НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/50 C12Q1/686 

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов. Набор предназначен для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости – HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и состоит из следующих праймеров:

HLA-A-F: AGAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTC

HLA-A-R: CTCAGCCCCACCTCTCTGGAACAGG

HLA-B-F: CACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACT

HLA-B-R: TTCTTTTACTTCAGTGGTGTTCCCCAGATG

HLA-C-F: CTAGAGAAGCCAATCAGCGTCT

HLA-C-R: ACGCAGACACATTCAGGTGCCTTTGC

HLA-DQB1-F1: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTA

HLA-DQB1-F2: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTG

HLA-DQB1-F3: TTCACCTCAAATGTTCATCCAGTG

HLA-DQB1-R: AGTCTTGATCCTCATAGCAGCAAATA

HLA-DRB1-F1: CGCTTTCACTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-F2: CACTTTCACTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-F3: CACTTTCGCTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-R1: CGTCTCTGCAGGCCACAAGCTAT

HLA-DRB1-R2: CGTCTCTGTAGGCCACAAGCTAT.

Цель изобретения – разработка набора синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости.

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток – метод клеточной терапии, применяющийся для лечения гематологических, онкологических, генетических и ряда других заболеваний путем пересадки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), способных полностью восстановить систему гемопоэза и иммунитета в организме после высокодозной химиотерапии [1, 2, 3].

Риски отторжения трансплантата и возникновения реакции «трансплантат против хозяина» зависят от качества подбора донора ГСК, совместимого по HLA-системе, характеризующейся высокой вариабельностью [4].

По состоянию на 07 февраля 2019 г., число потенциальных доноров ГСК, зарегистрированных в объединенной базе данных о российских донорах BMDS (Bone Marrow Donor Search), составляет 94 204 человека, в неё включены 15 регистров из 11 регионов Российской Федерации [5]. Такое количество безвозмездных доноров на сегодняшний день обеспечило 282 трансплантации ГСК для пациентов российских клиник [6].

В последние пять лет наметился явный прогресс во взаимодействии трансплантационных клиник с BMDS, однако многие российские пациенты по-прежнему зависят от донорского материала, получаемого из-за рубежа, либо вообще остаются без совместимого неродственного донора [6].

Сложившаяся ситуация требует увеличения числа потенциальных доноров ГСК в короткие сроки, а трансплантационные центры диктуют необходимость HLA-типирования доноров молекулярно-генетическими методами как минимум по пяти HLA-локусам. Прогресс в расширении донорской базы ограничивается прежде всего высокой стоимостью реагентов, используемых для проведения массового HLA-типирования доноров и низкой производительностью анализа.

В настоящее время наибольшее распространение в практике получили четыре технологии HLA-типирования: SSP (Sequence Specific Primers), SSO (Sequence Specific Oligonucleotides), SBT (Sequence Based Typing) и NGS (Next Generation Sequence). Метод SSP характеризуется низкой производительностью, SSO – невозможностью определения отдельных точечных вариаций, что особенно актуально в условиях малоизученных популяций, к которым следует отнести и большинство популяций, проживающих на территории РФ [7]. Технология SBT признана «золотым стандартом» HLA-типирования, с точки зрения идентификации новых аллелей, а при использовании современных многокапиллярных секвенаторов обладает и высокой производительностью. Однако даже существенное масштабирование исследований, выполняемых методом SBT, практически не снижает стоимости типирования. При необходимости изучения дополнительных экзонов/интронов затраты на SBT-типирование возрастают. Наиболее перспективным, с точки зрения увеличения производительности и существенного снижения стоимости HLA-типирования, представляется применение технологии массового параллельного секвенирования (MPS - massive parallel sequencing).

Стандартный протокол проведения таргетного MPS исследования включает в себя следующие этапы: таргетное обогащение генов, приготовление библиотек, секвенирование, анализ данных.

Отдаленным аналогом предлагаемого изобретения является набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности 1 интрона, примыкающего ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1) [8].

