СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЦИРКОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СВИНЕЙ ВТОРОГО ТИПА ПРЯМЫМ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИМ АНАЛИЗОМ НА ОСНОВАНИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/53 

Данное изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях, для диагностики заболеваний, в том числе цирковирусной болезни свиней 2 типа с выявлением антигена возбудителя в инфицированных клетках системы фагоцитирующих мононуклеаров при иммуногистохимическом исследовании криотомных срезов подвздошных лимфатических узлов и легких, на основе моноклональных антител.

Уровень техники

Для диагностики цирковирусной болезни свиней 2 типа (ЦВС-2) применяют множество современных, лабораторных методов направленных на определение присутствия вирусного агента в организме и выделение антител против вируса. Для осуществления данных исследований применяют следующие методики: полимеразную цепную реакцию (ПНР), в том числе в реальном времени (РТ ПЦР), позволяющую выявить РНК вируса и многократно размножить ее, данный метод не дает количественных данных о наличии возбудителя в организме; флюоресцентную гибридизацию in situ, которая применяется на гистологических срезах и требует множество дорогостоящих компонентов для диагностики; иммуноферментный анализ (ИФА) сывороток крови для определения специфических антител к цирковирусу свиней 2 типа (ЦВС-2), в результате данного анализа выявляются только антитела к возбудителю ЦВС-2, но не определяет само наличие вируса; реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), которая применяется на культуре монослоя культивируемых клеток с последующим их заражением и применением антител с флюоресцнтной меткой [Luo W, Ge М, Jiang D, Li R, Zhao W, Chen G, Yang X, Yu X. Development and application of a double-antigen sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to porcine circovirus 2// Clin Vaccine Immunol. 2012. Vol. 19(9). P. 1480-1486.; Liu C, Liu Y, Chen H, Feng H, Chen Y, Wang Y, Wang J, Liu D, Deng R, Zhang G. Genetic and immunogenicity analysis of porcine circovirus type 2 strains isolated in central China // Arch Virol. 2018. P. 1-10.; S. Krakowka, J.A. Ellis, F. Mcneilly, S. Ringler, D.M. Rings, G. Allan Activation of the Immune System is the Pivotal Event in the Production of Wasting Disease in Pigs Infected with Porcine Circovirus-2 (PCV-2) // Vet Pathol. 2001. Vol. 38. P. 31-42.; Стаффорд В.В. Патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят, экспериментально зараженных вирусом репродуктивно-респираторного синдрома и цирковирусом свиней типа 2/ Стаффорд В.В., Забережный А.Д., Гулюкин М.И. // Ветеринария №9, 2016, стр. 24-27.].

На территории Российской Федерации, для диагностики заболеваний вызываемых цирковирусом свиней 2 типа, используют ПЦР, ИФА и иммуноцитохимическое исследование [Раев С.А. Получение рекомбинантного капсидного белка цирковируса свиней второго типа (генотип 2b) в бакуловирусной системе и использование его для изготовления вакцины / Раев С.А., Алексеев К.П., Шемельков Е.В., Булгаков А.Д., Мусиенко М.И., Орлянкин Б.Г., Верховский О.А., Алипер Т.И. // РВЖ СХЖ. - 2012. - №3. - С. 17-19; Стаффорд В.В. Патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят, экспериментально зараженных вирусом репродуктивно-респираторного синдрома и цирковирусом свиней типа 2/ Стаффорд В.В., Забережный А.Д., Гулюкин М.И. // Ветеринария №9, 2016, стр. 24-27.]. А также, используют антитела для диагностики цирковируса свиней 2 типа в сэндвич-ИФА. Для применения данного метода используется сыворотка крови животного, в которой ищут антиген к цирковирусу 2 типа, или используют суспензию лимфатического узла животного подозреваемого на заболевание. [Козлов А.Ю. Получение моноклональных антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) и их применение для диагностики цирковирусной инфекции / А.Ю. Козлов, кандидат биологических наук, Л.В. Костина, кандидат биологических наук, К.П. Алексеев, кандидат биологических наук, М.А. Арутюнова, Ю.О. Терехова, В.В. Цибезов, кандидат биологических наук. Т.И. Алипер, доктор биологических наук, О.А. Верховский // РВЖ СХЖ. - 2013. - №2. - С. 20-22]. Данный метод также не дает понимания о диссеминации вируса в организме животного. Это прототип.

