АНТИТЕЛА, НАПРАВЛЕННЫЕ ПРОТИВ IL-17 Российский патент 2016 года по МПК C07K16/24 A61K39/395 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Эта патентная заявка заявляет преимущество предварительной заявки на патент США № 61/370978, поданной 5 августа 2010 года, которая включена здесь посредством ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ МАТЕРИАЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[0002] Включенным здесь посредством ссылки в его полном виде является считываемый компьютером список нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, представленных совместно и идентифицированных следующим образом: One 119,414 Byte ASCII (Text) file, названный “708661_ST25.TXT”, созданный 1 августа 2011 года.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Интерлейкин-17 (IL-17) является провоспалительным цитокином, секретируемым активированными Т-клетками. Семейство IL-17 цитокинов включает в себя IL-17В, IL-17С, IL-17D, IL-17E (также называемый IL-25) и IL-17F, и член-прототип этого семейства был обозначен IL-17А (см., например, Moseley et al., Cytokine Growth Factor Rev., 14(2): 155-74 (2003)). Все члены семейства IL-17 имеют сходную белковую структуру, с четырьмя высоко консервативными остатками цистеина, критическими для их трехмерной формы, но все-таки они не имеют сходства последовательности с любыми известными цитокинами. Однако один вирусный гомолог IL-17А был обнаружен в открытой рамке считывания 13 из Herpesvirus saimiri (см., например, Yao et al., Immunity, 3: 811 (1995)), который имеет 72% идентичность аминокислотных остатков относительно IL-17А человека.

[0004] Для членов семейства IL-17 сообщались множественные функции, которые первично включают в себя регуляцию иммунной реакции. Например, IL-17 участвует в повышающем регулировании молекул адгезии и индуцировании продуцирования множественных воспалительных цитокинов и хемокинов из различных типов клеток, в том числе синовиоцитов, хондроцитов, фибробластов, эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, кератиноцитов и макрофагов. IL-17 индуцирует также рекрутинг нейтрофилов к сайту воспаления посредством индукции высвобождения хемокина, стимулирует продуцирование простагландинов и металлопротеиназ и ингибирует синтез протеогликанов. IL-17 играет важную роль в созревании гемопоэтических клеток-предшественников, и, по-видимому, IL-17 имеет сигнальные роли в различных органах и тканях, в том числе в легком, суставном хряще, кости, головном мозге, гемопоэтических клетках, почке, коже и кишечнике (см., например, Kolls and Linden, Immunity, 21: 467-476 (2004) и Fossiez, et al., Int. Rev. Immunol., 16: 541 (1998)). IL-17 индуцирует также продуцирование матриксных металлопротеиназ (ММР) и осуществляет понижающую регуляцию (даун-регуляцию) тканевого ингибитора металлопротеиназ (TIMP) (см., например, Jovanovic et al., J. Reumatol., 28: 712-718 (2001)), и блокирование IL-1 и IL-17 оказывает синергическое действие на воспаление и деструкцию костей in vivo (см., например, Chabaud et al., Arthritis Rheum., 44: 1293-1303 (2001)).

[0005] Неуместное или увеличенное продуцирование IL-17 (т.е. IL-17А) было ассоциировано с несколькими заболеваниями, такими как воспаление дыхательных путей, астма, ревматоидный артрит (RA), остеоартрит, остеопороз, эрозия костей, внутрибрюшинные абсцессы и адгезии, воспалительное нарушение пищеварительного тракта (IBD), хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), болезнь Аддисона, агаммоглобулинемия, аллергическая астма, круговая (гнездная) алопеция, брюшная афта, болезнь Шагаса, идиопатический легочный невроз, болезнь Крона, язвенный колит, отторжение трансплантата (например, ренального), псориатический артрит, увеит, болезнь Бехчета, некоторые типы рака, ангиогенез, атеросклероз, рассеянный склероз (MS), системная красная волчанка, септицемия, септический или эндотоксический шок, реакция на действие аллергена, ассоциированный с Helicobacter pylori гастрит, бронхиальная астма, анкилозирующий спондилит, волчаночный нефрит, псориаз, ишемия, системный склероз и другие воспалительные нарушения (см., например, Witowski et al., Cell Mol. Life Sci., 61: 567-579 (2004); Antonysamy et al., J. Immunol., 162: 577-584 (1999), van Kooten et al., J. Am. Soc. Nephrol., 9: 1526-1534 (1998); Molet et al., J. Allergy Clin. Immunol., 108: 430-438 (2001); Teunissen et al., J. Invest. Dermatol., 111: 645-649 (1998); и Kurasawa et al., Arthritis Rheum., 43: 2455-2463 (2000)).

[0006] На основании предыдущего описания IL-17 является, по-видимому, мишенью для лечения нескольких воспалительных или аутоиммунных заболеваний. Для этой цели антитела, которые связывают IL-17, были предложены для применения в лечении IL-17-опосредуемых заболеваний и нарушений (см., например, публикации международных заявок на патент №№ WO 2006/013107 и WO 2007/117749; и публикации заявок на патент США №№ 2008/0269467 А1 и 2009/0280131 А1). Кроме того, блокирование биоактивности IL-17 IL-17-специфическим антителом или растворимым рецептором, связывающимся с IL-17, уменьшает воспаление и эрозию костей в различных моделях артрита животных (см., например, Lubberts et al., Arthritis & Rheumatism, 50: 650-659 (2004)). Однако терапевтическая применимость доступных в настоящее время IL-17-антител ограничена их субоптимальными фармакокинетикой, стабильностью и эффективностью in vivo.

[0007] Таким образом, существует потребность в IL-17-связывающем агенте (например, антителе), который связывает IL-17 с высокой аффинностью, проявляет увеличенную стабильность и улучшенную фармакокинетику и эффективно нейтрализует активность IL-17 in vivo. Это изобретение обеспечивает такой IL-17-связывающий агент.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Это изобретение обеспечивает выделенный IL-17-связывающий агент, который содержит один или несколько из следующих компонентов: (а) полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий SEQ ID NO: 1, за исключением того, что один или несколько из остатков 32, 53 и 59 SEQ ID NO: 1 заменены другим остатком, и необязательно один или несколько из остатков 30, 31, 35, 40, 50, 52, 53, 59, 62, 66, 69, 75, 79, 88 и 97 заменены другим остатком, или его фрагмент, содержащий по меньшей мере пять аминокислот, и (b) полипептид легкой цепи иммуноглобулина, содержащий SEQ ID NO: 23, за исключением того, что один или несколько из остатков 9, 10, 11, 13, 17, 20, 21 и 22 SEQ ID NO: 23 заменены другим остатком, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична ей.

[0009] Это изобретение обеспечивает также выделенный IL-17-связывающий агент, содержащий полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, за исключением того, что остаток в положении 50 SEQ ID NO: 1 заменен остатком S, A или I, и необязательно один или несколько из остатков 31, 32, 35, 40, 52, 62, 66, 88 и 97 SEQ ID NO: 1 заменены другим остатком, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична ей.

[0010] Это изобретение обеспечивает далее выделенный IL-17-связывающий агент, содержащий полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, за исключением того, что один или несколько из остатков 104, 109 и 115 SEQ ID NO: 1 заменены другим остатком, и необязательно один или несколько из остатков 100, 101, 102, 106, 107, 108 и 111 SEQ ID NO: 1 заменены другим остатком, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична ей.

[0011] Это изобретение обеспечивает выделенный IL-17-связывающий агент, содержащий полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 78 или SEQ ID NO: 79, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична ей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НЕСКОЛЬКИХ ВИДОВ ФИГУР

[0012] Фиг.1 является графиком, иллюстрирующим изменения в профиле КС (CXCL1) в зависимости от времени после подкожного введения hIL-17 в дозе 1, 3 и 10 мкг/мышь.

[0013] Фиг.2 является графиком, иллюстрирующим зависимую от дозы супрессию уровней сывороточного КС при двух часах после введения hIL-17 в мышей анти-IL-17-антителом (SEQ ID NO: 4, спаренным с SEQ ID NO: 24).

[0014] Фиг.3 является диаграммой, которая иллюстрирует кривые диссоциации BIACORE^TM А100 для комбинаций НС и LC, описанных в примере 2.

[0015] Фиг.4 является графиком, иллюстрирующим результаты анализа высвобождения IL-6 в синовиальных фибробластах RA человека, описанного в примере 3.

[0016] Фиг.5 является графиком, иллюстрирующим результаты анализа ELISA, который использовали для измерения ингибирования связывания рецептор-лиганд анти-IL-17а-антителами, описанного в примере 4.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0017] Это изобретение обеспечивает выделенный IL-17-связывающий агент, который содержит полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептид легкой цепи иммуноглобулина, или их фрагмент (например, иммуногенный фрагмент). Под “IL-17-связывающим агентом” имеется в виду молекула, предпочтительно белковая молекула, которая специфически связывается с цитокином IL-17. Предпочтительно, IL-17-связывающий агент является антителом или его фрагментом (например, иммуногенным фрагментом). Термин “иммуноглобулин” или “антитело” относится в данном контексте к белку, который обнаруживается в крови или других жидкостях тела позвоночных, который используется иммунной системой для идентификации или нейтрализации чужеродных объектов, таких как бактерии и вирусы. Полный иммуноглобулин обычно состоит из четырех полипептидов: двух идентичных копий полипептида тяжелой (Н) цепи и двух идентичных копий полипептида легкой (L) цепи. Каждая из этих тяжелых цепей содержит N-концевой вариабельный (V_H) район и три С-концевых константных (СН₁, СН₂ и СН₃) района, и каждая легкая цепь содержит один N-концевой вариабельный (V_L) район и один С-концевой константный (C_L) район. Легкие цепи антител могут быть отнесены к одному из двух различных типов, либо каппа (κ), либо лямбда (λ), на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов. В типичном иммуноглобулине каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью дисульфидными связями, и две тяжелые цепи связаны друг с другом дисульфидными связями. Вариабельный район легкой цепи выравнен с вариабельным районом тяжелой цепи, и константный район легкой цепи выравнен с первым константным районом тяжелой цепи. Остальные константные районы тяжелой цепи выравнены друг с другом.

[0018] Вариабельные районы каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий сайт антитела. Районы V_H и V_L имеют одинаковую общую структуру, где каждый район содержит четыре каркасных района, последовательности которых являются относительно консервативными. Эти каркасные районы соединены тремя определяющими комплементарность районами (CDR). Эти три CDR, известные как CDR1, CDR2 и CDR3, образуют “гипервариабельный район” антитела, который является ответственным за связывание антигена. Четыре каркасных района (FW или FR) принимают конформацию бета-структуры (структуры складчатого листа), и эти CDR образуют петли, соединяющие и, в некоторых случаях, содержащие часть этой бета-структуры (структуры складчатого листа). Константные районы легких и тяжелых цепей не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие в антитело-зависимой клеточной токсичности посредством взаимодействий с эффекторными молекулами и клетками.

[0019] Желательно, чтобы IL-17-связывающий агент этого изобретения связывался с интерлейкином-17 (IL-17 или IL-17А). IL-17А является обнаруженным членом группы цитокинов, называемых семейством IL-17. IL-17А сначала идентифицировали в качестве транскрипта из Т-клеточной гибридомы грызуна, и он известен как CTLA8 в грызунах (Rouvier et al., J. Immunol., 150 (12): 5445-5456 (1993)). IL-17А связывается с рецептором клеточной поверхности типа I, называемым IL-17R, который имеет по меньшей мере три варианта IL17RA, IL17RB и IL17RC (Starnes et al., J. Immunol., 169 (2): 642-646 (2002)). Кроме IL-17А, семейство IL-17 включает в себя IL-17В, IL-17С, IL-17D, IL-17Е (также называемый IL-25) и IL-17F. Все члены семейства IL-17 имеют сходную белковую структуру с четырьмя высоко консервативными остатками цистеина, критическими в отношении их 3-мерной формы, но все-таки не имеют сходства последовательности с любыми другими известными цитокинами.