Техническим результатом заявляемого изобретения является изучение последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости с целью создания системы типирования HLA. Использование предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов позволит проводить таргетную амплификацию при HLA-типировании потенциальных доноров ГСК в высоком разрешении, с возможностью выявления ранее незарегистрированных аллелей.

Для достижения указанного результата проводят ПЦР длинных фрагментов образца ДНК. В отличие от отдалённого аналога, позволяющего получать только последовательность первого интрона генов HLA-A и HLA-DRB1, предлагаемый набор праймеров позволяет определять последовательности всего гена локусов HLA-A, HLA-B, HLA-C (за исключением участка 3’-UTR), участка гена с первого по пятый экзон локуса HLA-DQB1, участка гена со второго по четвертый экзон локуса HLA-DRB1, что сводит число возможных неоднозначностей типирования к минимуму.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в ООО «ПАРСЕК ЛАБ».

Осуществление изобретения:

Материалом для исследования является геномная ДНК человека. Исследуемый препарат ДНК не должен содержать посторонних примесей, соотношение А₂₆₀/A₂₈₀ должно составлять 1,7-1,9. Для анализа одного образца требуется 300 нг ДНК (30 мкл ДНК с концентрацией 10нг/мкл для анализа 5 локусов), концентрация геномной ДНК должна быть оценена флуоресцентным методом.

Использование изобретения возможно в двух форматах моноплексный и мультиплексный:

1. Формат – моноплексный.

Для получения последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости используется постановка ПЦР длинных фрагментов с помощью набора специфичных праймеров. Дополнительно в реакционную смесь добавляют следующие компоненты: смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов в конечной концентрации каждого 200 мкМ, Taq-полимеразу (AccuPrime или Encyclo), реакционный буфер (600 мМ Tris-SO₄, рН=8,9; 180 мМ (NH₄)₂SO₄, 20 мМ Mg²⁺, 10% глицерол).

В подготовленную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПЦР длинных фрагментов по следующим профилям:

- для локуса HLA-A

Температура Время Количество циклов 94^оС 2 мин 1 98^оС 10 сек 35 67^оС 15 сек 68^оС 3 мин 68^оС 10 мин 1 4^оС не ограничено

- для локуса HLA-B

Температура Время Количество циклов 94^оС 2 мин 1 98^оС 10 сек 35 60^оС 15 сек 68^оС 5 мин 68^оС 10 мин 1 4^оС не ограничено

- для локуса HLA-C

Температура Время Количество циклов 94^оС 2 мин 1 98^оС 10 сек 35 65^оС 15 сек 68^оС 5 мин 68^оС 10 мин 1 4^оС не ограничено

- для локуса HLA-DQB1

Температура Время Количество циклов 94^оС 2 мин 1 98^оС 10 сек 35 60^оС 15 сек 68^оС 6 мин 68^оС 10 мин 1 4^оС не ограничено

- для локуса HLA-DRB1

Температура Время Количество циклов 94^оС 2 мин 1 98^оС 10 сек 30 62^оС 30 сек 68^оС 7 мин 68^оС 10 мин 1 4^оС не ограничено

2. Формат – мультиплексный.

Для получения последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости используется постановка ПЦР длинных фрагментов с помощью набора специфичных праймеров. Дополнительно в реакционную смесь добавляют следующие компоненты: смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов в конечной концентрации каждого 200 мкМ, Taq-полимеразу (AccuPrime или Encyclo), реакционный буфер (600 мМ Tris-SO₄, рН=8,9; 180 мМ (NH₄)₂SO₄, 20 мМ Mg²⁺, 10% глицерол).

