ЦИКЛИЧЕСКИЕ АНАЛОГИ АПЕЛИНА Российский патент 2019 года по МПК C07K7/54 C07K7/08 C07K14/47 A61K38/12 A61P3/00 A61P9/00 A61P25/00 

Настоящее изобретение относится к области фармакологии. В частности, оно относится к новым аналогам апелина и к их терапевтическим применениям.

Ген апелина кодирует препробелок из 77 аминокислот, который подвергается процессингу с образованием биологически активных пептидов, состоящих из 36, 17 или 13 аминокислот (соответственно апелин-36, апелин-17 и апелин-13). Двумя основными изоформами являются апелин-13 и апелин 36.

Рецептор апелина, APJ, представляет собой сопряженный с G-белком рецептор (GPCR). Обычная стимулируемая апелином APJ сигнализация включает в себя активацию G-белков (Gi или Go), чувствительных к коклюшному токсину, приводящую в результате к снижению выработки сАМР, а также активации фосфолипазы С, протеинкиназы С и регулируемых внеклеточными сигналами киназ 1 и 2. См. O'Carroll et al. (J. of Endocrinology (2013) 219, R13-R35) недавний обзор по активации апелиновой сигнализации. В дополнение к этому, стимулирование APJ апелином приводит к накоплению β-аррестинов (Lee et al. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 395: 185-189). Как рассмотрено в работе Ma и Pei (J. Cell Science (2007) 120, 213-218), аррестины образуют группу каркасных белков, которые не только регулируют рецепторную десенсибилизацию и интернализацию, но также активируют альтернативные G-белок-независимые сигнальные пути после GPCR. Например, в ответ на активацию некоторых GPCR (3-аррестины перемещаются из цитоплазмы в ядро и ассоциируются с кофакторами транскрипции, такими как p300 и белок, связывающийся с сАМР-ответным элементом (CREB), на промоторах генов-мишеней для активации транскрипции. Также они взаимодействуют с регуляторами факторов транскрипции, такими как и MDM2, в цитоплазме и опосредованно регулируют транскрипцию. Данная опосредованная β-аррестином регуляция транскрипции, по-видимому, играет важную роль в клеточном росте, апоптозе и модуляции иммунных функций.

Апелин и APJ характеризуются высоким уровнем экспрессии в гомогенатах из органов животных с такой же закономерностью, как у рецептора ангиотензиногена и ангиотензина. Апелин широко распространен в CNS и на периферии, особенно в сердце, почке, легком и молочных железах. Апелин-подобная иммунореактивность была выявлена в адипоцитах, слизистой оболочке желудка, эндотелии и клетках Купфера в печени.

Апелин-13 представляет собой эндогенный лиганд рецептора APJ, активирующий данный сопряженный с G-белком рецептор, со значением ЕС50, составляющим 0,37 нМ (значения ЕС50 для апелина-17 и апелина-36 составляют соответственно 2,5 и 20 нМ). Он действует преимущественно в периферической и центральной нервной системе, играя важные роли в регулировании сердечно-сосудистой функции, гомеостазе жидкостей, гипертензии и чувствительности к инсулину. В отличие от апелина-36, апелин-13 слабо блокирует проникновение вируса иммунодефицита человека в клетки.

Связывание апелина-13 и 36 с APJ ингибирует индуцированную форсколином выработку сАМР и опосредует Ras-независимую активацию внеклеточно регулируемых киназ (ERK). Связывание как апелина-13, так и апелина-36 приводит к интернализации APJ, который повторно возвращается на внешнюю поверхность клетки (Zhou, N et al., 2003 APJ. Virology 307, 22-36).

Экзогенное введение апелина изменяет сердечно-сосудистую функцию, давление крови, температуру тела, жидкость организма и варианты поведения, связанные с приемом пищи и поглощением воды. Ряд сердечно-сосудистых заболеваний человека сопровождаются изменениями уровня экспрессии апелина и/или APJ в тканях сердечно-сосудистой системы. При исследованиях на животных апелин оказывает вазодилатационные и положительные ионотропные действия. Апелин активирует эндотелиальную синтазу оксида азота и вследствие этого стимулирует высвобождение оксида азота из васкулярных эндотелиальных клеток. Также апелин улучшает прогноз в отношении функции сердца при патологическом состоянии, таком как экспериментальная ишемия и реперфузионное повреждение (Lee, D.K., George, S.R. and O'Dowd, В.F. (2006) Trends in Pharmacological Sciences 27, 190-194). Однако такие сердечно-сосудистые эффекты являются краткосрочными в связи с коротким периодом циркулирования апелинового пептида.

В уровне техники известны попытки увеличить период полужизни апелинов. Например, в WO 2012/125408 раскрывается пегилированный апелин, который содержит одну или несколько молекул полиэтиленгликоля (PEG), функционально связанных по меньшей мере с одним аминокислотным остатком на N-конце апелина. Было обнаружено, что пегилированный апелин характеризуется пролонгированным периодом циркулирования и ионотропным эффектом по сравнению с непегилированным апелином. Другой подход в увеличении периода полужизни апелинов предусматривает создание циклических вариантов. Например, были получены большие циклические варианты (1-12, 1-7 и 7-12) апелина-12, которые демонстрировали дозозависимые ингибирующие эффекты в отношении индуцированного форсколином накопления циклического аденозинмонофосфата (сАМР), и максимальные эффекты практически устранялись при обработке коклюшным токсином (РТх) (Hamada, J. (2008) International Journal of Molecular Medicine. 22, 547-552). Однако все циклические аналоги характеризовались уменьшенной на несколько порядков активностью по сравнению с pE-апелин-13.

В WO 2013/111110 раскрываются синтетические миметики апелина для лечения сердечной недостаточности. Варианты включают циклические структуры, где боковые цепи аминокислот связаны вместе с помощью либо моносульфидной, либо дисульфидной, либо амидной связи.

Соответственно существует необходимость в улучшенных аналогах апелина с тем, чтобы улучшить их период циркулирования и другие полезные характеристики. В частности, было бы желательным, чтобы аналог имел увеличенный период полужизни в сочетании с отличающейся биологической активностью, например такой, чтобы его можно было применять для избирательной модуляции различных путей, активируемых через посредство рецептора APJ. Например, было бы интересно получить аналоги, для которых бы наблюдалась существенная (агонистическая) сигнализация посредством сАМР-активности, но которые были бы менее активными, чем эндогенные агонисты, при индуцировании накопления β-аррестина, интернализации и/или даун-регуляции рецептора APJ с тем, чтобы усилить биологическую активность. И наоборот, ввиду опосредованной β-аррестином регуляции транскрипции и его роли в клеточном росте, апоптозе и модуляции иммунных функций, варианты, которые являются более активными стимулами накопления аррестина, также являются представляющими интерес агонистами смещенной активности. В частности эффекты, оказываемые на накопление бета-аррестина и стимуляцию Gi/0, могут приводить к другим эффектам и/или эффектам с другими кинетическими свойствами в клетке. По-видимому, аррестин не действует через посредство Akt пути, поскольку действует Gi/0. По-видимому, активация зависимого от G-белка ERK является быстрой и временной и может быть заблокирована с помощью коклюшного токсина или ингибиторов РКА. В отличие от этого, активация зависимого от бета-аррестина ERK является более медленной в проявлении и более длительной по времени, а также она является чувствительной к истощению бета-аррестинов, но не к ингибированию Gi/PKA или снижению Gs (Lan Ma 2006). Стимуляция MAPK посредством Gi/0 и аррестин-поддерживающие эффекты в отношении MAPK влияют на распределение ERK в цитоплазме/ядре иным образом, с последствиями для дальнейшей судьбы клетки.

Неожиданно было обнаружено, что по меньшей мере несколько из вышеуказанных целей достигаются с помощью новых циклических соединений апелина, которые характеризуются тиоэфирным мостиком, охватывающим 2, 3, 4 или 5 аминокислотных остатков, с образованием на выходе пространственно ограниченного полипептида, обладающего биологической активностью. Например, внесение тиоэфирного мостика в апелин приводило к 2-8-кратному повышению стабильности в плазме при сохранении сигнальной активности. Кроме того, был выявлен ряд представляющих интерес вариантов, которые демонстрируют либо значительное повышение, либо ухудшение сигнализации посредством сАМР в отношении аррестина, по сравнению с нативным апелином.