[0020] Как обсуждалось выше, члены семейства белков IL-17 проявляют многочисленные иммунные регуляторные функции, которые первично обусловлены их способностью индуцировать иммунные передающие сигнал молекулы. В частности, было показано, что IL-17 индуцирует и опосредует провоспалительные реакции и обычно ассоциирован с аллергическими реакциями. IL-17 индуцирует продуцирование цитокинов, таких как IL-6, G-CSF, GM-CSF, IL-1β, TGF-β, TNF-α, хемокинов (например, IL-8, GRO-α и МСР-1) и простагландинов (например, PGE2), из многих типов клеток (например, фибробластов, эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, кератиноцитов и макрофагов). Высвобождение цитокинов вызывает многие функции, такие как ремоделирование дыхательных путей, которое является характерной реакцией IL-17. Увеличенная экспрессия хемокинов аттрагирует другие клетки, в том числе нейтрофилы, но не эозинофилы. Функция IL-17 является также существенной для субпопуляции CD4+ Т-клеток, называемых Т-хелперными 17 (Th17) клетками. Таким образом, семейство белков IL-17 было ассоциировано с патологиями нескольких иммунных и аутоиммунных заболеваний, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, ревматоидный артрит, астму, волчанку, отторжение трансплантата и противоопухолевый иммунитет (см., например, Aggarwal et al., J. Leukoc. Biol., 71 (1): 1-8 (2002)). IL-17-связывающий агент этого изобретения может связывать любой член этого описанного здесь семейства белков IL-17, такой как, например, IL-17А и/или IL-17F. В одном предпочтительном варианте осуществления IL-17-связывающий агент связывается с белком IL-17А. В другом варианте осуществления IL-17-связывающий агент может связываться, или перекрестно реагировать с IL-17 человека и/или ортологами IL-17А не человека.

[0021] Выделенный IL-17-связывающий агент этого изобретения содержит полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина или его фрагмент, содержащий по меньшей мере пять аминокислот, и/или полипептид легкой цепи иммуноглобулина или его фрагмент, содержащий по меньшей мере пять аминокислот. В одном варианте осуществления этот выделенный IL-17-связывающий агент содержит полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина или полипептид легкой цепи иммуноглобулина. В другом варианте осуществления этот выделенный IL-17-связывающий агент содержит как полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, так и полипептид легкой цепи иммуноглобулина. Аминокислотная последовательность нескольких полипептидов тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, которые связывают один или несколько членов семейства белков IL-17, известна в данной области (см., например, международные публикации заявок на патент №№ WO 2006/013107 и WO 2007/117749; и публикации заявок на патент США №№ 2008/0269467 А1 и 2009/0280131 А1).

[0022] Один пример полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина, который связывается с IL-17, содержит SEQ ID NO: 1, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична ей (например, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 100% идентична ей). В контексте этого изобретения, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 1, за исключением того, что один или несколько из остатков SEQ ID NO: 1 заменены другим аминокислотным остатком. В этом отношении, один или несколько из остатков 32, 53 и 59 SEQ ID NO: 1 заменены другим остатком, и необязательно один или несколько из остатков 30, 31, 35, 40, 50, 52, 53, 59, 62, 66, 69, 75, 79, 88 и 97 последовательности SEQ ID NO: 1 заменены другим остатком. Каждый из аминокислотных остатков 30, 31, 35, 40, 50, 52, 53, 59, 62, 66, 69, 75, 79, 88 и 97 SEQ ID NO: 1 может быть заменен любым подходящим аминокислотным остатком, который может быть тем же самым или другим в каждом положении. Аминокислотным “замещением” или “заменой” называют замену одной аминокислоты в конкретном положении или остатке другой аминокислотой в том же самом положении или остатке в полипептидной последовательности.

[0023] Аминокислоты группируют в широком смысле как “ароматические” или “алифатические”. Ароматическая аминокислота включает в себя ароматическое кольцо. Примеры “ароматических аминокислот” включают в себя гистидин (Н или His), фенилаланин (F или Phe), тирозин (Y или Tyr) и триптофан (W или Trp). Неароматические аминокислоты группируют в широком смысле как “алифатические”. Примеры “алифатических” аминокислот включают в себя глицин (G или Gly), аланин (A или Ala), валин (V или Val), лейцин (L или Leu), изолейцин (I или Ile), метионин (M или Met), серин (S или Ser), треонин (T или Thr), цистеин (С или Cys), пролин (Р или Pro), глутаминовую кислоту (E или Glu), аспарагиновую кислоту (А или Asp), аспарагин (N или Asn), глутамин (Q или Gln), лизин (К или Lys) и аргинин (R или Arg).

[0024] Алифатические аминокислоты могут быть подразделены на четыре подгруппы. “Большая алифатическая неполярная подгруппа” состоит из валина, лейцина и изолейцина. “Алифатическая слабополярная подгруппа” состоит из метионина, серина, треонина и цистеина. “Алифатическая полярная/заряженная подгруппа” состоит из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, аспарагина, глутамина, лизина и аргинина. “Группа с небольшими остатками” состоит из глицина и аланина. Группа заряженных/полярных аминокислот может быть подразделена на три подгруппы: “положительно заряженную подгруппу”, состоящую из лизина и аргинина, “отрицательно заряженную подгруппу”, состоящую из глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, и “полярную подгруппу”, состоящую из аспарагина и глутамина.

[0025] Ароматические аминокислоты могут быть подразделены на две подгруппы: “подгруппу с азотистым кольцом”, состоящую из гистидина и триптофана, и “фенильную подгруппу”, состоящую из фенилаланина и тирозина.

[0026] Фраза “консервативная аминокислотная замена” или “консервативная мутация” относится к замене одной аминокислоты другой аминокислотой с общим свойством. Функциональным путем для определения общих свойств между индивидуальными аминокислотами является анализ нормализованных частот аминокислотных изменений между соответствующими белками гомологичных организмов (Schulz, G.E. и R.H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). Согласно таким анализам, могут быть определены группы аминокислот, в которых аминокислоты в одной группе заменяются предпочтительно друг с другом и, следовательно, сходны друг с другом в их действии на общую структуру белка (Schulz, G.E. и R.H. Schirmer, supra).

[0027] Примеры консервативных аминокислотных замен включают в себя замены аминокислот в пределах подгрупп, описанных выше, например, аргинина на лизин и наоборот, так что может быть сохранен положительный заряд; аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту и наоборот, так что может быть сохранен отрицательный заряд; треонина на серин, так что может быть сохранен свободный -ОН; и аспарагина на глутамин, так что может быть сохранен свободный -NH₂.

[0028] “Полуконсервативные мутации” включают в себя аминокислотные замены аминокислот теми же самыми группами, перечисленными выше, которые не принадлежат к одной и той же подгруппе. Например, мутация аспарагиновой кислоты вместо аспарагина или аспарагина вместо лизина, в каждом случае, включает в себя аминокислоты в одной и той же группе, но в разных подгруппах. “Неконсервативные мутации” включают в себя аминокислотные замены между разными группами, например, лизина вместо триптофана или фенилаланина вместо серина и т.д.

[0029] В одном варианте осуществления выделенный IL-17-связывающий агент содержит полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит SEQ ID NO: 1, за исключением того, что остаток 32 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Н (гистидина), S (серина) или F (фенилаланина), остаток 53 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Е (глутаминовой кислоты) или остатком Н (гистидина), остаток 59 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Н (гистидина) или любой комбинацией упомянутых выше замен.

[0030] Кроме аминокислотных замен, обсуждаемых выше, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина необязательно содержит дополнительные аминокислотные замены. В одном варианте осуществления полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 1, за исключением того, что один или несколько из остатков 30, 31, 35, 40, 50, 52, 53, 59, 62, 66, 69, 75, 79, 88 и 97 SEQ ID NO: 1 заменены другим остатком. В другом варианте осуществления полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 1, за исключением того, что остаток 30 SEQ ID NO: 1 заменен остатком N (аспарагина), остаток 31 SEQ ID NO: 1 заменен остатком N (аспарагина) или D (аспарагиновой кислоты), остаток 35 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Т (треонина), N (аспарагина) или D (аспарагиновой кислоты), остаток 40 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Т (треонина), остаток 50 SEQ ID NO: 1 заменен остатком А (аланина), S (серина), I (изолейцина) или G (глицина), остаток 52 SEQ ID NO: 1 заменен остатком N (аспарагина) или R (аргинина), остаток 53 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Е (глутаминовой кислоты) или Н (гистидина), остаток 59 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Н (гистидина), остаток 62 SEQ ID NO: 1 заменен остатком G (глицина), остаток 66 SEQ ID NO: 1 заменен остатком V (валина), остаток 69 SEQ ID NO: 1 заменен остатком I (изолейцина), остаток 75 SEQ ID NO: 1 заменен остатком D (аспарагиновой кислоты), остаток 79 SEQ ID NO: 1 заменен остатком V (валина), остаток 88 SEQ ID NO: 1 заменен остатком V (валина), остаток 97 SEQ ID NO: 1 заменен остатком V (валина), Т (треонина), L (лейцина) или F (фенилаланина) или любой комбинацией упомянутых выше замен.

[0031] Примерные полипептиды тяжелой цепи иммуноглобулина могут содержать любую из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3-5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10-20, SEQ ID NO: 35-72, SEQ ID NO: 76 и SEQ ID NO: 77.

[0032] Это изобретение обеспечивает также выделенный IL-17-связывающий агент, содержащий полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, за исключением того, что остаток в положении 50 SEQ ID NO: 1 заменен другим остатком, и необязательно один или несколько из остатков 31, 32, 35, 40, 52, 62, 66, 88 и 97 SEQ ID NO: 1 заменены другим остатком. В этом отношении, аминокислотный остаток в положениях 50, 31, 32, 35, 40, 52, 62, 66, 88 и 97 SEQ ID NO: 1 могут быть заменены любым подходящим аминокислотным остатком, описанным здесь. В одном варианте осуществления остаток в положении 50 SEQ ID NO: 1 заменен остатком S, A или I. В других вариантах осуществления остаток 31 SEQ ID NO: 1 заменен остатком N или D, остаток 35 SEQ ID NO: 1 заменен остатком N, T или D, остаток 40 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Т, остаток 52 SEQ ID NO: 1 заменен остатком N или R, остаток 62 SEQ ID NO: 1 заменен остатком G, остаток 66 SEQ ID NO: 1 заменен остатком V, остаток 88 SEQ ID NO: 1 заменен остатком V, остаток 97 SEQ ID NO: 1 заменен остатком V, T, L или F, или любой комбинацией упомянутых выше остатков. Например, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может содержать любую из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 74 или SEQ ID NO: 75.

[0033] Это изобретение обеспечивает дополнительно выделенный IL-17-связывающий агент, содержащий полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, за исключением того, что один или несколько из остатков 104, 109 и 115 SEQ ID NO: 1 заменены другим остатком, и необязательно один или несколько из остатков 100, 101, 102, 106, 107, 108 и 111 SEQ ID NO: 1 заменены другим остатком. В этом отношении, аминокислотный остаток в положениях 100, 101, 102, 104, 106, 107, 108, 109, 111 и 115 SEQ ID NO: 1 может быть заменен любым аминокислотным остатком, описанным здесь. В одном варианте осуществления остаток 104 SEQ ID NO: 1 заменен остатком V, остаток 109 SEQ ID NO: 1 заменен остатком V, остаток 115 SEQ ID NO: 1 заменен остатком N или E или любой комбинацией упомянутых выше замен. В других вариантах осуществления остаток 100 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Н, остаток 101 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Н или F, остаток 102 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Е, остаток 106 SEQ ID NO: 1 заменен остатком N, остаток 107 SEQ ID NO: 1 заменен остатком S, остаток 108 SEQ ID NO: 1 заменен остатком Н или F, остаток 111 SEQ ID NO: 1 заменен остатком S или любой комбинацией из выше упомянутых замен. Например, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может содержать SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 73.

