Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/68 

Описание патента на изобретение RU2700479C1

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции.

Известно определение видовой принадлежности мяса птицы для этого используют концентрированные экстракты различных групп мышц, например грудной, бедренной, голени и др. одной особи, предварительно определяют свежесть мяса по рН, затем подвергают фотометрированию, измеряют их оптическую плотность при длине волны 310-320 нм, составляют сравнительную таблицу, по которой определяют видовую принадлежность исследуемого мяса. Способ позволяет сократить сроки и повысить точность определения видовой принадлежности мяса птиц, однако - не высокая точность (патент РФ №2178169, кл. G01N 33/12. 2002).

Также известен способ для выявления и идентификации ДНК курицы домашней (Gallus gallus) и свиньи домашней (Sus scrofa) методом полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле с использованием специфичных для участка генома ДНК курицы домашней (Gallus gallus) и свиньи домашней (Sus scrofa) олиго-нуклеотидных праймеров, зондов, красителей, внутреннего контрольного образца и положительных контрольных образцов, измерение специфических сигналов и сигнала контролей и интерпретацию результатов (Инструкция по применению тест-системы «ЧИС» для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней методом полимеразной цепной реакции https://docviewer.yandex.ru - прототип).

Однако в известном способе нуклеотидная последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза, что влияет на точность диагностирования видовой принадлежности мяса в продуктах питания и кормах для животных.

Техническим результатом является повышение точности идентификации видовой принадлежности тканей кур и свиней.

Технический результат достигается тем, что в способе определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах, включающем выделение сорбционным методом ДНК из тканей курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa), постановку полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации с использованием специфичных для участка генома ДНК ткани курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей, внутреннего контрольного образца и положительных контрольных образцов, измерение специфических сигналов и сигнала контролей и интерпретацию результатов согласно изобретению проводят одноэтапную полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для тканей свиньи (Sus scrofa); FAM/Green - тканей курицы (Gallus gallus) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца, интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь содержащую фрагменты геномов тканей курицы (Gallus gallus), тканей свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:

Новизна заявляемого способа состоит в идентификации видовой принадлежности мяса птицы и свинины с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, что в свою очередь позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на рисунках 1-5 представлены скриншоты с дисплея прибора Rotor-Gene Q: рис. 1 - представлен график канала Су5 для внутреннего контрольного образца (ВКО); рис. 2 - таблица количественных данных для Cycling A.Red (ВКО); рис. 3 - представлен график канала JOE/Yellow для специфического сигнала для тканей свиньи (Sus scrofa); рис. 4 - представлен график канала FAM/Green - тканей курицы (Gallus gallus); рис. 5 - таблица количественных данных для Cycling A.Yellow (Sus scrofa) и A.Green (Gallus gallus).

Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах осуществляется следующим образом

Для исследования кормов, продовольственного сырья и пищевых продуктов на содержание ДНК в тканях курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для тканей свиньи (Sus scrofa); FAM/Green - тканей курицы (Gallus gallus) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный. Для повышения точности идентификации мяса для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь содержащую фрагменты геномов тканей курицы (Gallus gallus), тканей свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.

При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.

Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.

Праймеры, специфичные для тканей курицы (Gallus gallus), тканей свиньи (Sus scrofa) спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации подобраны олигонуклеотидные флуоресцентно-меченные зонды Su-Znew-r6g (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Su-Fnew и Su-Rnew) и Ga-Znew fam (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Ga-F и Ga-R). Зонды были помечены красителями FAM HEX. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геноме любых видов растений и животных, которые потенциально встречаются вблизи тех, которые определены в кормах и пищевых продуктах.

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Су5. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Пример конкретного осуществления способа определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.

Для подтверждения эффективности способа были использованы сухие корма в виде рыбной и мясной муки; сырые и термически обработанные мясные продукты, т.е. мясные полуфабрикаты.

От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.

Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.

Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР - СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах:

1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).

Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР - СВИНИНА-КУРИЦА-ФАКТОР» для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ТУ 21.10.60-139-51062356-2017, http://www.vetfaktor.ru/. Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.

Исследования состоит из трех этапов:

- экстракция нуклеиновая кислота (НК);

- проведение реакции ПЦР РВ;

- учет результатов анализа.

Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательный контрольный образец (ОКО), вносят по 10 мкл внутренний контрольный образец (ВКО) для ткани курицы и свиньи (СК) в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл.