Соответственно настоящее изобретение обеспечивает

аналог апелина, состоящий из полипептида общей формулы Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14, содержащего один лантиониновый мостик структуры Ala-S-Ala или один метиллантиониновый мостик структуры Abu-S-Ala или Ala-S-Abu, где

X1 представляет собой N-конец полипептида и либо отсутствует, либо представляет собой Lys-Phe-Arg-Arg;

Х2 либо отсутствует, либо выбран из pGlu, Gln и Ala;

X3 представляет собой Arg или Ala;

Х4 представляет собой Pro, Ala, Pro-(me)Lan, Pro-Dhb, Ala-Dhb или Ala-(me)Lan;

X5 представляет собой Arg, Ala, (me)Lan, Dhb, Arg-(me)Lan, Arg-Dhb, Ala-Dhb или Ala-(me)Lan;

X6 представляет собой Leu, Ala, (me)Lan, Dhb, Leu-(me)Lan, Leu-Dhb, Ala-Dhb или Ala-(me)Lan;

X7 представляет собой Ala, (me)Lan, Dhb, Ala-(me)Lan, Ala-Dhb, Dhb-Ala или (me)Lan-Ala;

X8 представляет собой His, Ala, (me)Lan, Dhb, His-(me)Lan, His-Dhb, Ala-Dhb или Ala-(me)Lan;

X9 представляет собой Lys, Ala, (me)Lan, Dhb, Lys-(me)Lan, Lys-Dhb, Ala-Dhb или Ala-(me)Lan;

X10 представляет собой Gly, Ala, (me)Lan, Dhb, Ala-Dhb или Ala-(me)Lan;

X11 представляет собой Pro, Ala, (me)Lan, Pro-Lan или Ala-(me)Lan;

X12 представляет собой Met, Ala, (me)Lan, Met-(me)Lan или Ala-(me)Lan;

X13 либо отсутствует, либо выбран из Pro, Dhb, (me)Lan, Pro-(me)Lan и Ala-(me)Lan;

X14 представляет собой C-конец и либо отсутствует, либо выбран из Phe и Ala в том случае, если Х13 не отсутствует;

в которой Dhb означает дегидробутирин;

(me)Lan означает Lan или meLan, где Lan обозначает N- или C-концевую половину лантионина (Ala-S-Ala), a meLan обозначает N- или C-концевую половину метиллантионина (Abu-S-Ala или Ala-S-Abu);

при условии, что:

(i) аналог содержит до двух остатков Ala;

(ii) последовательность от Х4 до Х13 содержит одну пару meLan или одну пару Lan, которые вместе образуют (метил)лантиониновый)мостик; а также

(iii) где указанный (метил)лантиониновый мостик имеет размер i, i+3; i, i+4, i, i+5 или i, i+6, предпочтительно i, i+3 или i, i+4; где "i" обозначает остаток (например X4) N-концевой аминокислоты, вовлеченной в образование тиоэфирного мостика, и где ‘‘i+…’’обозначает остаток (например Х7 в случае i+3) C-концевой аминокислоты, вовлеченной в образование тиоэфирного мостика;

или его амид, сложный эфир или соль.

В одном варианте осуществления

X1 представляет собой N-конец полипептида и либо отсутствует, либо представляет собой Lys-Phe-Arg-Arg;

Х2 либо отсутствует, либо выбран из pGlu, Gln и Ala;

X3 представляет собой Arg или Ala;

Х4 представляет собой Pro, Ala, Pro-(me)Lan или Ala-(me)Lan;

Х5 представляет собой Arg, Ala, (me)Lan, Arg-(me)Lan или Ala-(me)Lan;

X6 представляет собой Leu, Ala, (me)Lan, Leu-(me)Lan или Ala-(me)Lan;

X7 представляет собой Ala, (me)Lan, Ala-(me)Lan или (me)Lan-Ala;

X8 представляет собой His, Ala, (me)Lan, His-(me)Lan или Ala-(me)Lan;

X9 представляет собой Lys, Ala, (me)Lan, Lys-(me)Lan или Ala-(me)Lan;

X10 представляет собой Gly, Ala, (me)Lan или Ala-(me)Lan;

X11 представляет собой Pro, Ala, (me)Lan, Pro-Lan или Ala-(me)Lan;

X12 представляет собой Met, Ala, (me)Lan, Met-(me)Lan или Ala-(me)Lan;

X13 либо отсутствует, либо выбран из Pro, (me)Lan, Pro-(me)Lan и Ala-(me)Lan;

X14 представляет собой C-конец и либо отсутствует, либо выбран из Phe и Ala в том случае, если X13 не отсутствует,

в котором (me)Lan означает Lan или meLan, где Lan обозначает N- или C-концевую половину лантионина (Ala-S-Ala), а meLan обозначает N- или C-концевую половину метиллантионина (Abu-S-Ala или Ala-S-Abu);

при условии, что:

(i) полипептид содержит до двух остатков Ala;

(ii) последовательность от Х4 до Х13 содержит либо одну пару meLan, которая совместно образует метиллантиониновый мостик или одну пару Lan, которые совместно образуют лантиониновый мостик; и

(iii) указанный (метил)лантиониновый мостик имеет размер i, i+3; i, i+4 i, i+5 или i, i+6, где "i" обозначает остаток (например X4) N-концевой аминокислоты, вовлеченной в образование тиоэфирного мостика, и где ‘‘i+…’’ обозначает остаток (например Х7 в случае i+3) C-концевой аминокислоты, вовлеченной в образование тиоэфирного мостика. Иными словами, размер i, i+3; i, i+4 i, i+5 или i, i+6 означает, что он составляет либо два, три, четыре, либо пять остатков под кольцом.

Было обнаружено, что структура (метил)лантионинового мостика с размером i, i+1 обеспечивает незначительную протеолитическую защиту, в то время как мостик i, i+2 является сложным для получения. i, i+5 и i, i+6 являются менее идеальным субстратом для циклазной активности, однако придает лучшую протеолитическую устойчивость. В предпочтительном варианте осуществления указанный (метил)лантиониновый мостик имеет размер i, i+3 или i, i+4 так, чтобы было либо два, либо три остатка под кольцом.

Настоящее изобретение относится к (метил)лантиониновым вариантам апелина, в которых тиоэфирный мостик образован с помощью либо (i) замены двух аминокислот из естественной последовательности; (ii) замены одной аминокислоты из естественной последовательности и вставки одной аминокислоты либо на N-, либо на C-концевой стороне замены; либо (iii) двух вставленных аминокислот.

Вариант, содержащий лантионин, характеризуется структурой Ala-S-Ala, которая образована двумя фрагментами "Lan", присутствующими (в результате либо замены, либо вставки) в интервале Х4-Х13. Вариант, содержащий лантионин, характеризуется структурой Abu-S-Ala или Ala-S-Abu, которая образована двумя фрагментами "meLan", присутствующими (в результате либо замены, либо вставки) в интервале Х4-Х13. Таким образом, маркировка пары Lan или пары meLan, включенной в Х4-Х13, относится к итоговой, циклизированной структуре. С точки зрения биосинтеза, остатки Lan и meLan являются производными от остатков цистеина, серина и треонина. Сначала выбранные остатки серина и треонина ферментативно дегидратируются с образованием соответственно остатков дегидроаланина (Dha) и дегидробутирина (Dhb). Затем нуклеофильное присоединение цистеинтиола на остаток Dha или Dhb по принципу Михаэля образует соответственно остаток Lan или MeLan. Данные модификации образуют ковалентную связь между цистеинтиолом и β-углеродом другого остатка, образуя таким путем тиоэфирный мостик. В частности, структура Ala-S-Ala может быть производной от Dha и Cys, где Cys может быть в N- или C-концевом положении относительно Dha. Структура Abu-S-Ala или Ala-S-Abu является производной от Dhb и Cys или Cys и Dhb соответственно.

В US 2013/0196899 описываются синтетические циклические аналоги апелина и способы их получения. Кольца аналогов из US 2013/0196899 сформированы аминокислотами, образующими дисульфидную или амидную связь посредством соответственно их боковой цепи или конца. Однако дисульфиды и амидные связи являются химически менее стабильными, чем тиоэфирные связи. Кроме того, при образовании лантионина определенную роль играет стереохимия, делая полученную в результате пептидную структуру более определенной и более специфичной к рецептору. Также тиоэфирные мостики в лантионинах являются более короткими мостиками, чем дисульфидные мостики и чем амидные поперечные связи. В результате лантионины создают структуры, которые отличаются от созданных с помощью дисульфидов и/или амидных поперечных связей.

У Hamada et al. (2008, Int. J. of Mol. Med. 22: 547-552) раскрывается синтез циклических аналогов фрагмента апелина RPRLSHKGPMPF (апелин-12), где N-конец соединен с C-концом или где боковая цепь Lys в позиции 7 образует кольцо либо с N-, либо с C-концевым остатком. В данном случае также встречаются цикломочевинные связи, которые являются менее стабильными, чем тиоэфирные мостики. В дополнение к этому, варианты Hamada et al. не имеют свободного N- и/или свободного C-конца.

В аналоге полипептида по настоящему изобретению каждый от X1 до Х14 должен быть выбран из группы отобранных вариантов.

X1 обозначает N-конец полипептида и либо отсутствует, либо представляет собой Lys-Phe-Arg-Arg. В одном предпочтительном аспекте X1 отсутствует.

Х2 либо отсутствует, либо выбран из pGlu, Gln и Ala. Предпочтительно X1 отсутствует, а Х2 представляет собой Glu или pGlu (пироглутамат). В конкретном аспекте X1 представляет собой pGlu. Внесение пироглутамата на N-конец может защитить аналог от N-концевого гидролиза. Пироглутаминовая кислота (также известная как PC А, 5-оксопролин, пидоловая кислота или пироглутамат для ее основной формы) представляет собой редко встречающееся производное аминокислоты, в котором свободная аминогруппа глутаминовой кислоты или глутамин циклизируется с образованием лактама. Она представляет собой метаболит в глутатионовом цикле, который преобразовывается до глутамата с помощью 5-оксопролиназы. Пироглутамат встречается во многих белках, включая бактериородопсин. N-концевая глутаминовая кислота и остатки глутамина могут спонтанно циклизироваться с образованием пироглутамата.