[0034] В другом варианте осуществления IL-17-связывающий агент может содержать полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, за исключением того, что один или несколько аминокислотных остатков инсертированы в SEQ ID NO: 1. Любое количество аминокислотных остатков может быть инсертировано в SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, по меньшей мере один аминокислотный остаток (например, 2 или более, 3 или более, 5 или более или 8 или более аминокислотных остатков), но менее 20 аминокислотных остатков (например, 18 или менее, 15 или менее, 12 или менее или 10 или менее аминокислотных остатков) инсертированы в SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, приблизительно 3 - приблизительно 20 аминокислотных остатков (например, приблизительно 3-5 аминокислотных остатков, приблизительно 5-10 аминокислотных остатков, приблизительно 10-15 аминокислотных остатков или приблизительно 15-20 аминокислотных остатков, или диапазон, определяемый любыми двумя из упомянутых выше величин) инсертированы в SEQ ID NO: 1. В одном предпочтительном варианте осуществления не более 8 аминокислотных остатков инсертированы в SEQ ID NO: 1. Например, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может содержать SEQ ID NO: 78 или SEQ ID NO: 79.

[0035] Один пример полипептида легкой цепи иммуноглобулина, который является специфическим в отношении IL-17, содержит SEQ ID NO: 23 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична ей (например, идентична ей на по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100%). В контексте этого изобретения выделенный IL-17-связывающий агент содержит полипептид легкой цепи иммуноглобулина, который содержит SEQ ID NO: 23, за исключением того, что один или несколько из остатков SEQ ID NO: 23 заменен другим аминокислотным остатком. В этом отношении, один или несколько из остатков 9, 10, 11, 13, 17, 20, 21 и 22 SEQ ID NO: 23 заменены другим остатком. Аминокислотные последовательности 9, 10, 11, 13, 17, 20, 21 и 22 SEQ ID NO: 23 могут быть заменены любым подходящим аминокислотным остатком, как описано здесь.

[0036] В одном варианте осуществления полипептид легкой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 23, за исключением того, что остаток 9 SEQ ID NO: 23 заменен остатком Y (тирозина), остаток 10 SEQ ID NO: 23 заменен остатком R (аргинина), остаток 11 SEQ ID NO: 23 заменен остатком Т (треонина), остаток 13 SEQ ID NO: 23 заменен остатком L (лейцина) или I (изолейцина), остаток 17 SEQ ID NO: 23 заменен остатком G (глицина) остаток 20 SEQ ID NO: 23 заменен остатком K (лизина), остаток 21 SEQ ID NO: 23 заменен остатком V (валина), остаток 22 SEQ ID NO: 23 заменен остатком D (аспарагиновой кислоты) или любой комбинацией упомянутых выше замен. Например, полипептид легкой цепи иммуноглобулина может содержать аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 80 или SEQ ID NO: 81.

[0037] Это изобретение не ограничивается выделенным IL-17-связывающим агентом, содержащим полипептид тяжелой цепи или полипептид легкой цепи иммуноглобулина, имеющими замены конкретных аминокислотных остатков, описанные здесь. Действительно, любой аминокислотный остаток SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 23 может быть заменен, в любой комбинации, другим аминокислотным остатком, или любые количества аминокислотных остатков могут быть инсертированы в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 23, пока биологическая активность этого IL-17-связывающего агента является увеличенной или улучшенной в результате замен или инсерций этих аминокислот. “Биологической активностью” IL-17-связывающего агента называют, например, аффинность связывания в отношении конкретного эпитопа IL-17, нейтрализацию активности IL-17 in vivo (например, IC₅₀), стабильность in vivo (в том числе, но не только, термостойкость и протеолитическую стабильность), фармакокинетику, иммуногенные свойства IL-17-связывающего агента и перекрестную реактивность (например, с гомологами или ортологами IL-17 не человека или с другими белками или тканями). Другие биологические свойства или характеристики антигенсвязывающего агента, признанные в данной области, включают в себя, например, авидность, селективность, растворимость, укладку, иммунотоксичность, экспрессию, приготовление и каталитическую активность. Вышеописанные свойства или характеристики могут наблюдаться, измеряться и/или оцениваться с использованием стандартных способов, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, ELISA, конкурентный ELISA анализ резонанса поверхностных плазмонов BIACORE или KINEXA, анализы нейтрализации in vitro или in vivo и анализы трансдукции сигнала и иммуногистохимические анализы.

[0038] Термины “ингибируют” или “нейтрализуют” относятся в контексте активности IL-17-связывающего агента к способности проявлять существенный антагонизм, препятствовать, предотвращать, задерживать, замедлять, разрушать, элиминировать, останавливать или обращать прогрессирование или тяжесть, например, биологической активности IL-17, или заболевания или состояния, ассоциированного с IL-17. Выделенный IL-17-связывающий агент этого изобретения предпочтительно ингибирует или нейтрализует активность IL-17 по меньшей мере на приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 100% или на диапазон, определяемый любыми двумя из упомянутых выше величин.

[0039] Выделенный IL-17-связывающий агент этого изобретения может быть полным антителом, описанным здесь, или фрагментом антитела. Термины “фрагмент антитела”, “антительный фрагмент” или “функциональный фрагмент антитела” используются здесь взаимозаменяемо для обозначения одного или нескольких фрагментов антител, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (см., в общих чертах, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)). Этот выделенный IL-17-связывающий агент может содержать любой IL-17-связывающий фрагмент антитела. Желательно, этот фрагмент антитела содержит, например, один или несколько CDR, вариабельный район (или его части), константный район (или его части) или их комбинации. Примеры фрагментов антител включают в себя, но не ограничиваются ими, (i) Fab-фрагмент, который является моновалентным фрагментом, состоящим из доменов V_L, V_H, C_L и CH₁; (ii) F(ab')₂-фрагмент, который является двухвалентным фрагментом, содержащим два Fab-фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; и (iii) Fv-фрагмент, состоящий из V_L и V_H-доменов одного плеча антитела.

[0040] В одном варианте осуществления этого изобретения выделенный IL-17-связывающий агент является антителом или фрагментом антитела, содержащим (а) полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 2-22 или SEQ ID NO: 31-79, или их фрагмент, и (b) полипептид легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 80 или SEQ ID NO: 81, или их фрагмент. В вариантах осуществления, где выделенный IL-17-связывающий агент содержит фрагмент полипептида тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, этот фрагмент может быть любого размера, пока этот фрагмент связывается с IL-17 и предпочтительно ингибирует активность IL-17. В этой связи, фрагмент полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина желательно содержит между приблизительно 5 и 18 аминокислотами (например, приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или диапазон, определяемый любыми двумя упомянутыми выше величинами). Подобным образом, фрагмент полипептида легкой цепи иммуноглобулина желательно содержит между приблизительно 5 и 18 аминокислотами (например, приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или диапазон, определяемый любыми двумя упомянутыми выше величинами). Когда IL-17-связывающий агент является антителом или фрагментом антитела, это антитело или фрагмент антитела содержит константный район (F_c) любого подходящего класса. Предпочтительно, это антитело или фрагмент антитела содержит константный район, который основан на антителах IgG1, IgG2 или IgG4 дикого типа или их вариантах.

[0041] IL-17-связывающий агент может также быть одноцепочечным фрагментом антитела. Примеры одноцепочечных фрагментов антител включают в себя, но не ограничиваются ими, (i) одноцепочечный Fv (scFv), который является моновалентной молекулой, состоящей из двух доменов Fv-фрагмента (т.е. V_L и V_H), соединенных синтетическим линкером, который позволяет синтезироваться этим двум доменам в виде единой полипептидной цепи (см., например, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., roc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); и Osbourn et al., Nat. Biotechnol. 16: 778 (1998), и (ii) диатело, которое является димером полипептидных цепей, где каждая полипептидная цепь содержит V_H, соединенный с V_L пептидным линкером, который является слишком коротким для возможности спаривания между V_H и V_L на одной и той же полипептидной цепи, посредством чего запускается спаривание между комплементарными доменами на разных цепях полипептидов V_H-V_L с образованием димерной молекулы, имеющей два функциональных антигенсвязывающих сайта. Фрагменты антител известны в данной области и описаны более подробно, например, в публикации заявки на патент США 2009/0093024 А1.

[0042] Выделенный IL-17-связывающий агент может быть также интрателом или его фрагментом. Интратело является антителом, которое экспрессируется и которое функционирует внутриклеточно. Интратела обычно лишены дисульфидных связей и способны модулировать экспрессию или активность генов-мишеней посредством их специфической активности связывания. Интратела включают в себя отдельные фрагменты доменов, такие как выделенные домены V_H и V_L и scFv. Интратело может включать в себя субклеточные сигналы направленной миграции, присоединенные к N- или С-концу этого интратела, для возможности экспрессии при высоких концентрациях в субклеточных компартментах, где локализован белок-мишень. После взаимодействия с геном-мишенью интратело модулирует функцию белка-мишени и/или достигает фенотипического/функционального нокаута посредством механизма, такого как усиление деградации белка-мишени, и секвестрации этого белка-мишени в нефизиологическом субклеточном компартменте. Другие механизмы опосредованной интрателом инактивации генов могут зависеть от эпитопа, на который направлено это интратело, такие как связывание с каталитическим сайтом на белке-мишени или с эпитопами, которые участвуют во взаимодействиях белок-белок, белок-ДНК или белок-РНК.

[0043] Выделенный IL-17-связывающий агент может быть антителом человека, антителом не человека или химерным антителом, или может быть получен из этих антител. Термин “химерные” означает антитело или его фрагмент, содержащие районы как антитела человека, так и районы антитела не человека. Антитела не человека включают в себя антитела, выделенные из любого животного, не человека, такого как грызун (например, мышь или крыса). Полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина IL-17-связывающего агента может быть получен из антитела человека, антитела не человека или химерного антитела, независимо от того, получен ли полипептид легкой цепи иммуноглобулина IL-17-связывающего агента из антитела человека, антитела не человека или химерного антитела. Например, другими словами, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может быть получен из антитела человека, а полипептид легкой цепи иммуноглобулина может быть получен из антитела не человека. Наоборот, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может быть получен из антитела не человека, а полипептид легкой цепи иммуноглобулина может быть получен из антитела человека. Альтернативно, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может быть получен из антитела грызуна или его фрагмента, а полипептид легкой цепи иммуноглобулина может быть получен из антитела человека или его фрагмента. Этот сценарий может быть применим, например, для гуманизации антитела. В другом варианте осуществления, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина и полипептид легкой цепи иммуноглобулина, оба, получают из антитела человека или из антитела не человека. Альтернативно, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина и полипептид легкой цепи иммуноглобулина являются оба химерными антителами.

[0044] Антитело человека, антитело не человека или химерное антитело может быть получено любым способом, в том числе посредством источников in vitro (например, гибридомной или клеточной линии, продуцирующей антитело рекомбинантно) и источников in vivo (например, грызунов). Способы генерирования антител известны в данной области и описаны, например, в Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976); Harlow and Lane (eds), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); и C.A. Janeway et al. (edc), Immunobiology, 5^th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001). В некоторых вариантах осуществления, антитело человека или химерное антитело могут быть генерированы с использованием трансгенного животного (например, мыши), где один или несколько эндогенных генов иммуноглобулина заменены одним или несколькими генами иммуноглобулина человека. Примеры трансгенных мышей, в которых гены эндогенного антитела эффективно заменены генами антитела человека, включают в себя, но не ограничиваются ими, HUMAB-MOUSE^TM, Kirin TC MOUSE^TM и КМ-MOUSE^TM (см., например, Londerg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005) и Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008)).