Наличие антигена в сыворотке крове не всегда говорит о наличии вируса, таким образом, технической проблемой является необходимость создания действенного способа диагностики цирковируса свиней 2 типа, для определения вирусного антигена в тканях и органах свиней, легко выполняемого в гистологических лабораториях, без использования дорогой, специализированной аппаратуры и расходных материалов.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является точное выявление антигена к вирусу ЦВС-2 в моноцитарных клетках органов свиней при помощи моноклональных антител меченных пероксидазой хрена. Данный способ позволяет точно выявить вирус ЦВС-2 в организме свиней и определить его количественные показатели, что способствует точной дифференциальной диагностике заболеваний. Данный способ прост и менее затратен.

Предложенный способ заключается в следующем.

Для выполнения ИГХ исследования гистологических срезов из органов свиней использовали мышиные моноклональные антитела (6h12) к рекомбинантному белку С вируса ЦВС 2 типа, меченные пероксидазой хрена. Данные МАТ были получены в Научно-исследовательском институте диагностики и профилактики болезней человека и животных.

Получение и характеристика МАТ. Для иммунизации мышей линии BALB/c использовали лизат клеток Sf-21, содержащий рекомбинантный белок С. Мышей иммунизировали трехкратно с интервалом 2 недели, по 500 мкг белка на мышь в смеси с адъювантом Фрейнда. Начиная со второй иммунизации сыворотки мышей тестировали методом непрямого ИФА на наличие специфических антител, используя в качестве антигена белок С, очищенный методом металлоаффинной хроматографии. Гибридомные клеточные линии получали путем слияния спленоцитов мыши с перевиваемой клеточной линией миеломы Sp2/0-Ag14. Первичный скрининг гибридом проводили на основе результатов непрямого ИФА с использованием в качестве антигена очищенного белка С. Позитивные гибридомы реклонировали и наращивали в культуральных флаконах, увеличивая объем. Асцитные жидкости, содержащие МКА, получали после введения гибридомных клеток в брюшную полость праймированных пристаном мышей линии BALB/c. Очистку МКА из асцитных жидкостей осуществляли методом аффинной хроматографии с использованием Белок-А-агарозы («Sigma», США) по протоколу фирмы-изготовителя. Субклассы МКА определяли посредством ИФА с помощью набора «Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit» («Sigma», США). Конъюгат МКА с пероксидазой хрена получали периодатным методом. Иммунохимическую специфичность антител выявляли посредством иммуноблоттинга. [Козлов А.Ю. Получение моноклональных антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) и их применение для диагностики цирковирусной инфекции / А.Ю. Козлов, кандидат биологических наук, Л.В. Костина, кандидат биологических наук, К.П. Алексеев, кандидат биологических наук, М.А. Арутюнова, Ю.О. Терехова, В.В. Цибезов, кандидат биологических наук. Т.И. Алипер, доктор биологических наук, О.А. Верховский // РВЖ СХЖ. - 2013. - №2. - С. 20-22].

Выполнение ИГХИ с полученными МАТ к рекомбинантному белку С ЦВС-2:

В качестве патологического материала, для проведения исследования, от павших животных брали подвздошные лимфатические узлы, легкое. Дополнительно отбирали почку, печень, селезенку и миокард для определения тропности вируса. Образцы, размером 0,5×0,5×1,0 см, помещали в морозильную камеру при -15°C с предварительной выдержкой образцов органов в холодильной камере при +2°С в течение 6 часов. Для более длительного хранения материала рекомендуется использовать низкотемпературные холодильные камеры с температурой -70°С.