X3 представляет собой основный аминокислотный остаток, выбранный из Arg и Ala, из которых Arg является предпочтительным.

Х4 выбран из группы, состоящей из Pro, Ala, Pro-(me)Lan, Pro-Dhb, Ala-Dhb или Ala-(me)Lan; например Pro, Ala, Pro-(me)Lan или Ala-(me)Lan. В одном варианте осуществления Х4 представляет собой Pro или Ala, из которых Pro является предпочтительным. В другом аспекте Х4 вовлечен в образование тиоэфирного мостика и выбран из Pro-(me)Lan и Ala-(me)Lan. Х4 может представлять собой Pro-Lan или Ala-Lan, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком Lan, представляет собой лантионин структуры Ala-S-Ala. В качестве альтернативы Х4 представляет собой Pro-meLan или Ala-meLan, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком meLan (например (me)Lan, His-(me)Lan или Ala-(me)Lan в позиции Х8), представляет собой метиллантионин структуры Abu-S-Ala или Ala-S-Abu.

Х5 представляет собой Arg, Ala, (me)Lan, Dhb, Arg-(me)Lan, Arg-Dhb, Ala-Dhb или Ala-(me)Lan; например X5 представляет собой Arg, Ala, (me)Lan, Arg-(me)Lan или Ala-(me)Lan. Предпочтительно X5 представляет собой Arg или Ala, из которых Arg является предпочтительным. В другом аспекте Х5 вовлечен в образование тиоэфирного мостика и выбран из (me)Lan, Arg-(me)Lan и Ala-(me)Lan. Х5 может представлять собой Lan, Arg-Lan или Ala-Lan, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком Lan (например Lan, Lys-Lan или Ala-Lan в позиции Х9), представляет собой лантионин структуры Ala-S-Ala. В качестве альтернативы Х5 представляет собой meLan, Arg-meLan или Ala-meLan, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком meLan, представляет собой метиллантионин структуры Abu-S-Ala или Ala-S-Abu.

Х6 выбран из группы, состоящей из Leu, Ala, (me)Lan, Dhb, Leu-(me)Lan, Leu-Dhb, Ala-Dhb и Ala-(me)Lan. Например X6 представляет собой Leu, Ala, (me)Lan, Leu-(me)Lan или Ala-(me)Lan. Предпочтительно X6 представляет собой Leu или Ala, из которых Leu является предпочтительным. В другом аспекте Х6 вовлечен в образование тиоэфирного мостика и выбран из (me)Lan, Leu-(me)Lan и Ala-(me)Lan. Х6 может представлять собой Lan, Leu-Lan или Ala-Lan, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком Lan (например Lan или Ala-Lan в позиции X10), представляет собой лантионин структуры Ala-S-Ala. В качестве альтернативы Х6 представляет собой meLan, Leu-meLan или Ala-meLan, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком meLan, представляет собой метиллантионин структуры Abu-S-Ala или Ala-S-Abu.

Х7 выбран из группы, состоящей из Ala, (me)Lan, Dhb, Ala-(me)Lan, Ala-Dhb, Dhb-Ala и (me)Lan-Ala. Например X7 представляет собой Ala, (me)Lan, Ala-(me)Lan или (me)Lan-Ala. Предпочтительно X7 вовлечен в образование тиоэфирного мостика и выбран из (me)Lan, Ala-(me)Lan и Ala-(me)Lan. Х7 может представлять собой Lan, Ala-Lan или Lan-Ala, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком Lan (например Lan, Pro-Lan или Ala-Lan в позиции X11), представляет собой лантионин структуры Ala-S-Ala. В качестве альтернативы Х7 представляет собой meLan, Ala-meLan или meLan-Ala, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком meLan, представляет собой метиллантионин структуры Abu-S-Ala или Ala-S-Abu. В конкретном аспекте Х7 представляет собой (me)Lan, необязательно в сочетании либо с Х9, являющимся Lys-(me)Lan, либо X10, являющимся (me)Lan или Ala-(me)Lan, X11, являющимся (me)Lan или Ala-(me)Lan, X12, являющимся (me)Lan, Met-(me)Lan или Ala-(me)Lan.

Х8 выбран из группы, состоящей из His, Ala, (me)Lan, Dhb, His-(me)Lan, His-Dhb, Ala-Dhb и Ala-(me)Lan. Например, X8 представляет собой His, Ala, (me)Lan, His-(me)Lan или Ala-(me)Lan. Предпочтительно X8 представляет собой His или Ala, из которых His является предпочтительным. В другом аспекте Х8 вовлечен в образование тиоэфирного мостика и выбран из (me)Lan, His-(me)Lan и Ala-(me)Lan. Х8 может представлять собой Lan, His-Lan или Ala-Lan, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком Lan (например Lan, Met-Lan или Ala-Lan в позиции X12), представляет собой лантионин структуры Ala-S-Ala. В качестве альтернативы Х8 представляет собой meLan, His-meLan или Ala-meLan, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком meLan, представляет собой метиллантионин структуры Abu-S-Ala или Ala-S-Abu. Х8, состоящий из His или содержащий его, является предпочтительным.

Х9 выбран из группы, состоящей из Lys, Ala, (me)Lan, Dhb, Lys-(me)Lan, Lys-Dhb, Ala-Dhb и Ala-(me)Lan. Например X9 представляет собой Lys, Ala, (me)Lan, Lys-(me)Lan или Ala-(me)Lan. Предпочтительно X9 представляет собой Lys или Ala, из которых Lys является предпочтительным. В другом аспекте Х9 вовлечен в образование тиоэфирного мостика и выбран из (me)Lan, Lys-(me)Lan и Ala-(me)Lan. Х9 может представлять собой Lan, Lys-Lan или Ala-Lan, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком Lan (например Lan, Pro-Lan или Ala-Lan в позиции X13), представляет собой лантионин структуры Ala-S-Ala. В качестве альтернативы Х9 представляет собой meLan, Lys-meLan или Ala-meLan, так что тиоэфирный мостик, образованный со вторым остатком meLan, представляет собой метиллантионин структуры Abu-S-Ala или Ala-S-Abu. Х9, состоящий из Lys или содержащий его, является предпочтительным. В конкретном аспекте Х9 представляет собой Lys-(me)Lan.

X10 выбран из группы, состоящей из Gly, Ala, (me)Lan, Dhb, Ala-Dhb и Ala-(me)Lan. Например X10 представляет собой Gly, Ala, (me)Lan или Ala-(me)Lan. В одном варианте осуществления Х10 представляет собой Gly. В другом варианте осуществления Х10 представляет собой meLan.

X11 представляет собой Pro, Ala, (me)Lan, Pro-Lan или Ala-(me)Lan. Предпочтительно X11 представляет собой Pro или (me)Lan.

X12 представляет собой Met, Ala, (me)Lan, Met-(me)Lan или Ala-(me)Lan. Предпочтительно X12 представляет собой Met.

X13 либо отсутствует, либо выбран из Pro, Dhb, (me)Lan, Pro-(me)Lan и Ala-(me)Lan. Предпочтительно X13 выбран из Pro, Dhb, (me)Lan, Pro-(me)Lan и Ala-(me)Lan, более предпочтительно из Pro и (me)Lan. В конкретном аспекте X13 представляет собой Pro. В другом конкретном аспекте X13 представляет собой Dhb.

Х14 представляет собой C-конец и либо отсутствует, либо выбран из Phe и Ala в том случае, если X13 не отсутствует. В одном варианте осуществления Х14 и X13 отсутствуют. В другом варианте осуществления Х14 представляет собой Phe или Ala, из которых Phe является предпочтительным. В конкретном аспекте пептидный вариант является амидированным на C-конце, например где Х14 представляет собой амидированный Phe (Phe-NH₂).

В конкретном варианте осуществления X1 отсутствует и последовательность Х2-Х3-Х4-Х5-Х6 представляет собой Gln-Arg-Pro-Arg-Leu или pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu. Очень хорошие результаты были получены с последовательностью Х7-Х8-Х9-Х10, представляющей собой (me)Lan-His-Lys-(me)Lan, предпочтительно meLan-His-Lys-meLan, или с последовательностью Х7-Х8-Х9-Х10, представляющей собой (me)Lan-His-Lys-(me)Lan-Gly, предпочтительно meLan-His-Lys-meLan-Gly.

В других вариантах последовательность Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 представляет собой Pro-(me)Lan-Arg-Leu-Ala-(me)Lan или Pro-Arg-(me)Lan-Arg Leu-Ala-(me)Lan.