[0045] В другом варианте осуществления этого изобретения выделенный IL-17-связывающий агент может быть частью “альтернативного скаффолда” или его фрагмента. Под “альтернативным скаффолдом” имеется в виду полипептид или полипептидный домен не антитела, который проявляет аффинность и специфичность в отношении представляющего интерес антигена, сходные с аффинностью и специфичностью антитела. Примеры альтернативных скаффолдов включают в себя β-сэндвич-домен, такой как фибронектин (например, Аднектины), липокалины (например, Антикалин), домен Кунитца, тиоредоксин (например, пептидный аптамер), белок А (например, молекулы AFFIBODY^TM), повтор анкирина (например, DARPin), γ-β-кристаллин или убиквитин (например, молекулы AFFLIN^TM), CTLD3 (например, Тетранектин) и мультивалентные комплексы (например, молекулы ATRIMER^TM или молекулы SIMP^TM). Альтернативные скаффолды описаны, например, в Binz et al., Nat. Biotechnol., 23: 1257-1268 (2005); Skerra, Curr. Opin. Biotech., 18: 295-304 (2007); и публикации заявки на патент США 2009/0181855 А1.

[0046] В одном варианте осуществления альтернативным скаффолдом может быть молекула AVIMER^TM. Одна молекула AVIMER^TM представляет класс терапевтических белков, происходящих из человека, неродственных с антителами и фрагментами антител, которые состоят из нескольких модулярных и повторно используемых доменов связывания, называемых А-доменами (также называемых модулем класса А, повтором типа комплемента или А-доменом класса рецептора LDL). Молекулы AVIMER^TM были разработаны из внеклеточных доменов рецепторов человека с использованием перетасовки экзонов in vitro и фагового дисплея (Silverman et al., Nat. Biotechnol., 23: 1493-94 (2005) и Silverman et al., Nat. Biotechnol., 24: 220 (2006)). Молекулы AVIMER^TM могут содержать множественные независимые связывающие домены, которые могут проявлять улучшенную аффинность (в некоторых случаях субнаномолярную) и специфичность, сравнимые со связывающими белками с единственным эпитопом (см., например, публикации заявок на патент США 2005/0221384 А1; 2005/0164301 А1; 2005/0053973 А1; 2005/0089932 А1; 2005/0048512 А1 и 2004/0175756 А1). Каждый из известных 217 А-доменов человека содержит приблизительно 35 аминокислот (приблизительно 4 кДа). Нативные А-домены укладываются быстро и эффективно в однородную, стабильную структуру, опосредуемую первично связыванием кальция и образованием дисульфида. Для этой общей структуры требуется консервативный мотив скаффолда только из двенадцати аминокислот. Молекула AVIMER^TM содержит множественные А-домены, которые отделены один от другого линкерами, которые имеют в среднем пять аминокислот в длину. Конечным результатом является единая белковая цепь, содержащая множественные домены, каждый из которых представляет отдельную функцию. Каждый домен молекулы AVIMER^TM связывает антиген независимо, и энергетические вклады каждого домена являются аддитивными.

[0047] Выделенный IL-17-связывающий агент этого изобретения может быть инсертирован в другие молекулы (например, полипептиды) для генерирования новых молекул, которые связывают представляющий интерес антиген. Таким образом, это изобретение обеспечивает способ продуцирования полипептида, который связывает IL-17, который предусматривает инсертирование IL-17-связывающего агента в другой полипептид. Такие новые антигенсвязывающие молекулы могут быть генерированы с использованием рутинных способов молекулярной биологии, известных в данной области. Например, IL-17-связывающий агент или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая этот IL-17-связывающий агент, могут быть инсертированы в другую молекулу (например, полипептид или полинуклеотид) для генерирования рекомбинантной молекулы, которая связывается с IL-17. В одном варианте осуществления CDR (например, CDR1, CDR2 или CDR3) или вариабельный район полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептида легкой цепи иммуноглобулина, описанные здесь, могут быть трансплантированы (т.е. пересажены) в другую молекулу, такую как полипептид антитела или не антитела, с использованием либо химии белков, либо технологии рекомбинантных ДНК. Таким образом, это изобретение обеспечивает выделенный IL-17-связывающий агент, содержащий по меньшей мере один CDR полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептида легкой цепи иммуноглобулина, как описано здесь. Этот выделенный IL-17-связывающий агент может содержать один, два или три CDR вариабельного района тяжелой цепи иммуноглобулина и/или вариабельный район легкой цепи иммуноглобулина, как описано здесь. Таким образом, CDR1 полипептидов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанных здесь, расположен между аминокислотными остатками 25 и 35, включительно, SEQ ID NO: 2-22 и SEQ ID NO: 31-79. CDR2 полипептидов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанных здесь, расположен между аминокислотными остатками 50-67, включительно, SEQ ID NO: 2-22 SEQ ID NO: 31-79. CDR3 полипептидов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанных здесь, расположен между аминокислотными остатками 99 и 102, включительно, SEQ ID NO: 2-22 и SEQ ID NO: 31-79. Эти местоположения CDR каждого из полипептидов легкой цепи иммуноглобулина, описанных здесь, представлены в таблице 1.

Таблица 1 SEQ ID №: Местоположение CDR1 (остатки SEQ ID NO) Местоположение CDR2 (остатки SEQ ID NO) Местоположение CDR3 (остатки SEQ ID NO) 24 24-35 (включит.) 51-57 (включит.) 90-98 (включит.) 25 24-35 (включит.) 51-57 (включит.) 90-98 (включит.) 26 24-34 (включит.) 50-56 (включит.) 89-97 (включит.) 27 24-40 (включит.) 56-62 (включит.) 95-104 (включит.) 28 24-35 (включит.) 51-57 (включит.) 90-98 (включит.)

[0048] В другом варианте осуществления весь вариабельный район полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептида легкой цепи иммуноглобулина, описанных здесь, может быть трансплантирован вместо вариабельного района LC и/или HC другого антитела.

[0049] Вышеупомянутые способы и молекулы могут быть использованы, например, для генерирования антитела, содержащего Fc-район другого изотипа или Fc-район, который конъюгирован с белковой или небелковой частью молекулы (например, флуоресцентной меткой или химиотерапевтическим агентом). Это изобретение обеспечивает также конъюгат (1) антитела, альтернативного скаффолда или его фрагментов и (2) белковой или небелковой части, содержащей IL-17-связывающий агент. Например, этот IL-17-связывающий агент может быть частью антитела, конъюгированного с пептидом, флуоресцентной молекулой или химиотерапевтическим агентом.

[0050] Кроме того, это изобретение обеспечивает вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую выделенный IL-17-связывающий агент (например, полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина и/или полипептид легкой цепи иммуноглобулина, описанные здесь). “Нуклеиновая кислота” включает в себя полимер ДНК или РНК, т.е. полинуклеотид, который может быть одноцепочечным или двухцепочечным и который может содержать неприродные или измененные нуклеотиды. Нуклеиновые кислоты обычно связаны через фосфатные связи с образованием нуклеиновых кислот или полинуклеотидов, хотя в данной области известны многие другие связи (например, фосфоротиоаты, боранофосфаты и т.п.).

[0051] Этот вектор может быть, например, плазмидой, эписомой, космидой, вирусным вектором (например, ретровирусным или аденовирусным) или фагом. Подходящие векторы и способы приготовления векторов хорошо известны в данной области (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Johm Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)).

[0052] Кроме нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-17-связывающий агент, этот вектор предпочтительно содержит регуляторные последовательности экспрессии, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы транскрипции, внутренние сайты связывания рибосомы (IRES) и т.п., которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине. Примеры регуляторных последовательностей экспрессии известны в данной области и описаны, например, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

[0053] Большое количество промоторов, включающих в себя конститутивные, индуцируемые и репрессируемые промоторы, из множественных различных источников хорошо известны в данной области. Репрезентативные источники промоторов включают в себя, например, вирус, млекопитающее, насекомое, растение, дрожжи и бактерии, и подходящие промоторы из этих источников являются легко доступными или могут быть получены синтетически на основе публично доступных последовательностей, например, из депозитариев, таких как АТСС, а также других коммерческих или частных источников. Промоторы могут быть однонаправленными (т.е. инициируют транскрипцию в одном направлении) или бинаправленными (т.е. инициируют транскрипцию в любом из 3'- или 5'-направления). Неограничивающие примеры промоторов включают в себя, например, бактериальную систему экспрессии Т7, бактериальную систему экспрессии pBAD (araA), промотор цитомегаловируса (CMV), промотор SV40, промотор RSV. Индуцируемые промоторы включают в себя, например, систему Tet (патенты США 5464758 и 5814618), индуцируемую экдизоном (стероидным гормоном) систему (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351 (1996)), систему T-REX^TM (Invitrogen, Carlsbad, CA), систему LACSWITCH^TM (Stratagene, San Diego, CA) и индуцируемую Cre-ERT тамоксифеном рекомбиназную систему (Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); патент США 7112715 и Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144 (2005)).

[0054] Термин “энхансер” относится в данном контексте к последовательности ДНК, которая увеличивает транскрипцию, например, нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Энхансеры могут быть расположены на расстоянии многих т.п.н. от кодирующего района этой последовательности нуклеиновой кислоты и могут опосредовать связывание регуляторных факторов, распределения метилирования ДНК или изменения в структуре ДНК. Большое количество энхансеров из различных других источников известно в данной области и доступно в виде или внутри клонированных полинуклеотидов (например, из депозитариев, таких как АТСС, а также других коммерческих или частных источников). Ряд полинуклеотидов, содержащих промоторы (такие, как широко применяемый промотор CMV), содержат также энхансерные последовательности. Энхансеры могут быть расположены выше по ходу транскрипции, внутри или ниже по ходу транскрипции кодирующих последовательностей. Термин “Ig-энхансеры” относится к энхансерным элементам, произведенным из энхансерных районов, картированным внутри иммуноглобулинового (Ig) локуса (такие энхансеры включают в себя, например, 5'-энхансеры тяжелой цепи (µ), 5'-энхансеры легкой цепи (каппа), интронные энхансеры каппа и µ и 3'-энхансеры (см., в общих чертах, Paul W.E. (ed.), Fundamental Immunology, 3^rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363; и патент США 5885827).

[0055] Этот вектор может также содержать “ген селектируемого маркера”. Этот термин “ген селектируемого маркера” относится в данном контексте к последовательности нуклеиновой кислоты, которая позволяет клеткам, экспрессирующим эту последовательность нуклеиновой кислоты, быть специфически селектируемыми как положительные или отрицательные в присутствии соответствующего селективного агента. Подходящие гены селектируемого маркера известны в данной области и описаны, например, в международных публикациях заявок на патенты WO 92/08796 и WO 94/28143; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150: 1 (1981); Santerre et al., Gene, 30 147 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980); и патенты США №№ 5122464 и 5770359.

[0056] В некоторых вариантах осуществления этот вектор является “эписомным вектором экспрессии” или “эписомой”, которая способна реплицироваться в клетке-хозяине и сохраняется в виде внехромосомного сегмента ДНК в клетке-хозяине в присутствии подходящего селективного давления (см., например, Conese et al., Gene Therapy 11: 1735-1742 (2004)). Репрезентативные коммерчески доступные эписомные экспрессирующие векторы включают в себя, но не ограничиваются ими, эписомные плазмиды, которые используют ядерный антиген 1 вируса Эпштейна-Барр (EBNA1) и сайт инициации репликации (ориджин репликации) вируса Эпштейна-Варр (oriP). Векторы pREP4, pCEP4, pREP7 и pcDNA3.1 из Invitrogen (Carlsbad, CA) и pBK-CMV из Stratagene (La Jolla, CA) представляют неограничивающие примеры эписомного вектора, который использует Т-антиген и сайт инициации репликации (ориджин) SV40 вместо EBNA1 и oriP.