Следующий этап это подготовка образцов к проведению ПЦР.

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительный контрольный образец (ПКО) СК, ВКО СК и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов тканей курицы (Gallus gallus), тканей свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1.

В отдельной пробирке смешать компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ СК;

10 мкл ПЦР БУФЕР СК;

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешивают смесь на вортексе и сбросывают капли кратковременным центрифугированием.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.

Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.

Интерпретация результатов анализа.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору и в соответствии с Приложениями 1, 2 и 3 Инструкции.

Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на каналах FAM/Green и JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на каналах JOE/Yellow и/или FAM/Green) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ (рис. 1, 2).

В образце обнаружена ДНК ткани свиньи (Sus scrofa), если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, рис. 3, 5).

В образце обнаружена ДНК ткани курицы (Gallus gallus), если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале FAM/Green, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, рис. 4, 5).

Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow и/или FAM/Green значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным (содержание целевой ДНК ниже предела обнаружения метода).

Образец считается отрицательным (ДНК ткани свиньи (Sus scrofa) и/или ткани курицы (Gallus gallus) если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале FAM/Green и/или JOE/Yellow при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, рис. 3, 4, 5), а значение Ct по каналу Cy5/Red менее 35.

Для исследуемых образцов (сухой корм и мясные полуфабрикаты) предел точности содержания ткани курицы и свиньи представлен в таблице 5.

Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с электрофоретической детекцией. Оказалось чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при обнаружении примеси тканей курицы и свинины в кормах в 10 раз выше, чем ПЦР с электрофоретической детекцией.

Похожие патенты RU2700479C1

название год авторы номер документа
Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах 2018
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Фисинин Владимир Иванович
  • Кочиш Иван Иванович
  • Стекольников Анатолий Александрович
  • Клименко Александр Иванович
  • Шахов Алексей Гаврилович
  • Суханова Светлана Фаилевна
  • Забашта Николай Николаевич
  • Дробин Юрий Дмитриевич
RU2700480C1
Тест-система для идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Баннов Василий Александрович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Малышев Денис Владиславович
  • Дунин Иван Михайлович
  • Амерханов Харон Адиевич
  • Дорожкин Василий Иванович
  • Племяшов Кирилл Владимирович
  • Бахарев Алексей Александрович
  • Коломиец Сергей Николаевич
  • Кривоногова Анна Сергеевна
  • Дробин Юрий Дмитриевич
RU2702858C1
Способ идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах 2019
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Черных Владимир Олегович
  • Лысенко Александр Анатольевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Шевченко Александр Алексеевич
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Хахов Латиф Асланбиевич
  • Лысенко Юрий Андреевич
  • Кузьминова Елена Васильевна
  • Щукина Ирина Владимировна
  • Инюкина Татьяна Андреевна
  • Лихоман Александр Владимирович
  • Забашта Сергей Николаевич
RU2726433C1
Способ идентификации видовой принадлежности тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах 2019
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Малышев Денис Владиславович
  • Черных Владимир Олегович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Шевченко Александр Алексеевич
  • Вацаев Шахаб Вахидович
  • Исаева Альбина Геннадьевна
  • Шаравьев Павел Викторович
  • Лоретц Ольга Геннадьевна
  • Лихоман Александр Владимирович
RU2742952C1
Способ идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах 2019
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Черных Владимир Олегович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Шевченко Александр Алексеевич
  • Вацаев Шахаб Вахидович
  • Кощаева Ольга Викторовна
  • Барашкин Михаил Иванович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Усенко Валентина Владимировна
  • Забашта Николай Николаевич
RU2726427C1
Тест-система для идентификации ДНК тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах 2019
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Черных Владимир Олегович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Шевченко Александр Алексеевич
  • Вацаев Шахаб Вахидович
  • Щукина Ирина Владимировна
  • Гугушвили Нино Нодариевна
  • Донник Ирина Михайловна
  • Усенко Валентина Владимировна
RU2725539C1
Способ определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах 2019
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Черных Владимир Олегович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Шевченко Александр Алексеевич
  • Хахов Латиф Асланбиевич
  • Гугушвили Нино Нодариевна
  • Исаева Альбина Геннадьевна
  • Шаравьев Павел Викторович
  • Усенко Валентина Владимировна
RU2714287C1
Способ идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах 2018
  • Малышев Денис Владиславович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Гулюкин Михаил Иванович
  • Лайшев Касим Анверович
  • Юлдашбаев Юсупжан Артыкович
  • Мирошников Сергей Александрович
  • Шаравьев Павел Викторович
  • Семененко Марина Петровна
  • Молчанов Алексей Вячеславович
  • Баннов Василий Александрович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
RU2694713C1
Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах 2019
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Малышев Денис Владиславович
  • Черных Владимир Олегович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Шевченко Александр Алексеевич
  • Вацаев Шахаб Вахидович
  • Инюкина Татьяна Андреевна
  • Нестеренко Антон Алексеевич
  • Семененко Марина Петровна
  • Семенов Владимир Григорьевич
  • Забашта Сергей Николаевич
RU2728662C1
Тест-система для идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах 2019
  • Черных Олег Юрьевич
  • Малышев Денис Владиславович
  • Баннов Василий Александрович
  • Черных Владимир Олегович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Лоретц Ольга Геннадьевна
  • Быкова Ольга Александровна
  • Щукина Ирина Владимировна
  • Тюрин Владимир Григорьевич
RU2728639C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 700 479 C1