Иллюстративные варианты включают варианты, где четыре C-концевых остатка состоят из последовательности Pro-Met-Pro-Phe и являются предпочтительными. Однако в других пригодных вариантах X14 отсутствует или представляет собой Ala, например где C-конец представляет собой Pro-Met-Pro, Pro-Met-Pro-Ala. В еще одном варианте осуществления Х11-Х12-Х13-Х14 представляет собой (me)Lan-Met-Pro-Phe.

Также охватываемыми являются амид, сложный эфир или соль указанного полипептида. Предпочтительно соль представляет собой фармацевтически приемлемую соль, такую как любая нетоксичная соль, например соль с неорганической кислотой, соль с органической кислотой, соль с неорганическим основанием, соль с органическим основанием и соль с аминокислотой. В контексте данного документа "приемлемая соль" относится к солям, которые сохраняют требуемую активность олигопептида или эквивалентного соединения, однако предпочтительно не оказывают вредного влияния на активность олигопептида или другого компонента системы, в которой применяется олигопептид. Примерами таких солей являются соли присоединения кислоты, образованные неорганическими кислотами, например соляной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и т.п. Также соли могут быть образованы органическими кислотами, такими как например уксусная кислота, трифторуксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, памовая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота и т.п. Соли могут быть образованы поливалентными катионами металлов, таких как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель и т.п., или органическим катионом, образованным из N,N'-дибензилэтилендиамина или этилендиамина или их комбинаций (например цинковая соль дубильной кислоты).

В одном варианте осуществления циклический аналог, представленный в данном документе, обладает активностью к рецептору APJ, сходной с апелином-13 или pyr-1-апелином-13. В одном варианте осуществления циклический агонист APJ по настоящему изобретению характеризуется полумаксимальной эффективной концентрацией (ЕС₅₀) менее 100 нМ при измерении ингибирования выработки сАМР и/или стимуляции угнетения накопления и/или любого другого измерения APJ-опосредованной сигнализации. В другом варианте осуществления ЕС₅₀ составляет менее 50 нМ, предпочтительно менее 25 нМ и более предпочтительно менее 15 нМ. Согласно другому конкретному варианту осуществления аналог по настоящему изобретению характеризуется ЕС₅₀ менее 10 нМ.

Аналог предпочтительно обладает стабильностью в плазме, превышающей таковую у апелина-13 или руг-1-апелина-13. В одном варианте осуществления улучшение стабильности в плазме по меньшей мере в 2 раза выше стабильности, наблюдаемой для известных апелинов. Стабильность может характеризоваться периодом полужизни (t50), периодом, в течение которого сохраняется 50% исходной ферментативной активности. В одном варианте осуществления аналог по настоящему изобретению характеризуется периодом полужизни (t50) в плазме, составляющим по меньшей мере 30 минут. В другом варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению характеризуется периодом полужизни, составляющим по меньшей мере 10 минут, предпочтительно по меньшей мере 40 мин. и более предпочтительно по меньшей мере 60 минут. В конкретном варианте осуществления t50 в плазме составляет более 1 часа, предпочтительно более 2 часов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 4 часа.

Конкретные аналоги апелина по настоящему изобретению показаны в таблице 1.

Также предложен способ получения аналога апелина согласно настоящему изобретению. Внутримолекулярные связи между боковыми цепями двух аминокислот в циклическом пептиде могут быть сформированы химическим или ферментативным путем. Циклические аналоги апелина преимущественно получают с помощью клетки-хозяина, содержащей один или несколько биосинтетических ферментов для синтеза лантипептида или лантибиотика (Arnison et al. 2013 Nat Prod Rep 30, 108-160). Лантипептиды и лантибиотики (подгруппа лантипептидов с антибактериальной активностью) являются небольшими пептидами, содержащими внутренние мостики, формирующиеся в результате образования остатка (метил)лантионина или лизиноаланила (рассмотрено в McAuliffe et al., FEMS Microbiol. Rev. 25, 285-308 (2001). Лантионин (Lan) и метиллантионин (MeLan) образуются в результате дегидратации соответственно серина в дегидроаланин (Dha) и треонина в дегидробутирин (Dhb) и образования тиоэфирной связи, образующейся в результате взаимодействия данных аминокислот с остатком цистеина в том же пептиде. Хорошо известными примерами лантибиотиков являются низин, субтилин, Рер5 и эпидерминин. Лантибиотики синтезируются рибосомами в виде неактивных препептидов, содержащих амино-концевой лидерный пептид и карбокси-концевой пропептид. Лидерный пептид необходим для взаимодействия предшественника лантибиотика с лантибиотическими ферментами. Лидерный пептид протеолитически отщепляется от пропептида либо внутри продуцирующей клетки, либо во время или после транспорта из клетки. Гены, отвечающие за синтез лантипептидов, собраны в кластеры и представлены в локусе под названием lan. LanA представляет собой ген, кодирующий препептид лантибиотика, lanB представляет собой ген, кодирующий фермент, ответственный за дегидратацию серина или треонина, и lanC представляет собой ген, кодирующий фермент, ответственный за образование цикла. В некоторых случаях активности LanB и LanC объединены в бифункциональном ферменте, закодированном с помощью lanM. Гены lanP и lanT кодируют ферменты, которые вовлечены в процессинг и/или транспорт препептидов.

Соответственно настоящее изобретение обеспечивает способ ферментативного получения циклического аналога апелина согласно настоящему изобретению, включающий: получение клетки-хозяина, которая содержит:

- молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первый фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий N-концевой лидерный пептид, встречающийся у пептида-предшественника лантипептида или лантибиотика, и второй фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий аналог апелина, при этом первый и второй указанные фрагменты находятся в открытой рамке считывания указанной молекулы нуклеиновой кислоты;

- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, способный осуществлять дегидратацию серина и/или треонина;

- необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспортный белок; а также

- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, способный индуцировать образование лантионина или метиллантионина.

Для применения в способе получения циклических аналогов пептида согласно настоящему изобретению подходит любой лидерный пептид, встречающийся у предшественника лантипептида/лантибиотика. Примерами таких лидерных пептидов являются лидерные пептиды низина, субтилина, Рер5 и эпидермина. Согласно предпочтительному варианту осуществления применяют лидерный пептид низина. Ферментом, способным дегидратировать серии и/или треонин, предпочтительно является LanB, такой как NisB, РерВ, SpaB или его функциональный эквивалент. Ферментом, способным индуцировать образование лантионина и/или метиллантионина, предпочтительно является LanC, такой как NisC, РерС, SpaC или его функциональный эквивалент. В одном варианте осуществления дегидратация серина и/или треонина и образование лантионина и/или метиллантионина индуцируются одним и тем же ферментом LanM, таким как CinM, LtnM, LctM или его функциональным эквивалентом.

Образование лантионина между дегидроаланином и цистеином энергетически возможно при комнатной температуре, а также может происходить спонтанно без участия фермента LanC или LanM.

Таким образом, в одном варианте осуществления обеспечивается способ ферментативного получения циклического аналога апелина согласно настоящему изобретению, содержащий (метил)лантиониновый мостик, который включает:

a) получение клетки-хозяина, содержащей:

- молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первый фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий N-концевой лидерный пептид, встречающийся у пептида-предшественника лантипептида/лантибиотика, и второй фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий аналог апелина, при этом указанные первый и второй фрагменты находятся в одной открытой рамке считывания указанной молекулы нуклеиновой кислоты;

- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, способный осуществлять дегидратацию серина и/или треонина;

- (необязательно) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспортный белок; а также

b) обеспечение возможности трансляции указанной первой нуклеиновой кислоты;

c) сбор указанного аналога пептида, предпочтительно сбор пептида либо из среды, либо после лизиса клетки-хозяина из цитоплазмы.

Таким образом, (метил)лантиониновый фрагмент можно посттрансляционно вставлять в линейный пептид-предшественник путем ферментативной дегидратации серина и треонина в соответственно α,β-ненасыщенные остатки 2,3-дидегидроаланина (Dha) и (Z)-2,3-дидегидробутирина (Dhb), с последующим внутримолекулярным присоединением по Михаэлю цистеинтиола с образованием тиоэфирного мостика. Данный подход с применением оборудования для биосинтеза можно воспроизводить in vitro или в бактериальных хозяевах.

В одном варианте осуществления способ включает создание клетки-хозяина с плазмидой, кодирующей ферменты для модификации лантипептида, которые дегидратируют серины/треонины и связывают образовавшиеся дегидроаминокислоты с цистеином, и необязательно кодирующей транспортную молекулу для лантипептида, а также с плазмидой, кодирующей конструкцию, состоящую из N-концевого лидерного пептида лантипептида и C-концевого аналога апелина.

Как подробно описано выше, (метил)лантионин образован между боковыми цепями дегидратированного серина или треонина, т.е. соответственно дегидроаланина или дегидробутирина и цистеина. Таким образом, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аналог апелина, который (при циклизации) содержит по меньшей мере один лантионин или метиллантионин, должна содержать триплет в нуклеиновой кислоте, кодирующий серии (ТСТ, ТСС, ТСА, TCG, AGT или AGC) или треонин (ACT, АСС, АСА или ACG), и триплет в нуклеиновой кислоте, кодирующий цистеин (TGT или TGC), по меньшей в двух аминокислотных позициях в аналоге пептида, которые будут образовывать лантионин или метиллантионин.