[0057] Другие подходящие векторы включают в себя интегрирующиеся экспрессирующие векторы, которые могут случайным образом интегрироваться в ДНК клетки-хозяина, или могут включать в себя сайт рекомбинации для осуществления специфической рекомбинации между экспрессирующим вектором и хромосомой клетки-хозяина. Такие интегрирующиеся экспрессирующие векторы могут использовать эндогенные регуляторные последовательности экспрессии хромосом клетки-хозяина для вызывания экспрессии желаемого белка. Примеры векторов, которые интегрируются сайт-специфическим образом, включают в себя, например, компоненты системы flp-in из Invitrogen (Carlsbad, CA) (например, pcDNA^TM5/FRT) или систему cre-lox, такую, как система, которая может быть найдена в pExchange-6 Core Vectors из Stratagene (La Jolla, CA). Примеры векторов, которые случайным образом интегрируются в хромосомы клетки-хозяина, включают в себя, например, pcDNA3.1 (при введении в отсутствие Т-антигена) из Invitrogen (Carlsbad, CA) и pCI или pFN10A (ACT) FLEXI^TM из Promega (Madison, WI).

[0058] Могут быть использованы также вирусные векторы. Репрезентативные коммерчески доступные вирусные экспрессирующие векторы включают в себя, но не ограничиваются ими, систему Per.C6 на основе аденовируса, доступную из Crucell, Inc. (Leiden, The Netherlands), pLP1 на основе лентивируса из Invitrogen (Carlsbad, CA) и ретровирусные векторы pFB-ERV плюс pCFB-EGSH из Stratagene (La Jolla, CA).

[0059] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид легкой цепи иммуноглобулина, этого IL-17-связывающего агента могут быть обеспечены клетке на одном и том же векторе (т.е. in cis). Бинаправленный промотор может быть использован для регуляции экспрессии обеих последовательностей нуклеиновых кислот. В другом варианте осуществления однонаправленный промотор может регулировать экспрессию обеих последовательностей нуклеиновых кислот. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид легкой цепи иммуноглобулина, могут быть обеспечены популяции клеток на отдельных векторах (т.е. in trans). Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, может содержать те же самые или отличающиеся регуляторные последовательности экспрессии в сравнении с вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид легкой цепи иммуноглобулина. Эти раздельные векторы могут быть обеспечены клеткам одновременно или последовательно.

[0060] Вектор (векторы), содержащий (содержащие) нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты), кодирующие IL-17-связывающий агент, могут быть введены в клетку-хозяина, которая способна экспрессировать кодируемые ими полипептиды, в том числе любую подходящую прокариотическую или эукариотическую клетку. Предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки, которые могут легко и надежно выращиваться, имеют приемлемо быстрые скорости роста, имеют хорошо характеризуемые системы экспрессии и могут быть трансформированы или трансфицированы легко и эффективно.

[0061] Примеры подходящих прокариотических клеток включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки из родов Bacillus (такие как Bacillus subtilis и Bacillus brevis), Escherichia (такие как E. coli), Pseudomonas, Streptomyces, Salmonella и Erwinia. Особенно применимые прокариотические клетки включают в себя различные штаммы Escherichia coli (например, К12, НВ101 (АТСС № 33694), DH5α, DH10, MC1061 (АТСС № 53338) и СС102).

[0062] Предпочтительно, эти векторы вводят в эукариотическую клетку. Подходящие эукариотические клетки известны в данной области и включают в себя, например, клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Примеры подходящих клеток дрожжей включают в себя клетки из родов Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhino-sporidium, Saccharomyces и Schizosaccharomyces. Предпочтительные клетки дрожжей включают в себя, например, Saccharomyces cerivisae и Pichia pastoris.

[0063] Подходящие клетки насекомых описаны, например, в Kitts et al., Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 (1993); и Lucklow et al., J. Virol., 67: 4566-4579 (1993). Предпочтительные клетки насекомых включают в себя Sf-9 и HI5 (Invitrogen, Carlsbad CA).

[0064] Предпочтительно, в этом изобретении используют клетки млекопитающих. Ряд подходящих клеток-хозяев млекопитающих известны в данной области и многие доступны из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС, Manassas, VA). Примеры подходящих клеток млекопитающих включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО) (АТСС № CCL61), клетки СНО DHFR (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220 (1980)), клетки почки эмбриона человека (HEK) 293 или 293Т (АТСС № CRL1573) и клетки 3Т3 (АТСС № CCL92). Другими подходящими линиями клеток млекопитающих являются линии клеток обезьян COS-1 (ATCC № CRL1650) и COS-7 (АТСС № CRL1651), а также линия клеток CV-1 (АТСС № CCL70). Дополнительные примеры клеток-хозяев млекопитающих включают в себя линии клеток приматов и линии клеток грызунов, в том числе линии трансформированных клеток. Применимы также нормальные диплоидные клетки, штаммы клеток, полученные из культуры in vitro первичной ткани, а также первичные эксплантаты. Другие подходящие линии клеток млекопитающих включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки нейробластомы мыши N2A, HeLa, клетки L-929 мыши и линии клеток хомячка BHK и HaK, все из которых доступны из АТСС. Способы для селекции подходящих клеток-хозяев млекопитающих и способы трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и очистки клеток известны в данной области.

[0065] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-17-связывающий агент, может быть введена в клетку “трансфекцией”, “трансформацией” или “трансдукцией”. “Трансфекцией”, “трансформацией” или “трансдукцией” называют в данном контексте введение одного или нескольких экзогенных полинуклеотидов в клетку-хозяина с использованием физических или химических способов. Многие способы трансфекции известны в данной области и включают в себя, например, кальций-фосфатный способ соосаждения ДНК (см., например, Murrey E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991); DEAE-декстрановый способ; электропорацию; опосредованную катионными липосомами трансфекцию; облегченную вольфрамовыми частицами бомбардировку микрочастицами (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и соосаждение ДНК фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Фаговые или вирусные векторы могут быть введены в клетки-хозяева, после роста инфекционных частиц в подходящих упаковывающих клетках многие из которых являются коммерчески доступными.

[0066] Это изобретение обеспечивает композицию, содержащую выделенный IL-17-связывающий агент или вектор, кодирующий IL-17-связывающий агент, описанный здесь. Предпочтительно, эта композиция является фармацевтически приемлемой (например, физиологически приемлемой) композицией, которая содержит носитель, предпочтительно фармацевтически приемлемый (например, физиологически) носитель, и IL-17-связывающий агент. Любой подходящий носитель может быть использован в контексте этого изобретения, и такие носители хорошо известны в данной области. Выбор носителя будет определяться, отчасти, конкретным участком, в который эта композиция может вводиться, и конкретным способом, используемым для введения этой композиции. Эта композиция, необязательно, может быть стерильной. Эта композиция может быть заморожена или лиофилизирована для хранения и воссоздана в подходящем стерильном носителе перед использованием. Эта композиция может быть получена в соответствии с общепринятыми способами, описанными, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001).

[0067] Это изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения IL-17-опосредованного заболевания в млекопитающем. Этот способ предусматривает введение вышеупомянутой композиции млекопитающему, имеющему IL-17-опосредованное заболевание, после чего это IL-17-опосредованное заболевание лечится в этом животном. Термин “IL-17-опосредованное заболевание” относится в данном контексте к любому заболеванию или нарушению, в котором присутствие IL-17 вызывает заболевание или способствует патологическим эффектам этого заболевания, или уменьшение уровней или активности IL-17 имеет терапевтическую пользу в этих млекопитающих, предпочтительно людях. Примеры IL-17-опосредуемых заболеваний включают в себя, но не ограничиваются ими, воспаление дыхательных путей, астму, ревматоидный артрит (RA), остеоартрит, остеопороз, эрозию костей, внутрибрюшинные абсцессы и адгезии, воспалительное нарушение пищеварительного тракта (IBD), хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), болезнь Аддисона, агаммоглобулинемию, аллергическую астму, круговую (гнездную) алопецию, брюшную афту, болезнь Шагаса, идиопатический легочный невроз, болезнь Крона, язвенный колит, отторжение трансплантата (например, ренального), псориатический артрит, увеит, болезнь Бехчета, некоторые типы рака, ангиогенез, атеросклероз, рассеянный склероз (MS), системную красную волчанку, септицемию, септический или эндотоксический шок, реакцию на действие аллергена, ассоциированный с Helicobacter pylori гастрит, бронхиальную астму, анкилозирующий спондилит, волчаночный нефрит, псориаз, ишемию, системный склероз и другие воспалительные нарушения.

[0068] В данном контексте термины “вылечивание”, “лечение” и т.п. относятся к желаемому фармакологическому и/или физиологическому эффекту. Предпочтительно, этот эффект является терапевтическим, т.е. этот эффект частично или полностью излечивает заболевание и/или вредные симптомы, приписываемые этому заболеванию. Для этой цели способ этого изобретения предусматривает введение “терапевтически эффективного количества” IL-17-связывающего агента. “Терапевтически эффективным количеством” называют количество, эффективное, при дозах и в течение необходимого периода времени, для достижения желаемого терапевтического результата. Это терапевтически эффективное количество может варьироваться в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и масса конкретного индивидуума, и способность IL-17-связывающего агента вызывать желаемую реакцию в этом индивидууме. Например, терапевтически эффективное количество IL-17-связывающего агента этого изобретения является количеством, которое уменьшает биоактивность IL-17 в человеке (например, блокированием связывания с IL-17R).

[0069] Альтернативно, фармакологическое и/или физиологическое действие может быть профилактическим, т.е. это действие полностью или частично предотвращает заболевание или его симптом. В этой связи, способ данного изобретения предусматривает введение “профилактически эффективного количества” IL-17-связывающего агента млекопитающему, которое предрасположено к IL-17-опосредуемому заболеванию. “Профилактически эффективным количеством” называют количество, эффективное, при дозах и в течение необходимого периода времени, для достижения желаемого профилактического результата (например, предотвращения появления заболевания).

[0070] Типичная доза может находиться, например, в диапазоне 0,001-1000 мкг; однако дозы ниже или выше этого примерного диапазона находятся в объеме этого изобретения. Суточная парентеральная доза может быть приблизительно 0,1 мкг/кг - приблизительно 100 мг/кг общей массы тела (например, приблизительно 5 мкг/кг, приблизительно 10 мкг/кг, приблизительно 100 мкг/кг, приблизительно 500 мкг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 50 мг/кг, или диапазоном, определяемым любыми двумя из вышеупомянутых величин), предпочтительно от приблизительно 0,3 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг общей массы тела (например, приблизительно 5 мкг/кг, приблизительно 1 мкг/кг, приблизительно 50 мкг/кг, приблизительно 150 мкг/кг, приблизительно 300 мкг/кг, приблизительно 750 мкг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг или диапазоном, определяемым любыми двумя из вышеупомянутых величин), более предпочтительно от приблизительно 1 мкг/кг до 1 мг/кг общей массы тела (например, приблизительно 3 мкг/кг, приблизительно 15 мкг/кг, приблизительно 75 мкг/кг, приблизительно 300 мкг/кг, приблизительно 900 мкг/кг, или диапазоном, определяемым любыми двумя из вышеупомянутых величин) и даже более предпочтительно от приблизительно 0,5-10 мг/кг массы тела в день (например, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 7 мг/кг, приблизительно 9 мг/кг или диапазоном, определяемым любыми двумя из вышеупомянутых величин). Терапевтическая или профилактическая эффективность может быть подвергнута мониторингу периодическим оцениванием лечимых пациентов. Для повторяемых введений на протяжении нескольких дней или более, в зависимости от состояния, это лечение повторяют до появления желаемой супрессии симптомов заболевания. Однако другие схемы введения доз могут быть также применимы и находятся в объеме этого изобретения. Желаемая доза может доставляться единственным болюсным введением этой композиции, множественными болюсными введениями этой композиции или непрерывным инфузионным введением этой композиции.