В подготовленную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПЦР длинных фрагментов по следующему профилю:

Температура Время Количество циклов 94^оС 2 мин 1 98^оС 10 сек 2 70^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 2 69^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 2 68^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 2 67^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 2 66^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 3 65^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 3 64^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 3 63^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 3 62^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 3 61^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 3 60^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 3 59^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 2 58^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 98^оС 10 сек 2 57^оС 15 сек 68^оС 5,5 мин 68^оС 10 мин 1 4^оС не ограничено

Оценку наличия продукта реакции ПЦР длинных фрагментов осуществляют электрофорезом в агарозном геле. Размер ампликона должен соответствовать указанному в таблице:

HLA-локус Размер продукта ПЦР, п.н HLA-A 3 200 HLA-B 4 609 HLA-C 3 000 HLA-DQB1 6 100 HLA-DRB1 4 300

Примеры визуализации продуктов реакции ПЦР длинных фрагментов с использованием набора синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости – HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1.

Моноплексный формат:

Мультиплексный формат:

Список литературы:

1. Passweg J.R., Baldomero H., Bader P.et al.; European Society for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Hematopoietic SCT in Europe 2013: recent trends in the use of alternative donors showing more haploidentical donors but fewer cord blood transplants. Bone Marrow Transplant. – 2015. – 50 (4). P. 476–82.

2. Syed A. Abutalib, Parameswaran Hari. Clinical Manual of Blood and Bone Marrow Transplantation. – Chichester: Wiley-Blackwell, 2017. – 424 с.

3. Кокорев О.В., Чердынцева Н.В., Зайцев К.В., Волгушев С.В. Теоретические и практические аспекты трансплантации стволовых клеток в онкологии // Сибирский онкологический журнал. – 2005. – № 4 (16). – С. 53–61.

4. Афанасьев Б.В., Зубаровская Л.С., Алянский А.Л. и др. Выбор донора при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // Российский журнал детской гематологии и онкологии. – 2016. – Т.3. – С. 30-36.

5. Счетчик регистра (2018). Доступен: http://www.rdkm.rusfond.ru/registr_stat/001 (обновление 10.08.2018).

6. Макаренко О.А., Алянский А.Л., Иванова Н.Е. и др. Эффективность поиска неродственного донора гемопоэтических стволовых клеток с помощью российской поисковой системы Bone Marrow Donor Search: опыт НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой // Клиническая онкогематология. – 2017. -№ 10. – С. 39-44.

7. Логинова М.А., Парамонов И.В. Новые HLA-аллели в российских популяциях // Трансфузиология. – 2016. - №3. Т.17. – С.13-20.

8. Патент Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности 1 интрона, примыкающей ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1). RU 2649064.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 в ходе ПЦР с дальнейшей визуализацией продуктов реакции методом электрофореза в агарозном геле. Изобретение обеспечивает создание новой системы типирования HLA. 4 ил., 7 табл., 2 пр.

Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости - HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 в ходе ПЦР длинных фрагментов (моноплексный и мультиплексный форматы):

HLA-A-F: AGAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTC

HLA-A-R: CTCAGCCCCACCTCTCTGGAACAGG

HLA-B-F: CACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACT

HLA-B-R: TTCTTTTACTTCAGTGGTGTTCCCCAGATG

HLA-C-F: CTAGAGAAGCCAATCAGCGTCT

HLA-C-R: ACGCAGACACATTCAGGTGCCTTTGC

HLA-DQB1-F1: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTA

HLA-DQB1-F2: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTG

HLA-DQB1-F3: TTCACCTCAAATGTTCATCCAGTG

HLA-DQB1-R: AGTCTTGATCCTCATAGCAGCAAATA

HLA-DRB1-F1: CGCTTTCACTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-F2: CACTTTCACTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-F3: CACTTTCGCTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-R1: CGTCTCTGCAGGCCACAAGCTAT

HLA-DRB1-R2: CGTCTCTGTAGGCCACAAGCTAT

с дальнейшей визуализацией продуктов реакции определенного размера методом электрофореза в агарозном геле, отличающийся возможностью определения последовательности всего гена локусов HLA-A, HLA-B, HLA-C (за исключением участка 3’-UTR), участка гена с первого по пятый экзон локуса HLA-DQB1, участка гена со второго по четвертый экзон локуса HLA-DRB1 в моноплексном и мультиплексном форматах.