В одном варианте осуществления второй фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий аналог апелина, кодирует полипептид, выбранный из группы, состоящей из QRPTRLACKGPMPF, QRPSRLACKGPMPF, QRPRTLACKGPMPF, QRPSLAHCGPMPF, QRPRLTHKCPMPF, QRPRLSAHKCPMPF, QRPRLSAHKCPMPF, QRPRLSAHKCGPMPF, QRPRLSAHKCGPMPF, QRPRLTHKCGPMPF, QRPRLTHKCGPMPF-NH₂, QRPRLTHKCGPMP, QRPRLSHKCGPMPF, QRPRLTHKGCPMPF, QRPRLSHKGCPMPF, QRPRLSHKGCPMPF, QRPRLAHSGPMCF, QRPRLSHKGCMPF, QRPRLTHKGCMPF, QRPRLSHKGPCPF, QRPRLSHKGPCMPF, KFRRQRPRLTHKCPMPF, KFRRQRPRLTHKCGPMPF, KFRRQRPRLSAHKCPMPF, KFRRQRPRLSAHKCGPMPF, KFRRQRPRLSHKGCPMPF, KFRRQRPRLAHSGPMCF, QRPRLSHKGPMCF и QRPRLSHKGPMCPF.

В случае, если N-концевым остатком пептида является глутамин (Q), то способ предпочтительно дополнительно включает превращение Q в pE согласно известным в данной области техники способам, например описанным в Rink et al. (Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 61 (2010) 210-218).

Если клеткой-хозяином является грамположительная бактерия, то для сбора из среды циклического аналога пептида или дегидратированного аналога пептида, который еще не был циклизован, особенно предпочтительно, чтобы присутствовал транспортный белок. Предпочтительно указанным транспортным белком является LanT, такой как NisT, или его функциональный эквивалент. У Escherichia coli присутствие транспортной молекулы не является обязательным, а сбор аналога пептида предпочтительно происходит после разрушения клеток.

Клеткой-хозяином, применяемой в способе получения циклического аналога согласно настоящему изобретению, предпочтительно является грамположительный прокариот, грамотрицательный прокариот или эукариот. Примеры подходящих клеток-хозяев включают молочнокислые бактерии, такие как Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermis и грамотрицательную бактерию E. coli.

Вместо ферментативной циклизации связывание дегидроаминокислоты с цистеином также возможно с помощью инкубирования в щелочном pH. Данное pH-индуцированное связывание преимущественно используют для образования (метил)лантионинов, например если пролин предшествует непосредственно цистеину, который препятствует эффективной активности циклазы. В качестве альтернативы, в случае пептидов, которые не циклизируются циклазой NisC, циклизация между дегидроаланином и цистеином может происходить спонтанно, что в зависимости от пептида может приводить или не приводить к образованию различных изомеров. Так, согласно альтернативному варианту осуществления настоящего изобретения замыкание кольца осуществляют без применения ферментов, например с помощью подвергания дегидратированного аналога-предшественника, содержащего остаток дегидроаланина или дегидробутирина и остаток цистеина в необходимых позициях, химической обработке, индуцирующей образование тиоэфирного мостика. Например, химическое замыкание кольца может включать в себя подвергание пептида, содержащего дегидроаланин и цистеин, в течение по меньшей мере 10 минут воздействию pH 8 (Burrage et al Chem Eur J, 2000 Biomimetic synthesis of lantibiotics. 6, 1455-1466) или пептида с дегидробутирином и цистеином в течение приблизительно 10 часов воздействию pH 8-9 (Zhu et al 2003 Biomimetic studies on the stereoselective lanthionine formation. Org. Biomol. Chem. 1, 3304-3315).

Согласно еще одному варианту осуществления аналог апелина синтезируют с помощью твердофазного химического синтеза, например согласно процедуре, описанной Knerr et al. (J. Am. Chem. Soc, 2012, 134 (18), pp 7648-7651) или в источниках, упомянутых в данном документе.

В связи с (различным) эффектом, оказываемым им в отношении рецептора APJ в сочетании со повышенной стабильностью, обеспечиваемый в настоящем документе циклический аналог апелина преимущественно находит свое применение в качестве лекарственного препарата. Таким образом, обеспечивается также фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один аналог апелина согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Аналог можно вводить в виде собственно соединения или в виде фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или основания, получаемой в результате реакции с неорганической кислотой (такой как соляная кислота, бромистоводородная кислота, перхлорная кислота, азотная кислота, тиоциановая кислота, серная кислота и фосфорная кислота); или с органической кислотой (такой как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота и фумаровая кислота); или в результате реакции с неорганическим основанием (таким как гидроксид натрия, гидроксид аммония, гидроксид калия); или с органическим основанием (таким как моно-, ди-, триалкил- и ариламины и замещенные этаноламины). В виде циклического пептидного соединения или его фармацевтически приемлемой соли по настоящему изобретению предпочтительным является соединение или его фармацевтически приемлемая соль в практически чистой форме. Более предпочтительными являются показатели степени чистоты выше 80% или более.

Рецептор апелина APJ связан с сердечно-сосудистыми нарушениями, атеросклерозом, рестенозом, ишемическим сердечно-сосудистым заболеванием, вирусной кардиомиопатией, стабилизацией лимфатических сосудов, нарушениями эндокринной системы и гормональными нарушениями, диабетической ретинопатией и метаболическими заболеваниями, заболеваниями желудочно-кишечного тракта и печени, злокачественными нарушениями, воспалительными заболеваниями, гематологическими нарушениями, респираторными заболеваниями, нарушениями опорно-двигательного аппарата, неврологическими нарушениями, урологическими нарушениями, дерматологическими заболеваниями, нарушениями заживления ран и воспроизводства.

Настоящее изобретение обеспечивает (метил)лантионин-содержащие агонисты и антагонисты рецептора APJ, избирательное применение которых зависит от заболевания. Более того, предусматривается, что лантиониновые апелины известным образом влияют на гетеродимеризацию рецептора APJ, при этом терапевтическая значимость связана с рецептором AT1.

Для агонистов рецептора апелина существует множество терапевтических областей. Основными мишенями для неоваскуляризационных свойств апелина являются сердечная мышца и мышца ноги. Стимуляция рецептора APJ обычно имеет кардиоваскулярное терапевтическое значение. Другими областями применений являются, например, фиброз, в отношении которого (метил)лантионин-апелин может обладать свойствами, обращающими его развитие, а также нейропротекция. Апелин оказывает терапевтические эффекты в отношении новорожденных, подвергающихся гипероксии. Антагонисты рецептора апелина являются ценными и при других заболеваниях, например в случаях патологического неоангиогенеза: диабетической нефропатии (Zhang 2013 PLOS 8 | Issue 4 | е60457 page 1-11); при торможении роста опухоли (Sorli 2006 Drug discovery today 11, 1100-1106); ишемической ретинопатии. Антагонисты получают, например, путем замены F13 на ala13. Блокировка рецептора APJ, который является корецептором для HIV-инфицирования, способствует предупреждению HIV-инфицирования. Блокировка рецептора APJ может способствовать уменьшению патологического образования избыточных сосудов, которое наблюдается при возрастной макулярной дегенерации (AMD).

Так, иллюстративные терапевтические применения включают все состояния, которые известны или предположены как связанные с сигнализацией через апелинергическую систему сигнализации, например состояния, связанные с измененным водным балансом, стрессиндуцированные расстройства, такие как тревожность и депрессия, сердечно-сосудистые нарушения и метаболические нарушения. В одном варианте осуществления аналог апелина производит эндотелий-зависимую вазодилатацию, эндотелий-независимую вазоконстрикцию и/или увеличение силы сердечного сокращения. Апелин оказывает противовоспалительные эффекты в отношении крысят, подвергнутых гипероксии. Настоящее изобретение обеспечивает циклический аналог апелина для применения в способе лечения или предупреждения сердечно-сосудистого состояния, например выбранного из группы, состоящей из гипоксии, ишемии и легочной артериальной гипертензии. В следующем варианте осуществления аналог апелина находит свое применение в модулировании ангиогенеза, например в опухолях.

APJ также является корецептором вируса иммунодефицита человека I типа (HIV-1), а апелин блокирует проникновение HIV-1 при взаимодействии с APJ. Ингибирование HIV-инфицирования у клеток СНО и клеток NP-2, экспрессирующих CD4 и рецептор, после преинкубации с пептидами апелина подтверждает предположение о роли APJ в качестве корецептора для HIV и HIV-2. Инкубация клеток, негативных для CD4, но положительных для APJ, с растворимым CD4 делала возможным HIV-инфицирование. Соответственно в еще следующем варианте осуществления циклический апелин по настоящему изобретению применяют для лечения HIV.