[0071] Композиция, содержащая IL-17-связывающий агент этого изобретения, может вводиться млекопитающему с использованием стандартных способов введения, включающих в себя пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, интраназальное, трансбуккальное, сублингвальное введение или введение в виде суппозитория. Эта композиция предпочтительно пригодна для парентерального введения. Термин “парентеральное” в этом контексте включает в себя внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное и внутрибрюшинное введение. Более предпочтительно, эту композицию вводят в млекопитающее с использованием периферической системной доставки внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекцией.

[0072] Сразу после введения млекопитающему (например, человеку) биологическая активность IL-17-связывающего агента этого изобретения может быть измерена любым подходящим способом, известным в данной области. Например, эта биологическая активность может оцениваться определением стабильности конкретного IL-17-связывающего агента. В одном варианте осуществления этого изобретения IL-17-связывающий агент (например, антитело) имеет период полувыведения in vivo между приблизительно 5 и 28 днями (например, приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 дней или диапазон, определяемый любыми двумя из вышеупомянутых величин). Предпочтительно IL-17-связывающий агент имеет период полувыведения in vivo между приблизительно 21 и 28 днями (например, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 днями). Биологическая активность конкретного IL-17-связывающего агента может также оцениваться определением его аффинности связывания с IL-17 или его эпитопом. Термин “аффинность” относится к константе равновесия для обратимого связывания двух агентов и выражается в виде константы диссоциации (K_D). Аффинность связывающего агента в отношении лиганда, такая как аффинность антитела в отношении эпитопа, может быть, например, от приблизительно 100 наномолярной (нМ) до приблизительно 0,1 нМ, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 пикомолярной (пМ), от приблизительно 1 нМ до приблизительно 1 пМ или от приблизительно 1 нМ до приблизительно 1 фемтомолярной (фМ). В контексте способа этого изобретения, IL-17-связывающий агент связывается с IL-17 с K_D, меньшей чем или равной 1 наномолярной (например, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,025 нМ, 0,01 нМ, 0,001 нМ или диапазону, определяемому любыми двумя вышеупомянутыми величинами), и предпочтительно меньшей чем, или равной 200 пикомолярной (например, 190 пмоль, 150 пмоль, 175 пмоль, 125 пмоль, 110 пмоль, 100 пмоль, 90 пмоль, 80 пмоль, 75 пмоль, 60 пмоль, 50 пмоль, 40 пмоль, 30 пмоль, 25 пмоль, 20 пмоль, 15 пмоль, 10 пмоль, 5 пмоль, 1 пмоль или диапазону, определяемому любыми двумя из вышеупомянутых величин). Аффинность иммуноглобулина в отношении представляющего интерес антигена или эпитопа может быть измерена с использованием признанного в этой области анализа. Такие способы включают в себя, например, активируемый флуоресценцией сортинг клеток (FACS), разделяемые гранулы (например, магнитные гранулы), пэннинг антигенов и/или ELISA (см., например, Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5^th ed., Garland Publishing, New York, NY, 2001).

[0073] IL-17-связывающий агент этого изобретения может вводиться отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами (например, в качестве адъювантов). Например, IL-17-связывающий агент может вводиться в комбинации с иммуносупрессивными или иммуномодулирующими агентами или другими противовоспалительными агентами для лечения или предотвращения IL-17-опосредуемых заболеваний, описанных здесь. В этом отношении, IL-17-связывающий агент может быть использован в комбинации с модифицирующими заболевание антиревматическими лекарственными средствами (DMARD) (например, солями золота, сульфасалазином, противомалярийными средствами, метотрексатом, D-пеницилламином, азатиоприном, микофеноловой кислотой, циклоспорином А, такролимусом, сиролимусом, миноциклином, лефлуномидом и глюкокортикоидами), ингибитором кальцинейрина (например, циклоспорином А или FK 506), модулятором рециркуляции лимфоцитов (например, FTY720 и аналогами FTY720), ингибитором mTOR (например, рапамицином, 40-О-(2-гидроксиэтил)-рапамицином, CCI779, АВТ578, АР23573 или TAFA-93), аскомицином, имеющим иммуносупрессивные свойства (например, АВТ-281, ASM981 и т.д.), кортикостероидами, циклофосфамидом, азатиопреном, метотрексатом, лефлуномидом, мизорибином, микофеноловой кислотой, микофенолят-мофетилом, 15-дезоксиспергуалином или его иммуносупрессивным гомологом, аналогом или производным, иммуносупрессивными моноклональными антителами (например, моноклональными антителами против рецепторов лейкоцитов, таких как МНС, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86, или их лигандами), другими иммуномодуляторными соединениями, ингибиторами молекул адгезии (например, антагонистами LFA-1, антагонистами ICAM-1 или -3, антагонистами VCAM-4 или антагонистами VLA-4), химиотерапевтическим агентом (например, паклитакселом, гемицитабином, цисплатиной, доксорубицином или 5-фторурацилом), анти-TNF-агентами (например, моноклональными антителами к TNF, такими как инфликсимаб, адалимумаб, CDP870, или рецепторными конструктами к TNF-RI или TNF-RII, такими как ENBREL^TM (Этанерцепт) или PEG-TNF-RI), блокаторами провоспалительных цитокинов, блокаторами IL-1 (например, KINERET^TM (Anakinra) или IL-1-ловушкой, AAL160, ACZ 885 и IL-6-блокаторами), блокаторами хемокинов (например, ингибиторами или активаторами протеаз), анти-IL-15-антителами, анти-IL-6-антителами, анти-CD20-антителами, NSAID и/или антиинфекционным агентом.

[0074] Кроме терапевтических применений IL-17-связывающий агент, описанный здесь, может быть использован в диагностических или исследовательских применениях. В этой связи, IL-17-связывающий агент может быть использован в способе диагностики IL-17-опосредованного заболевания или нарушения. Например, это изобретение обеспечивает способ диагностики IL-17-опосредованного заболевания в млекопитающем, который предусматривает введение IL-17-связывающего агента млекопитающему, предположительно имеющему IL-17-опосредованное заболевание, после чего детектирование связывания IL-17-связывающего агента с IL-17 является показателем того, что это млекопитающее имеет IL-17-опосредованное заболевание. Подобным образом, IL-17-связывающий агент может быть использован в анализе для мониторинга уровней IL-17 в субъекте, тестируемом на IL-17-ассоциированное заболевание или нарушение. Исследовательские применения включают в себя, например, способы, которые используют IL-17-связывающий агент и метку для детектирования IL-17 в пробе, например, тканевой жидкости человека, или в экстракте клеток или ткани. Этот IL-17-связывающий агент может быть использован с модификацией или без модификации, такой как ковалентное или нековалентное мечение детектируемой частью молекулы. Например, этой детектируемой частью может быть радиоактивный изотоп (например, ³Н, ¹⁴С, ³²Р, ³⁵S или ¹²⁵I), флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение (например, флуоресцеинизотиоцианат, родамин или люциферин) или фермент (например, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза хрена). Любой способ, известный в данной области, для раздельного конъюгирования антигенсвязывающего агента (например, антитела) с детектируемой частью может быть использован в контексте этого изобретения (см., например, Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); и Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 (1982)).

[0075] Уровни IL-17 могут быть измерены с использованием IL-17-связывающего агента любым подходящим способом, известным в данной области. Такие способы включают в себя, например, ELISA, радиоиммуноанализ (RIA) и FACS. Нормальные или стандартные величины экспрессии IL-17 могут быть установлены любым подходящим способом, например, комбинированием пробы, содержащей или предположительно содержащей полипептид IL-17, с IL-17-специфическим антителом при условиях, подходящих для образования комплекса антиген-антитело. Это антитело является непосредственно или опосредованно меченым детектируемым веществом для облегчения детектирования связанного или несвязанного антитела. Подходящие детектируемые вещества включают в себя различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы (см., например, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). Затем количество IL-17-полипептида, экспрессируемого в пробе, сравнивают со стандартными величинами.

[0076] Этот IL-17-связывающий агент может быть обеспечен в наборе, т.е. упакованной комбинации реагентов в заранее определенных количествах с инструкциями для проведения диагностического анализа. Если IL-17-связывающий агент помечен ферментом, этот набор, желательно, включает в себя субстраты и кофакторы, необходимые для этого фермента (например, предшественник субстрата, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, в этот набор могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизисный буфер) и т.п. Относительные количества различных реагентов могут варьироваться для обеспечения концентраций в растворе этих реагентов, которые существенно оптимизируют чувствительность этого анализа. Эти реагенты могут быть обеспечены в виде сухих порошков (обычно лиофилизированных), в том числе эксципиентов, которые после растворения будут обеспечивать раствор реагента, имеющий подходящую концентрацию.

[0077] Следующие примеры дополнительно иллюстрируют это изобретение, но, конечно, не должны рассматриваться как каким-либо образом ограничивающие его объем.

ПРИМЕР 1

[0078] Этот пример демонстрирует, что IL-17-связывающий агент в соответствии с этим изобретением может блокировать активность IL-17 человека in vivo.

[0079] IL-17 человека (hIL-17) способен связываться и стимулировать IL-17-рецептор мыши, приводя к последующему выделению хемокина КС (CXCL1). Выполняли эксперименты по определению диапазона времени и доз для идентификации оптимальной дозы hIL-17, которая приводила к максимальной индукции КС мыши in vivo. IL-17 человека вводили подкожно мышам при 1, 3 и 10 мкг/мышь. В различных временных точках после введения hIL-17 (фиг.1) мышей умерщвляли и уровни КС определяли при помощи ELISA с использованием коммерчески доступного набора в соответствии с инструкциями изготовителя (КС Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN). Эти эксперименты показывают, что подкожная доза 10 мкг/мышь IL-17 человека приводила к максимальным уровням КС в сыворотке мыши спустя два часа после введения цитокина человека (фиг.1).

[0080] Полноразмерное антитело IgG1, содержащее полипептид тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 4, и полипептид легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 24, вводили внутривенно мышам при 1, 10 и 100 мкг/мышь за два часа перед подкожной инъекцией hIL-17. Спустя два часа после введения IL-17 человека, мышей умерщвляли и уровни КС определяли при помощи ELISA с использованием коммерчески доступного набора. Совместимое по изотипу (IgG1) антитело использовали в качестве отрицательного контроля (NC). Как показано на фиг.2, антитело, содержащее SEQ ID NO: 4, блокирует способность hIL-17 стимулировать IL-17 рецептор мыши зависимым от дозы образом. При дозе 100 мкг/мышь это антитело уменьшало уровни КС приблизительно на 75-80% в сравнении с носителем и антителом NC, которые не проявляли действия.

[0081] Результаты этого примера демонстрируют, что IL-17-специфическое антитело, содержащее SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 24, может ингибировать активность IL-17 in vivo.

ПРИМЕР 2

[0082] Этот пример демонстрирует, что полипептиды тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC), описанные здесь, могут образовывать антитела, которые связывают IL-17 in vitro.