Далее образцы органов размещали на предметных столиках криостата при помощи криогеля Neg-50 и замораживали в камере криотома при температуре -35°С. Затем нарезали блоки толщиной 5 микрон и наклеивали на предметные стекла с поляризационным покрытием. После этого, срезы помещали в смесь изопропилового спирта 30 мл и физиологического раствора 70 мл, при +4°С - 60 минут. Затем ополаскивали в фосфатносолевом буфере (ФСБ) рН 7,6 3 раза по 3-5 минут при комнатной температуре (22°С). Для удаления эндогенной пероксидазы на срезы наносили 3% раствор перекиси водорода и помещали в термостат при +37°С на 40 минут. Затем ополаскивали в ФСБ рН 7,6 3 раза по 3-5 минут при комнатной температуре. Для предотвращения неспецифического связывания готовили блокирующий 5% раствор обезжиренного сухого молока в ФСБ рН 7,6 и инкубируют при 37°С, 40 минут. После инкубации ополаскивали в ФСБ рН 7,6 3 раза по 3-5 минут при комнатной температуре. Пока идет процесс ополаскивания, готовили раствор рабочей концентрации антител меченых пероксидазой хрена 6h12 к рекомбинантному белку С вируса ЦВС-2. Рабочий раствор антител готовили на ФСБ рН 7,6. Данный раствор подбирается опытным путем в соответствии с чувствительностью антител. Обычно разведение антител составляет от 1:200 до 1:400. На стекла наносили по 200 мкл рабочего разведения антител и помещали в термостат во влажную камеру при 37°С на 80 минут. Промывали в ФСБ рН 7,6 3 раза по 3-5 минут при комнатной температуре. Во время инкубации срезов с антителами, для специфического окрашивания пероксидазной метки, перед использованием готовили рабочий раствор субстрата на Na-фосфатном буфере рН 5,0. Рабочий раствор готовится непосредственно перед работой, годен 12 час. Маточный раствор хранится при +4°С в течении 3 месяцев.

Маточный раствор: 0,02 г 3-амино-9-этилкарбазола растворяют в 3 мл диметилформамида. Работу необходимо выполнять в перчатках и в вытяжном шкафу. Необходимо помнить, что данный раствор обладает канцерогенными свойствами.

Рабочий раствор готовят на 0,02 М Na-фосфатном буфере, рН 5,0-5 мл, с добавлением 300 мкл маточного раствора и 1 мкл 3% раствора перекиси водорода.

Рабочий раствор наносят на срезы в количестве 200 мкл, стекла помещали во влажную камеру в термостат при 37°С на 30 минут. По истечении времени инкубации, для остановки реакции, срезы аккуратно промывают в 3 этапа, каждый по 3-5 минут: 1 раз в дистиллированной воде, последующие 2 раза в ФСБ рН 7,6. После этого для дифференциальной окраски и лучшей визуализации клеточных элементов на срезы наносили гематоксилин Майера на 5-10 минут. Срезы помещали в дистиллированную воду для проявления гематоксилина, и затем наносили монтирующую альбуминовую среду и закрывают покровным стеклом.

Приведенный способ рассчитан на проведение иммуногистохимического анализа криотомных срезов подвздошных лимфатических узлов, легких и других органов с применением моноклональных антител меченых пероксидазой хрена 6h12 к ЦВС-2. Обнаружение антигена вирусного агента осуществляется на цитоплазме свободных макрофагов подвздошных лимфатических узлов, легких с окрашиванием метки пероксидазы хрена, которое характеризуется образованием конгломератов буро-коричневого оттенка. Окраску гематоксилином Майера в ИГХИ проводят для дифференциации клеток, четкости визуализации ядер мононуклеарной системы лимфатических узлов, легкого и других органов.

Вышеуказанный способ позволяет с точностью выявлять антигены ЦВС-2 и дифференцировать их от патологических агентов, схожих по симптомокомплексу заболеваний, так как обладает высокой специфичностью и чувствительностью к цирковирусу свиней второго типа. Результаты положительного диагноза на ЦВС-2 представлены на фиг. 1 и фиг. 2.

Сектор патоморфологии ФГБНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко успешно занимался испытанием предложенного способа в 2017 году, подтверждая, что данный способ исследования может быть рекомендован для применения в ветеринарных лабораториях и научно-исследовательских учреждениях.

Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами:

При выполнении ИГХ реакции брали патологический материал из легкого и подвздошного лимфатического узла. Выполнили криотомию, и на полученных срезах органов выполнили ИГХ реакцию описанную выше. При положительном диагнозе на ЦВС-2 была получена картинка, представленная на фигурах 1 и 2, откуда видно буро-коричневое окрашивание на клетках в исследуемых органах. В случае отрицательного результата на заболевание данного окрашивания не было, пример представлен на фигурах 3 и 4.