В контексте данного документа "лечение" означает ослабление или излечение симптомов или заболевания, и/или сопутствующих ему симптомов. "Предупреждение" означает способ задерживания по времени или предупреждения возникновения симптома или заболевания, и/или сопутствующих ему симптомов, способ предотвращения приобретения пациентом симптомов или заболевания, или способ снижения у пациента риска приобретения симптомов или заболевания.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению получают с помощью соответствующего смешивания соединения или его фармацевтически приемлемых солей согласно настоящему изобретению по меньшей мере с одним или несколькими разновидностями фармацевтически приемлемых носителей и т.д. в соответствующих количествах согласно способам, известным в области техники получения лекарственных препаратов. Уровни содержания соединения или его фармацевтически приемлемой соли по настоящему изобретению в данной фармацевтической композиции изменяются в зависимости от лекарственных форм, дозы и т.д., однако составляют, например, 0,1-100% по весу всей фармацевтической композиции.

"Фармацевтическая композиция" включает препараты для перорального введения, такие как таблетки, капсулы, гранулы, порошки, пастилки, сиропы, эмульсии и суспензии, а также препараты для парентерального введения, такие как препараты для наружного применения, суппозитории, инъекции, офтальмологические растворы, интраназальные средства и ингаляционные средства.

"Фармацевтически приемлемые носители" включают различные традиционные органические или неорганические вещества-носители, например вещества в твердых препаратах, такие как наполнители, разрыхлители, связующие, регуляторы сыпучести и смазывающие вещества, а также вещества в жидких препаратах, такие как растворители, солюбилизирующие средства, суспендирующие средства, изотонизирующие средства, буферы и успокаивающие средства. При необходимости применяют такие добавки, как консерванты, антиоксиданты, красители и подсластители. "Наполнители" включают, например, лактозу, белый мягкий сахар, D-маннит, D-сорбит, кукурузный крахмал, декстрин, микрокристаллическую целлюлозу, кристаллическую целлюлозу, кармеллозу, кармеллозу кальция, карбоксиметилкрахмал натрия, низкозамещенную гидроксипропилцеллюлозу и аравийскую камедь. Регуляторы сыпучести включают, например, легкую безводную кремниевую кислоту и стеарат магния. Смазывающие вещества включают, например, стеарат магния, стеарат кальция и тальк. Растворители включают, например, очищенную воду, этанол, пропиленгликоль, макрогол, кунжутное масло, кукурузное масло и оливковое масло. Солюбилизирующие средства включают, например, пропиленгликоль, D-маннит, бензилбензоат, этанол, триэтаноламин, карбонат натрия и цитрат натрия. "Суспендирующие средства" включают, например, бензалкония хлорид, кармеллозу, гидроксипропилцеллюлозу, пропиленгликоль, повидон, метилцеллюлозу и глицерилмоностеарат. Буферы включают, например, двузамещенный фосфорнокислый натрий, ацетат натрия, карбонат натрия и цитрат натрия.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить отличным от человека млекопитающим (например мышам, крысам, хомякам, морским свинкам, кроликам, кошкам, собакам, свиньям, коровам, лошадям, овцам, обезьянам) и людям пероральным или парентеральным путем (например местным применением, ректальным, внутривенным введением) в терапевтически эффективном количестве. Несмотря на то, что "терапевтически эффективное количество" изменяется в зависимости от пациентов, заболевания, симптомов, лекарственных форм, путей введения, например доза, в случае перорального введения взрослому пациенту (весом приблизительно 60 кг), страдающему сердечно-сосудистым заболеванием, обычно варьирует от приблизительно 1 мг до 1 г в сутки с применением в качестве активного ингредиента циклического аналога апелина или его фармацевтически приемлемой соли по настоящему изобретению. Такое количество можно вводить пациенту за один раз или за несколько раз в сутки.

Также пригодны фармацевтическая композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента или активатора, и наборы (набор для введения, лечения и/или предупреждения), упаковки (упакованные товары и т.д.), а также комплект с лекарством (и/или контейнер), содержащие листок-вкладыш по применению фармацевтической композиции, на котором указано, что фармацевтическую композицию можно применять или следует применять для лечения и/или предупреждения. Такой набор, упаковка или комплект с лекарством могут быть снабжены одним или несколькими контейнерами, заполненными одним или несколькими активными ингредиентами и другими лекарствами, или лекарством (или компонентом) вышеупомянутых фармацевтических композиций. В качестве примеров такого набора, упаковки и комплекта с лекарством включены набор для коммерческого использования, соответственно предназначенный для лечения и/или предупреждения целевого заболевания, а также упаковка для коммерческого использования. В качестве листка-вкладыша, включенного в такой набор, упаковку и комплект с лекарством, включены сведения от правительственной организации, которая регулирует производство, применение и продажу фармацевтических или биологических продуктов, а также сведения, в которых указано одобрение правительственной организацией касательно производства, применения или продажи продукта, имеющего отношение к лекарственному препарату для людей. В вышеупомянутый набор, упаковку и комплект с лекарством также может быть включен упакованный продукт, а также может быть включена сформированная структура, полученная в результате введения соответствующей стадии в ходе производства лекарственного препарата (стадии), а также может быть включена сформированная структура, с помощью которой можно осуществлять лечение и/или предупреждение целевого заболевания с включением предпочтительного лекарства.

Соединение или его фармацевтически приемлемую соль по настоящему изобретению можно применять в соответствии с общепринятым способом, который используется в настоящее время в области медицины, в комбинации (далее "комбинированная терапия") с одним или несколькими другими лекарственными средствами (далее "сопутствующее лекарственное средство"). Выбор времени для введения аналога апелина или его фармацевтически приемлемой соли по настоящему изобретению и сопутствующего лекарственного средства не ограничен. Их можно вводить пациенту в виде комбинированного лекарственного средства или их можно вводить пациенту одновременно или через одинаковые интервалы. Можно применять фармацевтический набор, который характеризуется тем, что в его состав входит фармацевтическая композиция по настоящему изобретению и сопутствующее лекарственное средство. Доза сопутствующего лекарственного средства должна соответствовать дозе клинического применения, и ее можно соответственно подбирать в зависимости от пациентов, заболевания, симптомов, лекарственных форм, путей введения, времени введения, комбинации. Способ введения сопутствующего лекарственного средства конкретно не ограничен, а соединение или его соль по настоящему изобретению и сопутствующее лекарственное средство следует вводить как раз совместно.

Сопутствующее лекарственное средство включает, например,

1) терапевтическое средство и/или профилактическое средство от сердечно-сосудистого нарушения, атеросклероза, рестеноза или ишемического сердечно-сосудистого заболевания,

2) терапевтическое средство и/или профилактическое средство от нарушений эндокринной системы и гормональных нарушений, диабетической ретинопатии или метаболического заболевания,

3) терапевтическое средство от онкологического заболевания,

4) терапевтическое средство и/или профилактическое средство от воспалительного заболевания, и

5) терапевтическое средство от HIV, и любое одно или несколько таких средств, а также в комбинации можно применять соединение или его фармацевтически приемлемую соль по настоящему изобретению.

Для ясности и краткости элементы описания в данном документе описаны как часть одних и тех же или различных вариантов осуществления, тем не менее будет понятно, что объем настоящего изобретения может включать варианты осуществления, содержащие комбинации всех или некоторых таких описанных элементов. В связи с этим специалисту в настоящей области очевидно, что варианты пункта 1 поданной формулы изобретения можно комбинировать с другими элементами, описанными в настоящей поданной заявке, в частности с элементами, раскрываемыми в зависимых пунктах формулы, причем такие пункты формулы обычно относятся к наиболее предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ПРИМЕР 1: синтез аналогов апелина, стабилизированных лантионином

Лантиониновые варианты апелина получали в соответствии с общепринятыми процедурами, описанными например в Kluskens, L.D., et al (2005) Post-translational Modification of Therapeutic Peptides by NisB, the Dehydratase of the Lantibiotic Nisin. Biochemistry 44, 12827-12834; Kluskens, L.D., et al. (2009) Angiotensin-(1-7) with thioether-bridge: an ACE-resistant, potent Ang-(1-7) analogue. J. Pharmacol. Exper. Ther. 328, 849-854; Rink, R. et al. (2007) NisC, the cyclase of the lantibiotic nisin, can catalyze cyclization of designed non-lantibiotic peptides. Biochemistry 46, 13179-13189.

Если кратко, использовали Lactococcus lactis, содержащий двухплазмидную систему. Первая плазмида кодировала лидерный пептид лантибиотического низина MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPR, который генетически гибридизирован на его C-конце с предшественником целевого (метил)лантионина-апелина, который содержал в позиции i серин/треонин и в позиции i+3, i+4, i+5 или i+6 цистеин. В качестве альтернативы, первая плазмида кодировала лидерную последовательность низина, за которой шли первые 17 аминокислот низина и сайт расщепления эндопротеиназы Glu-C (Е): MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMIE. N-концевой метионин обычно отщепляется хозяином.