Реферат патента 2019 года Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах, включающий выделение сорбционным методом ДНК из тканей курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa), постановку полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации с использованием специфичных для участка генома ДНК ткани курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей, внутреннего контрольного образца и положительных контрольных образцов, измерение специфических сигналов и сигнала контролей и интерпретацию результатов, согласно изобретению проводят одноэтапную полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для тканей свиньи (Sus scrofa); FAM/Green - тканей курицы (Gallus gallus) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца, интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца – смесь, содержащую фрагменты геномов тканей курицы (Gallus gallus), тканей свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1:1. Изобретение позволяет повысить точность идентификации видовой принадлежности тканей кур и свиней. 5 ил., 5 табл.

Формула изобретения RU 2 700 479 C1

Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах, включающий выделение сорбционным методом ДНК из тканей курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa), постановку полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации с использованием специфичных для участка генома ДНК ткани кур (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей, внутреннего контрольного образца и положительных контрольных образцов, измерение специфических сигналов и сигнала контролей и интерпретацию результатов, отличающийся тем, что проводят одноэтапную полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для тканей свиньи (Sus scrofa); FAM/Green - тканей кур (Gallus gallus) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца, интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца – смесь, содержащую фрагменты геномов тканей кур (Gallus gallus), тканей свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:

Su-Fnew GGAACAGACCTCGTAGAATG

Su-Rnew GTAGGTCTGGTGAGAATAGTA

Su-Znew-r6g ACAAAGCAACCCTCACACGATTC

Ga-F AATTTCGGCTCCCTATTA

Ga-R TCGTCCGATGTGAAGGAA

Ga-Znew fam ATGCACTACACAGCAGACACA-BHQ1

T4F TACATATAAATCACGCAAAGC

T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG

T4P CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2019 года RU2700479C1

Инструкция по применению тест-системы "ЧИС" для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней методом полимеразной цепной реакции, организация производитель - ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г
Москва, 2013, найдено в Интернет 15.05.2019, адрес сайта: rukovodstvo/ru/oxp/111649/index.html?page =2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МЯСА ДОМАШНИХ И ДИКИХ ПТИЦ 2000
  • Гугушвили Н.Н.
  • Урусов Н.Н.
  • Сенченко Б.С.
  • Кабанова Е.М.
  • Шпонько Ю.Б.
  • Герасимова В.Ю.
RU2178169C2

RU 2 700 479 C1

Авторы

Котельникова Александра Андреевна

Черных Олег Юрьевич

Баннов Василий Александрович

Донник Ирина Михайловна

Лысенко Александр Анатолиевич

Кривонос Роман Анатольевич

Шевкопляс Владимир Николаевич

Кощаев Андрей Георгиевич

Дайбова Любовь Анатольевна

Дробин Юрий Дмитриевич

Малышев Денис Владиславович

Егоров Иван Афанасьевич

Джавадов Эдуард Джавадович

Тюрин Владимир Григорьевич

Салеева Ирина Павловна

Лоретц Ольга Геннадьевна

Дельцов Александр Александрович

Кузьминова Елена Васильевна

Даты

2019-09-17Публикация

2018-10-01Подача