[0083] ДНК-пробы, кодирующие различные полипептиды тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC), описанные здесь, готовили объединением следующих компонентов: 20 мкл максипрепарата ДНК (содержащие плазмиду 0,2 мкг НС и 0,2 мкг LC), 9,8 мкл OPTIMEM^TM (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), 1,2 мкл реагента трансфекции GENEJUICE^TM (Novagen, Gibbstown, NJ) и 13,8 мкл OPTIMEM^TM (предварительно нагретые). После тщательного перемешивания и инкубации (при комнатной температуре) ДНК-препаратов, 35 мкл смеси реагент/ДНК добавляли к 5×10⁴ клеткам НЕК293-c18. За 18 часов перед трансфекцией эти клетки высевали в 150 мкл среды Freestyle на лунку 96-луночного микротитрационного планшета и инкубировали при 37°С в увлажненной атмосфере при 8% СО₂. После трансфекции клетки возвращали в условия 37°С в 8% СО₂. Комбинации последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи, которые тестировали, представлены в таблице 2.

Таблица 2 № лунки SEQ ID NO: тяжелой цепи SEQ ID NO: легкой цепи 1 30 29 2 1 29 3 2 29 4 4 29 5 6 29 6 7 29 7 9 29 8 30 24 9 1 24 10 2 24 11 4 24 12 6 24 13 7 24 14 9 24 15 30 25 16 4 25 17 6 25 18 30 27 19 4 27 20 6 27

[0084] Супернатанты в 96-луночных планшетах собирали спустя 5-7 дней после трансфекции. Перед загрузкой на BIACORE^TM А100 и/или BIACORE^TM 4000 (GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom) планшеты откручивали при 1500 об/мин в течение 5 минут для удаления пузырьков воздуха. Положительные, отрицательные контроли и контроли среды помещали в пустые лунки. Один специфический анти-Fc-IgG связывали с использованием сочетания с амином с поверхностью Sensor Chip CM5 при разных плотностях на двух пятнах проточной кюветы для 2 повторяемых анализов. Представляющие интерес IgG захватывались при обеих плотностях. Две концентрации антигена (IL-17 человека) протекали через каждое антитело при каждой плотности (в том числе с взятием пробы “нулевой концентрации”), и их подвергали мониторингу на взаимодействия связывания. Поверхность регенерировали 10 мМ глицином при рН 1,7 для удаления материала, который был связан захватывающим антителом. Этот набор данных анализировали с режимом взаимодействия 1:1 Langelier с массопереносом (переносом массы). Тестируемые полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи образовывали антитела, которые связываются с IL-17 человека (см. фиг.3).

[0085] Результаты данного примера демонстрируют, что IL-17-связывающий агент, содержащий полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи цепей иммуноглобулина, описанные здесь, может связываться с IL-17 человека in vitro.

ПРИМЕР 3

[0086] Этот пример демонстрирует, что полипептиды тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC), описанные здесь, могут образовывать антитела, которые связываются с IL-17 человека in vitro.

[0087] Ранговый порядок аффинности связывания для следующих анти-IL-17а-антител определяли анализом однородной флуоресценции с временным разрешением (HTRF): (а) антитела, содержащего полипептид тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 55, и полипептид легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 24 (“APE508”), (b) антитела, содержащего полипептид тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 78, и полипептид легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 24 (“APE755”), (с) первого ссылочного анти-IL-17а-антитела (описанного в международной публикации заявки на патент № WO 2006/013107) и (d) второго ссылочного анти-IL-17а-антитела (описанного в патенте США № 7838738). В этом анализе IL-17-антиген (APE349 - SEQ ID NO: 82), связанный с флуоресцентным белком васаби (WFP) (см., например, Ai et al., BMC Biol., 6: 13 (2008)), метили активированным N-гидроксисукцинимидом криптатом (Eu3+-TBP-NHS-криптатом) с использованием набора для мечения HTRF® криптатом в соответствии с протоколом изготовителя (Cisbio US, Bedford, MA). Биотинилированную версию второго ссылочного антитела связывали со Стрептовидин-XL665 (Cisbio US, Bedford, MA) и затем смешивали с каждым из вышеупомянутых анти-IL-17а-антител в различных концентрациях. Затем эти антитела инкубировали с меченым антигеном в течение ночи при комнатной температуре. В конце этого анализа эту реакцию считывали в ProxiPlate-384 Plus (Perkin Elmer, Waltham, MA) с использованием планшет-ридера EnVision Multilabel (PerkinElmer, Waltham, MA). Связывание меченого антигена и ссылочного антитела определяли в виде отношения 665 нм к 620 нм. Эти отношения в виде концентрации антител и IC₅₀ для каждого антитела определяли построением кривой ингибирования с использованием программы GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Результаты этого анализа демонстрируют, что антитела APE755 и APE508 связываются с одним и тем же эпитопом на IL-17, что и ссылочные анти-IL-17а-антитела.

[0088] Анализ высвобождения цитокина с использованием клеток НТ1080, клеток NIH 3T3 или первичных синовиальных фибробластных клеток из клеток пациентов с ревматоидным артритом (RA SFB) также использовали для демонстрации, что полипептиды тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) иммуноглобулина, описанные здесь, могут образовывать антитела, которые связываются с IL-17 человека. Высвобождение IL-6 из клеток NIH3T3 и НТ-1080 определяли количественно при помощи ELISA. Клетки высевали в 96-луночный планшет для анализа при 1×10⁴ клеток на лунку и затем обрабатывали в течение 24 часов (i) очищенным Myc-IL-17а человека (APE280, 52 пМ для клеток NIH3T3 или 200 пМ для клеток НТ1080), (ii) рекомбинантным TNFα человека (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, 0,5 нг/мл; только клетки NIH3T3) и (iii) анти-IL-17а-антителами, описанными выше, при различных концентрациях (все в 100 мкл DMEM/10% FCS). После обработки 10 мкл супернатанта из каждой лунки анализировали при помощи ELISA (eBioscience, Inc., San Diego, CA) для количественного определения IL-6 мышей согласно протоколу изготовителя. Уровни IL-6 нормализовали относительно отрицательного контроля, в котором во время этой обработки не присутствовало анти-IL-17а-антитело. Эти нормализованные уровни IL-6 строили в виде графиков против концентрации антител и IC₅₀ для каждого антитела определяли построением кривой ингибирования с использованием программы GraphPad Prism. IL-17а-стимулируемое высвобождение IL-8 из клеток НТ-1080 измеряли, как показано выше, за исключением того, что использовали 800 пМ Myc-IL-17a и 0,05 нг/мл рекомбинантного TNFα человека. Количественное определение IL-8 выполняли с использованием набора ELISA BioLegend (San Diego, CA) согласно протоколу изготовителя.

[0089] Антитело АРЕ755 ингибировало высвобождение IL-6 из стимулированных IL-17 клеточных линий с 5-10-кратно более высокой эффективностью, чем первое ссылочное анти-IL-17а-антитело. Это антитело АРЕ755 ингибировало высвобождение IL-8 из стимулированных IL-17 клеточных линий с 2-кратно более высокой эффективностью, чем первое ссылочное анти-IL-17а-антитело.

[0090] Высвобождение IL-6 и IL-8 из клеток RA SFB определяли количественно при помощи ELISA. Клетки RA SFB при пассаже 2-4 (Asterand, MI, выделенные из болезненного участка колена у 63-летней женщины Индоевропейской группы населения с ревматоидным артритом) высевали в 96-луночном планшете для анализа при 5×10³ клеток на лунку. После ночного культивирования эти клетки обрабатывали в течение 24 часов IL-17а человека (Humanzyme, IL, 200 пМ) и различными концентрациями одного из следующих анти-IL-17а-антител: (а) АРЕ508, (b) АРЕ755, (с) первым ссылочным анти-IL-17а-антителом (описанным в международной публикации заявки на патент № WO2006/013107), (d) вторым ссылочным анти-IL-17а-антителом (описанным в патенте США № 7838738) и (е) антителом, специфическим в отношении фактора роста нервов (NGF) (“АРЕ409”), которое служило в качестве отрицательного контроля (все в 100 мкл DMEM/F-12/10% FBS). После обработки 10 мкл или 20 мкл супернатанта из каждой лунки подвергали действию IL-6 человека (eBioscience, Inc., San Diego, CA) или IL-8 человека (BioLegend, San Diego, CA), соответственно, согласно протоколам изготовителей. Уровни IL-6 и IL-8 нормализовали относительно отрицательных контролей (т.е., в которых во время обработки не присутствует анти-IL-17а-антитело). Эти нормализованные уровни строили в виде графиков, как описано выше.

[0091] Это антитело АРЕ755 ингибировало высвобождение IL-6 и IL-8 из IL-17-стимулированных первичных синовиальных фибробластов RA человека с 5-кратно более высокой эффективностью, чем ссылочные анти-IL-17а-антитела (см. фиг.4).

[0092] Результаты этого примера демонстрируют, что IL-17-связывающий агент, содержащий полипептиды тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, описанные здесь, может связываться с IL-17 человека in vitro.

ПРИМЕР 4

[0093] Этот пример демонстрирует, что полипептиды тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) иммуноглобулина, описанные здесь, могут образовывать антитела, которые блокируют активность IL-17 in vitro.

[0094] Ингибирование связывания рецептор-лиганд анти-IL-17а-антителами определяли количественно конкурентным ELISA. 96-луночный планшет для анализа покрывали 5 нМ myc-IL-17а (АРЕ280) в 100 мкл буфера для покрытия (eBioscience, Inc., San Diego, CA). 1 нМ биотинилированный IL-17-рецептор А (IL-17RA) (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) смешивали с различными концентрациями анти-IL-17а-антител, описанных в примере 3 (все в 100 мкл блокирующего буфера (eBioscience, Inc., San Diego, CA)) и инкубировали в течение 24 часов в покрытом IL-17А планшете. Захваченный биотинилированный IL-17RA определяли количественно с использованием авидин-пероксидазы хрена (HRP) согласно стандартному протоколу ELISA. Эти сигналы нормализовали относительно отрицательного контроля, в котором анти-IL-17а-антитело присутствовало для блокирования связывания. Нормализованные сигналы связывания рецептор-лиганд изображали в виде графика против концентраций этих антител и IC₅₀ для каждого антитела определяли при помощи подгонки ингибиторной кривой с использованием программы GraphPad Prism. Антитело АРЕ755 было 40-кратно более эффективным, чем первое ссылочное анти-IL-17а-антитело, и эквивалентным второму ссылочному анти-IL-17а-антителу в блокировании взаимодействия IL-17 IL-17RA (фиг.5).

[0095] Результаты этого примера демонстрируют, что IL-17-специфическое антитело, содержащее полипептид тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 78, и полипептид легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 24, может ингибировать активность IL-17 in vitro.

ПРИМЕР 5

[0096] Этот пример демонстрирует, что полипептиды тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) иммуноглобулина, описанные здесь, могут образовывать антитела и связывать IL-17 человека in vitro.

[0097] Аффинности связывания различных антител, содержащих полипептиды тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) иммуноглобулина, описанные здесь, оценивали с использованием анализов BIACORE^TM и KINEXA®.

[0098] BIACORE T100^TM используют для определения кинетики и аффинности связывания антитело-антиген. Эта технология основана на резонансе поверхностных плазмонов (SPR), оптическом феномене, который позволяет детектировать взаимодействия без метки в реальном времени в матриксе декстранового биосенсора. Вследствие этого эта технология пригодна для измерения констант скорости ассоциации (k_on), а также диссоциации (K_off). Все реагенты и материалы приобретали из GE Healthcare (Buckinghamshire, United Kingdom). Анти-IL-17а-антитела захватывались анти-Fc человека-антителом (GE Healthcare, Catalog № BR-1008-39), которое было ковалентно иммобилизовано на сенсорном чипе СМ5 (GE Healthcare, Catalog № BR-1005-30) с использованием химической реакции сочетания с амином. 3000 реакционных единиц (RU) захватывающего антитела присоединяли к поверхности декстрана и затем захватывали 30-50 RU 500 нг/мл анти-IL-17а-антител. 1Х HBS-EP+ буфер (0,01 М HEPES, 0,15 М NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% Полисорбат, рН 7,6) использовали для воссоздания антигена при различных концентрациях (начиная при 50 нМ и используя двухкратные серийные разведения для каждой концентрации). 210 мкл каждой концентрации антигена инъецировали на захваченное антитело при скорости потока 30 мкл/мин, затем давали диссоциироваться в течение 10 минут. Поверхность регенерировали 60 мкл 3 М MgCl₂ после каждого цикла для установления фона. Кинетические константы ассоциации и диссоциации (k_a и k_d) оценивали с использованием модели связывания “1:1 c переносом массы” в программе оценивания BIACORE^TM Т100. Степень связывания для анализа BIACORE^TM измеряли как “++” (сильное связывание), “+” (связывание) или “+/-” (близкое к фону). Результаты анализа BIACORE^TM представлены в таблице 3.