Плазмиду, кодировавшую гибридный белок, который содержал лидерную последовательность низина и предшественник (метил)лантионин-апелина, совместно экспрессировали в L. lactis со второй плазмидой, плазмидой pIL3BTC, кодировавшую ферменты созревания NisB и NisC, а также отвечающий за транслокацию фермент NisT. NisB дегидратировал серии или треонин с образованием соответственно дегидроаланина и дегидробутирина. После этого циклаза NisC ковалентно связывала дегидроаминокислоту с цистеином с образованием соответственно лантионина или метиллантионина. Культуру L. lactis выращивали на протяжении ночи при 30°C в среде GM17, дополненной 4 пг/мл эритромицина и 4 пг/мл хлорамфеникола, (Kluskens LD, et al. (2005). Post-translational modification of therapeutic peptides by NisB, the dehydratase of the lantibiotic nisin. Biochemistry 44: 12827-12834). Затем 1/100 объема переносили в минимальную среду и культуру выращивали на протяжении ночи при 30°C (Rink R, et al. (2005) Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides that can be modified by lantibiotic enzymes. Biochemistry 44: 8873-8882).

Надосадочную жидкость собирали с помощью центрифугирования (10 мин., 12857 g) с последующей вакуумной фильтрацией (0,2 мкм). Пептид очищали от средовой фракции с помощью колонок для ионообменной хроматографии HiTrap SP HP (GE Healthcare, Швеция). Из собранной фракции, включавшей пептид, удаляли соли (колонка PD10, Amersham) и подвергали ее вакуумной сушке.

(Метил)лантионин-апелиновый пептид высвобождался в результате протеолитического расщепления с помощью 10 ЕД/мл эндопротеиназы Glu-C в 50 мМ натрий-фосфатном буфере с pH 7,6 при 37°C. Инкубация в течение 48 часов при указанной температуре приводила к полному превращению N-концевого глутамина (Q) в пироглутамат (pE). Если был необходим N-концевой Q, то время расщепления с помощью Glu-C сводили к минимуму, равному нескольким часам. Отщепленный гибридный пептид отделяли на колонке для обратно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (Jupiter 4 pm Proteo 90А, С12, Phenomenex). Отделение осуществляли на скорости 1,0 мл/мин в градиенте от 15 до 40% ацетонитрила в воде milli-Q, в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты. Пиковые фракции (детектированные на 214 нм) собирали и анализировали на Maldi-TOF масс-спектрометре (Voyager-DE Pro, Applied Biosystems). Отсутствие или наличие (метил)лантионина оценивали с помощью инкубации с CDAP, который присоединялся к немодифицированным цистеинам, но не к (метил)лантионинам (Rink 2007 Biochemistry 46, 13179-13189).

В некоторых случаях дегидратированный серии связывали с цистеином без применения ферментов, что давало в результате различные изомеры. Лантионины (Ala-S-Ala) показаны как [Lan-Lan]; метиллантионины (Abu-S-Ala и Ala-S-Abu) как [meLan-meLan].

ПРИМЕР 2; связывание вариантов лантионин-содержащих апелинов с рецептором APJ

Способы: анализ конкурентного связывания с APJ

Проводили эксперименты по связыванию [Glp⁶⁵, Nle⁷⁵, Tyr⁷⁷][¹²⁵I]-апелина-13 в SPA 96-луночном формате. Мембраны, используемые в данном анализе, получали из клеток HEK293, которые стабильно экспрессировали либо рекомбинантный hAPJ, либо рекомбинантный rAPJ. Инкубацию начинали с помощью добавления смеси гранул WGA PVT SPA (0,5 мг/лунка) и 0,08 пг мембран в аналитический буфер (25 мМ HEPES, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ CaCl₂, 0,1% BSA, pH 7,4), содержавший 0,06 нМ

[Glp⁶⁵, Nle⁷⁵, Tyr⁷⁷][¹²⁵I]-апелин-13 и возраставшие концентрации тестируемого соединения (10-точечные концентрационные характеристические кривые). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 100 нМ апелина 17. Образцы инкубировали в течение восьми часов при комнатной температуре (22°C). Затем 96-луночные планшеты считывали на Microbeta Trilux.

Результаты

pE представляет собой пироглутамат.

Выводы

- Мутации Р на А или Р на V прекращают связывание. Тем не менее, в приведенном в данном документе ниже примере 8 показана значительная активность QRPRLAHLanGPMLanF. Следовательно, влияние пролина на разрыв спирали можно имитировать с помощью лантионинового мостика. Мутант с заменой F на А не связывается.

- Апелины, содержащие два лантионина, сохраняют способность связываться с рецептором APJ. Их связывающая способность ниже, чем у апелина-13 дикого типа. Тем не менее, следует отметить, что лантиониновые апелины содержат pE вместо Q, что может частично объяснить сниженное связывание с рецептором.

ПРИМЕР 3: лантиониновые апелины оказывают влияние на уровни сАМР в клетках, экспрессирующих рецептор APJ

Способы: анализ сАМР при стимуляции форсколином Уровень циклического AMP в клетках HEK293, экспрессировавших рекомбинантные рецепторы APJ, анализировали с помощью конкурентного иммуноанализа HTRF. Клетки при плотности 4000 клеток/лунка ресуспендировали в аналитическом буфере (HBSS, содержавшем Са²⁺ и Mg²⁺, дополненном 0,1% BSA и 5 мМ HEPES) и вносили в аналитический планшет. Инкубацию на протяжении 40 мин. при комнатной температуре начинали с внесения возрастающих концентраций соединений, содержавших 10 мкМ форсколина и 0,5 мМ IBMX. Реакцию останавливали с помощью внесения лизирующего буфера, содержавшего (12-меченный сАМР, с последующим внесением меченного криптатом моноклонального антитела к сАМР согласно инструкциям производителя. Флуоресценцию с временным разрешением на 620 и 665 нм измеряли в приборе Envision спустя 2 часа инкубации при комнатной температуре в темноте. Содержание сАМР в образцах определяли с помощью интерполяции на калибровочной кривой сАМР.

Результаты

Вывод

В отношении модулирования уровня сАМР активны два варианта, которые связаны с рецептором, как продемонстрировано в примере 1.

ПРИМЕР 4: лантиониновые апелины влияют на накопление аррестина

Способы:

анализ накопления hAPJ β-аррестина

Стимуляцию взаимодействия hAPJ с β-аррестином исследовали с помощью системы PathHunter™ от DiscoveRx. Клеточная линия СНО-K1 была сконструирована для совместной экспрессии меченного ProLink/ферментным донором (PK) APJ и меченных активатором фермента (ЕА) гибридных белков на основе β-аррестина. При активации GPCR происходило дополнение фрагмента фермента с образованием активного β-Gal фермента. Данные клетки высевали с плотностью 15000 клеток/лунка. На следующий день клетки стимулировали соединениями с потенциальным агонистическим профилем при различных концентрациях. Спустя 90 мин. инкубации при 37°C с соединениями, клетки лизировали и инкубировали реактивом PathHunter в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем образцы считывали согласно протоколу считывания люминесценции с низким пределом чувствительности с применением прибора Envision (Perkin Elmer).

Результаты

Вывод

В данном анализе значительной активностью обладает вариант pEApeM5.

ПРИМЕР 5: лантиониновые апелины не взаимодействуют с рецептором ангиотензина II тип 1 (AT₁)

Ввиду гомологии между APJ и рецептором AT1 было исследовано, взаимодействуют ли лантиониновые апелины с рецептором ангиотензина II тип 1.

Например, для различных терапевтических применений было бы нежелательно, если бы лантиониновые варианты апелина стимулировали рецептор AT1.

Способы:

агонистическое и антагонистическое действие лантионин-содержащих апелинов измеряли посредством анализа AT1, связанного с бета-аррестином.

Результаты

Вывод

Лантиониновые апелины не оказывают ни агонистического, ни антагонистического действия на рецептор AT1.

ПРИМЕР 6: анализ интернализации рецептора hAPJ

Способы:

клетки HEK293 высеивали за 24 часа до эксперимента с 50% конфлюентностью в 2×F75 колбы. На следующее утро клетки обрабатывали трипсином, встряхивали на вортексе в течение 60 секунд и пропускали через фильтр с размером ячейки 40 микрон. Клетки ресуспендировали при плотности 300000 клеток/мл в OptiMEM + 2% FBS, а также добавляли вирус Ad-GFP-hAPJ в MOI с 1 PFU/клетка. Клетки встряхивали на вортексе и вносили в 96-луночные черные чашки с прозрачным дном при концентрации 10000 клеток/лунка. Клетки выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут для обеспечения возможности клеткам прикрепиться к чашке перед инкубированием в течение ночи при 37°C в 5% CO₂ инкубаторе. На следующее утро вносили аналоги апелина в пределах концентрационной кривой (500 нМ максимум). Транслокацию APJ-GFP наблюдали и документировали на конфокальном микроскопе Olympus FV. Обычный цикл транслокации завершался за 3 часа, причем основную часть эффектов наблюдали в первые 90 минут воздействия соединением.

Результаты

Вывод

Поскольку интернализация может отражать десенсибилизацию, то предпочтительными являются варианты, которые демонстрируют способность к сигнализации, однако характеризуются сниженной интернализацией. В данной серии, с учетом сигнализации сАМР в примере 2, предпочтительным является pEApeM6.