Учет результатов прилагается.

Список литературы:

1. Козлов А.Ю. Получение моноклональных антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) и их применение для диагностики цирковирусной инфекции / А.Ю. Козлов, кандидат биологических наук, Л.В. Костина, кандидат биологических наук, К.П. Алексеев, кандидат биологических наук, М.А. Арутюнова, Ю.О. Терехова, В.В. Цибезов, кандидат биологических наук. Т.Н. Алипер, доктор биологических наук, О.А. Верховский // РВЖ СХЖ. - 2013. - №2. - С. 20-22.

2. Раев С.А. Получение рекомбинантного капсидного белка цирковируса свиней второго типа (генотип 2b) в бакуловирусной системе и использование его для изготовления вакцины / Раев С.А., Алексеев К.П., Шемельков Е.В., Булгаков А.Д., Мусиенко М.И., Орлянкин Б.Г., Верховский О.А., Алипер Т.И. // РВЖ СХЖ. - 2012. - №3. - С. 17-19

3. Стаффорд В.В. Патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят, экспериментально зараженных вирусом репродуктивно-респираторного синдрома и цирковирусом свиней типа 2/ Стаффорд В.В., Забережный А.Д., Гулюкин М.И. // Ветеринария №9, 2016, стр. 24-27.

4. S. Krakowka, J.A. Ellis, F. Mcneilly, S. Ringler, D.M. Rings, G. Allan Activation of the Immune System is the Pivotal Event in the Production of Wasting Disease in Pigs Infected with Porcine Circovirus-2 (PCV-2) // Vet Pathol. 2001. Vol. 38. P. 31-42.

5. Luo W, Ge M, Jiang D, Li R, Zhao W, Chen G, Yang X, Yu X. Development and application of a double-antigen sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to porcine circovirus 2// Clin Vaccine Immunol. 2012. Vol. 19(9). P. 1480-1486.

6. Liu C, Liu Y, Chen H, Feng H, Chen Y, Wang Y, Wang J, Liu D, Deng R, Zhang G. Genetic and immunogenicity analysis of porcine circovirus type 2 strains isolated in central China // Arch Virol. 2018. P. 1-10.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 Препарат легкого с докраской ядер клеток гематоксилином Майера. Стрелочки указывают на скопления конгломератов буро-коричневого цвета.

Фиг. 2 Препарат подвздошного лимфатического узла, с докраской клеток гематоксилином Майера. Стрелочки указывают на скопления конгломератов буро-коричневого цвета.

Фиг. 3 Отрицательный результат на препарате без докраски ядер

Фиг. 4 Отрицательный результат на препарате с докраской ядер.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для диагностики цирковирусной болезни свиней 2 типа. Способ включает исследование биологического материала, где в качестве исследуемого объекта используют органы свиней, нарезанные в криотоме, на наличие антигена ЦВС-2 прямым иммуногистохимическим методом. Используют моноклональные антитела с меткой пероксидазы хрена клона 6h12, специфичные к рекомбинантному белку С вируса ЦВС второго типа, с последующим специфическим окрашиванием и выявлением конгломератов буро-коричневого цвета. Использование данного способа позволяет диагностировать цирковирусную болезнь свиней 2 типа в органах свиней на основании моноклональных антител 6h12 к рекомбинантному белку С вируса ЦВС-2 для идентификации антигена данного вируса. 4 ил.

Способ диагностики цирковирусной инфекции свиней второго типа прямым иммуногистохимическим анализом на основании моноклональных антител, включающий исследование биологического материала, отличающийся тем, что в качестве исследуемого объекта используются органы свиней, нарезанные в криотоме, и исследуются на наличие антигена ЦВС-2 прямым иммуногистохимическим способом, используя моноклональные антитела с меткой пероксидазы хрена клона 6h12, специфичные к рекомбинантному белку С вируса ЦВС второго типа, с последующим специфическим окрашиванием и выявлением конгломератов буро-коричневого цвета.