsFv и одноцепочечного связывающего полипептида.

4. Выделенное антитело IL-33 по п. 1 или 2, которое представляет собой IgG1 антитело.

5. Выделенная или очищенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело IL-33 по любому из пп. 1-4.

6. Выделенная или очищенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 5, где молекула представлена в векторе.

7. Композиция, содержащая (a) эффективное количество антитела IL-33 по любому из пп. 1-4 и (b) фармацевтически приемлемый носитель, для использования в качестве лекарственного средства для лечения расстройства у млекопитающего, которое реагирует на ингибирование IL-33.

8. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что нарушение представляет собой воспалительное нарушение, аутоиммунное заболевание или рак.

9. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что нарушение представляет собой аллергическую астму, пищевую аллергию или фиброз.

10. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что нарушение представляет собой аллергию на арахис.

11. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что нарушение представляет собой атопический дерматит.

12. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что нарушение представляет собой болезнь Крона или ревматоидный артрит.

13. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что нарушение представляет собой эпителиальный рак, хроническую гранулоцитную лейкемию (CML), рак молочной железы или желудочно-кишечный рак.

14. Композиция по любому из пп. 7-13, отличающаяся тем, что время полужизни антитела IL-33 в млекопитающем составляет от 30 минут до 45 дней.

15. Композиция по любому из пп. 7-14, отличающаяся тем, что антитело IL-33 связывается с IL-33 с K_D между приблизительно 1 фемтомолярной (фМ) и приблизительно 100 микромолярной (мкМ).

16. Выделенная клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 5 или 6, где выделенная клетка экспрессирует антитело IL-33, кодируемое молекулой нуклеиновой кислоты.

17. Способ лечения нарушения, которое является восприимчивым к ингибированию IL-33, включающий введение эффективного количества антитела IL-33 по п. 1 или 2 или композиции по п. 7 млекопитающему.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что нарушение представляет собой воспалительное нарушение, аутоиммунное заболевание или рак.

19. Способ по п. 17, отличающийся тем, что нарушение представляет собой аллергическую астму, пищевую аллергию или фиброз.

20. Способ по п. 17, отличающийся тем, что нарушение представляет собой аллергию на арахис.

21. Способ по п. 17, отличающийся тем, что нарушение представляет собой атопический дерматит.

22. Способ по п. 17, отличающийся тем, что нарушение представляет собой болезнь Крона или ревматоидный артрит.

23. Способ по п. 17, отличающийся тем, что нарушение представляет собой эпителиальный рак, хроническую гранулоцитную лейкемию (CML), рак молочной железы или желудочно-кишечный рак.

24. Способ по любому из пп. 17-23, отличающийся тем, что время полужизни антитела IL-33 в млекопитающем составляет от 30 минут до 45 дней.

25. Способ по любому из пп. 17-23, отличающийся тем, что антитело IL-33 связывается с IL-33 с K_D между приблизительно 1 фемтомолярной (фМ) и приблизительно 100 микромолярной (мкМ).