ПРИМЕР 7: лантиониновый апелин обладал сниженной устойчивостью к разрушению пептидазами в плазме

Способы:

стабильность аналогов апелина в плазме крови крысы. Апелин (конечная концентрация апелина 0,1 мг/мл) инкубировали в 10% плазме крыс, которая была забуферена 16 мМ фосфатным буфером с pH 7,4 при 37°C. Образцы гасили с помощью подкисления до конечной концентрации 5% TFA. Образцы анализировали на HPLC. Значения высоты пиков откладывали на графике относительно изначальных значений высоты пиков.

Результаты

Выводы

Ясно видно, что пептид с pGlu и лантионином является намного более стабильным, чем линейный пептид с Q. Как pGlu, так и лантионин вносят свой вклад в стабильность. Сравнение варианта pEApeM5T с pEApeM5 демонстрирует повышенную стабильность с помощью остатка Dhb.

ПРИМЕР 8: ингибирование сАМР пути и стимулирование В-аррестинового пути с помощью стимуляции рецептора APJ.

(Ме)lan-апелиновые варианты тестировали посредством наборов для анализов на основе сАМР и бета-аррестина от компании DiscoverX.

Выводы

- Некоторые (метил)лантиониновые варианты стимулируют сАМР путь в концентрациях ниже или слегка выше, чем у линейного контроля с заменой S на А.

- Способность стимулировать бета-аррестиновый путь достаточно изменчива и зависит от пептида. Это означает сильно различающуюся активность у нескольких вариантов, что проиллюстрировано варьированием значений в последней колонке, в которой приведено соотношение для обоих путей.

- В частности, лантиониновые варианты производят впечатление очень активных.

- Не только замена аминокислоты на часть лантионина, но также вставка (части) лантионина дает активные варианты.

- Два варианта более эффективно стимулируют бета-аррестиновый путь, чем сАМР путь.

Изобретение относится к области фармакологии. Предложены новые аналоги апелина и их терапевтическое применение. Настоящее изобретение относится к циклическому аналогу апелина общей формулы Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14, содержащему лантиониновый мостик структуры Ala-S-Ala или метиллантиониновый мостик структуры Abu-S-Ala или Ala-S-Abu, и где значения Х1-Х14 и размер лантионинового и метиллантионинового мостика определены в формуле изобретения. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 8 табл., 8 пр.

1. Циклический аналог апелина общей формулы Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14, содержащий один лантиониновый мостик структуры Ala-S-Ala или один метиллантиониновый мостик структуры Abu-S-Ala или Ala-S-Abu, где

X1 отсутствует;

Х2 выбран из pGlu и Gln;

Х3 представляет собой Arg;

Х4 представляет собой Pro, Pro-(me)Lan;

Х5 представляет собой Arg, (me)Lan, Arg-(me)Lan;

Х6 представляет собой Leu, (me)Lan, Leu-(me)Lan;

Х7 представляет собой Ala, (me)Lan;

Х8 представляет собой His, (me)Lan;

Х9 представляет собой Lys, (me)Lan, Lys-(me)Lan;

Х10 представляет собой Gly, (me)Lan;

X11 представляет собой Pro, (me)Lan, Pro-Lan;

X12 представляет собой Met, (me)Lan, Met-(me)Lan;

X13 либо отсутствует, либо выбран из Pro, Dhb, (me)Lan;

X14 представляет собой С-конец и либо отсутствует, либо выбран из Phe и Ala в том случае, если Х13 присутствует;

где

Abu означает аминомасляную кислоту, a Dhb означает дегидробутирин;

(me)Lan означает Lan или meLan, где Lan обозначает N- или С-концевую половину лантионина (Ala-S-Ala), a meLan обозначает N- или С-концевую половину метиллантионина (Abu-S-Ala или Ala-S-Abu);

при условии, что:

(i) последовательность от Х4 до Х13 содержит одну пару meLan или одну пару Lan, которые вместе образуют (метил)лантиониновый мостик; и

(ii) при этом указанный (метил)лантиониновый мостик имеет размер, составляющий два, три или четыре остатков под кольцом;

или его амид, сложный эфир или фармацевтически приемлемая соль.

2. Аналог апелина по п. 1, где Х2 представляет собой pGlu.

3. Аналог апелина по п. 1, где Х2-Х3-Х4-Х5-Х6 представляет собой Gln-Arg-Pro-Arg-Leu или pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu.

4. Аналог апелина по п. 1, где Х5, Х6, Х7 или Х9 представляет собой (me)Lan.

5. Аналог апелина по п. 1, где последовательность Х7-Х8-Х9-Х10 представляет собой (me)Lan-His-Lys-(me)Lan, предпочтительно Lan-His-Lys-Lan, или где последовательность Х7-Х8-Х9-Х10 представляет собой (me)Lan-His-Lys-(me)Lan-Gly, предпочтительно Lan-His-Lys-Lan-Gly.

6. Аналог апелина по п. 1, где последовательность Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 представляет собой Pro-(me)Lan-Arg-Leu-Ala-(me)Lan.

7. Аналог апелина по п. 1, где последовательность Х11-Х12-Х13-Х14 представляет собой (me)Lan-Met-Pro-Phe.

8. Аналог апелина по п. 1, выбранный из группы, состоящей из:

pERPmeLanRLAmeLanKGPMPF, pERPLanRLALanKGPMPF,

pERPRmeLanLAmeLanKGPMPF, pERPLanLAHLanGPMPF,

pERPRLmeLanHKmeLanPMPF, pERPRLmeLanHKmeLanPMdhbF,

pERPRLLanAHKLanPMPF, pERPRLLanAHKLanGPMPF,

pERPRLmeLanHKmeLanGPMPF, pERPRLmeLanHKmeLanGPMPF-NH₂,

pERPRLmeLanHKmeLanGPMP, pERPRLLanHKLanGPMPF,

pERPRLAHLanGPMLanF, pERPRLLanHKGLanMPF,

pERPRLmeLanHKGmeLanMPF, pERPRLLanHKGPLanPF,

pERPRLLanHKGPLanMPF.

9. Аналог апелина по п. 1, способный индуцировать выработку с AMP в клетках, экспрессирующих рецептор апелина (APJ), с ЕС50, составляющей 0,1-200 нМ, предпочтительно 0,1-5 нМ.

10. Аналог апелина по п. 1, характеризующийся сниженной интернализацией рецептора апелина, связанной с бета-аррестином, по сравнению с нативным апелином-13.

11. Аналог апелина по п. 1, демонстрирующий стабильность (Т50) в плазме крови крысы, составляющую по меньшей мере 3 часа, предпочтительно по меньшей мере 6 часов, более предпочтительно по меньшей мере 8 часов.

12. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью связывания с рецептором APJ, содержащая терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного аналога апелина по любому из пп. 1-11.

13. Аналог апелина по п. 1 для применения в качестве лекарственного препарата, обладающего активностью связывания с рецептором APJ.

14. Аналог апелина по п. 1 для применения в способе лечения состояния, связанного с измененным водным балансом, стресс-индуцированного расстройства, такого как тревожность и депрессия, сердечно-сосудистого нарушения или метаболического нарушения, предпочтительно сердечнососудистого нарушения.

15. Способ получения аналога апелина по любому из пп. 1-11, включающий:

a) получение клетки-хозяина, содержащей:

- молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первый фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий N-концевой лидерный пептид, встречающийся у пептида-предшественника лантипептида/лантибиотика, и второй фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий аналог пептида, при этом указанные первый и второй фрагменты находятся в одной открытой рамке считывания указанной молекулы нуклеиновой кислоты;

- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, способный осуществлять дегидратацию серина и/или треонина;

- необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспортный белок;

b) обеспечение возможности трансляции указанной первой нуклеиновой кислоты; а также

c) сбор указанного аналога пептида.

16. Способ по п. 15, включающий замыкание кольца химическими или ферментативными средствами, предпочтительно ферментативными средствами.

17. Способ по п. 15 или п. 16, где второй фрагмент нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, выбранный из группы, состоящей из:

QRPTRLACKGPMPF, QRPSRLACKGPMPF, QRPRTLACKGPMPF,

QRPSLAHCGPMPF, QRPRLTHKCPMPF, QRPRLSAHKCPMPF,

QRPRLSAHKCGPMPF, QRPRLTHKCGPMPF, QRPRLTHKCGPMPF-NH₂,

QRPRLTHKCGPMP, QRPRLSHKCGPMPF, QRPRLAHSGPMCF,

QRPRLSHKGCMPF, QRPRLTHKGCMPF, QRPRLSHKGPCPF,

QRPRLSHKGPCMPF.

18. Циклический аналог апелина с последовательностью pERPRLLanHKGPMLanF или pERPRLLanHKGPMLanPF, демонстрирующий стабильность (Т50) в плазме крови крысы по меньшей мере 24 часа.

19. Аналог апелина по п. 18 для применения в способе лечения состояния, связанного с измененным водным балансом, стресс-индуцированного расстройства, такого как тревожность и депрессия, сердечно-сосудистого нарушения или метаболического нарушения, предпочтительно сердечнососудистого нарушения.