Таблица 3 SEQ ID NO: тяжелой цепи SEQ ID NO: легкой цепи название клона 4000 +/- связывание BIACORE^TM 1 24 546/773 + 4 25 817/772 + 4 27 817/842 + 9 24 843/773 + 8 24 846/773 + 10 25 847/772 + 10 27 847/842 + 12 25 878/772 + 12 27 878/842 + 13 25 887/772 + 13 26 887/841 + 13 27 887/842 + 14 24 1102/773 + 21 24 1103/773 + 33 24 1129/773 + 34 24 1134/773 + 32 24 1137/773 + 35 24 1139/773 + 17 24 1142/773 + 77 24 1143/773 + 76 24 1144/773 + 19 24 1146/773 + 15 24 1147/773 + 36 24 1153/773 + 84 24 MP4-2 + 85 24 MP4-4 ++ 86 24 MP4-5 ++ 87 24 MP4-6 + 88 24 MP4-7 + 89 24 MP4-8 + 90 24 MP4-9 + 91 24 MP4-10 + 92 24 MP4-11 + 93 24 MP4-14 + 94 24 MP4-16 + 95 24 MP4-17 + 96 24 MP4-19 +/- 97 24 MP4-20 + 98 24 MP4-21 + 99 24 MP4-22 + 100 24 MP4-23 ++

[0099] Антитела, оптимизированные до ≤100 пМ, также характеризовали с использованием анализа KINEXA® 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID). Технология KINEXA® измеряет несвязанную/свободную молекулу рецептора в фазе раствора. Измерение событий связывания в фазе раствора с использованием микрогранул для максимизации площади поверхности позволяет избежать эффектов недостатков массопереноса и мобильности, присущих способам, которые измеряют связывание с твердой фазой. Для каждого эксперимента 50 мкг IL-17а человека подвергали сочетанию с амином с 50 мг гранул UltraLink Biosupport (Thermo Scientific, Waltham, MA; Catalog № 53110). Константную концентрацию антитела (достаточную для продуцирования сигнала 0,8-1,2 В) инкубировали в течение достаточного периода времени для приближения к равновесию или для достижения равновесия (время инкубирования варьируется для каждого антитела и зависит от аффинности) с титруемым антигеном в буфере для проб (1Х PBS (ЗФР), рН 7,4, 0,02% NaN₃, 0,1% БСА). Затем раствор антитело-антиген протекал над связанными с антигеном гранулами при скорости 0,25 мл/мин. Свободное антитело, захваченное гранулами, детектировали с использованием Cy5-конъюгированного AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (Н+L) (Jackson ImmunoResearch; Catalog № 709-175-149). K_d и/или ABC (концентрацию активного связывания) антитела получали из нелинейного регрессионного анализа с использованием модели односайтного гомогенного связывания в программе KINEXA® Pro. Для достижения наиболее точного измерения для каждого антитела каждую “K_d-контролируемую кривую” (где концентрация антитела ниже этой K_d) объединяли с “контролируемой рецептором кривой” (где концентрация антитела достаточно выше этой K_d) в анализе N-кривых. Результаты анализа KINEXA® представлены в таблице 4.

Таблица 4 SEQ ID NO: тяжелой цепи SEQ ID NO: легкой цепи название клона Средние величины KINEXA®       k_a (1/Мс) k_d (1/с) KD 2 24 APE253-771/773 (НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ) НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ~60 нМ 4 24 APE265-817/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 322 пМ 12 24 APE318-878/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 14,2 нМ 13 24 APE319-887/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 6,1 нМ 10 24 APE320-847/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2,5 нМ 6 24 APE321-844/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 9,4 нМ 48 24 APE422-1141/773 3,60E+05 2,40E-05 67 пМ 37 24 APE467-1138/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 374 пМ 20 24 APE470-1150/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 6,9 нМ 64 24 APE480-1261/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 1,2 нМ 67 24 APE490-1263/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 948 пМ 53 24 APE498-1330/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 126 пМ 56 24 APE499-1332/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 92 пМ 55 24 APE508-1266/773 4,18E+05 1,80E-05 43 пМ 42 24 APE545-1346/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 270 пМ 55 81 APE744-1266/1540 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 875 пМ 83 24 APE860-1723/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 49 пМ 78 24 APE755-1574/773 1,20E+06 5,90E-06 4,9 пМ 79 24 APE857-1622/773 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 4,8 пМ

[00100] Результаты этого примера демонстрируют, что IL-17-связывающий агент, содержащий полипептиды тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, описанные здесь, может связываться с IL-17 человека in vitro.

[00101] Все ссылки, включающие в себя публикации, заявки на патент и патенты, цитируемые здесь, включены тем самым посредством ссылки в такой же степени, как если бы было указано, что каждая ссылка отдельно и конкретно включена посредством ссылки и представлена в ее полном виде здесь.

[0100] Применение терминов “a” и “an” и “the” и подобные символы в этом контексте описания этого изобретения (особенно в контексте следующих пунктов формулы изобретения) должны пониматься как включающие в себя как единственное, так и множественное число, если нет другого указания здесь или это не противоречит явно контексту. Термины “содержащий”, “имеющий”, “включающий в себя” и “состоящий” должны пониматься как расширяемые (открытые) (т.е., означающие “включающие в себя, но не ограничивающиеся ими”), если нет иных указаний. Перечисление диапазонов величин предназначено служить в качестве стенографического способа ссылки индивидуально в отношении каждой отдельной величины, находящейся в этом диапазоне, если не указано особо здесь, и каждая отдельная величина включена в это описание, как если бы она была индивидуально упомянута здесь. Все способы, описанные здесь, могут выполняться в любом подходящем порядке, если нет другого указания или это не противоречит явно контексту. Применение любого или всех примеров, или примерной формулировки (например, “такие как”), обеспеченное здесь, предназначено только для лучшего разъяснения этого изобретения и не создает ограничения объема этого изобретения, если нет других указаний. Никакая формулировка в этом описании не должна пониматься как указание любого незаявленного элемента как существенного для применения на практике этого изобретения.

[0101] Здесь описаны предпочтительные варианты осуществления этого изобретения, в том числе наилучший способ, известный авторам изобретения, для проведения этого изобретения. Вариации этих предпочтительных вариантов могут становиться очевидными квалифицированному в данной области специалисту после прочтения предыдущего описания. Авторы изобретения ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие вариации в качестве подходящих, и авторы изобретения имеют в виду, что это изобретение будет использоваться на практике иным образом, чем конкретно описано здесь. Таким образом, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты предмета изобретения, представленного в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено применимым законом. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех их возможных вариациях включена в данное изобретение, если нет других указаний здесь или это не противоречит явно данному контексту.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлено выделенное IL-17-связывающее антитело. Также изобретение относится к вектору экспрессии, композиции и способам применения IL-17-связывающего антитела для лечения IL-17-опосредованного заболевания. Изобретение позволяет повысить аффинность, увеличить стабильность и улучшить фармакокинетику связывания антитела с IL-17, а также эффективно нейтрализовать активность IL-17 in vivo. 5 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Выделенное IL-17-связывающее антитело, содержащее:
(a) полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность с любой из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6-10, 12-15, 17, 19-21, 30, 32, 33-37, 42, 48, 53, 55, 56, 64, 67, 76-79 или 83-100, и
(b) полипептид легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность с любой из SEQ ID NO: 24-27, 29 или 81.

2. Выделенное IL-17-связывающее антитело по п.1, где полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 2.

3. Выделенное IL-17-связывающее антитело по п.1, где полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 78 или SEQ ID NO: 79.

4. Выделенное IL-17-связывающее антитело по п.3, которое содержит полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий SEQ ID NO: 32.

5. Выделенное IL-17-связывающее антитело по п.3, которое содержит полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий SEQ ID NO: 33.

6. Выделенное IL-17-связывающее антитело по п.3, которое содержит полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий SEQ ID NO: 78.

7. Выделенное IL-17-связывающее антитело по п.3, которое содержит полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий SEQ ID NO: 79.

8. Выделенное IL-17-связывающее антитело по п.1, где полипептид легкой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 24.

9. Выделенное IL-17-связывающее антитело по п.1, которое представлено антигенсвязывающим фрагментом антитела или конъюгатом антитела.

10. Выделенное IL-17-связывающее антитело по п.1, которое представлено антителом человека, антителом не человека или химерным антителом.

11. Выделенное IL-17-связывающее антитело по п.9, где фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из F(ab′)2, Fab′, Fab, Fv, scFv, dsFv, dAb и одноцепочечного связывающего полипептида.

12. Вектор экспрессии антитела к IL-17, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую выделенное IL-17-связывающее антитело по любому из пп.1-11.

13. Композиция, содержащая терапевтически эффективное количество выделенного IL-17-связывающего антитела по любому из пп.1-11 или вектора по п.12 и фармацевтически приемлемый носитель, где композиция является эффективной для снижения биологической активности IL-17 у субъекта.

14. Способ лечения IL-17-опосредованного заболевания у млекопитающего, включающий введение композиции по п.13 млекопитающему, имеющему IL-17-опосредованное заболевание, после чего IL-17-опосредованное заболевание лечится в млекопитающем.

15. Способ по п.14, где IL-17-опосредованное заболевание выбрано из группы, состоящей из воспаления дыхательных путей, астмы, ревматоидного артрита (RA), остеоартрита, остеопороза, эрозии костей, внутрибрюшинных абсцессов и адгезий, воспалительного нарушения пищеварительного тракта (IBD), хронического обструктивного заболевания легких (COPD), болезни Аддисона, агаммоглобулинемии, аллергической астмы, круговой (гнездной) алопеции, болезни глютеновой недостаточности (спру), болезни Шагаса, идиопатического легочного невроза, болезни Крона, язвенного колита, отторжения трансплантата (например, ренального), псориатического артрита, увеита, болезни Бехчета, некоторых типов рака, ангиогенеза, атеросклероза, рассеянного склероза (MS), системной красной волчанки, септицемии, септического или эндотоксического шока, реакции на действие аллергена, ассоциированного с Helicobacter pylori гастрита, бронхиальной астмы, анкилозирующего спондилита, волчаночного нефрита, псориаза, ишемии, системного склероза и инсульта.

16. Способ по п.14 или 15, где IL-17-связывающее антитело (a) имеет период полувыведения в млекопитающем между 5 и 28 днями, (b) связывается с IL-17 с K_D, меньшей чем или равной 1 наномолярной, и/или (c) связывается с IL-17 с K_D, меньшей чем или равной 200 пикомолярной.

17. Способ снижения активности IL-17 у млекопитающих, который включает введение композиции по п.13 в клетку млекопитающего, после чего антитела, связывающие IL-17, связываются с IL-17 в клетках млекопитающих и снижают биологическую активность IL-17.

18. Способ по п.17, где клетки млекопитающих находятся в млекопитающем и композицию по п.13 вводят в млекопитающее.